CN110651037A - 用于产生有机化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备有机化合物的方法，该方法包括：I)在包含蔗糖作为可同化碳源的培养基中培养遗传修饰的微生物，以使得遗传修饰的微生物产生有机化合物；II)从方法步骤I)中得到的发酵液中回收有机化合物，其中遗传修饰的微生物包含A)与未经遗传修饰的原始微生物相比导致rbsK‑基因编码的酶的活性增加的至少一种遗传修饰，并且其中原始微生物属于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)。本发明还涉及遗传修饰的微生物及其在由蔗糖作为可同化碳源发酵制备有机化合物中的用途。
Description
本发明涉及用于产生有机化合物、优选琥珀酸的方法，涉及遗传修饰的微生物，以及涉及遗传修饰的微生物在有机化合物、优选琥珀酸的发酵生产中的用途。
具有6个或更少碳的有机化合物例如小二羧酸是有商业意义的用途多样的化学品。例如，小二酸包括1,4-二酸，例如琥珀酸、苹果酸和酒石酸，和5-碳分子衣康酸。其它二酸包括二碳草酸、三碳丙二酸、五碳戊二酸和六碳己二酸并且也存在这类二酸的许多衍生物。
作为一类，这些小二酸具有某种化学相似性并且它们在聚合物生产中的用途可以为树脂提供特殊特性。这种多用性使其轻易契合下游化工基础设施市场。例如，1,4-二酸分子满足大规模化学品马来酐的许多用途，在于它们被转化成多种工业化学品(四氢呋喃、丁内酯、1,4-丁二醇、2-吡咯烷酮)和琥珀酸衍生物琥珀酰胺、琥珀腈、二氨基丁烷和琥珀酸化合物的酯。酒石酸在食品、皮革、金属和印刷工业中具有众多用途。衣康酸形成产生3-甲基吡咯烷酮、甲基-BDO、甲基-THF等的原料。
特别的是，琥珀酸或琥珀酸化合物-这些术语在本文中可互换使用-已经吸引巨大兴趣，因为已经在食品、化工和制药业中使用它作为许多工业上重要的化学品的前体。实际上，一份来自美国能源部的报告报道，琥珀酸是从生物质产生的前12大化学结构单元之一。因此，在细菌中制备二酸的能力将具有明显的商业重要性。
WO-A-2009/024294公开了产生琥珀酸的细菌菌株(其属于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)成员，最初从瘤胃分离并且能够利用甘油作为碳源)，以及有其衍生的保留所述能力的变体和突变株，特别的是，如保藏于DSMZ((Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124 Braunschweig,Germany)的命名为DD1的细菌菌株，所述细菌菌株具有保藏编号DSM 18541(ID06-614)并且具有产生琥珀酸的能力。DD1-菌株属于物种产琥珀酸巴斯夫菌(Basfiasucciniciproducens)及巴斯德菌科，如依据Kuhnert等人,2010分类。WO-A-2010/092155中公开了这些菌株的突变，其中已经破坏ldhA-基因和/或pflD-基因或pflA-基因，这些突变菌株的特征为：与WO-A-2009/024294中公开的DD1-野生型相比，在厌氧条件下显著增加了从碳源例如甘油或甘油和碳水化物(例如麦芽糖)的混合物产生琥珀酸。
然而，基于生物的琥珀酸化合物仍然面临以下挑战：在成本上针对基于石油化学的替代品变得有竞争力。为了发展基于生物的工业生产琥珀酸，在低成本培养基中培养细胞将是重要的，并且工作菌株应当最佳地能够代谢类型广泛的低成本糖原料以便以良好产率产生琥珀酸，从而可以使用最便宜的可用原料。
蔗糖(通常称为糖)是由葡萄糖和果糖组成的二糖，并且它是自然界中非常丰富并且从具有光合作用能力的所有植物产生的碳源。特别的是，甘蔗和糖用甜菜含有大量蔗糖，并且世界上超过60％的蔗糖目前产自甘蔗。特别的是，蔗糖以十分低的成本生产，因为它可以通过蒸发/浓缩通过机械压榨甘蔗获得的提取物的简单工艺而工业产生。因此，蔗糖作为通过微生物发酵产生化学化合物的原料是价廉的，并且它还发挥以下作用：保护细胞膜免受含有大量所需代谢物的外部环境影响，因此产生高浓度的所需代谢物，如Kilimann等人(Biochimica et Biophysica Acta,1764,2006)所示。
WO 2015/118051 A1公开了一种修饰的微生物，其与野生型相比具有由fruA-基因编码的酶的活性降低，其中衍生出修饰的微生物的野生型属于巴斯德菌科，fruA-基因编码果糖特异性磷酸转移酶(果糖PTS)。与野生型细胞(即上述DD1菌株)相比，当在蔗糖作为唯一或主要碳源的存在下培养时，其中fruA-基因已缺失的重组细胞的特征在于琥珀酸收率提高。然而，考虑到由蔗糖作为碳源发酵生产琥珀酸的经济效率，仍然期望提供进一步的修饰微生物，其能够从蔗糖生产大量琥珀酸，并且与从现有技术已知的修饰的菌株相比，优选地由蔗糖产生甚至更多的琥珀酸。
因此，本发明的目的在于克服现有技术的缺点。
特别的是，本发明的目的在于提供生产有机化合物例如琥珀酸的方法，当使用蔗糖作为碳源时，通过该方法可以实现高碳收率。
本发明的另一个目的在于提供遗传修饰的微生物，与通过遗传修饰从其衍生的原始细胞相比，它使得由蔗糖作为碳源产生有机化合物例如琥珀酸，具有更高碳收率。
通过生产有机化合物，优选琥珀酸的方法，为实现上述目的做出了贡献，该方法包括：
I)在培养基中培养遗传修饰的微生物，该培养基包含蔗糖作为可同化碳源，以使得遗传修饰的微生物产生有机化合物；
II)从方法步骤I)中获得的发酵液中回收有机化合物，
其中遗传修饰的微生物包含：
A)与未经遗传修饰的原始微生物相比，导致由rbsK-基因编码的酶的活性增加的至少一种遗传修饰，
并且其中原始微生物属于巴斯德菌科。
令人惊讶的是，已经发现，巴斯德菌科的微生物包含至少一种遗传修饰，其导致由rbsK-基因编码的酶(编码ATP依赖性果糖激酶；EC 2.7.1.4)的活性增加，所述微生物的特征在于与未经基因修饰的原始微生物相比，由蔗糖作为唯一或主要碳源生产有机化合物例如琥珀酸的产率增加。除此基因修饰外，如果修饰的微生物还包含至少一种遗传修饰，其导致由fruA-基因编码的酶(编码果糖特异性磷酸转移酶系统；EC 2.7.1.202)的活性降低，则由蔗糖生产有机化合物例如琥珀酸的产率甚至可以得到进一步提高。
在本发明的方法中，使用了遗传修饰的微生物，其包含：
A)与未经遗传修饰的原始微生物相比，导致由rbsK-基因编码的酶的活性增加的至少一种遗传修饰，其中原始微生物属于巴斯德菌科。
此类遗传修饰的微生物可通过至少包含以下步骤的方法获得：
i)提供巴斯德菌科的原始微生物；
ii)按照由rbsK-基因编码的酶活性增加这样的方式对所述微生物进行遗传修饰；
iii)任选进行微生物的进一步遗传修饰，其导致不同于由rbsK-基因编码的酶的一种或多种另外的酶的活性增加或降低，其中方法步骤iii)可以在方法步骤i)后的任意时间进行(特别是在方法步骤ii)前，方法步骤ii)后或方法步骤ii)之前和之后)。
如本文所用，术语“原始微生物”优选指所谓的“野生型”-菌株。术语“野生型”是指这样一种微生物，其基因组、特别是其rbsK-基因及其rbsK-基因的调控元件，以由于进化而自然产生的状态存在。作为结果，术语“野生型”优选不覆盖其基因序列至少部分地被人通过重组方法修饰的那些微生物。因此，术语“遗传修饰的微生物”包括经过遗传改变、修饰或改造(例如，遗传改造)的微生物，以使其与衍生它的天然存在的野生型微生物相比，表现出改变、修饰或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响该微生物的编码核酸序列时)。根据本发明方法中使用的遗传修饰的微生物的特别优选的实施方案，该遗传修饰的微生物是重组微生物，这意味着该微生物已经使用重组DNA获得。如本文所用，表述“重组DNA”是指通过使用实验室方法(分子克隆)将来自多种来源的遗传物质聚集在一起而产生的DNA序列，从而生成了在生物有机体中找不到的序列。这种重组DNA的实例是已插入异源DNA-序列的质粒。
通过上述遗传修饰从其衍生遗传修饰的微生物的原始微生物属于巴斯德菌科。巴斯德菌科包括革兰氏阴性蛋白菌(Proteobacteria)的大家族，其成员范围从细菌例如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)到动物和人粘膜的共生体。大部分成员作为共生体生活在鸟和哺乳动物的粘膜表面，特别是在上呼吸道。巴斯德菌科通常为棒状，并且是值得注意的兼性厌氧菌。通过氧化酶的存在，它们可以与相关的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)区别，而由于不存在鞭毛，它们可以与大多数其它相似的细菌区别。基于代谢特性，巴斯德菌科中的细菌已被分类为许多属，并且存在16S RNA和23S RNA的序列。许多巴斯德菌科含有丙酮酸-甲酸-裂解酶基因，并且能够以厌氧方式将碳源发酵成有机酸。
在这种情况下，特别优选原始微生物属于Basfia属，并且特别优选它属于产琥珀酸巴斯夫菌物种。
最优选的是，原始微生物是根据布达佩斯条约由德国DSMZ(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen,GmbH)保藏的产琥珀酸巴斯夫菌-菌株DD1，其具有保藏号DSM 18541。可以从德国产的母牛的瘤胃中分离该菌株。可以从动物并且特别是哺乳动物的胃肠道中分离出巴斯德菌属细菌。特别地，细菌菌株DD1可以从牛瘤胃中分离出来，并且能够利用甘油(包括粗甘油)作为碳源。可用于制备本发明的修饰的微生物的Basfia属的其它菌株是已经以保藏号DSM 22022保藏的Basfia-菌株或已经在瑞典CultureCollection of the University of (CCUG)保藏的Basfia-菌株，其具有保藏号CCUG 57335、CCUG 57762、CCUG 57763、CCUG 57764、CCUG 57765或CCUG 57766。所述菌株最初从德国或瑞士产的母牛瘤胃中分离。
在这种情况下，特别优选原始微生物具有SEQ ID NO：1的16S rDNA或显示出与SEQID NO：1至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的序列同源性的序列。还优选原始微生物具有SEQ ID NO：2的23S rDNA或显示出与SEQ ID NO：2至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的序列同源性的序列。
与根据本发明的用于修饰的微生物的多种多肽或多核苷酸有关的百分比值的同一性优选地被计算为在比对序列的整个长度内的残基的同一性，例如，借助程序针从生物信息学软件包EMBOSS(版本5.0.0，http://emboss.source-forge.net/what/)计算的同一性，其中默认参数为：即空位开放(罚分以开放空位)：10.0，空位延伸(罚分以延长空位)：0.5，和数据文件(包中包括的得分矩阵文件)：EDNAFUL。
应当注意，从其衍生出遗传修饰的微生物的原始微生物不限于上述菌株之一，特别是不限于产琥珀酸巴斯夫菌-菌株DD1，还可以包括这些菌株的变体。在上下文中，表述“菌株的变体”包括每个具有与野生型菌株相同或基本相同的特征的菌株。在这种情况下，特别优选变体的16S rDNA与衍生出该变体的野生型具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，并且最优选至少99.9％的同一性。还特别优选的是，该变体的23S rDNA与衍生出该变体的野生型具有至少90％，优选至少95％，更优选至少99％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，并且最优选至少99.9％的同一性。例如，可以通过用诱变化学试剂、X射线或UV光处理野生型-菌株来获得该定义含义中的菌株变体。
根据遗传修饰的微生物的优选实施方案，rbsK-基因包含选自以下的核酸：
a1)具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的核酸；
b1)编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列的核酸；
c1)与a1)或b1)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％，最优选100％同一性的核酸，该同一性为a1)或b1)的核酸的总长度的同一性；
d1)编码氨基酸序列的核酸，该氨基酸序列与a1)或b1)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％，最优选100％同一性，该同一性为a1)或b1)的核酸编码的氨基酸序列的总长度的同一性；
e1)能够在严格条件下与a1)或b1)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
f1)与a1)或b1)的任意核酸编码相同的蛋白质、但由于遗传密码的简并性而与上述a1)或b1)的核酸不同的核酸。
如本文所用，术语“杂交”包括“核酸分子链通过碱基配对与互补链结合的任何过程”(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,Stockton Press,New York)。杂交和杂交强度(即核酸分子之间缔合的强度)受例如核酸分子之间的互补程度，所涉及条件的严格性，所形成的杂合体的Tm以及核酸分子内的G:C比这样的因素影响。
如本文所用，术语“Tm”是指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体一半解离成单链的温度。用于计算核酸分子的Tm的公式在本领域中是众所周知的。如标准参考文献所示，当核酸分子在1M NaCl的水溶液中时，可通过以下公式计算Tm值的简单估算值：Tm＝81.5+0.41(％G+C)(参见，例如Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic Acid Hybridization(1985))。其它参考文献包括更复杂的计算，在计算Tm时要考虑结构和序列特征。严格条件是本领域技术人员已知的，并且可以在CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。
特别的是，术语“严格条件”是指这样的条件，其中互补核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)片段或与之相同的100个或以上连续核苷酸，150个或以上连续核苷酸，200个或以上核苷酸以上或250个或以上核苷酸与特异性核酸分子(DNA、RNA、sDNA或ssRNA)在等价于以下条件下杂交：在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，在50℃或65℃、优选在65℃于2×SSC、0.1％SDS中洗涤。优选地，杂交条件等价于在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，在50℃或65℃、优选65℃于1×SSC、0.1％SDS中洗涤，更优选杂交条件等价于在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，在50℃或65℃、优选65℃于0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤。优选地，互补核苷酸与片段或完整fruA核酸杂交。或者，优选的杂交条件包括在65℃于1×SSC中杂交或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在65℃于0.3×SSC中洗涤，或在50℃于4×SSC中杂交或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在50℃于2×SSC中洗涤。进一步优选的杂交条件为0.1％SDS、0.1SSD和65℃。
具有其SEQ ID NO：3的核苷酸序列的核酸相当于产琥珀酸巴斯夫菌-菌株DD1的rbsK-基因。
根据用于根据本发明的方法中的遗传修饰的微生物的特别优选的实施方案，该遗传修饰的微生物还包含：
B)与未经遗传修饰的原始微生物相比，导致由fruA-基因编码的酶活性降低的至少一种遗传修饰。
在衍生修饰的微生物的原始微生物中，fruA-基因优选包含选自如下的核酸：
a2)具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸；
b2)编码SEQ ID NO：6的氨基酸序列的核酸；
c2)与a2)或b2)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％，最优选100％同一性的核酸，该同一性为a2)或b2)的核酸的总长度的同一性；
d2)编码氨基酸序列的核酸，该氨基酸序列与a2)或b2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％，最优选100％同一性，该同一性为a2)或b2)的核酸编码的氨基酸序列的总长度的同一性；
e2)能够在严格条件下与a2)或b2)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
f2)与a2)或b2)的任意核酸编码相同的蛋白质、但由于遗传密码的简并性而与上述a2)或b2)的核酸不同的核酸。
具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸相当于产琥珀酸巴斯夫菌-菌株DD1的fruA-基因。
增加的果糖激酶活性
根据本发明的方法中使用的遗传修饰的微生物包含：A)至少一种遗传修饰，与未经遗传修饰的原始微生物相比，该遗传修饰导致由rbsK-基因编码的酶的活性增加。例如，这种遗传修饰可以是rbsK-基因本身的修饰和/或rbsK-基因的调控元件的修饰，其中rbsK-基因的修饰和/或rbsK-基因的调控元件的修饰与其中未进行rbsK-基因和/或rbsK-基因的调控元件修饰的原始微生物相比，导致由rbsK-基因编码的酶活性增加。
如果原始微生物已经具有一定的果糖激酶活性，则优选地将酶活性的增加(Δ活性)定义如下：
其中，在测定Δ活性时，在完全相同的条件下测定原始微生物中的活性和修饰微生物中的活性。rbsK-基因编码的果糖激酶的活性可以通过Helanto等人:“Characterizationof genes involved in fructose utilization by Lactobacillus fermentum”；Arch.Microbiol.(2006),第186卷,p.51-59所公开的测定。
与微生物野生型中的所述酶的活性相比，果糖激酶的活性增加可以是酶活性增加1-10000％，或酶活性增加至少50％或至少100％或至少200％或至少300％或至少400％或至少500％或至少600％或至少700％或至少800％或至少900％或至少1000％或至少5000％。优选地，酶活性的增加范围为10-1000％，更优选范围为100-500％。
果糖激酶活性的增加可以通过下列方式进行：对rbsK-基因本身进行遗传修饰，例如通过增加rbsK-基因的拷贝数，通过使用编码具有增加的活性的相应酶的基因或等位基因，或通过导入一种或多种导致果糖激酶活性增加的基因突变。此类突变可以再次通过经典方法非定向产生，例如进化适应、UV照射或诱变化学品，或者通过遗传改造方法靶向产生，例如缺失、插入和/或核苷酸交换，通过侧定向诱变。此外，果糖激酶活性的增加可以通过修饰rbsK-基因的调控元件来实现，例如对rbsK-启动子序列的遗传修饰或对牵涉rbsK-基因的转录和/或基因产物的翻译的调节蛋白、阻抑制子、增强子、转录激活物等的修饰。在这种情况下，例如可以使用与原始微生物中的启动子序列相比更强的启动子序列。当然，也能够组合这些措施以增加果糖激酶活性。
根据本发明，例如，通过转化、转导、缀合或这些方法的组合，使用含有期望基因的载体、该基因的等位基因或其部分，以及包括能够表达的基因的载体产生遗传修饰的微生物。异源表达特别是通过将基因或等位基因整合到细胞的染色体或染色体外复制载体中来实现。
在这种情况下，特别优选的是，至少一种遗传修饰A)包含rbsK-基因的过表达，优选在ackA-启动子控制下的附加型质粒上的rbsK-基因的过表达。ackA-启动子优选包含选自以下的核酸：
a3)具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列的核酸；
b3)与a3)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％，最优选100％同一性的核酸，该同一性为a3)的核酸总长度的同一性。
例如，可以通过实时PCR确定基因在细胞中表达的程度。通过实时PCR可以确定基因在细胞中表达的细节在Wong和Medrano在“Real-time PCR for mRNA quantitation”,BioTechniques,第39卷,第1期,2005年7月,pp.75-85中公开。
降低的磷酸转移酶活性
根据用于根据本发明的方法的遗传修饰的微生物的特别优选的实施方案，该遗传修饰的微生物还包含B)至少一种遗传修饰，与未经遗传修饰的原始微生物相比，其导致由fruA-基因编码的酶的活性降低。例如，这种遗传修饰可以是fruA-基因本身的修饰和/或fruA-基因的调控元件的修饰，其中fruA-基因的修饰和/或fruA-基因调控元件的修饰，与未修饰fruA-基因和/或fruA-基因的调控元件的原始微生物相比，导致由fruA-基因编码的酶的活性降低。
将酶活性降低(Δ活性)定义如下：
其中，在测定Δ活性时，在完全相同的条件下，测定原始微生物中的活性和遗传修饰的微生物中的活性。例如，在上述Helanto等人的出版物中可以找到检测和确定由fruA-基因编码的酶的活性的方法。
由fruA-基因编码的果糖特异性磷酸转移酶的活性降低(或如下文所述，“乳酸脱氢酶活性降低”或“丙酮酸甲酸裂解酶活性降低”)可以是与所述酶在原始细胞中的活性相比，酶活性降低至少50％，或酶活性降低至少90％，或更优选酶活性降低至少95％，或更优选酶活性降低至少98％，或甚至更优选酶活性降低至少99％，或甚至更优选酶活性降低至少99.9％。术语“果糖特异性磷酸转移酶的活性降低”或-如下所述-“乳酸脱氢酶活性降低”或“丙酮酸甲酸裂解酶活性降低”还涵盖了具有这些酶不可检测到的活性的修饰微生物。
磷酸转移酶活性降低可以通过对fruA-基因本身进行遗传修饰来实现。在这种情况下，特别优选的是，遗传修饰B)包含fruA-基因的失活，其中该失活优选通过缺失fruA-基因或其部分来完成。还能够使用编码具有降低的活性的相应酶的基因或等位基因，或者通过导入导致磷酸转移酶的活性降低的一种或多种基因突变来实现。此类突变可以再次通过经典方法非定向产生，例如进化适应、UV照射或诱变化学品，或通过遗传改造方法靶向产生，例如缺失、插入和/或核苷酸交换，通过侧定向诱变。此外，可以通过修饰fruA-基因的调控元件来实现降低的磷酸转移酶活性，所述fruA-基因的调控元件例如与牵涉fruA-基因的转录和/或基因产物翻译的fruA-基因表达(例如，通过去除强启动子或阻遏性启动子)相关的调控序列或位点、调控蛋白、阻抑制子、增强子、转录激活物等。
根据本发明方法中使用的遗传修饰微生物的优选实施方案，通过缺失fruA-基因或其至少部分，缺失fruA-基因或其部分的调控元件例如启动子序列或通过将至少一种突变导入fruA-基因来完成fruA-基因的失活。
在下文中，描述了用于重组，特别是用于导入突变或用于缺失序列的适合的技术。
该技术有时在本文中也被称为“Campbell重组”(Leenhouts等人,Appl EnvMicrobiol.(1989),第55卷,394-400页)。如本文所用，“Campbell in”是指原始宿主细胞的转化体，其中整个环状双链DNA分子(例如质粒)通过单一同源重组事件(cross in事件)已整合入染色体中，并且有效地导致将所述环状DNA分子的线性化形式插入与所述环状DNA分子的第一DNA序列同源的染色体的第一DNA序列。“Campbelled in”是指已经整合到“Campbell in”转化体的染色体中的线性化DNA序列。“Campbell in”包含第一同源DNA序列的重复，其每个拷贝包括并且围绕同源重组交叉点的拷贝。
如本文所用，“Campbell out”是指由“Campbell in”转化体下行的细胞，其中第二同源重组事件(cross out事件)发生在“Campbelled in”DNA的线性化插入的DNA上包含的第二DNA序列与染色体起点的第二DNA序列之间，所述染色体起点的第二DNA序列与所述线性化插入物的第二DNA序列同源，第二重组事件导致整合的DNA序列的部分缺失(删除(jettisoning))，但重要的是，还产生保留在染色体中的部分(可能少至一个碱基)整合的Campbelled in DNA，使得与原始宿主细胞相比，“Campbell out”细胞包含一个或多个染色体有意改变(例如，单碱基取代，多碱基取代，插入异源基因或DNA序列，插入同源基因或修饰的同源基因的另一个拷贝或多个拷贝，或插入包含以上列出的这些上述实例中多于一个的DNA序列)。“Campbell out”细胞优选通过对“Campbelled in”DNA序列的一部分(期望被删除的部分)中包含的基因(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)sacB-基因)进行反选择而得到，这在存在约5％-10％蔗糖的情况下生长的细胞中表达时具有致死性。不论是否进行反选择，都可以使用任何可筛选的表型，通过筛选期望的细胞来获得或鉴定期望的“Campbell out”细胞，例如但不限于菌落形态，菌落颜色，存在或不存在抗生素抗性，存在或不存在通过聚合酶链反应的指定的DNA序列，存在或不存在营养缺陷型，存在或不存在酶，菌落核酸杂交，抗体筛选等。还可以将术语“Campbell in”和“Campbell out”用作多种时态中的动词，以指代上述方法或过程。
应当理解，导致“Campbell in”或“Campbell out”的同源重组事件可以发生在同源DNA序列内的一系列DNA碱基上，并且由于同源序列在此范围内的至少一部分彼此相同，因此，通常不可能确切指定交换事件发生的位置。换句话说，不可能精确地指定哪个序列最初来自插入的DNA，以及哪个最初来自染色体DNA。此外，第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常由部分非同源的区域隔开，并且正是这一非同源的区域保留在“Campbell out”细胞的染色体中。
优选的是，第一和第二同源DNA序列的长度为至少约200个碱基对，并且长度可以至多为几千个碱基对。但是，该过程可以用更短或更长的序列进行。例如，第一和第二同源序列的长度可以在约500至2000个碱基的范围内，并且通过将第一和第二同源序列排序成近似相同长度有助于从“Campbell in”获得“Campbell out”，优选相差小于200个碱基对，并且最优选两者中的较短者的碱基对为较长者的长度的至少70％。
可以通过上述“Campbell重组”缺失或者通过上述“Campbell重组”导入至少一种突变的fruA-基因或其部分优选包含如上定义的核酸。
根据用于根据本发明的方法的遗传修饰的微生物的进一步优选的实施方案，所述微生物可以另外通过以下方式表征：
-降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性，
-降低的乳酸脱氢酶活性，和/或
-降低的丙酮酸甲酸裂解酶活性和降低的乳酸脱氢酶活性。
乳酸脱氢酶缺失和/或丙酮酸甲酸裂解酶活性缺失的修饰的微生物公开在WO-A-2010/092155、US 2010/0159543和WO-A-2005/052135中，其有关降低微生物中乳酸脱氢酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶活性的不同方法的公开内容作为引用并入本文，所述微生物优选巴斯德菌属的细菌细胞，特别优选产琥珀酸巴斯夫菌菌株DD1。例如，用于测定丙酮酸甲酸裂解酶活性的方法由Asanum N.和Hino T.在“Effects of pH and Energy Supply onActivity and Amount of Pyruvate-Formate-Lyase in Streptococcus bovis”,Appl.Environ.Microbiol.(2000),第66卷,3773-3777页中公开，并且用于测定乳酸脱氢酶活性的方法例如由Bergmeyer,H.U.,Bergmeyer J.和Grassl,M.(1983-1986)公开在“Methods of Enzymatic Analysis”,第3版,第III卷,126-133页,Verlag Chemie,Weinheim中。
在本文中，优选乳酸脱氢酶活性的降低通过使ldhA-基因(其编码乳酸脱氢酶；LdhA；EC 1.1.1.27或EC 1.1.1.28)失活实现，并且丙酮酸甲酸裂解酶的降低通过使pflA-基因(编码丙酮酸甲酸裂解酶的激活剂；PflA；EC 1.97.1.4)或pflD-基因(编码丙酮酸甲酸裂解酶；PflD；EC 2.3.1.54)失活实现，其中这些基因(即ldhA、pflA和pflD)失活优选通过这些基因或其部分的缺失，通过这些基因或其至少部分的调控元件的缺失或通过将至少一种突变导入这些基因来实现，其中这些修饰优选通过如上所述的“Campbell重组”来进行。
在根据本发明的方法中使用的遗传修饰的微生物中其活性降低的ldhA-基因优选包含选自以下的核酸：
α1)具有SEQ ID NO：8的核苷酸序列的核酸；
α2)编码SEQ ID NO：9的氨基酸序列的核酸；
α3)与α1)或α2)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％，最优选100％同一性的核酸，该同一性为α1)或α2)的核酸的总长度的同一性；
α4)编码氨基酸序列的核酸，该氨基酸序列与α1)或α2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％，最优选100％同一性，该同一性为α1)或α2)的核酸编码的氨基酸序列的总长度的同一性；
α5)能够在严格条件下与α1)或α2)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
α6)与α1)或α2)的任意核酸编码相同的蛋白质、但由于遗传密码的简并性而与上述α1)或α2)的核酸不同的核酸。
在根据本发明的方法中使用的遗传修饰的微生物中其活性降低的pflA-基因优选包含选自以下的核酸：
β1)具有SEQ ID NO：10的核苷酸序列的核酸；
β2)编码SEQ ID NO：11的氨基酸序列的核酸；
β3)与β1)或β2)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％，最优选100％同一性的核酸，该同一性为β1)或β2)的核酸的总长度的同一性；
β4)编码氨基酸序列的核酸，该氨基酸序列与β1)或β2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％，最优选100％同一性，该同一性为β1)或β2)的核酸编码的氨基酸序列的总长度的同一性；
β5)能够在严格条件下与β1)或β2)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
β6)与β1)或β2)的任意核酸编码相同的蛋白质、但由于遗传密码的简并性而与上述β1)或β2)的核酸不同的核酸。
在本发明的方法中使用的遗传修饰的微生物中其活性降低的pflD-基因优选包含选自以下的核酸：
γ1)具有SEQ ID NO：12的核苷酸序列的核酸；
γ2)编码SEQ ID NO：13的氨基酸序列的核酸；
γ3)与γ1)或γ2)的核酸具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％，最优选100％同一性的核酸，该同一性为γ1)或γ2)的核酸的总长度的同一性；
γ4)编码氨基酸序列的核酸，该氨基酸序列与γ1)或γ2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％，最优选100％同一性，该同一性为γ1)或γ2)的核酸编码的氨基酸序列的总长度的同一性；
γ5)能够在严格条件下与γ1)或γ2)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
γ6)与γ1)或γ2)的任意核酸编码相同的蛋白质、但由于遗传密码的简并性而与上述γ1)或γ2)的核酸不同的核酸。
在本文中，优选的是，除至少一种修饰A)或除至少一种修饰A)和至少一种修饰B)外，根据本发明的方法中使用的遗传修饰的微生物的修饰还包含：
C)ldhA-基因或至少其部分缺失，ldhA-基因或至少其部分的调控元件缺失，或至少一种突变导入ldhA-基因；
D)pflD-基因或至少其部分缺失，pflD-基因或至少其部分的调控元件缺失，或至少一种突变导入pflD-基因；
E)pflA-基因或至少其部分缺失，pflA-基因或至少其部分的调控元件缺失，或至少一种突变导入pflA-基因；
F)ldhA-基因或至少其部分缺失，ldhA-基因或至少其部分的调控元件缺失，或至少一种突变导入ldhA-基因；
和
pflD-基因或至少其部分缺失，pflD-基因或至少其部分的调控元件缺失，或至少一种突变导入pflD-基因；
或
G)ldhA-基因或至少其部分缺失，ldhA-基因或至少其部分的调控元件缺失，或至少一种突变导入ldhA-基因；
和
pflA-基因或至少其部分缺失，pflA-基因或至少其部分的调控元件缺失，或至少一种突变导入pflA-基因。
用于本发明方法的遗传修饰的微生物的特别优选的实施方案为：
-Basfia属的修饰细菌细胞，优选物种产琥珀酸巴斯夫菌的修饰细菌细胞，最优选物种产琥珀酸巴斯夫菌菌株DD1的修饰细菌细胞，其中rbsK-基因过表达(优选在ackA-启动子控制下的附加型质粒上)，更优选其中fruA-基因失活(优选通过缺失fruA-基因或至少其部分)并且其中rbsK-基因过表达(优选在ackA-启动子控制的附加型质粒上)；
-Basfia属的修饰细菌细胞，优选物种产琥珀酸巴斯夫菌的修饰细菌细胞，最优选物种产琥珀酸巴斯夫菌菌株DD1的修饰细菌细胞，其中rbsK-基因过表达(优选在ackA-启动子控制下的附加型质粒上)，更优选其中fruA-基因失活(优选通过缺失fruA-基因或至少其部分)并且其中rbsK-基因过表达(优选在ackA-启动子控制下的附加型质粒上)，并且其中除这些遗传修饰外，乳酸脱氢酶的活性降低，优选通过ldhA-基因的修饰，特别是通过缺失具有根据SEQ ID NO：8的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO：9的氨基酸序列的LdhA的ldhA-基因来进行；
-Basfia属的修饰细菌细胞，优选物种产琥珀酸巴斯夫菌的修饰细菌细胞，最优选物种产琥珀酸巴斯夫菌菌株DD1的修饰细菌细胞，其中rbsK-基因过表达(优选在ackA启动子控制下的附加型质粒上)，更优选其中fruA-基因失活(优选通过缺失fruA-基因或至少其部分)并且其中rbsK-基因过表达(优选在ackA-启动子控制的附加型质粒上)，并且其中除这些遗传修饰外，丙酮酸甲酸裂解酶的活性降低，优选通过修饰pflA-基因或pflD-基因，特别是通过修饰具有根据SEQ ID NO：10的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列的PflA的pflA-基因，或通过修饰具有根据SEQ ID NO：12的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO：13的氨基酸序列的PflD的pflD-基因来进行；
-Basfia属的修饰细菌细胞，优选物种产琥珀酸巴斯夫菌的修饰细菌细胞，最优选物种产琥珀酸巴斯夫菌菌株DD1的修饰细菌细胞，其中rbsK-基因过表达(优选在ackA启动子控制下的附加型质粒上)，更优选其中fruA-基因失活(优选通过缺失fruA-基因或至少其部分)并且其中rbsK-基因过表达(优选在ackA-启动子控制下的附加型质粒上)，其中除这些遗传修饰外，乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂解酶的活性降低，优选通过修饰ldhA-基因和pflA-基因，特别是通过修饰具有根据SEQ ID NO：8的核酸序列并且编码具有根据SEQ IDNO：9的氨基酸序列的LdhA的ldhA-基因，或通过修饰具有根据SEQ ID NO：10的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO：11的氨基酸序列的PflA的pflA-基因，或通过修饰ldhA-基因和pflD-基因，特别是通过修饰具有根据SEQ ID NO：8的核酸序列并且编码具有根据SEQ IDNO：9的氨基酸序列的LdhA的ldhA-基因，或通过修饰具有根据SEQ ID NO：12的核酸序列并且编码具有根据SEQ ID NO：13的氨基酸序列的PflD的pflD-基因来进行。
在方法步骤I)中，将本发明的遗传修饰的微生物在包含蔗糖作为可同化碳源的培养基中培养以使得修饰的微生物产生有机化合物，从而获得包含有机化合物的发酵液。可以通过本发明方法产生的优选的有机化合物包括羧酸例如甲酸、乳酸、丙酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3-羟基丁酸、丙烯酸、丙酮酸或这些羧酸的盐，二羧酸例如丙二酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、戊二酸、衣康酸、己二酸或其盐，三羧酸例如柠檬酸或其盐，醇例如甲醇或乙醇，氨基酸例如L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-异亮氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酰胺，L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-丝氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸等。
根据本发明方法的一个优选实施方案，有机化合物是琥珀酸。如本发明上下文中所用，术语“琥珀酸”应当以其最广意义理解并且还涵盖其盐(即，琥珀酸盐)，例如碱金属盐，如Na+盐和K+盐，或碱土金属盐，如Mg2+盐和Ca2+盐，或琥珀酸的铵盐或酐。
优选在培养基中在约10℃至60℃或20℃至50℃或30℃至45℃范围的温度在5.0至9.0或5.5至8.0或6.0至7.0的pH温育本发明的遗传修饰的微生物。
优选有机化合物，特别是琥珀酸，在厌氧条件下产生。可以借助常规技术建立厌氧条件，例如通过使反应介质组分排气并且通过以例如0.1至1或0.2至0.5vvm流速导入二氧化碳或氮气或其混合物和任选的氢，维持厌氧条件。可以借助常规技术建立需氧条件，例如通过以例如0.1至1或0.2至0.5vvm流速引入空气或氧气。如果需要，可以在过程中应用0.1至1.5巴的略微较高压力。
可同化碳源优选为蔗糖。在上下文中，优选至少50wt.-％，优选至少75wt.-％，更优选至少90wt.-％，甚至更优选至少95wt.-％，并且最优选至少99wt.-％的可同化碳源为蔗糖，以可同化碳源的总重为基准，但不包括二氧化碳。
将可同化碳源的初始浓度、优选地将蔗糖的初始浓度调节至5至100g/L、优选5至75g/L并且更优选5至50g/L范围的值，并且可以在培养期间维持在所述范围内。反应介质的pH可以通过添加合适的碱控制，所述碱例如是氨气、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N和/或其混合物。如果发酵过程期间形成的有机化合物是羧酸或二羧酸，则特别需要这些碱性中和剂。在琥珀酸作为有机化合物的情况下，Mg(OH)2是特别优选的碱。
本发明的发酵步骤I)可以例如在搅拌式发酵罐、鼓泡塔和环流反应器中进行。可以在Chmiel:“Bioprozesstechnik:Einführung in die Bioverfahrenstechnik”,第1卷中找到可能方法类型的综述，包括搅拌器类型和几何设计。在本发明的方法中，可用的常见变通实施方案是本领域技术人员已知的或例如在Chmiel,Hammes and Bailey:“BiochemicalEngineering”中解释的以下变通实施方案，例如分批、补料分批、重复补料分批或另外伴随或不伴随生物质再循环的连续发酵。取决于生产菌株，可以用空气、氧气、二氧化碳、氢气、氮气或适宜气体混合物实现鼓泡以实现良好产率(YP/S)。
在方法步骤I)中用于生产有机酸、特别是琥珀酸的特别优选的条件为：
在方法步骤I)中进一步优选，可同化碳源、优选蔗糖，转化成有机化合物，优选转化成琥珀酸，其中碳产率YP/S为至少0.5g/g直至约1.18g/g；例如碳产率YP/S为至少0.6g/g、至少0.7g/g、至少0.75g/g、至少0.8g/g、至少0.85g/g、至少0.9g/g、至少0.95g/g、至少1.0g/g、至少1.05g/g或至少1.1g/g(有机化合物/碳，优选琥珀酸/碳)。
在方法步骤I)中进一步优选，可同化碳源、优选蔗糖，转化成有机化合物，优选转化成琥珀酸，其中比生产力产率(specific productivity yield)是至少0.6g g DCW-1h-1有机化合物，优选琥珀酸，或是至少0.65g g DCW-1h-1、0.7g g DCW-1h-1、至少0.75g g DCW- 1h-1或至少0.77g g DCW-1h-1有机化合物，优选琥珀酸。
在方法步骤I)中进一步优选，蔗糖转化成有机化合物，优选转化成琥珀酸，其中有机化合物、优选琥珀酸的空间时间产率是至少2.2g/(L×h)或至少2.5g/(L×h)、至少2.75g/(L×h)、至少3g/(L×h)、至少3.25g/(L×h)、至少3.5g/(L×h)、至少3.7g/(L×h)、至少4.0g/(L×h)、至少4.5g/(L×h)或至少5.0g/(L×h)有机化合物，优选琥珀酸。根据本发明方法的另一个优选实施方案，在方法步骤I)中，修饰的微生物将至少20g/L，更优选至少25g/L并且甚至更优选至少30g/L蔗糖转化成至少20g/L、更优选至少25g/L并且甚至更优选至少30g/L有机化合物、优选琥珀酸。
如本文所述的不同产率参数(“碳产率”或“YP/S”；“比生产力产率”；或“空间-时间-产率(STY)”)是本领域众所周知的并且例如由Song和Lee,2006所述那样测定。“碳产率”和“YP/S”(各自以产生的有机化合物的质量/消耗的可同化碳源的质量表述)在本文中作为同义词使用。比生产力产率描述每小时和每升发酵液每g生物质产生的产物(如琥珀酸)的量。称作“DCW”的干细胞重量的量描述了生物化学反应中生物活性微生物的量。该值作为每g DCW每h的g产物(即g g DCW-1h-1)给出。空间-时间-产率(STY)定义为在整个培养时间范围内考虑时在发酵过程中形成的有机化合物的总量与培养物体积的比。空间-时间-产率也称作“体积生产力”。
在方法步骤II)中，从方法步骤I)中获得的发酵液回收有机化合物、优选琥珀酸。
通常，回收方法包含下列步骤：将遗传修饰的微生物从发酵液中分离为所谓的“生物质”。用于取出生物质的方法是本领域技术人员已知的，并且包括过滤、沉积和浮集或其组合。因此，生物质可以用例如离心机、分离器、倾析器、滤器或在浮集装置中取出。为了最大限度回收有价值的产物，经常建议洗涤生物质，例如以渗滤形式洗涤。方法的选择取决于发酵液中的生物质含量和生物质的特性，并且还取决于生物质与有机化合物(即有价值产物)的相互作用。在一个实施方案中，可以将发酵液消毒或巴氏消毒。在进一步的实施方案中，浓缩发酵液。取决于要求，该浓缩可以分批或连续地进行。应当选择压力和温度范围，从而首先不出现产物受损，并且其次必须最少使用装置和能量。巧妙地选择用于多步蒸发的压力和温度水平特别能够节省能量。
回收过程还可以包含其中进一步纯化有机化合物、优选琥珀酸的另外的纯化步骤。然而，如果有机化合物通过如下文描述的化学反应转化成次级有机产物，则取决于反应类别和反应条件，不必然要求进一步纯化有机化合物。为了纯化方法步骤II)中获得的有机化合物，优选纯化琥珀酸，可以例如使用本领域技术人员已知的方法，例如结晶、过滤、电渗析和色谱。在琥珀酸作为有机化合物的情况下，例如，可以通过以下方式分离琥珀酸：通过使用氢氧化钙、氧化钙、碳酸钙或碳酸氢钙中和并且过滤沉淀物，将琥珀酸通过作为琥珀酸钙产物沉淀来分离。通过用硫酸酸化，随后过滤以移除沉淀的硫酸钙(石膏)，从沉淀的琥珀酸钙回收琥珀酸。所产生的溶液可以通过离子交换色谱进一步纯化以除去不想要的残余离子。可选择的是，如果氢氧化镁、碳酸镁或其混合物已经用来中和发酵液，则可以酸化方法步骤I)中获得的发酵液以转化培养基中所含的琥珀酸镁成为酸形式(即琥珀酸)，后者随后可以通过冷却酸化的培养基而结晶。其它适合的纯化过程的实例在EP-A-1 005 562、WO-A-2008/010373、WO-A-2011/082378、WO-A-2011/043443、WO-A-2005/030973、WO-A-2011/123268和WO-A-2011/064151和EP-A-2 360 137中公开。
根据本发明方法的优选实施方案，该方法还包含以下方法步骤：
I)通过至少一个化学反应，将方法步骤I)中获得的发酵液内所含的有机化合物转化成或将方法步骤II)中获得的回收有机化合物转化成与该有机化合物不同的次级有机产物。
在琥珀酸作为有机化合物的情况下，优选的次级有机产物选自琥珀酸酯及其聚合物、四氢呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮。
根据用于产生THF、BDO和/或GBL的优选实施方案，该方法包括：
b1)将方法步骤I)或II)中得到的琥珀酸直接催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL，或
b2)将方法步骤I)或II)中得到的琥珀酸和/或琥珀酸盐化学酯化成其相应的二低级烷基酯，随后将所述酯催化氢化成THF和/或BDO和/或GBL。
根据本发明产生吡咯烷酮的优选的实施方案，该方法包括：
b)以本身已知的方式，将方法步骤I)或II)中得到的琥珀酸铵盐化学转化成吡咯烷酮。
对于制备这些化合物的细节，参见US-A-2010/0159543和WO-A-2010/092155。
此外，对解决开始部分提到的问题的贡献进一步通过遗传修饰的微生物提供，所述遗传修饰的微生物包含：
A)与未经遗传修饰的原始微生物相比，至少一种导致rbsK-基因编码的酶的活性增加的遗传修饰，
其中原始微生物属于巴斯德菌科。
本发明遗传修饰的微生物的优选实施方案为上述描述为用于本发明方法的优选遗传修饰的微生物的那些实施方案。
对解决开始部分提到的问题的贡献进一步通过本发明的遗传修饰的微生物用于由蔗糖作为可同化碳源发酵产生有机化合物、优选琥珀酸的用途提供。优选的有机化合物和用于发酵生产有机化合物的优选条件为与本发明方法的方法步骤I)相关描述的那些化合物和条件。
现在借助于非限制性实施例更详细地解释本发明。
实施例
实施例1：缺失构建体的生成
如上所述通过标准技术进行载体和菌株构建(Becker等人Biotechnology andBioengineering,第110卷(2013),第3013-3023页)。全部构建的突变体如表1中所列：
| 菌株 |
| 野生型DD1(保藏号DSM 18541) |
| DD1 P<sub>ackA</sub>rbsK |
| DD1ΔfruAP<sub>ackA</sub>rbsK |
表1：实施例中涉及的DD1-野生型和突变体的命名
用于菌株构建和验证的具体的引物序列如表2所示：
表2：用于实施例的测序的引物
编码果糖PTS的fruA的Marker自由缺失使用整合型载体pClikCM(Becker等人，Metabolic Engineering,第13卷(2011),第59-168页)和引物PRfruA1-PRfruA4(表2)。将fruA-缺失片段通过限制位点XbaI和XhoI连接入载体pClik int sacB(Kind等人MetabolicEngineering,第12卷(2010),第341–351页)。通过PCR验证基因组中的fruA的期望的消除。通过质粒pSacB_delta_fruA制备ΔfruA Basfia-菌株也公开在WO 2015/118051 A1中。
为了过表达果糖激酶(rbsK)，使用附加型质粒pJFF224(Frey,Res.Microbiol.第143卷(3)(1992),第263-9.1992页)。在编码醋酸激酶的ackA启动子控制下表达该基因。对于启动子和基因的无缝融合，应用重叠延伸PCR。为了这一目的，首先分别使用引物组合PRrbsK1/PRrbsK2和PRrbsK3/PRrbsK4扩增ackA-启动子和rbsK-基因。然后使得到的PCR片段与1520bp-大小的具有PRrbsK1/PRrbsK4的启动子基因构建体融合。使用InFusion试剂盒(Clontech Laboratories,Mountain View,CA,USA)将PackArbsK构建体亚克隆入XbaI和XhoI消化的载体pJFF224，并且产生质粒pJFF224_PackArbsK。通过电穿孔用pJFF224和pJFF224_PackArbsK转化产琥珀酸巴斯夫菌(B.succiniciproducens)(Becker等人,2011)。通过PCR和酶活性研究分析得到的突变体(表1)。通常使用校正读码聚合酶进行PCR(Phusion高保真度PCR试剂盒,Thermo Fisher Scientific,Schwerte,Germany)。
实施例2：DD1、DD1 PackArbsK和DD1ΔfruAPackArbsK在蔗糖上的培养
将DD1-菌株的生产力与突变株DD1 PackArbsK和DD1ΔfruAPackArbsK在蔗糖作为碳源存在下的生产力进行比较。利用下述培养基和温育条件分析生产力。
1.培养基制备
为了进行生理学研究和琥珀酸生产，在复合培养基中进行产琥珀酸巴斯夫菌的第一预培养，该培养基每升包含：50g蔗糖，5g酵母提取物(Becton Dickinson,FranklinLakes,NJ,US)，5g细菌蛋白胨144(Becton Dickinson)，1g NaCl，0.2g MgCl2·6H2O，0.2gCaCl2·2H2O，3g K2HPO4，1g(NH4)2SO4和50g MgCO3。为了进行第二预培养和主要培养，使用基本培养基，其每升包含：50g蔗糖，1g NaCl，0.2g MgCl2·6H2O，0.2g CaCl2·2H2O，3gK2HPO4，5g(NH4)2SO4，3mg硫胺·HCl，0.6mg核黄素，3mg烟酸，10mg泛酸Ca，1mg吡哆醛·HCl，0.5mg生物素，0.05mg氰钴胺和50gMgCO3。将二氧化碳以0.8巴超压力施加于培养瓶(血清烧瓶)。为了培养包含质粒的菌株，加入氯霉素至培养基，终浓度为50μg mL-1。
为了进行酶测定，使细胞生长在基本培养基中，其每升包含：50g蔗糖，1g NaCl，0.2g MgCl2·6H2O，0.2g CaCl2·2H2O，3g K2HPO4，5g(NH4)2SO4，3mg硫胺·HCl，0.6mg核黄素，3mg烟酸，10mg泛酸Ca，1mg吡哆醛·HCl，0.5mg生物素和0.05mg氰钴胺，并且自动添加1MNa2CO3用于pH控制。
2.培养
为了在血清烧瓶中厌氧培养，在30mL血清瓶中进行培养，该血清瓶配备用于采样的丁基橡胶塞，并且填充10mL培养基，在0.8巴超压力的CO2气氛中。自冷冻储备物接种后，将第一预培养物在37℃和130rpm下在定轨振荡器上温育8小时。在指数生长期间，通过离心收获细胞(3分钟，16,000×g，16℃)，用1mL培养基洗涤，并且用于接种第二预培养物至初始光密度(OD600)为0.3。10小时温育后，收获呈指数生长的细胞并且如上所述洗涤，然后用于接种主培养物至初始OD600为0.08。
3.分析
通过HPLC分析琥珀酸。测定粗的不含细胞的提取物中的酶活性。为了制备粗的不含细胞的提取物，通过离心收获细胞(5分钟，5,000×g，4℃)，用100mM Tris·HCl(0.75mM二硫苏糖醇，pH 7.8)洗涤，重新混悬于相同缓冲液至浓度为0.33(g细胞湿重)mL-1，然后用台式匀化器破碎(Precellys 24,Peqlab,VWR International GmbH,Darmstadt,Germany)。在37℃通过分光光度法(Spectronic Helios,Thermo Electron Corporation,Waltham,Massachusetts,255USA)对酶活性进行定量。如Helanto等人2006)所述测定100mM Tris·HCl(pH 7.8，10mM MgCl2)、1U mL-1葡萄糖6-磷酸脱氢酶、2U mL-1葡糖磷酸异构酶、1mM NADP+和不同浓度的ATP(0-5mM)和果糖(0-25mM)中的果糖激酶，以便确定动力学参数。
4.结果
用于测定菌株DD1、DD1 PackArbsK和DD1 ΔfruAPackArbsK中果糖激酶活性的酶测定结果如表3中所示：
| 菌株 | 比活性[mU/mg] |
| DD1 | 67±3 |
| DD1 P<sub>ackA</sub>rbsK | 200±3 |
| DD1ΔfruAP<sub>ackA</sub>rbsK | 154±3 |
表3：果糖激酶比活性
表4显示当在分批法中培养细胞时由蔗糖作为唯一碳源形成琥珀酸：
| 菌株 | 摩尔琥珀酸/摩尔蔗糖 |
| DD1 | 1.01±0.01 |
| DD1 P<sub>ackA</sub>rbSK | 1.42±0.01 |
| DD1ΔfruAP<sub>ackA</sub>rbsK | 1.97±0.02 |
序列
SEQ ID NO：1(菌株DD1的16S rDNA的核苷酸序列)
SEQ ID NO：2(菌株DD1的23S rDNA的核苷酸序列)
SEQ ID NO：3(来自菌株DD1的rbsK-基因的核苷酸序列)
SEQ ID NO：4(来自菌株DD1的RbsK的氨基酸序列)
SEQ ID NO：5(来自菌株DD1的fruA-基因的核苷酸序列)
SEQ ID NO：6(来自菌株DD1的FruA的氨基酸序列)
SEQ ID NO：7(来自菌株DD1的ackA-启动子的核苷酸序列)
SEQ ID NO：8(来自菌株DD1的ldhA-基因的核苷酸序列)
SEQ ID NO：9(来自菌株DD1的LdhA的氨基酸序列)
SEQ ID NO：10(来自菌株DD1的pflA-基因的核苷酸序列)
SEQ ID NO：11(来自菌株DD1的PflA的氨基酸序列)
SEQ ID NO：12(来自菌株DD1的pflD-基因的核苷酸序列)
SEQ ID NO：13(来自菌株DD1的PflD氨基酸)
SEQ ID NO：14(引物PRfruA1的核苷酸序列)
SEQ ID NO：15(引物PRfruA2的核苷酸序列)
SEQ ID NO：16(引物PRfruA3的核苷酸序列)
SEQ ID NO：17(引物PRfruA4的核苷酸序列)
SEQ ID NO：18(引物PRrbsK1的核苷酸序列)
SEQ ID NO：19(引物PRrbsK2的核苷酸序列)
SEQ ID NO：20(引物PRrbsK3的核苷酸序列)
SEQ ID NO：21(引物PRrbsK4的核苷酸序列)
SEQ ID NO：22(质粒pJFF224_PackArbsK的核苷酸序列)
SEQ ID NO：23(质粒pClikCMΔfruA的核苷酸序列)
PCT/RO/134表
Claims (15)
1.生产有机化合物的方法，该方法包括：
I)在包含蔗糖作为可同化碳源的培养基中培养遗传修饰的微生物，以使得遗传修饰的微生物产生有机化合物；
II)从方法步骤I)中得到的发酵液中回收有机化合物，
其中遗传修饰的微生物包含：
C)与未经遗传修饰的原始微生物相比，导致由rbsK-基因编码的酶活性增加的至少一种遗传修饰，
并且其中原始微生物属于巴斯德菌科。
2.根据权利要求1的方法，其中有机化合物为琥珀酸。
3.根据权利要求1或2的方法，其中原始微生物属于Basfia属。
4.根据权利要求3的方法，其中原始微生物属于物种产琥珀酸巴斯夫菌。
5.根据权利要求4的方法，其中原始微生物为作为保藏号DSM 18541保藏在德国DSMZ的产琥珀酸巴斯夫菌菌株DD1。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中rbsK-基因包含选自如下的核酸：
a1)具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的核酸；
b1)编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列的核酸；
c1)与a1)或b1)的核酸具有至少70％同一性的核酸，该同一性为a1)或b1)的核酸总长度的同一性；
d1)编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列与a1)或b1)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％的同一性，该同一性为a1)或b1)的核酸编码的氨基酸序列总长度的同一性；
e1)在严格条件下能够与a1)或b1)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
f1)与a1)或b1)的任意核酸编码相同的蛋白质、但由于遗传密码的简并性而与上述a1)或b1)的核酸不同的核酸。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中至少一种遗传修饰A)包括rbsK-基因的修饰、rbsK-基因的调控元件的修饰或它们两者的组合。
8.根据权利要求7的方法，其中至少一种遗传修饰A)包括rbsK-基因的过表达修饰。
9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中遗传修饰的微生物还包含：
D)与未经遗传修饰的原始微生物相比，导致由fruA-基因编码的酶活性降低的至少一种遗传修饰。
10.根据权利要求9的方法，其中fruA-基因包含选自如下的核酸：
a2)具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的核酸；
b2)编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列的核酸；
c2)与a2)或b2)的核酸具有至少70％同一性的核酸，该同一性为a2)或b2)的核酸总长度的同一性；
d2)编码氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列与a2)或b2)的核酸编码的氨基酸序列具有至少70％的同一性，该同一性为a2)或b2)的核酸编码的氨基酸序列总长度的同一性；
e2)在严格条件下能够与a2)或b2)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
f2)与a2)或b2)的任意核酸编码相同的蛋白质、但由于遗传密码的简并性而与上述a2)或b2)的核酸不同的核酸。
11.根据权利要求10的方法，其中至少一种遗传修饰B)包括fruA-基因的修饰、fruA-基因的调控元件的修饰或它们两者的组合。
12.根据权利要求11的方法，其中至少一种修饰B)包含fruA-基因的失活。
13.遗传修饰的微生物，其包含：
A)与未经遗传修饰的原始微生物相比，导致由rbsK-基因编码的酶活性增加的至少一种遗传修饰，
其中原始微生物属于巴斯德菌科。
14.根据权利要求13的遗传修饰的微生物，其中遗传修饰如权利要求7-12任一项中所定义。
15.根据权利要求13或14的遗传修饰的微生物在由蔗糖作为可同化碳源发酵生产有机化合物中的用途。
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