CN101970648A

CN101970648A - 具有使用蔗糖作为碳源能力的重组微生物

Info

Publication number: CN101970648A
Application number: CN2008801267807A
Authority: CN
Inventors: 李相烨; 李政旭; 宋孝鹤; 金知满; 崔松; 朴真焕
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date: 2007-12-18
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2011-02-09
Also published as: EP2227541A2; EP2227541B1; WO2009078687A2; WO2009078687A3; EP2227541A4; US20130078673A1; JP2011505869A; AU2008339217A1; US20110269183A1; BRPI0819509A2; ES2424240T3

Abstract

本发明涉及一种能够代谢蔗糖的重组微生物，更具体地涉及一种其中导入了编码蔗糖磷酸转移酶的基因和/或编码蔗糖-6-磷酸水解酶的基因的能够代谢蔗糖的重组微生物，或者是一种其中导入了编码β-呋喃果糖苷酶的基因的能够代谢蔗糖的重组微生物。根据本发明提供了一种能够利用廉价的蔗糖作为碳源代替昂贵的葡萄糖的重组微生物。另外，在原先不能利用蔗糖作为一种碳源的微生物培养过程中，蔗糖能够代替其他碳源包括葡萄糖。

Description

具有使用蔗糖作为碳源能力的重组微生物

技术领域

本发明涉及一种能够代谢蔗糖的重组微生微，尤其涉及一种其中引入了编码蔗糖磷酸转移酶的基因和/或编码蔗糖-6-磷酸水解酶的基因的能够代谢蔗糖的重组微生物或者其中引入了编码β-呋喃果糖苷酶的基因的能够代谢蔗糖的重组微生物。

背景技术

为了人类的可持续发展，人们正以极大的兴趣积极地进行用于从可再生生物资源生产有用化合物的工业生物技术发展的研究。迄今为止进行的利用微生物发酵的化学物质的生产都是以葡萄糖作为主要原料的。然而，利用微生物发酵的化学产品的生产难以商业化，因为葡萄糖价格昂贵且从而利用微生物发酵生产的化合物的价格高于以原油为主要原料通过化学合成生产的化合物。因此，为发展使用昂贵的葡萄糖作为碳源的替代方法，人们正在积极地进行能够从充足的生物资源获得的各种廉价碳源的探索的研究。例如，包括本发明发明人的多数研究者正在进行使用相对廉价的原料如木质纤维素水解物、甘油、乳清、玉米浆液或类似物的各种主要代谢物的生产的研究(Samuelov等，Appl.Environ.Microbiol.，65：2260，1999；Lee等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54：23，2000；Lee等人，Biotechnol.Bioeng.，72：41，2001；Lee等，Biotechnol.Lett.，25：111，2003；Lee等，Bioproc.Biosystems Eng.，26：63，2003)。但是，根据目前为止所公布的研究结果表明，当使用所述原料替代葡萄糖作为碳源时，与使用葡萄糖作为碳源时相比所需的代谢产物的生产率或产量显著地低。因此，迫切地需要进行研究和发展来克服这个缺点。

蔗糖(俗称糖)是一种有葡萄糖和果糖组成的双糖，而它是自然界中非常充足且能够从所有具有光合作用能力的植物所生产的碳源。特别是甘蔗和甜菜含有大量的蔗糖，且世界上60％以上的蔗糖正在由甘蔗产生。特别是蔗糖生产的成本非常低，因为其能够通过对机械压榨甘蔗的提取物进行蒸发/浓缩的简单工艺而工业化生产。Koutinas等人在2004年基于葡萄糖的含量，对可用于化学物质的微生物生产的各种原料的价格进行了计算。结果，基于1Kg葡萄糖含量的蔗糖的价格为26.1美分，这是非常低廉的价格，相当于小麦价格的77％、糖蜜价格的50％、蔗糖价格的28.9％(Koutinas等人，Ind.Crops和Products，20：75，2004)。

关于国际糖协定的每日价格的报告表明蔗糖的价格在1994-1995年达到顶峰之后由于供给过剩而处于稳步下降的趋势且这种下降趋势预计将继续下去。因此，蔗糖作为代替昂贵的葡萄糖的最有效的碳源而备受瞩目，葡萄糖目前通过微生物发酵来生产各种化学物质。尤其是，本领域技术人员公知将葡萄糖的生产成本降低到蔗糖的水平是非常困难的，因为葡萄糖主要从玉米淀粉中生产，其通过非常复杂的工艺，包括从玉米中提取淀粉、热/化学预处理淀粉、通过酶反应将淀粉转化为葡萄糖、和纯化葡萄糖，而且玉米的价格不断在上升。基于这些原因，在美国以玉米为原料的生物乙醇的生产逐渐减少(Mae-Wan Ho，Science in Society，33：40，2007)，但在巴西以甘蔗(即蔗糖)为原料的生物乙醇的生产快速增长。

迄今为止，对以蔗糖为碳源的有用化合物生产的研究，通过有关可生物降解聚合物(Lee等人，Biotechnol.Lett.，15：971，1993；Lee等人，Biotechnol.Techniques，1：59，1997)、柠檬酸(Forster等人，App.Microbiol.Biotechnol.，75：1409，2007)、丙酮、丁醇、乙醇和异丙醇(George等人，Appl.Environ.Microbiol.，45：1160，1983；Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49：639，1998)、衣康酸(Kautola等人.，Biotechnol.Lett.，11：313，1989)、黄原胶(Letisse等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，55：417，2001)等的高浓度细胞培养而进行。特别是，分析国际生物能源和生物燃料贸易的国际能源机构(IEA)生物能源第40项任务的报告(2006)评估认为，巴西的从甘蔗生产生物乙醇是环境友好型且可持续发展的生物燃料生产的典范。

以蔗糖作为原料通过微生物发酵生产的化合物价格低廉且起到保护细胞膜远离含有大量所需代谢物的外部环境，因此产生高浓度的所需代谢物。Kilimann等人将微生物在致死温度下暴露于含有蔗糖和不含蔗糖的培养基中然后检测它们的活性和蛋白质的二级结构(Biochimica et Biophysica Acta，1764，2006)。

研究结果显示暴露在含有蔗糖的培养基中的微生物细胞中的蛋白质的二级结构保存良好，但是暴露在含有蔗糖的培养基中的微生物细胞中的蛋白质的二级结构具有较大的改变。特别是，暴露在含有蔗糖的培养基中的微生物的活性显著高于暴露在不含蔗糖的培养基中的微生物。这直接证明了蔗糖具有保护微生物远离有害的外部环境的作用。

尽管蔗糖是具有上述包括价格低廉且具有保护微生物远离有害的外部环境的作用等优点的优良的原料，一个例子显示了以蔗糖作为碳源成功生产所需化合物的过程，而他们的商业应用则仍没有报道。这是因为大量的微生物没有将蔗糖输送到细胞内、将输送到的蔗糖降解并将降解产物连接到糖酵解的完善机制，因此不能使用蔗糖作为碳源。即使在具有能够使用蔗糖的机制的微生物中，他们也不能有效地生产所需的代谢产物，因为以蔗糖为碳源的摄取率和降解率很低。

为了以产业经济的方式进行利用微生物发酵生产各种化合物，需要利用廉价原料如上面描述的蔗糖。此外，需要识别能够高效率有效摄取和降解以蔗糖为碳源的酶和能够使用上述酶的研发技术。特别是，鉴于事实上通过微生物发酵生产的化合物中，原料价格占去最终产物价格的50％，所以迫切需要识别能够有效利用蔗糖作为廉价原料的酶且发展所述酶的应用。

已经有报道，蔗糖通过高浓度细胞培养可用于生产各种生物制品，其包括可生物降解聚合物、柠檬酸、衣康酸、丙酮、丁醇、乙醇、异丙醇和黄原胶。然而，通过微生物发酵成功生产所需化合物和它们的实际上商业应用的例子很少有报道。

因此，为了使通过微生物发酵生产各种化合物作为一项环境友好型技术成功地在工业中应用，需要能够有效地摄入和降解如蔗糖的廉价和充足的碳源的微生物的发展。

发明内容

因此本发明的一个目的在于提供能够以蔗糖作为碳源的新的蔗糖代谢相关基因，以及由所述基因编码的酶。

本发明的另一目的在于提供一种其中导入了蔗糖代谢相关基因的能够代谢蔗糖的重组微生物，以及使用所述微生物生产代谢产物、可生物降解聚合物或重组蛋白质的方法。

为了达到上述目的本发明提供具有序列号：1的氨基酸序列的蔗糖磷酸转移酶、编码所述蔗糖磷酸转移酶的基因(ptsG)以及含有所述ptsG基因和编码蔗糖-6-磷酸水解酶的基因(sacC)的重组载体。

本发明还提供能够代谢蔗糖的一种重组微生物，其中所述基因导入到选自下组中的宿主细胞，所述组由细菌、酵母和真菌组成；以及生产代谢产物、可生物降解聚合物或重组蛋白质的方法，所述方法包括在含有以蔗糖作为碳源的培养基中培养所述重组微生物。

本发明还提供一种β-呋喃果糖苷酶，其具有将β-D-呋喃果糖苷键水解以释放果糖的活性；以及编码所述β-呋喃果糖苷酶的基因。

本发明还提供一种能够代谢蔗糖的重组微生物，其中所述基因导入到选自下组的宿主细胞，所述组由细菌、酵母和真菌组成；以及生产代谢产物、可生物降解聚合物或重组蛋白质的方法，所述方法包括在含有以蔗糖作为碳源的培养基中培养所述重组微生物。

本发明的其他特征和方面通过以下详细说明和附属的权利要求将更加明确。

附图说明

图1是源自M.succiniciproducens MBEL55E的新的能够代谢蔗糖的代谢相关酶(蔗糖磷酸转移酶、蔗糖-6-磷酸水解酶和果糖激酶)导入到不能代谢蔗糖的微生物中时，蔗糖被摄取和降解以及所述降解产物通过糖酵解代谢的途径的示意图。粗箭头(→)表示引入源自M.succiniciproducens MBEL55E的新的代谢相关酶所参与的代谢途径；以及细箭头(→)表示重组微生物原来的代谢途径。

图2是当所述酶导入到不能代谢蔗糖的微生物中时，源自M.succiniciproducens MBEL55E的新的能够代谢蔗糖的β-呋喃果糖苷酶参与蔗糖代谢的4个可能的途径的示意图。粗箭头(→)表示源自M.succiniciproducens MBEL55E的新的β-呋喃果糖苷酶将参与的4个可能的途径；以及细箭头(→)表示重组基因原来的代谢途径。

图3是含有编码蔗糖磷酸转移酶、蔗糖-6-磷酸水解酶和果糖激酶的基因(ptsG、sacC和rbsK)的重组载体pMSscrIIA的图谱。

图4是亲本MBEL55E、重组MptsG菌株和重组MsacC菌株在蔗糖培养基中生长的图表(●：MBEL55E；▲：MptsG；和△：MsacC)。

图5是重组载体pTac15K的酶切图谱。

图6是含有编码蔗糖-6-磷酸水解酶基因的重组载体pTac15K的酶切图谱。

图7是重组大肠杆菌W3110pTac15K在含有蔗糖的M9培养基中生长的图表(含●的实线：蔗糖浓度；含◆的实线：OD₆₀₀)。

图8是具有代谢蔗糖的能力的本发明重组大肠杆菌W3110pTac15K在含有蔗糖的M9培养基中生长的图表(含●的实线：蔗糖浓度；含◆的实线：OD₆₀₀；含有●点线：葡萄糖的浓度；含有

的点线：醋酸的浓度)。

图9是大肠杆菌W3110pTac15KEWcscA和大肠杆菌W3110pTac15KBSsacA在含有蔗糖的M9培养基中生长的图表(含●的实线：大肠杆菌W3110pTac15KEWcscA；和含▲的实线：大肠杆菌W3110pTac15KBSsacA)。

图10是本发明的在厌氧条件下发酵，能够代谢蔗糖的大肠杆菌W3110pTac15KsacC的生长和代谢产物的图表(含有●的实线：蔗糖浓度；含有△的实线：OD₆₀₀；含有

的实线：葡萄糖浓度；含有■的实线：果糖浓度；含有●的点线：琥珀酸浓度；含有

的虚线：乳酸；含有■的虚线：甲酸浓度；含有◇的点线：醋酸浓度；和含有▲的点线：乙醇浓度)。

具体实施方式

本发明的目的在于以蔗糖(俗称糖)作为廉价且充足的碳源制备生物制品，特别是发现了能够使用蔗糖作为碳源的微生物或者使不能使用蔗糖作为碳源的微生物变为能够使用蔗糖的酶，另外目的是使用所述酶生产生物制品。

蔗糖是由葡萄糖和果糖组成的双糖，是全球丰富的碳源。它由具有光和作用的大多数植物产生，特别是，甘蔗和甜菜是含有大量蔗糖的热带和亚热带植物。蔗糖可以通过对机械压榨甘蔗的提取物进行蒸发/浓缩的简单工艺而工业化生产，且目前全球60％以上的蔗糖由甘蔗产生。根据Koutinas等人的论文(2004年出版)，他们基于葡萄糖含量计算了可用于微生物发酵的各种原料的价格，基于1Kg葡萄糖的蔗糖的价格为26.1美分，这是葡萄糖价格的1/4和小麦和糖蜜价格的1/2到2/3(Koutinas等人，Ind.Crops和Products，20：75，2004)。此外，有关近15年来国际糖协定的公布的蔗糖价格变动，蔗糖价格在1995年达到13.28美分/磅的顶峰之后下降到1999年的6.27美分/磅，在2008年3月再次上升到14.20美分/磅且维持在2008年5月7号的12.44美分/磅的水平，而且由于供给过剩蔗糖的价格预计将有下降趋势。除了成本这方面的优势，蔗糖的优点还在于即使在食物危机的情况下，例如最近的粮食危机，其也能够稳定地供给，因为它不是从粮食中获得。

迄今为止，已经有报道称蔗糖可通过高浓度细胞培养用于生产各种生物制品，包括可生物降解聚合物、柠檬酸、衣康酸、丙酮、丁酮、乙醇、异丙醇和黄原胶(Lee等人，Biotechnol.Lett.，15：971，1993；Lee等人，Biotechnol.Techniques，1：59，1997；Forster等人，App.Microbiol.Biotechnol.，75：1409，2007；George等人，Appl.Environ.Microbiol.，45：1160，1983；Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49：639，1998；Kautola等人，Biotechnol.Lett.，11：313，1989；Letisse等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，55：417，2001)。这表明蔗糖应用的发展直接影响生物制品的有效生产。

然而，尽管蔗糖具有各种优点，包括作为原料、起到防止蛋白质被修饰的作用和起到保护细胞远离外部环境的作用(Kilimann等人，Biochimica et Biophysica Acta，1764，2006)，许多例子显示了以蔗糖作为碳源通过微生物发酵成功生产所需化合物的过程，而它们的实际商业应用却鲜有报道。原因之一是，大量的微生物不能有效生产所需的生物制品，因为所述微生物不具有代谢蔗糖的机制或者即使具有这种机制，其代谢率也很低。因此，为了通过作为环境友好型技术的微生物发酵生产各种化合物能够成功地在工业上应用，需要发展能够有效地摄取和降解廉价且充足的碳源如蔗糖的微生物。为此，需要识别能够高效降解和代谢的酶以及应用所述酶。

到目前为止，一些研究人员已经开发出能够利用蔗糖的酶组。典型例子的包括Ajinomoto公司的工艺，其中大肠杆菌来源的PTS(磷酸烯醇丙酮酸依赖型磷酸系统)和非PTS蔗糖运输系统被导入并用于生产氨基酸。这项工艺的特征在于，导入了与PTS或非PTS相关的整个基因组而完成发明。

但是，在本发明中，基于Mannheimia succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)的遗传信息，发现了编码酶(蔗糖磷酸转移酶(PtsG，MS0784)、蔗糖-6-磷酸水解酶(SacC，MS0909)和果糖激酶(RbsK，MS1233))的新基因(ptsG，sacC和rbsK)，其涉及将蔗糖输送到细胞内，降解输送的蔗糖且将降解产物连接到糖酵解；并确定其序列和功能。

因此，一方面本发明涉及到具有序列号：1氨基酸序列的蔗糖磷酸转移酶、具有序列：3氨基酸序列的蔗糖-6-磷酸水解酶和具有序列号：5氨基酸序列的酸果糖激酶，他们是参与将蔗糖输送到细胞内、降解转送的蔗糖且将降解产物连接到糖酵解的酶。本发明还涉及一种编码所述蔗糖磷酸转移酶的基因(ptsG)、一种编码所述蔗糖-6-磷酸水解酶的基因(sacC)以及一种编码所述果糖激酶的基因(rbsK)。

在本发明中，所述蔗糖磷酸转移酶(PtsG)起到将蔗糖输送到细胞内同时将蔗糖转化为蔗糖-6-磷酸的作用，蔗糖-6-磷酸水解酶(SacC)具有将蔗糖-6-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸和果糖的活性，且果糖激酶(RbsK)具有将果糖转化为果糖-6-磷酸的活性。

在本发明中，ptsG优选由序列号：2的碱基序列表示，sacC优选由序列号：4的碱基序列表示，且rbsK优选由序列号：6的碱基序列表示。

特别是在本发明中构建了含有ptsG和sacC基因的重组载体，然后导入到不能使用蔗糖作为碳源的大肠杆菌中，并将所述构建的重组大肠杆菌在含蔗糖作为唯一的碳源的培养基中培养。结果，发现所述重组大肠杆菌具有了代谢蔗糖的能力。

因此，如图1所示，可以推断蔗糖被蔗糖磷酸转移酶(PtsG)输送到细胞内同时被转化为蔗糖-6-磷酸，输送到细胞内的所述蔗糖-6-磷酸被所述蔗糖-6-磷酸水解酶(SacC)转化为葡萄糖-6-磷酸和果糖，所述果糖被果糖激酶(RbsK)转化为果糖-6-磷酸，然后所述降解产物连接到糖酵解。

同时，本发明的发明人示出了通过导入了蔗糖-6-磷酸水解酶(SacC，MS0909)与其他编码β-呋喃果糖苷酶的新基因(cscA和sacA)，不能代谢蔗糖的微生物能够代谢蔗糖，所述蔗糖-6-磷酸水解酶是源自Mannheimia succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)的β-呋喃果糖苷酶，并示出了利用微生物菌株生产各种代谢产物的实例，从而完成了本发明。换言之，基于Mannheimia succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)，大肠杆菌W和枯草芽孢杆菌的遗传信息，发现了编码涉及将蔗糖降解和将降解产物连接到糖酵解的β-呋喃果糖苷酶的新基因(sacC，cscA和sacA)，并确定这些基因的序列和功能。国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会提供的EC编码(酶学委员会编码)(http://www.iubmb.org/)是一个众所周知的数值分类体系，其根据酶催化的化学反应进行分类。

蔗糖-6-磷酸水解酶的正式名称为β-呋喃果糖苷酶(EC 3.2.1.26)且还具有其他名字，包括β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶(β-D-fructofuranoside fructohydrolase)、转化酶(invertase)、蔗糖酶(saccharase)、葡聚糖蔗糖酶(glucansucrase)、β-h-果糖苷酶(β-h-fructosidase)、β-果糖苷酶(β-fructosidase)、转化酵素(invertin)、蔗糖酶(sucrase)、蔗糖转化酶(maxinvert)L 1000、果糖转化酶(fructosylinvertase)、碱性转化酶(alkaline invertase)、酸性转化酶(acid invertase)(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/26.html)。也就是说蔗糖-6-磷酸水解酶和蔗糖酶都具有正式名称β-呋喃果糖苷酶(EC 3.2.1.26)。

这种β-呋喃果糖苷酶催化在β-D-呋喃果糖苷中的的非还原β-D-呋喃果糖苷残基末端的水解反应。当其催化蔗糖水解时具有正式名称“蔗糖酶或转化酶”，且当他催化蔗糖-6-磷酸水解时具有正式名称“蔗糖-6-磷酸水解酶”。

在本发明的实施例中，除了证明导入源自Mannheimia的蔗糖-6-磷酸水解酶(EC 3.2.1.26，SacC)，即，β-呋喃果糖苷酶引起的蔗糖代谢能力外，还努力证明了将一般的β-呋喃果糖苷酶导入到微生物中赋予了微生物蔗糖代谢能力。结果，当分别将来自大肠杆菌W的转化酶(invertase)(EC3.2.1.26，CscA)和来自枯草芽孢杆菌的β-呋喃果糖苷酶导入到不能代谢蔗糖的微生物中时，观察到导入了β-呋喃果糖苷酶(EC 3.2.1.26)的微生物通过代谢蔗糖而生长。

因此，在另一方面，本发明涉及β-呋喃果糖苷酶，其具有将β-D-呋喃果糖苷键水解释放果糖的活性，包括将蔗糖水解为葡萄糖和果糖的活性和将蔗糖-6-磷酸水解为葡萄糖-6-磷酸和果糖的活性。且，β-呋喃果糖苷酶具有从下组中选择的氨基酸序列，该组包括序列号：3，序列号：7和序列号：9的氨基酸序列，但是本发明的范围不限于此。

特别是，在本发明中，作为β-呋喃果糖苷酶的一个实例蔗糖-6-磷酸水解酶(SacC)具有将蔗糖-6-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸和果糖的活性或者将蔗糖转化为葡萄糖和果糖的活性。同样，在本发明的实施例中，使用了源自Mannheimia的β-呋喃果糖苷酶，但是源自其他微生物的这些酶也落入本发明的范围内且可具有序列号：3的氨基酸序列，编码所述β-呋喃果糖苷酶的基因(sacC)优选由序列号：4的碱基序列表示。

在本发明中作为β-呋喃果糖苷酶例子的转化酶(invertase)、蔗糖酶(sucrase)和蔗糖水解酶(sucrose hydrolase)(CscA)都与降解蔗糖和将降解产物连接到糖酵解有关的酶，且这些酶具有将蔗糖-6-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸和果糖的活性或者将蔗糖转化为葡萄糖和果糖的活性。此外，在本发明的实施例中，举例说明了来自大肠杆菌的β-呋喃果糖苷酶，但是从其他微生物中获得的也落入本发明的保护范围内且可具序列号：7的氨基酸序列，编码所述酶的基因(cscA)优选由序列号：8的碱基序列表示。

在本发明中，作为β-呋喃果糖苷酶的一个例子的蔗糖-6-磷酸水解酶(SacA)是与降解蔗糖和将降解产物连接到糖酵解有关的酶，且具有将蔗糖-6-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸和果糖的活性或者将蔗糖转化为葡萄糖和果糖的活性。在本发明的一实施例中，举例说明了来自枯草芽孢杆菌的β-呋喃果糖苷酶，但是来自其他微生物的酶也落入本发明的保护范围内且可具有序列号：9的氨基酸序列，而且编码所述酶的基因(sacA)优选由序列号：10(sacA，BSU38040，蔗糖-6-磷酸水解酶)的碱基序列表示。

此外，当由sacC基因编码的来自Mannheimia的β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列与通过蛋白质BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索到的氨基酸序列比较时，与来自大肠杆菌W来源的cscA编码的转化酶具有28％的氨基酸序列同源性，且与来自由枯草芽孢杆菌来源的sacA编码的蔗糖-6-磷酸水解酶具有35％的氨基酸序列同源性。同样，源自所述两种菌株的β-呋喃果糖苷酶都具有指定为“SacC”的保守区域区域β-果糖苷酶(β-fructosidase)(COG1621)。这表明，将与sacC基因编码的来自Mannheimia的氨基酸序列有些不同但是含有指定为“SacC”的保守区域β-果糖苷酶(β-fructosidase)的任何酶导入到下述的微生物中，所述微生物能够代谢蔗糖而生长。因此，通过序列号：3、7或9的氨基酸序列举例说明了β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列，但本发明的保护范围并不限于此。也就是说，所有β-呋喃果糖苷酶可包含在本发明的范围之内，只要他们具有将β-D-呋喃果糖苷键水解释放果糖的活性。例如，与序列号：3、7或9具有至少70％、80％或90％的氨基酸序列同源性的氨基酸序列同样可包含在本发明范围之内。

同样，编码β-呋喃果糖苷酶的基因可具有，例如序列号：4、8或10的碱基序列。DNA包括这些序列中的一个或多个碱基的一种变异(替代、缺失、插入或增加)且与根据本发明的碱基序列比较具有至少70％或80％的序列同源性，优选90％，更优选95％。

这里所用的术语“序列同源性”是指两个多聚核苷酸或两个核酸分子之间的序列相似性。所述序列同源性可通过比较窗口(comparison window)比较两个最佳对准序列来确定，其中在比较窗口中的多聚核苷酸或氨基酸序列的片段与参考序列(例如一致序列)比较可包括增加或缺失(例如缺口或外伸)。序列同源性的百分比可通过计算两个序列中同源核酸碱基或者氨基酸残基出现的位置的数量得出相匹配的位置的数量，匹配位置的数量除以比较窗口中的所有位置的总数并乘以100获得序列同源性的百分比。核酸或者氨基酸序列的同源性可利用序列分析软件来测量，例如BLASTN或BLASTP。BLAST一般可在网站上使用(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。

在本发明中，如上所述，蔗糖是含有D-葡萄糖和D-果糖的双糖，已知它具有阻止细胞中的蛋白质被修饰、稳定细胞中的蛋白质和减少由于外部环境改变而引起的细胞溶解的作用。因此，蔗糖在基础化合物的高浓度生产或者在高浓度细胞培养中是非常有用的。

如图2所示，当源自M.succiniciproducens MBEL55E的新β-呋喃果糖苷酶的蔗糖-6-磷酸水解酶导入到不能代谢蔗糖的微生物中时，导入的酶被认为是通过4种可能的途径代谢蔗糖或者蔗糖-6-磷酸。

第一种可能的途径(反应I)为蔗糖-6-磷酸水解酶在细胞外空间将蔗糖降解为葡萄糖和果糖的情况，然后降解产物通过与转送有关的酶被导入到细胞内，例如各自的磷酸转移酶。

第二种可能的途径(反应II)为蔗糖-6-磷酸水解酶在周质将蔗糖降解为葡萄糖和果糖的情况，然后降解产物通过参与转送的酶被导入到细胞内，例如各自的磷酸转移酶。

第三种可能的途径(反应III)为蔗糖通过通透酶而不是磷酸转移酶家族被导入到细胞中的情况，然后通过导入的蔗糖-6-磷酸水解酶降解成葡萄糖和果糖。

第四种可能的途径(反应IV)为蔗糖通过磷酸转移酶转化为蔗糖-6-磷酸同时被导入到细胞中的情况，然后通过导入的蔗糖-6-磷酸水解酶转化为果糖和葡萄糖-6-磷酸。

同样，sacC基因源自与Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC55618)一起属于Pasteurellaceae家族的M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)。特别是，所述M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)和Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618)具有相似的基因组序列和细胞生理功能。这两个微生物菌株的基因组序列是迄今为止解码的所有基因组序列中彼此最为相似的(McKinlay等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，76：727，2007)。同样，已知源自M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC 0769BP)的sacC基因和源自Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618)的sacC基因具有高度的同源性且最为相似。因此，对于本领域技术人员来说显而易见的是源自M.succiniciproducens MBEL55E的蔗糖-6-磷酸水解酶(SacC，MS0909)和编码它的基因以及源自Actinobacillus succinogenes 130Z的蔗糖-6-磷酸水解酶(Asuc_1829)和编码它的基因，同样可应用于本发明。

因此，在另一方面，本发明涉及一种能够代谢蔗糖的微生物，其中导入了编码蔗糖磷酸转移酶和/或蔗糖-6-磷酸水解酶，和一种生产代谢产物、可生物降解聚合物或重组蛋白质的方法，其包括含有蔗糖作为唯一碳源的培养基中培养所述重组微生物。

在本发明中，所述重组载体是能够在合适的宿主细胞中表达蛋白质的载体，所述宿主细胞涉及构造成含有一种DNA序列，所述序列与帮助操纵使蛋白质表达最优化或载体复制中所需的基因的其他序列一起可操作地连接到能够控制蛋白质表达的控制序列上。所述控制序列可包含一个调控转录的启动子、一个可选择地添加用于调控转录的操纵子、一个合适的mRNA核糖体结合位点和/或控制转录/翻译终止的多个序列。

例如，所述重组载体可以是本发明实施例中所用的如pTrc99A的重组载体，但是除了这个在体外其他已知的载体也可用于本发明。同样，含有sacC基因的表达框不仅可被插入到如pKK223-3、pTac99A，pET系列或pMAL系列的表达载体中，还可被插入到如pACYC、pBluescriptSK-、pBR322、pGEM系列或pMB1的克隆载体中，且这样的表达载体可用于本发明。此外，还可以使用与本发明相关的技术领域中已知的重组载体(Sambrook J & Russell D，Molecular Cloning：a laboratory manual，3rd ed.，Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press，New York，2001)。此外，除氨苄青霉素抗性基因之外，本领域已知的其他抗性基因也可用于本发明。

上述基因源自同Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618)一起属于Pasteurellaceae家族的M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)。特别是所述两个菌种M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)和Actinobacillus succinogenes 130Z(ATCC 55618)具有非常相似的基因组序列和细胞生理活性。根据McKinlay等人的报道(2007)，已知所述两个微生物菌株的基因组序列是在迄今为止解码的基因组序列中彼此最为相似的(Appl.Microbiol.Biotechnol.，76：727，2007)。因此，对于本领域技术人员来说明确是上述基因同M.succiniciproducensMBEL55E(KCTC 0769BP)一样可应用于源自Actinobacillus succinogenes130Z(ATCC 55618)的基因。

在本发明的一实施例中，使用含有ptsG，sacC和rbsK基因的重组载体转化不能利用蔗糖作为碳源的重组微生物，从而构建了具有代谢蔗糖的能力的重组微生物。然而，根据本领域公知的方法，将上述基因插入到不能利用蔗糖作为碳源的微生物染色体中也可构建基因工程重组微生物。

在本发明中，构建了含有包括sacC基因在内的β-呋喃果糖苷酶-编码基因的重组载体，然后导入到不能利用蔗糖作为碳源的大肠杆菌中，然后在含有蔗糖作为唯一碳源的培养基中培养所述构建的重组微生物。结果发现，所述重组微生物具有代谢蔗糖的能力。在另一方面，本发明涉及所述重组载体，一种用所述重组载体转化并具有代谢蔗糖的能力的重组微生物以及利用所述重组微生物生产代谢产物、可生物降解聚合物或重组蛋白质的方法。

所述重组载体可以是具有如图5所示酶切图谱的重组载体，但是除了图5所示的pTac15K载体，其他已知载体可用于本发明。此外，含有包括sacC基因的β-呋喃果糖苷酶-编码基因的表达框不仅可被插入到如pTrc99A、pTac99A或pMAL系列的表达载体中，还可被插入到如pACYC、pBluescript SK-、pBR322、pGEM系列或pMB1的克隆载体中，且所述重组载体可应用于本发明。此外，还可以使用本发明所属领域中已知的重组载体(Sambrook J & Russell D，Molecular Cloning：a laboratory manual，3rd ed.，Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press，NewYork，2001)。另外，含有除了含有卡那霉素抗性基因之外，一些包含本领域其他已知抗药基因的载体也可用于本发明。

在本发明实施例中，使用含有sacC，cscA和sacA基因的重组载体转化不能利用蔗糖作为碳源的一种微生物，从而构建了能够代谢蔗糖的重组载体。然而，根据本领域已知的方法通过将上述基因插入到不能利用蔗糖作为碳源的微生物的染色体中也可构建能够代谢蔗糖的重组微生物。此外，在本发明的实施例中只以特定的大肠杆菌菌株作为不能利用蔗糖作为碳源的宿主微生物进行说明，对于本领域技术人员来说显而易见的是即使上述基因插入到其他大肠杆菌菌株也可以得到与上述大肠杆菌同样的结果，而且不能利用蔗糖作为碳源的宿主微生物还包括：细菌、酵母和真菌。

这里使用的术语“代谢产物”指的是通过代谢途径产生的中间产物和产物的集合。所述代谢产物可分为初级代谢产物和次级代谢产物。例如，本发明可通过各种方式应用于不能利用蔗糖的重组体或基因工程微生物中来生产生物燃料、初级和次级代谢产物、可生物降解聚合物和重组蛋白质。例如，为了生产丁醇(Atsumi等人Nature.，451：7174，2008)、乙醇(Lindsay等人Appl.Microbiol.Biotechnol，43：70，1995)和乳酸(Zhou，Appl.Environ.Microbiol，69：3992003)和琥珀酸及苹果酸(Jantama等人Biotechnol.Bioeng.，99：1140，2008)、氨基酸(Park等人PNAS，104：7797，2006；Lee等人Molecular Systems Biology，3：1，2007)、可生物降解聚合物(Ahn等人，Appl.Environl.Microbiol.，66：3624，2000；Park等人，Biomacromolecules，2：248，2001；Park等人，Biotechnol.Bioeng.，74：81，2001)重组蛋白质(Jeong等人，Appl.Environl.Microbiol.，65：3027，1999；Han等人，Appl.Environl.Microbiol.，69：5772，2003)，在现有技术中利用葡萄糖作为主要碳源生产所需生物制品；然而，当本发明的基因导入到已知的微生物菌株中时，所需的生物制品可利用蔗糖作为碳源而生产。

此外，本领域技术人员可同样容易地应用本发明来生产可生物降解聚合物和重组蛋白。在本发明的实施例中，如苏氨酸的代谢产物被作为例子说明，但是对本领域技术人员来说显而易见的是本发明同样可容易地应用于生物降解微生物、重组蛋白质及类似物的生产。

实施例

以下根据实施例进一步描述本发明。但是可以理解的是，这些实施例仅用于说明而不构成对本发明的范围的限定。

特别是，在下面的例子，举例说明了特定的大肠杆菌作为不能代谢蔗糖的宿主细胞来表达本发明的基因，但是对于本领域技术人员显而易见的是，即使使用其他大肠杆菌菌株或者其他种类的微生物，通过将本发明的涉及蔗糖代谢基因导入到所述微生物并培养重组微生物，也能够生产包括蔗糖的代谢产物。

实施例1：ptsG，sacC和rbsK基因的蔗糖代谢能力的检测

1.1ptsG、sacC和rbsK基因的分离

为了检测根据本发明的基因(ptsG，sacC和rbsK)是否一起参与蔗糖代谢，从M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)中分离了所述基因。

首先，以M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)的基因组DNA作为模板，以序列：11和12作为引物对，进行PCR扩增ptsG(MS0784)的DNA。同样，sacC(MS0909)和rbsK(MS1233)的DNA分别使用一对序列：13和14的引物和一对序列：15和16引物分别进行PCR扩增。使用序列：13和16的引物，以DNA片段的混合物作为模板重叠PCR。所述ptsG(MS0784)，sacC(MS0909)和rbsK(MS1233)基因分别为编码蔗糖磷酸转移酶、蔗糖-6-磷酸水解酶及果糖激酶的基因。

序列11：5′-GGAATTCATGCTCGTTTTAGCTAGAATTGG

序列12：5′-TCCGAGCTCTTACTATTCTTTTGCGTTAGCTCTTG

序列13：5′-ACCTGCGAGCTCTTTCACACAGGAAACAATTTTCATGCGGTCGTTTTTACCG

序列14：

5′-CAAATTTTGTTTGTCATATGCATGAAATCTGTTTCCTGTGTGAAATTACTATTTATATTCAATTTCTTTCGGATA

序列15：

5′-TATCCGAAAGAAATTGAATATAAATAGTAATTTCACACAGGAAACAGATTTCATGCATATGACAAACAAAATTTG

序列16：5′-ACCTGCGGGTACCCTATTAGTTTGCTAAAAATTCCGCT

1.2：重组载体pMSscrIIA的构建

为了使来自Mannheimia的基因表达，ptsG(MS0784)，sacC(MS0909)和rbsK(MS1233)，其在大肠杆菌分别编码蔗糖磷酸转移酶、蔗糖-6-磷酸水解酶及果糖激酶，通过如下方式构建了表达载体。

在实施例1.1中扩增的含有sacC(MS0909)和rbsK(MS1233)基因的DNA片段使用限制性内切酶SacI和KpnI消化，连接到使用相同的限制性内切酶消化的pTrc99A(Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden)上，从而构建了pTrc99AsacCrbsK。

然后，使用EcoRI和SacI消化实施例1.1获得的ptsG(MS0784)DNA片段，随后连接到使用相同的限制性内切酶消化的表达载体pTrc99AsacCrbsK上，从而构建了pTrc99AptsGsacCrbsK。所述构建的载体命名为“pMSscrIIA”(图3)。

1.3大肠杆菌W3110pMSscrIIA和W3110pTrc99A菌株的构建

下面的实验使用一种模式微生物大肠杆菌W3110进行的，它是已知的一种不能代谢蔗糖的大肠杆菌K-12的次代菌株。

将大肠杆菌W3110涂在LB固体培养基中并在37℃培养8小时。然后，将菌落接种在10ml的LB液体培养基中培养8小时。培养液以1％(v/v)接种在100ml的LB液体培养基中并在37℃下在摇床上培养。

大约2个小时之后，当培养液的OD₆₀₀值达到约为0.30-0.35的时候，将其置于冰上20分钟，使细胞的生长停止。培养液在4℃下，以3000rpm离心15分钟收集细胞，然后将细胞在4℃下悬浮于32ml的RFI溶液中。悬浮液在4℃下，以3000rpm离心15分钟收集细胞，细胞再次悬浮在8ml的RFII溶液中，然后将其置于冰上15分钟。最后，重悬浮液以100μl/孔分装并在-70℃储藏。RFI溶液的成分由100mM RbCl，50mMMnCl₂-4H₂O，0.1M CH₃COOK，10mM CaCl₂和15％(w/v)甘油组成并用0.2M的醋酸盐将pH值调至5.8。RF II溶液的成分由10mM MOPS，10mM RbCl，0.1M CH₃COOK，10mM CaCl₂和15％(w/v)甘油组成并用NaOH将pH值调至6.8。

实施例1.2构建的pMSscrIIA表达载体或者pTrc99A(Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden)作为对照添加到大肠杆菌W3110菌株中，然后，在42℃下90秒钟进行热休克转化，从而转化菌株。热休克转化之后，向菌株中加入0.8ml的LB液体培养基并将菌株在37℃下在摇床中培养1小时。

所述培养液涂在含有抗生素氨苄青霉素(最终浓度：50ug/L)的LB固体培养基上并在37℃下培养12小时或12小时以上。所形成的大肠杆菌W3110 pMSscrIIA和大肠杆菌W3110 pTrc99A接种于LB液体培养基，在37℃下培养8小时或8小时以上。为了确认所述载体是否成功被导入，利用GeneAll^R质粒SV(GeneAll Biotechnology，韩国)从所述培养菌株中分离载体并进行电泳。大肠杆菌W3110pMSscrIIA菌株Solgent公司(韩国)利用序列为序列：17到24的引物进行测序，从而检测所述菌株的碱基序列是否与所述基因的碱基序列一致。

序列17：5′-GGAAACAGACCATGGAATTC

序列18：5′-CCGCAAAAGATTTATTCGAAGAAG

序列19：5′-CCTGGTTATATGATACTTTAGG

序列20：5′-TAGTGCTGGGCGCAAGAGCTAACG

序列21：5′-ACCAGTGGGCGATAAAATCG

序列22：5′-TGATCAAGGTTTCGATTTCT

序列23：5′-TTTTCCTGAATGACGGCGAA

序列24：5′-CGATCTGCCGCAATTTCAAG

1.4：重组大肠杆菌代谢蔗糖的能力的检测

在实施例1.3中构建的大肠杆菌W3110pMSscrIIA和大肠杆菌W3110pTrc99A在固体培养基上形成菌落，接种在含有以5g/L蔗糖作为唯一碳源的M9基本培养基中并在37℃下培养16个小时。然后，所述培养液接种到含有以3％(v/v)蔗糖的100ml的M9基本培养基中，接着在37℃培养。这里作为一种抗生素，加入氨苄青霉素至最终浓度为50ug/L。所述M9基本培养基由33.9g/L的Na₂HPO₄、15g/L的KH₂PO₄、2.5g/L的NaCl、5g/L的NH₄Cl和0.36g/L的MgSO₄组成。使用分光光度计测定OD₆₀₀来确定培养基中的细胞浓度。在培养过程中，定期收集样本，收集的样本13,000rpm离心5分钟，然后利用高效液相色谱法测定上清液中的蔗糖浓度。

结果如表1所述，大肠杆菌W3110pTrc99A菌株不能在含有以蔗糖作为唯一碳源的M9基本培养基中生长，但是大肠杆菌W3110pMSscrIIA菌株显示了极好的代谢蔗糖的能力。大肠杆菌W3110pMSscrIIA菌株在19小时代谢了约2.2g/L的蔗糖，这表明基于OD₆₀₀3.12的生物量增加，并产生了0.67g/L的醋酸作为副产物。由此确定当一种微生物包含所有的ptsG、sacC和rbsK基因时，其显示极好的代谢蔗糖的能力。

表1

如上所述，无论是将蔗糖磷酸转移酶基因还是将蔗糖磷酸转移酶基因与蔗糖-6-磷酸水解酶基因的组合物导入到不能代谢蔗糖的微生物中，所述微生物都具有了代谢蔗糖的能力，此外产生醋酸作为以蔗糖作为碳源的代谢产物。

因此，任何本领域技术人员可容易地应用本发明生产醋酸之外的乳酸、琥珀酸、乙醇、生物燃料和含有生物丁醇、可生物降解聚合物以及重组蛋白的生物能源。

实施例2：每个pstG基因和sacC基因对于代谢蔗糖能力的检测

2.1：构建重组载体用于检测pstG基因和sacC基因代谢蔗糖的能力

为了检测本发明的pstG基因和sacC基因是否单独具有代谢蔗糖的能力，构建了缺失ptsG基因的(MS0784)载体(pSacHR06ptsG)和缺失sacC(MS0909)基因的载体(pSacHR06sacC)用于基因敲除实验。

首先，为了干扰所述蔗糖磷酸转移酶基因(ptsG)用同源重组方法按以下方式构建了基因交换载体。左同源臂区域利用Mannheimiasucciniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)的基因组DNA作为模板以序列：25和26为引物，且右同源臂区域使用序列：27和28作为引物进行扩增；含有抗生素标记和lox突变位点的DNA片段，以pECmulox载体(Kim等人，FEMS Microbiol.Lett.，278：78，2008)作为模板以序列：29和30作为引物进行扩增。这三个DAN片段利用序列：25和28作为引物通过重叠PCR进行扩增。

序列25：5′-ATATCTGCAGCCGGCATTAAATATTAGTCAAC

序列26：5′-CGTTCTAACGGAGGTTGAAAACTGCCCTTT

序列27：5′-GTCTCCCTATCACGCCGTTATTTTCATTATT

序列28：5′-ATTAGTCGACACCATCCCCACGGAATACAT

序列29：5′-TTTCAACCTCCGTTAGAACGCGGCTACAAT

序列30：5′-TAACGGCGTGATAGGGAGACCGGCAGATCC

如此扩增的最终DNA片段用限制性内切酶PstI和SalI消化并克隆到用同样的酶消化的pSacHR06载体(Park等人，PNAS，104：7797，2007)中，由此构建了pSacHR06ptsG。此外，利用上述同样的方法利用序列：31和36作为引物构建了pSacHR06sacC。

序列31：5′-ATACACTGCAGTTATGCAATTTATCGCACCC

序列32：5′-AATCTGCTCTGATGCGGTCGTGAAATGCTTCCA

序列33：5′-CACAGAATCAGGACAAATGGCATTCAATGCTG

序列34：5′-ATACTGTCGACTCAATGGCATATGCAGCG

序列35：

5′-AAGCATTTCACGACCGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAG

序列36：

5′-TTGAATGCCATTTGTCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTAC

2.2：M.succiniciproducens MptsG和M.succiniciproducens MsacC菌株的构建

分别使用实施例2.1中构建的交换载体pSacHR06ptsG剔除ptsG基因的和交换载体pSacHR06sacC剔除sacC基因，根据Kim等人(FEMSMicrobiol.Lett.，278：78，2008)报道的方法从M.succiniciproducensMBEL55E(KCTC0769BP)基因组中剔除了所述基因，因此构建了突变菌株，M.succiniciproducens MptsG和M.succiniciproducens MsacC。

特别是，M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)涂在含有10g/L葡萄糖的LB-葡萄糖固体培养基中并在37℃下培养36小时。然后，菌落接种到10ml的LB-葡萄糖液体培养基中培养12小时。充分生长的细胞培养液以1％(v/v)接种到100ml的LB-葡萄糖液体培养基中，然后在37℃下以200rpm在摇床中培养。

在4-5小时后，当所述培养液的OD₆₀₀达到约为0.3-0.4时，在4℃、4,500rpm下离心20分钟收集细胞，然后细胞在4℃下重新悬浮在200ml的10％甘油溶液中。所述重悬浮溶液在4℃、5,500rpm下离心20分钟以收集细胞。所述重悬浮过程重复两次同时甘油溶液的浓度减少到一半，然后所述细胞以1∶1的体积比重新悬浮在甘油溶液中以获得一种细胞浓缩物。所述细胞浓缩物分别与实施例2.1中构建的pSacHR06ptsG或者pSacHR06sacC基因交换载体混合，然后在2.5kV，25μF和400ohms条件下进行电穿孔，由此将每种基因导入到培养的M.succiniciproducens中。电穿孔之后，1ml的LB-葡萄糖液体培养基加入到菌株中然后所述菌株在200rpm、37℃条件下在摇床中培养1小时。所述培养液涂布在含有抗生素氯霉素(最终浓度：6.8μg/L)的LB-葡萄糖固体培养基中在37℃下培养48小时或48小时以上。为了筛选只有双交叉发生的菌落，将所形成的菌落在含有氯霉素(最终浓度：6.8μg/L)的LB-培养基(含有100g/L蔗糖的LB培养基)上划线。24小时后，形成的菌落在同样的培养板中重新划线。

在培养板上形成的所述菌落(突变)在含有一种抗生素的LB-葡萄糖液体培养基中培养，且通过Rochelle等人(FEMS Microbiol.Lett.，100：59，1992)描述的方法从培养的菌株中提取基因组DNA。以提取的突变基因组DNA作为模板进行PCR，然后所述PCR产物进行电泳以确定在各自突变菌株中的已剔除ptsG基因和sacC基因。

为了确定MptsG菌株中已剔除ptsG基因，分别用序列：37和38的一对引物以及序列：39和40的一对引物进行PCR。为了确定MsacC菌株中已剔除sacC基因，分别用一对序列：39和40的引物以及一对序列：41和42的引物进行PCR。

序列37：5′-CGGGGCGAAAGTGATTGAGA

序列38：5′-AATTGCCGCCTGGGTATTGG

序列39：5′-ACCTTTACTACCGCACTGCTGG

序列40：5′-GCGGGAGTCAGTGAACAGGTAC

序列41：5′-GATCTTGAGTCCGTAAAACAGGCTT

序列42：5′-TTCCGCTCAAGCCATTGTAGTG

2.3：MptsG菌株、MsacC菌株以及亲本菌株(MBEL55E)之间生长的比较

在实施例2.2中构建的MptsG菌株、MsacC菌株分别在BHI(BactoTMBrain Heart Infusion；Becton，Dickinson and Company，Sparks，MD)中培养8小时，然后10ml的所述培养液接种到300ml的MH5S培养基(每升：2.5g酵母提取物、2.5g多聚蛋白胨、1g NaCl、8.7gK₂HPO₄、10gNaHCO₃、0.02g CaCl₂·2H₂O、0.2g MgCl₂·6H₂O和10g蔗糖)中，然后比较所述菌株的生长曲线和以相同条件培养的亲本菌株(MBEL55E)的生长曲线。图4是通过OD₆₀₀测定的MBEL55E(●)、MptsG(▲)和MsacC(△)菌株的生长曲线。如图4所示，从菌株中缺失每种基因之后，在蔗糖培养基中亲本菌株(MBEL55E)的生长能力大幅消失。这表明对于在蔗糖培养基中的菌株的生长来说每种所述基因都是必需的。

同时，rbsK基因编码的果糖激酶(RbsK，MS1233)进行了如上述的相同实验，没有观察到如生长率下降的生长变化。同样，酶活性测定结果显示，亲本菌株和rbsK缺失菌株之间在酶活性上没有显示很大差别且具有比通常的果糖激酶低很多的酶活性水平。也就是说，这两个菌株显示了微小的酶活性。基于这种结果，推断认为rbsK基因不编码果糖激酶或者即使它编码果糖激酶也只具有非常微弱的活性。

2.4：MptsG菌株、MsacC菌株以及亲本菌株的酶活性比较

为了测定蔗糖PTS的酶活性，使用了Jacobson等人(J.Biol.Chem.，254：249，1979)和Lodge等人(Infect.Immun.，56：2594，1988)的方法。

第一，为了使细胞具有渗透性，1ml的OD₆₀₀值约为1.2的细胞培养液用TDM缓冲液(50mM Tris/HCl，10mM MgCl₂，1mM DTT；pH 7.5)洗涤并在1ml的相同缓冲液中重悬浮，0.01ml甲苯加入到其中，然后所述细胞溶液强烈震荡45秒钟。震荡的细胞在12,000×g离心，然后收集的细胞用TDM缓冲液洗涤2次。再次重复这一过程，得到的细胞在50μl的TDM缓冲液中重悬浮，由此制备了具有渗透性的细胞。PEP依赖型蔗糖磷酸化是通过将5μl的具有渗透性的细胞悬浮液添加到含有25mMTris/HCl(pH 8.0)，1mM DTT，5mM MgCl₂，10mM KF和1μCi[U-¹⁴C]蔗糖的100μl反应混合物中，并测定含有1mM PEP的混合物和不含PEP的混合物之间的反应差异。所述混合物在37℃反应10分钟，并用1ml的冷水终止反应。终反应产物经过一过滤系统的DEAE过滤盘(Whatman，DE81)并用10倍体积的冷水进行洗涤，然后根据已知的方法利用Beckman LS6500液体闪烁计数器(Beckman，Ramsey，MN)测定其中的放射性。蔗糖-6-磷酸水解酶的活性通过做了些修改的Martin等人(Appl.Environ.Microbiol.，53：2388，1987)方法进行测量的。OD₆₀₀值大约为1的20ml细胞培养物以测量蔗糖PTS活性的相同方法进行具有渗透性并最终重悬浮在1ml的TDM缓冲液中，由此制备了具有渗透性的细胞。PEP依赖蔗糖磷酸化是通过将30μl的具有渗透性的细胞添加到含有50mM钠钾磷酸盐缓冲溶液(pH 7.2)、5mM的MgCl₂、4mM的蔗糖、0.8Mm的NADP以及6.4U的葡萄糖-6-磷酸水解酶的300μl反应混合物中，并测定含有10mM PEP的混合物和不含PEP的混合物之间的反应差异。

测定分别剔除了ptsG基因和sacC基因的突变菌株以及亲本菌株的活性，且在表2中示出测定结果。结果表明由MS0784(ptsG)编码的蔗糖PTS酶具有PTS活性且由MS0909(sacC)编码的蔗糖-6-磷酸水解酶在细胞中具有糖酵解功能。

表2

^aBHI，BactoTMBrainHeartInfusion(Becton，DickinsonandCompany，Spark，MD)MH5S培养基成分包括：每升2.5g酵母提取物、2.5g多聚蛋白胨、1g NaCl、8.7g K₂HPO₄、10g NaHCO₃、0.02g CaCl₂·H₂O、0.2g的MgCl₂·6H₂O以及10g蔗糖。

蔗糖磷酸转移酶的^b活性以通过液体闪烁计数器测量的从cpm(每分钟计数)转换而来的单位mU/mg来示。

相对^c活性以计算相对于用符号*表示的培养液的余值的100％来测定。

实施例3：编码与蔗糖代谢相关的酶的新基因的分离

基于实施例2的结果已经证实了具有代谢蔗糖的能力的编码β-呋喃果糖苷酶的基因包括sacC，按照如下的方法分别从曼氏杆菌(Mannheimia)、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中被分离。

3.1源自曼氏杆菌的编码蔗糖-6-磷酸水解酶基因的分离

首先，通过以M.succiniciproducens MBEL55E(KCTC0769BP)的基因组DNA作为模板，以序列：43和44作为引物进行PCR扩增获得sacC(MS0909)基因的DNA。sacC(MS0909)基因是一种编码β-呋喃果糖苷酶(蔗糖-6-磷酸水解酶)的基因(序列：4)。

序列43：5′-ACTGAGCCATGGCGAAAATCAATAAAGTAGATC-3′

序列44：5′-TGATCCGAGCTCCTATTATTCCAGTGTTCCCGCC-3′

3.2：源自大肠杆菌的编码转化酵素(invertase)基因的分离

以大肠杆菌W的基因组DNA作为模板，以序列：45和46作为引物进行PCR扩增获得cscA基因的DNA。cscA基因是一种编码β-呋喃果糖苷酶(转化酵素)的基因(序列：8)。

序列45：ACTCCGGAATTCATGACGCAATCTCGATTGCA

序列46：ACCTGCGAGCTCCCGTTGTTCCACCTGATATTATG

3.3：源自枯草芽孢杆菌的编码蔗糖-6-磷酸水解酶基因的分离

以枯草芽孢杆菌的基因组DNA作为模板，以序列：47和48作为引物进行PCR扩增获得sacC基因的DNA。sacC基因是一种编码β-呋喃果糖苷酶(蔗糖-6-磷酸水解酶)的基因(序列：10)。

序列47：GCATAGAATTCATGACAGCACATGACCAGGAGCT

序列48：GCATAGAGCTCCTACATAAGTGTCCAAATTCCGACATTC

实施例4：重组载体的构建

4.1：pTac15K的制备

通过将trc启动子和pKK223-3(Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden)的转录终止子区域插入到pACYC177(NEB，Beverly，MA，USA)中构建了pTac15K载体。pTac15K是一种组成型表达的表达载体并具有如图5中所示的酶切图谱。

4.2：pTac15KsacC的构建

为了在大肠杆菌中表达编码从曼氏杆菌中分离的β-呋喃果糖苷酶(蔗糖-6-磷酸水解酶)的sacC(MS0909)基因，按照下例方法构建了一种表达载体。

根据已知的分子工程方法，使用EcoRI和SacI消化含有实施例3.1中PCR扩增片段的sacC(MS0909)基因并插入到使用相同酶消化的pTac15K中从而构建了pTac15KsacC(图6).所述构建载体利用序列：49到52的引物在Solgent公司(韩国)进行测序。由此检测导入到载体中的基因的碱基序列与sacC(MS0909)基因的碱基序列是否一致。

序列49：5′-CCCGTTCTGGATAATGTTTT-3′

序列50：5′-AAAGTCACGGTTGTTATTCC-3′

序列51：5′-CATTTAATGCCGCTCATATT-3′

序列52：5′-ACCGCTCAATTATTGAGATT-3′

4.3：重组载体pTac15KEWcscA的构建

根据已知的分子工程方法，使用EcoRI和SacI消化实施例3.2中获得的DNA片段并插入到使用相同酶消化的pTac15K中从而构建了pTac15KEWcscA。

4.4重组载体pTac15KBSsacA的构建

根据已知的分子工程方法，使用EcoRI和SacI消化实施例3.3中获得的DNA片段并插入到使用相同酶消化的pTac15K中从而构建了pTac15KBSsacA。

实施例5：重组菌株的构建

5.1：大肠杆菌W3110pTac15KsacC菌株的构建

下面的实验使用作为模型微生物的大肠杆菌W3110进行，大肠杆菌W3110是已知的不能代谢蔗糖的大肠杆菌K-12的次代菌株。将大肠杆菌W3110涂在LB固体培养基上，并在37℃下培养8小时，然后将菌落接种到10ml的LB液体培养基中并培养8小时。培养液以1％(v/v)接种到100ml的LB液体培养基中并在37℃下在摇床中培养。

大约2小时后，所述培养液的OD₆₀₀达到约0.30-0.35时，将其置于冰上20分钟以停止细胞生长。所述培养液在4℃下3,000rpm离心15分钟以收集细胞，然后在4℃下将所述细胞悬浮于32ml的RFI溶液中。所述细胞悬浮液在4℃下3,000rpm离心15分钟以收集细胞。收集的细胞在8ml的RFII溶液中重悬浮，然后将其置于冰上15分钟。最后，重悬浮液以100μl/孔的量分装并在-70℃下储藏。RFI溶液的成分由100mM的RbCl、50mM的MnCl₂-4H₂O、0.1M的CH₃COOK、10mM的CaCl₂以及15％(w/v)甘油组成并加入0.2M醋酸盐将pH值调至5.8。RFII溶液由10mM的MOPS、10mM RbCl、100mM CaCl₂以及15％(w/v)甘油组成并加入NaOH将pH值调至6.8。

实施例2.2构建的表达载体或pTac15K(Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden)作为对照加入到大肠杆菌W3110菌株，然后所述菌株在42℃下进行热休克转化90秒钟，从而转化所述菌株。热休克转化之后，向所述菌株中加入0.8ml的LB液体培养基并将菌株在37℃下在摇床中培养1小时。

所述培养液涂在含有抗生素卡那霉素(最终浓度：50μg/L)的LB固体培养基中在37℃下培养12小时或12小时以上。所形成的大肠杆菌W3110pTac15K和大肠杆菌W3110pTac15KsacC菌落接种到LB液体培养基中并在37℃下培养8小时或8小时以上。为了确认所述载体是否成功导入到所述菌株中，利用GeneAll^R质粒SV(GeneAll Biotechnology，Korea)从培养的菌株中分离所述载体并进行电泳。

5.2：大肠杆菌W3110pTac15KEWcscA和大肠杆菌W3110pTac15KBSsacA菌株的构建

根据实施例5.1描述的相同方法，已知不能代谢蔗糖的大肠杆菌K-12的次代菌株大肠杆菌W3110用实施例4.3和实施例4.4构建的每个pTac15KEWcscA和pTac15KBSsacA载体进行转化，然后通过电泳确定所述载体是否成功地被导入。

实施例6：重组大肠杆菌的蔗糖代谢能力和生长的检测

实施例5.1中构建的固体培养基上的大肠杆菌W3110pTac15KsacC和大肠杆菌W3110pTac15K菌落，分别接种于10ml的LB培养基并在37℃培养8小时。然后，所述细胞以5％(v/v)接种到100ml的M9基本培养基(含有10g/L的蔗糖)并在37℃下培养。这里，作为抗生素，加入卡那霉素至最终浓度50ug/L。所述LB培养基由10g/L的胰蛋白胨、10g/L的NaCl以及5g/L的酵母提取物组成且所述M9基本培养基由33.9g/L的Na₂HPO₄、15g/L的KH₂PO₄、2.5g/L的NaCl、5g/L的NH₄Cl和0.36g/L的MgSO₄组成。培养液中的细胞浓度利用分光光度计以OD₆₀₀值来测定。培养过程中，定期收集样本，然后所收集的样本以13,000rpm离心5分钟。然后，通过高效液相色谱法(HPLC)分析悬浮液中的蔗糖和代谢物的浓度。

结果，如图7、图8和表3所示，大肠杆菌W3110pTac15K菌株不能在以蔗糖作为唯一碳源的M9基本培养基中生长，但大肠杆菌W3110pTac15KsacC菌株显示了极好的代谢蔗糖的能力。大肠杆菌W3110pTac15KsacC菌株17小时代谢了11.08g/L的蔗糖并且显示基于OD₆₀₀值的3.71生物总量增长。这种生物总量的增长相当于鉴于OD₆₀₀值的换算系数(1OD₆₀₀＝0.37g/L DCW)和常规大肠杆菌干细胞重量(DCW，g/L)的约1.37g/L的生物总量。此外，观察到产生了1.42g/L的醋酸，剩余2.01g/L的葡萄糖及4.51g/L的果糖，且上述两种糖类随着时间的推移逐渐被消耗。

表3

在W3110pTac15K菌株(图.7)的生长曲线中，接种后8小时OD值的略微的增长被认为是由于以5％(v/v)培养基的成分接种而引起的。所述W3110pTac15K菌株的LC分析结果表明所述菌株既不能降解蔗糖也不能利用蔗糖作为唯一的碳源生长。

此外，用以蔗糖作为唯一碳源培养W3110pTac15KsacC菌株的同样方法培养实施例5.2中转化的所述重组菌株大肠杆菌W3110pTac15KEWcscA和大肠杆菌W3110pTac15KBSsacA。结果，如图9所示，所述菌株显示了极好的生长能力。同样，在大肠杆菌W3110pTac15KEWcscA的例子中，48小时后蔗糖从初始阶段7.77g/L降低到1.82g/L，且在大肠杆菌W3110pTac15KBSsacA菌株的例子中，48小时后蔗糖从初始阶段8.49g/L降低到7.98g/L。这表明这些菌株可通过代谢蔗糖生长。

实施例7：在重组的大肠杆菌中利用蔗糖作为碳源生产代谢产物

如上所述，当源自M.succiniciproducens的蔗糖-6-磷酸水解酶被导入到不能利用蔗糖作为唯一碳源的微生物中时，所述微生物能够利用蔗糖作为唯一碳源生长。也就是说，当一种不能利用蔗糖作为碳源的微生物进行如上述的处理之后它就能够利用蔗糖作为唯一碳源在一种基本培养基中生长。用于生产各种生物制品的现有系统(例如，初级和次级代谢产物、重组蛋白质及可生物降解聚合物)可被应用于本发明中。

因此，这个实施例示出了在厌氧条件下利用蔗糖的各种代谢产物的生产。

实施例5.1中构建的大肠杆菌W3110pTac15KsacC菌株接种到10ml的LB培养基中并在37℃下培养8小时，然后将培养液接种到200ml的LB培养基中并在37℃下培养8小时。然后，所述培养液接种到2.5L体积发酵罐中(New Brunswick System，Bioflo 3000)。发酵罐中的培养基由含有20g/L蔗糖的R/2基本培养基组成，且在pH 6.8，37℃和200rpm转的操作条件下，100％CO₂以0.5vvm的频率注入到发酵罐中。作为一种抗生素，加入卡那霉素至以最终浓度为50μg/L加入卡那霉素。所述R/2培养基由6.75g/L的KH₂PO₄、2g/L的(NH₄)₂HPO₄、0.85g/L的C₆H₈O₇H₂O、0.7g/L的MgSO₄7H₂O以及5ml/L的微量金属溶液(10g/L FeSO₄7H2O、2g/L CaCl₂、2.2g/L ZnSO₄7H₂O、0.54g/LMnSO₄5H2O、1g/L CuSO₄5H₂O、0.1g/L NH₄Mo₇O₂₄7H₂O、0.02g/LNa₂B₄O₇10H₂O及5ml HCl)组成。利用分光光度计以OD₆₀₀值测定所述培养液中的细胞浓度，并在培养期间，定期收集样本，所述样本在13,000rpm下离心5分钟，然后通过高效液相色谱法(HPLC)分析悬浮液中的蔗糖浓度和代谢物的浓度。

结果，如图10和表4所示，成功生产了醋酸、甲酸、乳酸、琥珀酸和乙醇。如上述的厌氧条件下经52.5小时，22.13g/L的蔗糖和由此衍生的糖完全被消耗，结果以0.20、0.17、0.19、0.23及0.12g/g的蔗糖产率生产了4.49g/L的醋酸、3.74g/L的甲酸、4.19g/L的乳酸、5.10g/L的琥珀酸和2.66g/L的乙醇，且这些产量总和0.91g/g的蔗糖非常接近理论值。同样，从初始阶段经过52.5小时之后的OD₆₀₀值是2.7，相当于鉴于上面描述的换算系数的g DCW的0.999。表明每株重量的产率的个别产量计算如表4所示。表4的结果表明，当单独导入蔗糖-6-磷酸水解酶时，利用蔗糖可以高产率和高特定产量成功地生产各种代谢产物。

表4

实施例8：通过应用到苏氨酸生产菌株的对代谢工程有用副产物的应用

下面的实验利用产生苏氨酸的菌株来进行，以说明当本发明的基因导入到基因组工程或重组大肠杆菌菌株时，所述菌株同样能够利用蔗糖代替其他现有的碳源而生产生物制品。特别地，下面的实验将作为一种模型，利用基于大肠杆菌W3110的代谢修饰的基因组工程和重组TH28CpBRThrABCR3(Lee等人，Molecular Systems Biology，3：149，2007)。

根据实施例5中同样的方法，用实施例4中构建的质粒pTac15KsacC转化TH28C pBRThrABCR3菌株，从而构建了TH28C pBRThrABCR3pTac15KsacC。

所述构建的TH28C pBRThrABCR3pTac15KsacC菌株接种到10ml的LB培养基中并在31℃下培养12小时，且所述培养液接种到50ml的LB培养基中并在31℃下培养12小时。然后，所述培养液接种到2.5L体积的发酵罐中(New Brunswick System，BioFlo 3000)。发酵罐中的培养基由含有20g/L蔗糖的TPM2培养基组成，并在pH 6.5、31℃下通过供给溶解有1vvm浓度氧气的空气维持40％以上的空气饱和度并自动地将转速(rpm)增加到1000。作为抗生素，分别以终浓度30ug/L、40ug/L及50ug/L加入氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素。所述TPM2培养基由2g/L的酵母提取液、2g/L的MgSO₄7H₂O、2g/L的KH₂PO4、10g/L的(NH4)₂SO₄、0.2g/L的L-蛋氨酸、0.2g/L的L-赖氨酸、0.05g/L的L-异亮氨酸及10ml/L的微量金属溶液(10g/L FeSO₄7H₂O、2g/L CaCl₂、2.2g/LZnSO₄7H₂O、0.54g/L MnSO₄5H₂O、1g/LCuSO₄5H₂O、0.1g/LNH₄Mo₇O₂₄7H₂O、0.02g/L Na₂B4O₇10H₂O及5ml HCl)组成。所述培养液中的细胞浓度利用分光光度计以OD₆₀₀值测定，并在培养期间，定期收集样本，所述样本在13,000rpm下离心5分钟，然后通过高效液相色谱法(HPLC)分析上清液中的蔗糖浓度和代谢物的浓度。为了测定氨基酸，5ml的培养液进行离心和过滤步骤，然后利用阳离子分离柱(LCA K06/Na1.6150mm；SykamGmbH，Eresing，Germany)在Science Lab Center公司(Daejeon，Korea)分离。然后，分离的样品利用Sykam S433氨基酸分析仪进行分析。

结果，如下面表5中所示，利用蔗糖成功生产了4.7g/L的苏氨酸。

表5

如上所述，当本发明的β-呋喃果糖苷酶基因导入到不能利用蔗糖作为唯一碳源的微生物中时，所述微生物具有了代谢蔗糖的能力，且另外，能够利用蔗糖作为碳源生产各种代谢产物，包括醋酸、甲酸、乳酸、琥珀酸以及乙醇。此外，当本发明的所述基因导入到以同样方法代谢修饰的菌株中时，能够成功生产所需的代谢产物(本实施例中是苏氨酸)。另外，本领域任何技术人员都能够容易地将本发明应用于生产可生物降解聚合物、重组蛋白质和类似物。

工业应用性

如上面的详细说明，本发明提供了能够利用廉价的蔗糖代替葡萄糖作为碳源的重组微生物。此外，在原先不能利用蔗糖作为唯一碳源的微生物在培养过程中，蔗糖能够代替其他碳源包括葡萄糖。在本发明中，能够使廉价且在自然界中充足的蔗糖有效利用的一组新的酶被识别并被开发。这些酶通过利用蔗糖作为碳源的微生物发酵，将被用于更经济有效地生产有用化合物或者医用重组蛋白质。尤其，已知蔗糖具有防止蛋白质在细胞中修饰、稳定细胞中的蛋白质并最小化细胞的裂解的功能，其在高浓度基本化合物的生产或者高浓度细胞培养中是非常有用的。

虽然本发明参照具体特征进行了详细介绍，但对于本领域技术人员来说显而易见的是这些描述仅是为了更好的体现本发明并不限定本发明的范围。因此，本发明实际范围由随附的权利要求以及其等同物来限定。