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CN110650750A - 基于肽的疫苗、其制造方法及其用于诱导免疫应答的用途 - Google Patents

基于肽的疫苗、其制造方法及其用于诱导免疫应答的用途 Download PDF

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CN110650750A
CN110650750A CN201880030232.8A CN201880030232A CN110650750A CN 110650750 A CN110650750 A CN 110650750A CN 201880030232 A CN201880030232 A CN 201880030232A CN 110650750 A CN110650750 A CN 110650750A
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CN
China
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peptide antigen
peptide
gly
leu
val
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Application number
CN201880030232.8A
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English (en)
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杰弗里·林恩
安德鲁·依希祖卡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Virginia Merger Of Subsidiary 2
National Institutes of Health NIH
Original Assignee
Goverment Of United States, AS REPRESENTED BY SECRETARY D
Avidi Technology
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Abstract

本公开涉及新颖的基于肽的疫苗、所述新颖的基于肽的疫苗的制造方法及其用于将肽抗原递送到对象以诱导免疫应答、特别是T细胞应答的用途。

Description

基于肽的疫苗、其制造方法及其用于诱导免疫应答的用途
优先权文件
本申请要求2017年4月4日提交的美国临时专利申请号62/481,432和2018年1月15日提交的美国临时专利申请号62/617,519的优先权，两者的发明名称均为“基于肽的疫苗、其制造方法及其用于诱导免疫应答的用途”(PEPTIDE-BASED VACCINES,METHODS OFMANUFACTURING,AND USES THEREOF FOR INDUCING AN IMMUNE RESPONSE)，两者的内容通过引用以其整体并入本文。
本发明在与美国健康与人类服务部(Department of Health and HumanServices)的机构国立卫生研究院(National Institutes of Health)的合作研究和开发协议的履行中产生。美国政府享有本发明的一定权利。
技术领域
本公开涉及新颖的基于肽的疫苗、所述新颖的基于肽的疫苗的制造方法及其在对象中诱导免疫应答、特别是T细胞应答的用途。本发明的基于肽的疫苗的实施方式可用于预防或治疗传染病和癌症，以及用于诱导耐受或调节免疫力以预防或治疗自体免疫和过敏症。
背景技术
包含抗原的免疫原性组合物的疫苗可用于在对象中诱导免疫应答，包括用于治疗或预防癌症或传染病，或甚至用于诱导耐受和/或免疫抑制以治疗或预防自体免疫或过敏症。用于诱导免疫应答以治疗或预防癌症和传染病的疫苗的组合物含有抗原和特定类型的佐剂，所述佐剂诱导针对所述抗原的细胞毒性T细胞应答和/或抗体，以介导病原体清除或病毒感染的或癌性细胞的灭杀。相反，用于诱导耐受原性或抑制性应答的疫苗的组合物可以含有抗原和介质(例如递送系统如粒子载体)和/或免疫抑制性化合物例如mTOR抑制剂，但缺少诱导细胞毒性T细胞的特定佐剂，但可能代之以诱导T细胞耐受或调控细胞例如调控性T细胞的活化，以下调或调节应答的定性特征。
越来越多地认识到，遗传背景、特别是主要组织相容性复合物(MHC)等位基因的组成和患者的环境，能够影响他们对癌症、传染病、自体免疫和过敏症的易感性，以及影响他们对用于治疗这些病症的疫苗的响应。提供对疾病分子基础的理解的新的诊断和信息学方法的持续发展，意味着有越来越多的患者特异性信息可用。因此，对使用关于个体的基因、蛋白质和环境的信息来指导所述个体接受的医疗护理，包括选择特定免疫疗法包括疫苗以治疗或预防癌症、传染病、自体免疫和过敏症，有越来越多的兴趣。
在癌症疗法中，关于个体的肿瘤的特定信息可用于协助诊断、设计治疗方案、了解治疗效果或做出预后。例如，关于个体的基因、蛋白质和环境的特定信息可用于通过在该信息的基础上开发疫苗，来定制癌症治疗的预防性方法。用于某些癌症的免疫学治疗或预防的疫苗应该诱导针对肿瘤相关抗原的免疫应答。一种优选的免疫应答是识别肿瘤相关抗原的CD8 T细胞应答和/或CD4 T细胞应答。
同样地，通过分别鉴定作为免疫介导的疾病的病因的具体自体抗原或外来抗原，治疗自体免疫或过敏症的个体化方法是可能的。尽管某些自体抗原和过敏原是已知的并且在患者之间是普遍的，但某些自体抗原和过敏原可能是患者特异性的，因此这些患者的治疗必须被定制。被鉴定为所述疾病的病因的抗原可以以肽的形式施用，作为能够诱导针对所述自体抗原(即自身抗原)的耐受的疫苗。或者，针对引起过敏症的外来抗原的免疫应答可能是引起疾病的特定类型的免疫应答。因此，针对这种外来抗原的疫苗可以被提供成基于肽的疫苗，以将所述免疫应答转变为不引起疾病的定性上不同类型的免疫应答。
T细胞在癌症治疗或预防中的作用
已知T细胞介导肿瘤消退并提高患者存活，正如使用基于过继性T细胞疗法和免疫检查点抑制剂的免疫疗法所显示的。在人类中的几项研究显示，识别单一肿瘤相关抗原的大量扩增的CD8和/或CD4 T细胞的静脉内输注能够介导肿瘤消退并提高存活率(参见：E.Tran等，N Engl J Med 375:2255-2262,2016；和E.Tran等，Science 344:641-645,2014)。另外，使用阻断或逆转T细胞抑制的药物例如阻断CTLA-4、PD-1和/或PD-L1的单克隆抗体(所谓的“检查点抑制剂”)治疗某些癌症，导致肿瘤减退和总体存活率的提高(参见：D.M.Pardoll,Nat Rev Cancer,12:252-264,2012；F.S.Hodi等，N Engl J Med,363:711-723,2010；和M.Reck等，N Engl J Med,375:1823-1833,2016；J.E.Rosenberg等，Lancet387:1909-1920,2016)。PD-1/PD-L1是一种受体-配体对，其中PD-1表达在T细胞上并且PD-L1表达在肿瘤中的细胞上。PD-1/PD-L1相互作用阻断T细胞执行它们的效应物功能，否则所述效应物功能将引起表达被所述T细胞识别的肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的生长减缓或消除。使用单克隆抗体阻断所述PD-1/PD-L1相互作用引起所述抑制性信号的中断，从而释放出T细胞以执行引起肿瘤细胞生长减缓或肿瘤细胞死亡的效应物功能(D.M.Pardoll,NatRev Cancer,12:252-264,2012)。
T细胞在患者中促进肿瘤清除的作用得到了在人类中进行的研究的支持，所述研究显示，在治疗开始时在肿瘤活检样品中存在较高水平的T细胞浸润的患者中，检查点抑制剂具有较高效能(较低死亡率)(参见：J.E.Rosenberg等，Lancet 387:1909-1920,2016)。此外还已显示，在肿瘤具有较高突变水平的患者中检查点抑制剂具有较高效能(参见：A.Snyder等，N Engl J Med 371,2189-2199 2014；和N.A.Rizvi等，Science,348:124-128,2015)，推测是因为数目越来越多的突变产生更大数目的突变蛋白，从而提供更大数目的潜在靶点，T细胞能够凭借这些靶点识别所述肿瘤细胞并靶向它们以便消除。
然而，主要挑战在于许多常见的肿瘤(例如前列腺、乳腺和胰腺癌)具有低突变负荷(参见：T.N.Schumacher,R.D.Schreiber,Science,348:69-74,2015)，并且患有这些癌症的患者很少或者不从检查点抑制剂获益。此外，即使是在具有高突变负荷的肿瘤中，也仅有一部分患者从检查点抑制剂疗法获益，因为大部分对象缺少免疫疗法介导效果所需的必要的预先存在的肿瘤特异性T细胞应答。
靶向肿瘤相关抗原的用于癌症治疗或预防的疫苗
产生用于癌症治疗或预防的免疫应答、特别是T细胞应答，需要鉴定适合的肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原包括：自身抗原，其存在于某些健康细胞上，但偏好性地被肿瘤细胞表达；来自于致瘤微生物病原体的病原体来源的抗原；和/或新抗原(neoantigen)，其是对肿瘤细胞具有特异性的并且通常但不总是对个体患者而言独特的畸变蛋白质。
适合的自身抗原可以是源自于在产后对象中不再表达的蛋白质的抗原。例如，适合的自身抗原可以包括被肿瘤细胞偏好性表达的抗原例如NY-ESO-1和MAGE-A3(参见：N.N.Hunder等，N Engl J Med,358:2698-2703,2008)。或者，自身抗原可以包括在健康组织中表达的抗原，其中针对该健康组织的T细胞应答不对所述患者过度有害，例如前列腺酸性磷酸酶(PAP)(参见：P.W.Kantoff等，N Engl J Med 363:411-422,2010)。
肿瘤相关抗原可以是源自于病原体例如病毒或作为赘生(neoplastic)过程的基础驱动力的其他病原体的抗原，例如来自于人乳头状瘤病毒(HPV)的蛋白质(参见：G.G.Kenter等，N Engl J Med,361:1838-1847,2009)。
新抗原是作为仅存在于肿瘤细胞中而不存在于正常细胞中的突变的结果的抗原(参见：T.N.Schumacher,R.D.Schreiber,Science,348:69-74,2015)。新抗原可能由引起非保守氨基酸变化的核苷酸多态性产生。新抗原可能由插入和/或缺失产生，这可以产生含有插入或缺失或移码突变的肽抗原。新抗原可能通过终止密码子的引入产生，所述终止密码子在其新背景下不被终止密码子机制识别，导致核糖体跳过所述密码子并产生含有单一氨基酸缺失的肽。新抗原可能通过剪接位点处的突变产生，这导致不正确剪接的mRNA转录本。新抗原可能通过倒位和/或染色体易位产生，这导致融合肽。
最后，肿瘤相关抗原可能含有未突变或突变的肽的新颖的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰在正常组织中不存在。
概括来说，肿瘤相关抗原是由赘生细胞产生的任何抗原，其在被T细胞应答靶向后，在理想情况下引起肿瘤生长的有意义的减退或阻止肿瘤发生，并且对健康的非癌性细胞具有有限的影响。
疫苗领域面临的挑战
对于某些癌症的治疗来说，优选的免疫应答是识别肿瘤相关抗原的CD8 T细胞应答(参见：E.Tran等，N Engl J Med 375:2255-2262,2016)和/或CD4 T细胞应答(参见：E.Tran等，Science 344:641-645,2014；和N.N.Hunder等，N Engl J Med,358:2698-2703,2008)，它们可能偏好地是持续、高强度和高功能性(高品质)的(L.Gattinoni等，NatureMedicine,17:1290-1297,2011)。
在对象中诱导针对抗原例如肿瘤相关抗原的T细胞应答的一种手段是通过疫苗接种。目前正在研究众多诱导针对肿瘤相关抗原的CD8和/或CD4 T细胞应答的方法，包括基于DNA/RNA、基于病毒载体和基于肽的方法(例如参见：L.M.Kranz等，Nature 534,396-401,2016；和C.J.Melief,S.H.van der BurgNat Rev Cancer 8:351-360,2008)。然而，产生针对癌症的有效T细胞免疫的主要挑战在于，大多数当前的疫苗方法受到引发CD8 T细胞免疫的免疫原性弱和针对大多数预测的新抗原的应答的抗原广度有限的限制(参见：S.Kreiter等，Nature 520,692-696,2015)。
诱导抗肿瘤T细胞免疫的许多尝试聚焦于使用简单地与不同免疫刺激剂和/或介质(佐剂)混合的合成的肽抗原(参见：C.J.Melief,S.H.van der Burg,Nat Rev Cancer 8:351-360,2008；和M.S.Bijker等，Eur J Immunol 38,1033-1042,2008)或RNA(参见：KranzLM等，Nature 534(7607):396-401,2016和Kreiter S等，Nature 520(7549):692-696,2015)。
然而，产生针对癌症的有效T细胞免疫的主要挑战在于，大多数当前的基于肽抗原或RNA的疫苗方法受到针对肿瘤相关抗原、包括新抗原的应答的强度低和抗原广度有限的阻碍。例如，对于抗原广度来说，当前的黄金标准的基于肽抗原的基于肽的疫苗方法(例如将25个氨基酸的合成的长肽与佐剂聚IC:LC混合)或RNA，诱导针对少于10％的预测的新抗原的T细胞应答(参见：S.Kreiter等，Nature 520,692-696,2015)。因此，需要改进的疫苗方法，特别是基于肽的疫苗方法。
由当代的疫苗技术产生的T细胞应答的低的强度和不良的抗原广度的充分解释仍有待确定，因此，持续的挑战在于，关于递送肽抗原以确保T细胞免疫的可靠引发以用于癌症治疗和预防以及用于其他应用、包括用于治疗和预防传染病的最适参数，目前不存在共识。同样地，基于肽的疫苗用于诱导抑制和耐受的最适参数仍然未知。
当前围绕基于肽的T细胞疫苗的挑战
开发用于传染病和癌症的治疗或预防的疫苗的主要挑战在于，目前关于如何最好地构建基于肽的疫苗以可靠地引发针对大多数抗原的高强度T细胞免疫不存在共识。同样地，关于如何最好地构建基于肽的疫苗以诱导免疫耐受或将免疫应答从诱导过敏症的应答类型转变成无害的应答类型，不存在共识。例如，关于诱导用于治疗或预防癌症和传染病以及用于治疗或预防自体免疫和过敏症的最适T细胞免疫所需的最适肽抗原长度、肽抗原递送的物理格式(例如可溶相比于颗粒)和先天性免疫刺激的类型(例如佐剂选择)，仍存在相当大的争论。事实上，基于肽的疫苗的许多参数对免疫应答的影响，包括CD4和CD8T细胞表位侧接的氨基酸、所使用的连接物化学、电荷等的影响，在很大程度上仍然未被探索。当考虑到必须为每位患者独特地定制个性化疫苗方法时，这个问题特别显著，因此需要用于可靠地引发针对患者特异性抗原的免疫、特别是T细胞免疫的通用的基于肽的疫苗方法。
当前的基于肽的疫苗方法面对的另一个重要挑战在于它们没有考虑到肽抗原的范围广泛的可能的物理和化学特性。例如，个体化癌症疫苗方法需要从每位患者产生独特的一套肽抗原，其可以具有范围广泛的可能的物理和化学特性。对于自体免疫来说，可能将多种不同的抗原鉴定为疾病的病因。因此，诱导耐受的疫苗必须含有对每位患者来说独特的一套肽抗原。问题在于肽抗原组成的可变性可以导致某些基于肽的抗原难以或不能作为本源肽抗原制造，其据估计为长度为25或更多个氨基酸的基于肽的抗原的约10至30％。因此，由于本源肽抗原不能被高效生产或在合成后分离，许多抗原不能被当前的疫苗方法靶向。此外，在当前的基于肽的疫苗方法中不受控制的、影响电荷和溶解性的肽抗原组成的可变性，可以影响疫苗制剂的各种不同属性包括肽的装料和/或导致肽抗原与其他肽抗原或疫苗的其他组分的不利相互作用。
因此，为了克服当前的基于肽的疫苗方法的限制，需要基于肽的疫苗的新颖的组合物及其制造方法，其(i)在制造期间以及在疫苗制剂中考虑到了肽抗原的物理和化学性质的可变性，以确保肽抗原的最适递送，以(ii)在对象中可靠地诱导针对大多数抗原的免疫应答，特别是T细胞应答。这些考虑到了肽抗原可变性并因此可推广到任何肽抗原的疫苗和方法，在个体化癌症治疗领域中将是特别有用的，其中在个体化癌症疫苗中使用的肽抗原的特性可能随患者而变。然而，所述基于肽的疫苗组合物对任何肽抗原的适用性，意味着所述组合物也可用于其他个体化的基于免疫学的治疗，例如用于诱导耐受或调节针对过敏原的免疫应答，以分别治疗自体免疫和过敏症。
发明内容
发明人开发了基于肽的疫苗的新颖的组合物及其制造方法，其克服了当前的基于肽的疫苗方法的至少一个限制。本文公开的新颖的基于肽的疫苗组合物和制造方法考虑到了肽抗原的物理和化学性质的可变性，因此可推广到任何肽抗原。此外，本文公开的新颖的基于肽的疫苗组合物确保了大量不同肽抗原的最适递送，以在对象中诱导免疫应答。
本文公开的新颖的组合物涉及包含肽抗原偶联物的免疫原性组合物。所述肽抗原偶联物包含肽抗原(A)，其直接地或通过任选的连接物(L)和/或分别连接到所述肽抗原的N-或C-端的任选的N-或C-端延长部(B1或B2)间接地连接到形成粒子的疏水分子(H)或预先形成的粒子(P)。
在某些实施方式中，由肽抗原偶联物形成的粒子还包含任选的带电荷分子(C)。在某些实施方式中，所述带电荷分子被连接到所述肽抗原偶联物，以使所述粒子在水性条件下稳定。在其他实施方式中，所述带电荷分子(C)被提供在分开的分子上，并且被并入到由所述肽抗原偶联物形成的粒子中。
某些N-和/或C-端延长部(B1和/或B2)和/或带电荷分子(C)的添加导致通过固相合成进行的基于肽的疫苗制造的出人意料的改进，以及通过提高有机溶剂溶解性提高了纯化的容易性，并出人意料地改进了对由所述肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸和稳定性的控制。这些组合物在T细胞免疫和肿瘤清除中表现出出人意料的改进，特别是在针对肿瘤相关抗原产生的T细胞的强度和广度方面。
本公开的实施方式包括一种肽抗原偶联物，其包含：肽抗原(A)；以及疏水分子(H)或粒子(P)，其中所述肽抗原(A)被直接地或通过连接到所述肽抗原(A)的N-端的N-端延长部(B1)或连接到所述肽抗原(A)的C-端的C-端延长部(B2)间接地连接到所述疏水分子(H)或粒子(P)。本公开的其他实施方式包括一种免疫原性组合物，其包含所述肽抗原偶联物。本公开的其他实施方式包括一种治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括向患有所述疾病的患者施用所述肽抗原偶联物或所述免疫原性组合物。
在某些实施方式中，所述用于癌症治疗的疫苗可以单独地或与其他免疫疗法和癌症治疗方式联合使用，所述其他免疫疗法和癌症治疗方式包括但不限于化疗、检查点抑制剂、辐射和用于对抗癌症的任何其他技术。
因此，本文还公开了一种治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括向患有所述疾病的患者施用本公开的肽抗原偶联物或免疫原性组合物。
此外，本文公开了本公开的肽抗原偶联物或免疫原性组合物在制造用于治疗疾病的药物中的用途。
本文公开的出人意料的发现涉及：
(i)确保T细胞免疫的可靠引发的在癌症疫苗中使用的肽抗原(A)的最适长度；
(ii)便于基于肽的疫苗的制造的肽抗原延长序列、即N-或C-端延长部(B1和/或B2)和/或任选的带电荷分子(C)的用途；
(iii)构成肽抗原偶联物的疏水分子(H)的特征如何影响可制造性以及粒子的尺寸和稳定性，以及这些参数如何影响生物活性；
(iv)为诱导并稳定化最适尺寸的粒子以促进T细胞免疫所需的带电荷分子(C)的组成和肽抗原偶联物的净电荷；
(v)在所述肽抗原偶联物的背景内促进被递送的最小表位的高效加工的酶可降解的肽序列的组成；和/或
(vi)在肽抗原偶联物上递送的具有佐剂性质的配体(例如PRR激动剂)的效能和定性特征如何影响T细胞应答的广度、强度和质量。
附图说明
图1：肽抗原偶联物的某些实施方式的卡通示意图。
图2：用于合成肽抗原偶联物的一般方案，其包括将包含带有叠氮化物的连接物前体X1的肽抗原片段与带有DBCO的连接物前体X2反应，以形成将所述肽抗原(A)连接到所述疏水分子(H)的三唑连接物(L)。
图3：化合物1的合成示意图。
图4：肽抗原(A)和递送由源自于MC38肿瘤细胞系的合成的长肽(SLP或“LP”)或最小(“Min”)CD8 T细胞表位构成的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的分子量和流体力学特性。所述由LP构成的肽抗原(A)被连接到连接物前体X1叠氮基-赖氨酸(K’)，所述X1保持不连接或被连接到由DBCO-W3或DBCO-2BXy3构成的疏水分子(H)。所述由LP构成的肽抗原(A)被连接到延长部(B1)，所述B1被连接到连接物前体X1叠氮基-赖氨酸(K’)，所述X1保持不连接或被连接到由DBCO-W3或DBCO-2BXy3构成的疏水分子(H)。
图5：肽抗原(A)长度、流体力学特性和TLR-7/8激动剂(TLR-7/8a)的共同递送对基于肽的新抗原(Irgq)的免疫原性的影响。将小鼠(N＝5只/组)用包含肽抗原(A)的不同免疫原性组合物进行免疫接种，所述肽抗原(A)基于源自于MC38肿瘤细胞系的抗原Irgq的合成的长肽(LP，有时被称为“SLP”)或最小CD8 T细胞表位(Min，有时被称为ME)，所述肽抗原(A)作为与TLR-7/8a佐剂混合的单独的肽抗原(A)；作为连接到疏水分子(H)W3并与TLR-7/8a佐剂混合的肽抗原(A)；或作为与TLR-7/8a佐剂2BXy3共同递送的连接到疏水分子(H)的肽抗原(A)。在第0和14天对小鼠进行免疫接种，并在第0和25天从全血评估抗原特异性CD8 T细胞应答(总CD8 T细胞的IFNg+的％)。空心圆圈指示肽抗原(A)是可溶的(即非颗粒物)，而实心圆圈指示所述小鼠接受所述肽抗原(A)的颗粒状免疫原性组合物。
图6：肽抗原(A)长度、流体力学特性和TLR-7/8a佐剂的共同递送对基于肽的新抗原(Cpne1)的免疫原性的影响。将小鼠(N＝5只/组)用包含肽抗原(A)的不同免疫原性组合物进行免疫接种，所述肽抗原(A)基于源自于MC38肿瘤细胞系的抗原Cpne1的合成的长肽(LP)或最小CD8 T细胞表位(Min)，所述肽抗原(A)作为与TLR-7/8a佐剂混合的单独的肽抗原(A)；作为连接到疏水分子(H)W3并与TLR-7/8a佐剂混合的肽抗原(A)；或作为与TLR-7/8a佐剂2BXy3共同递送的连接到疏水分子(H)的肽抗原(A)。在第0和14天对小鼠进行免疫接种，并在第0和25天从全血评估抗原特异性CD8 T细胞应答(总CD8 T细胞的IFNg+的％)。空心圆圈指示肽抗原(A)是可溶的(即非颗粒物)，而实心圆圈指示所述小鼠接受所述肽抗原(A)的颗粒状免疫原性组合物。
图7：肽抗原(A)和递送由源自于B16肿瘤细胞系的合成的长肽(SLP或“LP”)或最小(“Min”)CD8 T细胞表位构成的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的分子量和流体力学特性。所述由LP构成的肽抗原(A)被连接到连接物前体X1叠氮基-赖氨酸(K’)，所述X1保持不连接或被连接到由DBCO-W3或DBCO-BXy3构成的疏水分子(H)。所述由LP构成的肽抗原(A)被连接到延长部(B1)，所述B1被连接到连接物前体X1叠氮基-赖氨酸(K’)，所述X1保持不连接或被连接到由DBCO-W3或DBCO-2BXy3构成的疏水分子(H)。
图8：肽抗原(A)长度和连接到疏水分子(H)的TLR-7/8a的效能对肽抗原偶联物的免疫原性的影响。将小鼠(N＝5只/组)用包含肽抗原偶联物的不同免疫原性组合物进行免疫接种，所述偶联物递送连接到疏水分子(H)DBCO-2BXy5或DBCO-2B5的B16肿瘤来源的肽抗原(A)的合成的长肽(LP)、最小CD8 T细胞表位(Min)或所述SLP与Min两者。在第0和14天对小鼠进行免疫接种，并在第24天从全血评估抗原特异性CD4和CD8 T细胞应答(总细胞的IFNg+的％)。条形图示出了每种肽抗原(M47、M44、M30、M25、M33、M27和M08)的平均应答的总和。
图9：连接到疏水分子(H)的TLR-7/8a的效能对针对肽新抗原的文库产生的T细胞应答的免疫原性和广度的影响。将小鼠(N＝5只/组)用包含4种独特的肽抗原偶联物的免疫原性组合物进行免疫接种，所述偶联物递送连接到2BXy5或2B5疏水分子(H)的不同的MC38肿瘤来源的最小CD8 T细胞表位(总共40种表位)。在第0和14天对小鼠进行免疫接种，并在第24天从全血评估抗原特异性CD8 T细胞应答(总CD8 T细胞的IFNg+的％)。示出了针对所述40种表位中每一者的CD8 T细胞应答。包含引起CD8 T细胞应答的最小CD8 T细胞表位的肽抗原(A)的比例被示出在饼状图中。
图10：肽抗原(A)的数目和剂量以及疫苗接种位点的数目对基于肽的新抗原的免疫原性的影响。将小鼠(N＝5只/组)用包含单个最小CD8 T细胞表位(Adpgk)的肽抗原偶联物或包含4种不同的最小CD8 T细胞表位(Dpagt、Cpne1、Adpgk和Aatf)的肽抗原偶联物进行免疫接种。对不同的组来说，肽抗原(A)的剂量和疫苗接种位点的数目是可变的。在第0和14天对小鼠进行免疫接种，并在第24天从全血评估抗原特异性CD8 T细胞应答(总CD8 T细胞的IFNg+的％)。
图11：式V的肽抗原偶联物的示意图。
图12：N-和C-端延长部(B1和B2)对CD8 T细胞活化的体外效能的影响。将具有APC和新抗原(Cpne1)特异性CD8 T细胞的脾细胞在体外用连接到不同延长部(B1和B2)的最小CD8 T细胞表位(Cpne1)肽抗原(A)刺激，并评估它们刺激Cpne1特异性CD8 T细胞的IFNg生产的能力。
图13：图12中评估的肽抗原偶联物。将由最小表位Cpne1(Ser-Ser-Pro-Tyr-Leu-His-Tyr-Leu SEQ ID NO：1)构成的肽抗原(A)连接到包含组织蛋白酶和/或免疫-蛋白酶体切割位点的B1和/或B2延长部中的任一者或两者，另外其中所述肽抗原(A)被直接或通过B2延长部连接到连接物前体X1叠氮基-赖氨酸(K’)，所述X1被连接到DBCO分子，所述DBCO分子被连接到疏水分子(H)2BXy3。
图14：带电荷分子(C)和延长部(B1和/或B2)对递送由最小CD8 T细胞表位构成的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的体内免疫原性的影响。将小鼠(N＝5只/组)在第0和14天用包含不同的带电荷分子(C)和延长部(B1和/或B2)的肽抗原偶联物进行免疫接种，并在第10天(上图)和第24天(下图)从全血评估抗原特异性CD8 T细胞应答(总CD8 T细胞的IFNg+的％)。
图15：N-和C-端延长部(B1和B2)对CD8 T细胞活化的体外效能的影响。将最小CD8T细胞表位(Adpgk)肽抗原(A)连接到不同的延长部(B1和B2)，并评估刺激从Adpgk特异性CD8 T细胞生产IFNg的能力。
图16：示出了图15中评估的不同肽抗原偶联物在半最高活性下的有效浓度(EC50)。较低的EC50指示较高的效能。
图17：N-和C-端延长部(B1和B2)对用于CD8 T细胞活化的体外效能和用于重新(denovo)引发CD8 T细胞应答的体内效能的影响。(A)将最小CD8 T细胞表位(Adpgk)肽抗原(A)连接到不同的延长部(B1和B2)，并评估刺激从Adpgk特异性CD8 T细胞生产IFNg的能力(B)。在单次免疫接种后第13天评估具有连接到疏水分子(H)2B3W2的不同N-和C-端延长部(B1和B2)的肽抗原偶联物的能力。
图18：肽抗原偶联物净电荷和疏水分子组成对流体力学特性的影响。通过动态光散射评估了0.1mg/mL或0.5mg/mL的多种不同的式V的肽抗原偶联物在pH 7.4的PBS中的流体力学特性。报告了所述肽抗原偶联物的净电荷和数均或重均粒子直径。通过在490nm处测量所述溶液的吸收值来确定浊度。浊度>0.04指示团集。
图19：肽抗原偶联物净电荷对流体力学特性的影响。(A)通过动态光散射评估了净电荷对以0.1mg/mL或0.5mg/mL悬浮在pH 7.4的PBS中的多种不同的式V的肽抗原偶联物的流体力学特性的影响。(B)图B示出了图(A)中示出的数据的选展列表。作为肽抗原偶联物递送的抗原的(C)GRAVY频率分布和(D)电荷频率分布。(E)被制备为式V的肽抗原偶联物的匹配的LP新抗原(n＝39)的粒子尺寸，所述偶联物自组装成具有+6或≥+8个净电荷的共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(“SNP-7/8a”)。(F)肽抗原偶联物净电荷和亲水性总平均值(GRAVY)对流体力学特性的影响。通过动态光散射评估了以0.1mg/mL悬浮在pH 7.4的PBS中的大量不同肽抗原偶联物的流体力学特性。报告了数均粒子直径随净电荷和GRAVY值的变化。
图20：肽抗原偶联物净电荷和疏水分子(H)的长度和组成对式V的肽抗原偶联物的流体力学特性的影响。通过动态光散射评估了以0.1mg/mL悬浮在pH 7.4的PBS中的不同肽抗原偶联物的流体力学特性，所述肽抗原偶联物具有不同的净电荷和疏水分子组成，并递送基于新抗原的最小表位(Min)模型Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser(SEQ ID NO：2)(“Adpgk”)。(A)对于4种不同的疏水分子(2B2W8、2BXy5、2B5、W5)，报告了数均粒子直径随所述肽抗原偶联物的净电荷的变化。(B)示出了自组装成纳米粒子的具有+6净电荷的肽抗原偶联物(“Min-SNP-7/8a”)和递送相同的肽抗原(A)但具有0的净电荷的组装成微粒/团聚体的肽抗原偶联物(“Min-MP-7/8a”)的尺寸分布数据。
图21：净电荷对递送疏水性肽抗原的式V的肽抗原偶联物的流体力学特性的影响。(A)来自于4种鼠类肿瘤模型(B16.F10、MC38、3123和Panc02)的1,377种LP新抗原的亲水性总平均值(GRAVY)分布图。(B)将在图(A)中鉴定到的疏水性最高的LP新抗原(红色实心圆圈)制备成作为式V的肽抗原偶联物递送的LP和Min，所述肽抗原偶联物自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(“SNP-7/8a”)，并评估净电荷(绝对值)对粒子尺寸的影响。粒子尺寸通过动态光散射，使用以0.5mg/mL悬浮在pH 7.4的PBS中的肽抗原偶联物来评估。报告了重均粒子直径随所述肽抗原偶联物的净电荷的变化。
图22：带电荷分子(C或“C区块”)和疏水分子(H或“H区块”)的组成对用于产生针对作为式V的肽抗原偶联物递送的新抗原最小表位Adpgk的CD8 T细胞应答的免疫原性的影响。(A-E)将递送最小表位Adpgk的具有不同的带电荷分子组成(聚(K)、聚(R)、聚(D)或无)和疏水分子组成(W5、2BXy3W2或2B3W2)的肽抗原偶联物，在第0、14和28天以不同剂量施用于小鼠(N＝3只/组/剂量)，并在随后的连续时间点从全血评估新抗原(Adpgk)特异性CD8 T细胞应答。
图23：带电荷分子(C或“C区块”)的组成对用于产生针对作为式V的肽抗原偶联物递送的新抗原最小表位Adpgk的CD8 T细胞应答的免疫原性的影响。(A)将递送最小表位Adpgk的具有基于聚(K)、聚(D)或PEG的C区块的肽抗原偶联物，在第0、14和28天以不同剂量施用于小鼠(N＝3只/组/剂量)，并在第36天从全血评估新抗原(Adpgk)特异性CD8 T细胞应答(B)。
图24：施用途径对由肽抗原偶联物(“SNP-7/8a”)产生的CD8T细胞应答的影响。将递送新抗原最小表位(Adpgk＝Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met(SEQ ID NO：77))的具有聚(K)带电荷分子(C)和2B3W2疏水分子(H)的肽抗原偶联物，在第0、14和28天施用于小鼠，并在第36天从全血评估新抗原(Adpgk)特异性CD8 T细胞应答。
图25：疏水分子(H)的组成和肽抗原偶联物的流体力学特性对CD4和CD8 T细胞应答的影响。将小鼠(N＝5只/组)用包含最小CD8T细胞表位和CD4 T细胞表位(PADRE表位)的、作为带有不同量和效能的TLR-7/8激动剂的微粒(MP)(直径>500nm)或纳米粒子(NP)胶束(直径<200nm)的免疫原性组合物进行免疫接种。在第0和14天对小鼠进行免疫接种，并在第24天从全血评估抗原(Adpgk)特异性(A)CD8 T细胞应答(总CD8 T细胞的IFNg+的％)和(B)PADRE特异性CD4 T细胞应答。
图26：具有聚(K)带电荷分子(C)和基于2B3W2的疏水分子(H)并递送肽抗原的LP或Min表位形式的肽抗原偶联物的卡通和化学示意图。
图27：肽新抗原的颗粒递送增强针对基于肽抗原(A)的新抗原的CD8 T细胞应答。(A)作为本源LP、连接到疏水分子(2B3W2)并组装成微粒的LP(“MP-7/8a”)或被合成为式V的肽抗原偶联物并自组装成纳米粒子的LP(“SNP-7/8a”)的不同新抗原的浊度。浊度>0.05OD指示团集。(B-E)将小鼠在第0和14天用与聚ICLC混合的本源LP或作为MP-7/8a或SNP-7/8a递送的LP进行免疫接种，并在第28天从全血评估CD8 T细胞应答。对数标尺上的数据被报告为具有95％CI的几何平均值；用于统计显著性的多组比较使用单向或双向ANOVA来确定；ns＝不显著；*，p＝0.05；**，p＝0.01。
图28：解释了自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子的肽抗原偶联物(SNP-7/8a)的免疫原性提高的机制。(A-C)将最小表位Adpgk荧光标记，然后作为与小分子TLR-7/8a混合的可溶性肽(7/8a)、与MP-7/8a混合或共价连接到MP-7/8a或SNP-7/8a的可溶性肽，在第0天皮下施用于小鼠的后足垫中。在随后的连续时间点收集引流所述免疫接种位点的淋巴结(N＝5个/时间点/组)，并评估肽的数量(E)、以每个细胞计淋巴结APC摄取的肽(F)和IL-12p40细胞因子生产(G)。数据被报告为平均值±SEM。用于统计显著性的多组比较使用单向或双向ANOVA来确定；ns＝不显著；*，p＝0.05；**，p＝0.01。
图29：作为自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子的式V的肽抗原偶联物(SNP-7/8a)，作为LP或Min递送的基于肽的新抗原的免疫原性。不同的基于肽的新抗原被制备成LP或Min，作为其中带电荷分子(C)是聚(赖氨酸)并且疏水分子(H)是2B3W2的自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子的肽抗原偶联物(被称为“SNP-7/8a”)递送。将小鼠(N＝7/组)在第0和14天用连接到SNP-7/8a的LP或Min形式的基于肽的新抗原进行免疫接种。在第28天从全血评估(A)CD8T细胞应答和(B)CD4 T细胞应答。对数标尺上的数据被报告为具有95％CI的几何平均值；用于统计显著性的多组比较使用单向或双向ANOVA来确定；ns＝不显著；*，p＝0.05；**，p＝0.01。
图30：相比于与聚ICLC混合的本源LP，作为基于LP的式V的肽抗原偶联物递送的基于肽的新抗原的免疫原性，所述肽抗原偶联物中带电荷分子(C)是聚(赖氨酸)并且疏水分子(H)是2B3W2，并且自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(被称为“SNP-7/8a”)。将小鼠在第0和14天进行免疫接种，并在第28天从全血评估CD8 T细胞应答。
图31：免疫原性和预测的结合亲和性之间的关系。(A)当作为其中疏水分子(H)是聚合物-TLR-7/8a的肽抗原偶联物递送时，用于产生CD8 T细胞应答的最小表位(N＝179)的免疫原性对使用免疫表位数据库(IEDB)一致性算法预测的结合亲和性作图。(B)基于0.5的一致性评分的截止值或500nM结合剂的不同MHC-I结合预测算法的灵敏度和特异性的受试者工作特征(ROC)曲线。
图32：作为自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(SNP-7/8a)的式V的肽抗原偶联物上的肽抗原(A)递送的自身抗原和新抗原，引发CD8和CD4 T细胞介导的已建立的黑素瘤的清除。将具有已建立的B16.F10肿瘤的小鼠在第2、9和16天，用PD1和递送Adpgk LP(在B16.F10中不存在的CD8 T细胞表位)、自身抗原Trp1、最小CD8 T细胞表位或具有CD4 T细胞表位的新抗原M30 LP的SNP-7/8a治疗。
图33：通过皮下和静脉内途径施用的作为自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(SNP-7/8a)的式V的肽抗原偶联物递送的新抗原，引发强健的CD8 T细胞介导的已建立的肿瘤的清除。将具有已建立的MC38肿瘤的小鼠在第9和16天通过皮下或静脉内途径用AdpgkLP-SNP-7/8a疫苗接种，并在其后的连续时间点评估肿瘤体积。
图34：作为自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(SNP-7/8a)的式V的肽抗原偶联物递送的新抗原引发CD8 T细胞介导的已建立的黑素瘤的清除。将具有已建立的B16.F10肿瘤的小鼠在第1、8和15天，用PDL1和递送Med12(具有CD8 T细胞表位的MC38新抗原)、Trp1(具有CD8 T细胞表位的B16自身抗原)或M39(具有CD8 T细胞表位的B16新抗原)的SNP-7/8a治疗。(A)监测肿瘤生长，并且(B)在第17天评估CD8 T细胞应答。
图35：作为自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(SNP-7/8a)的式V的肽抗原偶联物递送的病毒(HPV)抗原引发CD8 T细胞介导的HPV+肿瘤的排斥。(A&B)将小鼠在第0和14天用作为式V的肽抗原偶联物递送的源自于HPV的不同的E6和E7肽最小表位(min)进行免疫接种，在所述肽抗原偶联物中带电荷分子(C)是聚(赖氨酸)并且疏水分子(H)是2B3W2，其自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(被称为“SNP-7/8a”)。(A)在第28天评估CD8 T细胞应答并将小鼠用HPV+癌细胞系(TC1)激惹，并且(B)在激惹后第14天评估肿瘤体积。
图36：多抗原粒子的粒子尺寸和稳定性。(A)将作为具有多种电荷(-6至+6)和亲水性(GRAVY从-2至+2)的肽抗原(A)(A1至A9)的新抗原LP(B)合成为式V的肽抗原偶联物，其中带电荷分子(C)是聚(K)，B1是VR，B2是SPVZ，X1连接物前体是叠氮基-赖氨酸(“X”也被称为K’)并且疏水分子(H)是2B3W2，其自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(SNP-7/8a)。将所述肽抗原偶联物以0.5mg/mL悬浮在pH 7.4的PBS中，并评估浊度(OD 490nm)和粒子尺寸(直径，nm)。(C)将包含多种不同肽抗原偶联物(A1-A9)的多抗原粒子在DMSO溶液中以不同比例混合在一起(场景1-7)，然后以0.5mg/mL悬浮在pH 7.4的PBS中，并评估浊度(OD 490nm)和粒子尺寸(直径，nm)。每个场景的构成所述多抗原粒子的每种肽抗原偶联物的百分率提供在表中。
图37：示出了由递送肿瘤相关自身抗原、传染病(HIV)抗原和外来抗原的式V的肽抗原偶联物诱导的T细胞应答。
图38：示出了包含不同的带电荷分子(C)或连接到式III的佐剂的基于式II的聚(氨基酸)的不同的疏水分子(H)的式V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和生物活性。
图39：示出了包含连接到不同的PRR激动剂的基于式II的聚(氨基酸)的不同的疏水分子(H)的式V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和生物活性。
图40：示出了式V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和生物活性，其中使用不同的连接物化学(酰胺和硫醚)将肽抗原(A)连接到疏水分子(H)。
图41：示出了包含基于脂肪酸、脂质和胆甾醇的不同的疏水分子(H)的式V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和生物活性。
图42：示出了包含基于A-B型二嵌段共聚物的不同的疏水分子(H)的式IV和V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和生物活性。
图43：示出了基于连接到预先形成的粒子(P)的肽抗原(A)的式V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和稳定性。
图44：示出了用于诱导耐受的递送自体抗原的肽抗原偶联物的粒子尺寸和生物活性。
图45：示出了包含A-H+C-H或A-H(C)(式VI)的粒子的粒子尺寸和生物活性。
详细描述
下文给出了术语和方法的细节，以便就用于在对象中诱导免疫应答的化合物、组合物、方法及其用途而言提供更大的清晰度，目的在于在本公开的实践中指导本领域普通技术人员。本公开的术语被理解为可用于为特定实施方式提供更好描述的目的，并且不应该被当作是限制性的。
约：在本公开的上下文中，“约”意味着从设定的量加或减5％。例如，“约10”是指9.5至10.5。“约5:1”的比例是指4.75:1至5.25:1.的比例。
佐剂：添加到疫苗以提高或改变抗原的免疫原性的任何物质。佐剂可以是递送系统，例如基于无机盐(例如被称为铝佐剂的氢氧化铝或磷酸盐)的粒子、油包水或水包油乳液或聚合物粒子(例如PLGA)，其中抗原被简单地与其混合或吸附到其上、并入在其中或间接地或通过共价相互作用直接地连接到其上。或者，佐剂可以是结合到限定受体并诱导下游信号传导途径的化学限定分子，包括模式识别受体(PRR)激动剂例如Toll样受体(TLR)的合成或天然存在的激动剂、干扰素基因的刺激剂(STING)、结合核苷酸的寡聚化结构域样受体(NLR)、视黄酸可诱导的基因-I样受体(RLR)或C-型凝集素受体(CLR)，以及生物分子(“生物佐剂”)例如IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L、4-1BBL。核苷酸碱基的小分子类似物例如分别结合到Toll样受体-7(TLR-7)和TLR-7/8a的羟基腺嘌呤和咪唑并喹啉，以及TLR-2/6、TLR-4、STING和NOD的激动剂，在本公开中被用作示例性PRR激动剂。本领域普通技术人员对佐剂是熟知的(参见：Perrie等，Int JPharm 364:272-280,2008和Brito等，Journal of controlled release,190C:563-579,2014)。一般来说，本文中列出的任何PRR激动剂或生物佐剂可以通过任何适合的手段联结到本公开的肽抗原偶联物。
施用：通过任何有效的途径向对象提供或给予药剂，例如本文中所描述的包含肽抗原偶联物的免疫原性组合物。
示例性的施用途径包括但不限于口服、注射(例如皮下、肌肉内、真皮内、腹膜内和静脉内)、透皮(例如局部)、鼻内、阴道和吸入途径。
“化合物的施用”和“施用化合物”应该被理解为意味着提供本文中所描述的化合物、化合物的前药或药物组合物。所述化合物或组合物可以由另一个人施用于所述对象，或者它可以由所述对象自我施用。
抗原呈递细胞(APC)：将结合到I类或II类MHC分子的抗原呈递给T细胞的任何细胞，包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞和朗格汉斯细胞。
抗原：含有结合到T细胞或B细胞受体的表位并能够在对象中刺激免疫应答、特别是B细胞应答和/或T细胞应答的任何分子。所述表位可以由含有能够与特定B细胞或T细胞蛋白的组分相互作用的表位的肽、糖肽、脂质或任何适合的分子构成。这些相互作用可以通过免疫细胞产生应答。“表位”是指肽抗原的与B和/或T细胞蛋白、即B细胞受体和T细胞受体发生相互作用的区域。
在本公开的实施方式中使用的抗原可以选自病原体、癌细胞、自体抗原或过敏原。在某些实施方式中，所述抗原可以是基于肽的抗原，其可以包括来自于病原体(例如病毒、细菌或真菌)或感兴趣的组织(例如癌细胞)的多肽或蛋白质的区域。在其他实施方式中，所述抗原可以是源自于病原体的完整蛋白质或糖蛋白或所述蛋白质或糖蛋白的肽或糖肽片段。在其他实施方式中，所述抗原可以是主要由肿瘤组织(而不是健康组织)表达的蛋白质或蛋白质的肽片段，并且是肿瘤相关抗原。在其他实施方式中，所述抗原是与自体免疫相关的蛋白质或肽。在另一些其他实施方式中，所述抗原是与过敏症相关的蛋白质或糖蛋白。
许多这样的抗原可以按照本发明的实施方式使用，并且在本文中更详细地讨论。
芳族：芳族化合物是不饱和的环状环，其具有奇数对的在形成所述环的碳或氮原子之间离域的π轨道电子。芳族氨基酸包括侧链含有芳族基团的氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。苯这种含有三个双键的6碳环是一种原型芳族化合物。苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)是原型芳族氨基酸。芳基可以是指芳族取代基，并且芳基胺可以是指包含胺的芳族基团。示例性的芳族胺是苯胺。芳族杂环是指包含的环状环结构包含碳和另一种原子例如氮、氧或硫的芳环。核苷酸碱基例如腺嘌呤和胞嘧啶，是示例性的芳族杂环。
生物相容的：如果材料当与体液、细胞或组织相接触时发挥极小的破坏或宿主应答效果，则它们被认为是生物相容的。
生物相容的基团可以含有包括来自于下述类别的化学组成部分：脂基，脂环基，杂脂基，杂脂环基，芳基或杂芳基。然而，取决于分子组成，这些组成部分不总是生物相容的。
或者，可以利用术语“生物相容性”来意指与识别蛋白和/或生物系统的其他组分(例如天然存在的抗体、细胞蛋白包括糖蛋白或细胞)，或特别地旨在引起与生物系统的组分的相互作用的物质或官能团(例如药物和前药)的极小相互作用，使得所述相互作用的结果不是实质上负面的或破坏性的。
CD4：分化群4，一种与其他细胞的表面上呈递的II类MHC分子相互作用的表面糖蛋白。一部分T细胞表达CD4，并且这些细胞通常被称为辅助性T细胞。
CD8：分化群8，一种与其他细胞的表面上呈递的I类MHC分子相互作用的表面糖蛋白。一部分T细胞表达CD8，并且这些细胞通常被称为细胞毒性T细胞或杀伤性T细胞。
电荷：物质的一种物理性质，这种物理性质影响所述物质与其他原子和分子包括溶质和溶剂的相互作用。带电荷物质经历来自于其他类型的带电荷物质以及不保有全整数电荷值的分子例如极性分子的静电力。相同电荷的两个带电荷分子彼此排斥，而不同电荷的两个带电荷分子彼此吸引。电荷通常以正或负整数单位描述。
带电荷分子(C)：带电荷分子(C)是指具有一个或多个带正电荷或负电荷的官能团的任何分子。构成所述带电荷分子的官能团可以具有部分或全整数电荷值。带电荷分子可以是具有单个带电荷官能团或多个带电荷官能团的分子。官能团可以永久带电荷，或者构成所述带电荷分子的官能团可以随着pH而具有电荷。所述带电荷分子可以包含带正电荷官能团、带负电荷官能团或带正电荷和负电荷的官能团两者。所述带电荷分子的净电荷可以是正、负或中性的。分子的电荷可以在分子的路易斯结构和本领域技术人员已知的公认方法的基础上容易地估算。电荷可能由诱导效应产生，例如键合在一起的电子亲和性有差异的原子可能产生极性共价键，产生带部分负电荷的原子和带部分正电荷的原子。例如，键合到氢的氮在氮上产生部分负电荷，并在所述氢原子上产生部分正电荷。或者，当指派给原子的电子数目小于或等于所述原子的原子序数时，该原子可以被认为具有全整数电荷值。官能团的电荷通过将构成所述官能团的每个原子的电荷相加来确定。带电荷分子(C)的净电荷通过将构成所述分子的每个原子的电荷相加来确定。本领域技术人员熟悉通过分别将分子或官能团中每个原子的形式电荷相加来估算分子或各个官能团的电荷的方法。
带电荷分子(C)可以包含带负电荷的官能团，例如酸的共轭碱在生理pH下、例如在约7.4的pH下所发生的情况(例如具有小于约6.5的pKa的官能团)。它们包括但不限于带有羧酸根、硫酸根、磷酸根、氨基磷酸根和膦酸根的分子。带电荷分子可以包含带正电荷的官能团，例如碱的共轭酸在生理pH下所发生的情况(例如其中所述碱的共轭酸的pKa大于约8.5的官能团)。它们包括但不限于带有伯胺、仲胺和叔胺以及铵、胍的分子。带电荷分子可以包含具有不依赖于pH的电荷的官能团，包括季铵、鏻和锍官能团。在某些实施方式中，所述带电荷分子是由带负电荷或正电荷的氨基酸或带负电荷和正电荷的氨基酸两者构成的聚(氨基酸)。在某些实施方式中，所述带负电荷氨基酸是谷氨酸或天冬氨酸。在其他实施方式中，所述带正电荷氨基酸是赖氨酸或精氨酸。本领域技术人员认识到许多这样的实施方式是可行的。
点击化学反应：可以是指在产生极少、生物相容和/或无害副产物的高得率反应中，在温和条件下将两种化合物联结在一起的生物正交反应。在本公开中使用的示例性的点击化学反应是提供在连接物前体X1上的叠氮化物基团与提供在连接物前体X2上的炔烃的反应，其通过张力促进的[3+2]叠氮化物-炔烃环加成反应形成三唑连接物(L)。
有效量：诱导所需应答需要的量。例如，诱导例如针对肽抗原偶联物的免疫应答所需的单独或与一种或多种其他药剂一起使用的药剂的量。
延长部：术语延长部在本文中用于描述连接到肽抗原(A)的N-或C-端的分子，其由氨基酸、非天然氨基酸、亲水性环氧乙烷单体(即PEG)、疏水性烷烃链或其组合构成，并起到调节所述肽抗原(A)的降解速率的作用。连接到所述肽抗原的N-端的延长部被称为B1，并且连接到所述肽抗原的C-端的延长部被称为B2。所述延长部(B1和B2)原则上起到控制所述肽抗原的降解速率的作用，但也可以执行任一种或多种另外的功能。在某些实施方式中，延长部(B1和/或B2)可以被连接到另一个分子例如带电荷分子(C)或疏水分子(H)，并起到连接物以及控制所述肽抗原(A)从所述其他分子释放的速率的作用。在另外的实施方式中，延长部(B1和/或B2)起到在任两个异源分子之间提供距离即间隔的作用。在其他实施方式中，延长部(B1和/或B2)起到为所述肽抗原偶联物提供疏水或亲水性质的作用。在另一些其他实施方式中，可以对用作连接物的所述延长部(B1和/或B2)的组成进行选择，以在所述肽抗原(A)与异源分子之间提供刚性或柔性。在优选实施方式中，延长部(B1和/或B2)是肽序列，其被选择成被酶例如蛋白酶识别并水解。注意，所述B1和B2延长部也可能分别被称为B1和B2连接物或B1和B2。适合于本公开的实践的延长部的具体组成被描述在全文各处。
接枝聚合物:可以被描述为由一种组成的聚合物连接到第二种不同组成的聚合物的侧链而产生的聚合物。通过共聚单体连接到第二聚合物的第一聚合物是接枝共聚物。通过末端基团连接到第二聚合物的第一聚合物可以被描述为嵌段聚合物(例如A-B型二嵌段)或末端接枝聚合物。
亲水性指数/GRAVY值：是表示氨基酸的疏水或亲水特征的数字。存在着各种不同的标度可用于描述构成肽的氨基酸的相对疏水和亲水特征。在本公开中，使用Kyte和Doolittle的亲水性标度(Kyte J,Doolittle RF,J.Mol.Biol 157:105–32,1983)来计算构成肽抗原偶联物、包括所述肽抗原(A)、基于肽的N-和C-端任选的延长部(B1和B2)和任选的带电荷分子(C)的氨基酸序列的亲水性总平均值(GRAVY)值，有时被称为GRAVY评分。肽的GRAVY值是构成所述肽的所有氨基酸的亲水性值之和除以所述肽的长度(即氨基酸数目)。所述GRAVY值是相对值。所述GRAVY值越大，认为肽序列越疏水，而所述GRAVY值越低，认为肽序列越亲水。
亲水：是指物质在水性介质中自由分散的倾向性。如果物质具有与其他亲水性物质相互作用的偏好性并避免与疏水性物质相互作用，则它被认为是亲水的。在某些情况下，亲水性可用作相对术语，例如同一个分子取决于正与其比较的分子，可以被描述为亲水或不亲水的。亲水分子通常是极性和/或带电荷的，并具有良好的水溶性，例如可溶至高达0.1mg/mL或更高。
疏水：是指物质避免与水接触的倾向性。如果物质具有与其他疏水性物质相互作用的偏好性并避免与亲水性物质相互作用，则它被认为是疏水的。疏水性是相对术语；同一个分子取决于正与其比较的分子，可以被描述为疏水或不疏水的。疏水分子通常是非极性和不带电荷的，并具有不良的水溶性，例如不溶至低达0.1mg/mL或更低。
疏水配体：是结合到生物受体并具有疏水特征的分子。在某些实施方式中，疏水配体沿着聚合物的骨架排列，由此为它连接到的聚合物提供疏水特性。在某些实施方式中，所述疏水配体是模式识别受体激动剂，其具有有限的水溶性并因此可以被描述为疏水的。在另外的实施方式中，所述疏水配体是TLR-7或TLR-7/8激动剂例如咪唑并喹啉。
疏水分子(H)：在本公开中，术语“疏水分子”(H)被用作泛称，以描述具有有限的水溶性或两亲性特征的分子，其可以被连接到肽抗原，产生在水性条件下形成粒子的肽抗原偶联物。在这种情形中，所述疏水分子(H)由于其不良的溶解性或组装成粒子的倾向性，在水性条件下，在一定的温度和pH范围内促进粒子组装。
本文中所描述的疏水分子(H)包括可以形成超分子结构例如胶束或形成双层的层状或多层结构(例如脂质体或聚合物囊体)的两亲性分子，以及完全不溶并独自形成团聚体的分子。所述分子的疏水特征可以是温度和/或pH响应性的。在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是在低温下可水溶，但在高于例如20℃的温度例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40℃下不溶或形成胶束的聚合物。在其他实施方式中，所述疏水分子(H)是在低pH例如低于6.5的pH下可水溶，但在例如高于6.5的pH下不溶的聚合物。疏水分子(H)的实例包括但不限于脂肪酸、胆甾醇及其衍生物、长链脂族化合物、脂质和各种不同的聚合物例如聚苯乙烯、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，以及主要由疏水氨基酸构成的聚(氨基酸)。在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是附连有多个疏水配体的亲水聚合物。在本文中公开了可用于本公开的实践的各种不同的疏水分子。
免疫应答：作为直接或例如通过细胞或细胞因子介导的间接刺激的结果，免疫系统的细胞例如B细胞、T细胞或单核细胞的活性变化。在一个实施方式中，所述应答特异性针对特定抗原(“抗原特异性应答”)。在一个实施方式中，免疫应答是T细胞应答，例如CD4 T细胞应答或CD8 T细胞应答。在一个实施方式中，免疫应答导致其他T细胞后代的产生。在一个实施方式中，免疫应答导致T细胞的移动。在另一个实施方式中，所述应答是B细胞应答，并导致特异性抗体的产生或其他B细胞后代的产生。在其他实施方式中，所述应答是抗原呈递细胞应答。“增强免疫应答”是指作为肽抗原偶联物的一部分的佐剂与免疫原性药剂例如肽抗原的共同施用，其中与不存在所述佐剂的情况下向所述对象施用所述免疫原性药剂相比，所述佐剂提高针对所述免疫原性药剂的所需免疫应答。在某些实施方式中，使用抗原来刺激免疫应答，导致杀死病毒感染的细胞或癌细胞的细胞毒性T细胞的活化。在某些实施方式中，使用抗原来诱导耐受或免疫抑制。耐受原性应答可以由T细胞或B细胞对抗原的无应答性产生。抑制性免疫应答可以由调节性细胞例如下调免疫应答即抑制所述免疫应答的调节性T细胞的活化产生。在不存在佐剂的情况下施用于患者的抗原通常是耐受原性或抑制性的，并且与佐剂一起施用的抗原通常是刺激性的并引起免疫细胞的召集、扩增和活化。
免疫原性组合物：包含抗原和任选地佐剂的材料的剂型，其诱导针对所述抗原的可测量的免疫应答。
配体：是描述结合到生物受体的任何分子的通用术语。模式识别受体激动剂是结合到模式识别受体的特定类型的配体，并且也可以被称为佐剂或具有佐剂性质的配体。例如，PRR激动剂是结合到PRR例如TLR的配体。结合到PRR(或PRRa)的配体也可以被称为佐剂、分子佐剂、佐剂分子或具有佐剂性质的配体。在水中具有有限溶解性的配体可以被称为疏水配体，而水溶性配体可以被称为亲水配体。具有佐剂性质的疏水配体或亲水配体可以分别被称为疏水佐剂或亲水佐剂。
连接或偶联：术语“连接”或“偶联”意味着直接或间接联结在一起。第一组成部分可以被共价或非共价连接到第二组成部分。在某些实施方式中，第一分子通过共价键连接到另一个分子。在某些实施方式中，第一分子通过静电吸引连接到另一个分子。在某些实施方式中，第一分子通过偶极-偶极力(例如氢键键合)连接到另一个分子。在某些实施方式中，第一分子通过范德华力(也被称为伦敦力)连接到另一个分子。第一分子可以通过这些偶联的任何和所有组合连接到另一个分子。
所述分子可以被间接连接，例如通过使用连接物。所述分子可以通过插入独立地非共价结合到两个分子的组分，而间接地连接。
当在本文中使用时，“连接的”及其变化形式是指维持分子处于化学或物理缔合状态下，包括在免疫接种后，至少直至它们接触细胞、特别是免疫细胞之前。
在某些实施方式中，连接的组分被缔合，使得所述组分不可彼此自由地分散，至少直至接触细胞例如免疫细胞之前。例如，两种组分可以被彼此共价连接，使得所述两种组分不能分开地分散或扩散。在优选实施方式中，肽抗原偶联物由直接或通过延长部(B1或B2)间接地共价连接到疏水分子(H)或粒子(P)的肽抗原(A)构成。包含疏水分子(H)的肽抗原偶联物在水性条件下组装成粒子，其中两个或更多个肽抗原偶联物缔合以形成稳定的粒子，其中所述各个肽抗原偶联物和构成所述肽抗原偶联物的组分在遇到细胞例如免疫细胞之前不能分散或扩散。
连接被具体地与例如可以在常规疫苗例如含有与佐剂混合的水溶性肽抗原的疫苗中存在的抗原与佐剂的简单混合物区分开。在简单混合物中，所述组合可以在疫苗接种的组织内及其外自由地独立分散。
连接物、连接物前体和连接物(L)：连接物是将两个或更多个组成部分连接或偶联或联结在一起的分子或原子团。本文公开的肽抗原偶联物是包含多种不同功能性组分(肽抗原(A)、疏水分子(H)或粒子(P)、任选的延长部(B1和/或B2)、任选的带电荷分子(C)、任选的连接物(L)或任选的佐剂等)的复杂分子，所述组分可以通过任何适合的手段连接或联结在一起。例如，被连接到疏水分子(H)的肽抗原(A)可以在所述肽抗原(A)与疏水分子(H)之间使用连接物。所述肽抗原(A)可以直接地或通过任何适合的手段包括任何适合的连接物经连接物(L)、延长部(B1或B2)或带电荷分子(C)间接地连接到疏水分子(H)或粒子(P)。在某些实施方式中，所述连接物被共价附连到被偶联的两个组成部分。在某些实施方式中，连接物是双功能的，意味着所述连接物在两个位点处包括官能团，其中所述官能团被用于将所述连接物偶联到所述两个组成部分。所述两个官能团可以是相同的(其可以被认为是同双功能连接物)或不同的(其可以被认为是异双功能连接物)。例如，在某些实施方式中，包含异双功能连接物并且还包含炔烃和酸的连接物前体X2，被用于连接带有胺的疏水分子(H)和连接到带有叠氮化物的连接物前体X1的肽抗原(A)；所述连接物前体X2的酸和炔烃分别与所述胺和叠氮化物反应以形成酰胺和三唑键，由此连接所述两个异源分子。在某些实施方式中，所述包含异双功能连接物的连接物前体X2是连接到酸的二苯并环辛炔(DBCO)分子。在其他实施方式中，所述连接物前体是联结胺和硫醇的连接到马来酰亚胺的酸或联结两个胺的双(羧酸)。在另一些其他实施方式中，可以使用三功能或多功能连接物，其中所述连键可以是相同或不同的。在其他实施方式中，使用可切割的N-或C-端肽延长部(B1或B2)将肽抗原(A)连接到疏水分子(H)。在某些实施方式中，所述可切割的肽延长部(B1或B2)是异双功能的，例如B2延长部的N-端胺被连接到所述肽抗原(A)的C-端，并且所述B2延长部的C-端羧基被直接连接到疏水分子(H)。延长部(B1或B2)可以起到连接物的作用，但不是所有的连接物都是延长部。
连接物(L)是连接物的特定亚类，其从连接物前体X1与连接物前体X2的反应产生，并具体地起到将所述肽抗原(A)直接或通过延长部(B1或B2)或带电荷分子(C)间接地联结到疏水分子(H)或粒子(P)的作用。连接物执行位点选择性偶联，即将所述肽抗原(A)与疏水分子(H)或粒子(P)联结或连接在一起的特定功能。通常在固相肽合成期间，连接物前体X1可以被直接或通过延长部(B1或B2)间接地连接到肽抗原。注意，直接连接到肽抗原(A)的N-或C-端的连接物前体X1不被当作延长部，因为它们不具体地起到调节所述肽抗原的降解速率的作用。尽管所述连接物前体X1可能对所述肽抗原(A)的降解速率具有一定影响，但所述连接物前体X1不被选择成调节所述肽抗原(A)的降解速率或它从其他分子的释放，而是具体地起到将所述肽抗原(A)联结到所述疏水分子(H)或粒子(P)的作用。
在某些实施方式中，连接物前体X1可以在固相肽合成期间被连接到肽抗原(A)；所述连接可以是直接的，或通过延长部(B1或B2)、包括可降解的肽连接物而是间接的。通常，直接或间接连接到肽抗原(A)的连接物前体X1被选择成促进与提供在疏水分子(H)或粒子(P)上的连接物前体X2的生物正交反应。生物正交反应允许所述肽抗原(A)位点特异性连接到所述疏水分子(H)或粒子(P)，而不引起构成所述肽抗原(A)的任何氨基酸的修饰。允许生物正交反应的优选的连接物前体X1包括带有叠氮化物或炔烃的X1。允许位点选择性反应性的其他连接物前体X1，取决于所述抗原的组成，包括硫醇、肼、酮和醛。在几个实施方式中，所述连接物前体具有叠氮化物官能团。在某些实施方式中，所述连接物前体X1是带有叠氮化物的非天然氨基酸，例如叠氮基-赖氨酸Lys(N3)。在这些实施方式中，连接到带有叠氮化物官能团的连接物前体X1的肽抗原(A)可以与提供在疏水分子(H)上的带有炔烃的连接物前体X2反应，导致联结所述肽抗原(A)和疏水分子(H)的三唑连接物的形成。各种不同的连接物前体(X1和X2)和连接物在本文中各处描述。
在本文中，所述连接物和连接物前体X1两者都可以被称为标签(T)，尽管标签(T)的情形被用于分辨所述标签(T)是连接物还是连接物前体(X1)。直接或通过所述任选的延长部(B1或B2)或任选的带电荷分子(C)间接地连接到肽抗原(A)但不被连接到疏水分子(H)或粒子(P)的标签(T)，也可被称为连接物前体X1。将所述肽抗原(A)连接到疏水分子(H)或粒子(P)的标签(T)也可被称为连接物(L)。所述连接物前体X2与所述连接物前体X1反应，以形成连接物。所述连接物前体X1有时可能被称为标签，并且所述连接物前体X2可能被称为标签反应性组成部分或标签反应性分子，其包含对所述标签具有特异性或反应性的官能团。
净电荷：由分子或者如果指定的话分子的区段所携带的静电电荷的总和。
粒子：由分子的组装体构成的纳米或微米尺寸的超分子结构。本公开的肽抗原偶联物包含连接到预先形成的粒子(P)或疏水分子(H)的肽抗原(A)，其组装成胶束或其他超分子结构。包含肽抗原偶联物的粒子可以被摄取到细胞(例如免疫细胞例如抗原呈递细胞)中。在某些实施方式中，所述肽抗原偶联物在水性溶液中形成粒子。在某些实施方式中，所述肽抗原偶联物的粒子形成依赖于pH或温度。在某些实施方式中，由肽抗原偶联物构成的纳米粒子具有5纳米(nm)至500nm之间的平均直径。在某些实施方式中，由肽抗原偶联物构成的纳米粒子可能大于100nm。在某些实施方式中，由肽抗原偶联物构成的纳米粒子被包含在更大的粒子结构中，所述粒子结构对于被免疫细胞摄取来说过大(例如大于约5000nm的粒子)，并缓慢释放出由所述肽抗原偶联物构成的较小纳米粒子。
在某些实施方式中，包含疏水分子(H)的肽抗原偶联物形成纳米粒子。所述纳米粒子由肽抗原偶联物通过疏水相互作用的缔合而形成，因此可以被当作超分子组装体。在某些实施方式中，所述纳米粒子是胶束。在优选实施方式中，所述纳米粒子胶束的直径在约5至50nm之间。在某些实施方式中，所述肽抗原偶联物形成胶束，并且所述胶束的形成是温度、pH或温度和pH两者依赖性的。在某些实施方式中，所公开的纳米粒子包含的肽抗原偶联物由连接到疏水分子(H)的肽抗原(A)构成，所述疏水分子(H)由连接到具有佐剂性质的配体例如PRR激动剂的聚合物构成；在所述纳米粒子中将所述肽抗原与所述PRR激动剂连接在一起，阻止了所述PRR激动剂在施用于对象后自由分散，从而防止系统毒性。
所述粒子可以由包含所述肽抗原偶联物的各个分子的组装形成，或者在肽抗原偶联物由连接到预先形成的粒子(P)的肽抗原(A)构成的情况下，所述粒子可以通过共价或非共价相互作用而交联。
某式的预先形成的粒子(P)/粒子(P)：预先形成的粒子(P)或简单地“粒子”(P)，描述了在连接到肽抗原(A)之前已经形成的粒子。因此，粒子(P)被用于描述某式的粒子，并且不同于通过两个或更多个包含疏水分子(H)的肽抗原偶联物的组装形成的粒子。为清楚起见，通过肽抗原偶联物的组装形成的粒子不同于某式的预先形成的粒子(P)或粒子(P)。在某些实施方式中，肽抗原(A)可以被直接或间接连接到粒子(P)以形成肽抗原偶联物，并且所述肽抗原偶联物在水性条件中可以是粒子。
为了在由肽抗原偶联物形成的粒子与预先形成的粒子(P)之间作出描述，当指称某式的预先形成的粒子或粒子(P)时，“粒子”后面跟有带括号的大写字母“P”，即“粒子(P)”。在某些实施方式中，所述粒子(P)可以是PLGA粒子(P)，其在水性条件中形成，然后被连接到肽抗原(A)，以形成在水性条件中仍然作为粒子的肽抗原偶联物。在某些实施方式中，所述粒子(P)可能由脂质构成，例如脂质体粒子(P)，其在水性条件中形成，然后被连接到肽抗原(A)，以形成在水性条件中仍然作为粒子的肽抗原偶联物。
模式识别受体(PRR)：由各种不同的细胞群体、特别是先天性免疫细胞表达的受体，其结合到被称为病原体相关分子模式(PAMP)以及损伤相关分子模式(DAMP)的一组多样化的合成和天然存在的分子。PAMP是存在于某些微生物体和病毒上的保守的分子基序。DAMP是在细胞死亡或损伤期间释放或表达的细胞组分。
模式识别受体的PAMP或DAMP活化诱导细胞内信号传导级联，引起宿主细胞的生理学的改变。这些生理学变化可以包括所述细胞的转录谱的变化，以诱导大量促炎性和促存活基因的表达。这些基因的协调表达可以增强适应性免疫。
存在几种类别的PRR。PRR的非限制性实例包括Toll样受体(TLR)、RIG-I样受体(RLR)、NOD样受体(NLR)、干扰素基因受体的刺激剂(STING)和C-型凝集素受体(CLR)。这些PRR的激动剂可用于增强针对靶抗原的免疫应答。
PRR的激动剂是佐剂，并且可以被称为配体(Ligand)或具有佐剂性质的配体。在本公开的某些实施方式中，PRR激动剂被用作佐剂，以增强针对肽抗原的免疫应答。
Toll样受体(TLR)1–13是识别多种不同PAMP的跨膜PRR。存在两大类TLR：位于细胞表面的TLR和位于胞内体腔的TLR。存在于细胞表面上的TLR通常在细菌的识别中是重要的。位于胞内体的腔的TLR例如TLR 3、7、8和9起到识别核酸的作用，因此通常在病毒的识别以及因此在促进抗病毒免疫应答中是重要的。聚次黄苷酸-聚胞苷酸是TLR-3的配体。TLR-7和TLR-8识别单链RNA以及核苷酸碱基类似物和咪唑并喹啉。TLR-9识别主要存在于细菌中的未甲基化的脱氧胞苷酸-磷酸-脱氧鸟苷酸(CpG)DNA。
所述NOD样受体(NLR)和RIG-I样受体(RLR)位于细胞质。RLR的非限制性实例包括RIG-I、MDA5和LGP2。存在22种人类NLR，其可以被细分成5个结构相关的NLR家族A、B、C、P和X。所有NLR都具有三个结构域：参与信号传导的N-端结构域，结合核苷酸的NOD结构域，和对配体识别来说重要的C-端富含亮氨酸的区域(LRR)。NLR的非限制性实例包括NALP3和NOD2。
关于模式识别受体的更多信息，参见Wales等，Biochem Soc Trans.,35:1501-1503,2007。
肽或多肽：通过酰胺键联结在一起的两个或更多个天然或非天然氨基酸残基。所述氨基酸残基可以含有翻译后修饰(例如糖基化和/或磷酸化)。这些修饰可以模拟在体内天然发生的翻译后修饰，或者可以是非天然的。所述肽抗原偶联物的任一种或多种组分可以由肽构成。
关于肽的长度没有概念上的上限。肽的长度通常根据应用来选择。在几个实施方式中，所述疏水分子(H)由肽构成，所述肽的长度可以在3至1,000个氨基酸之间，通常长度不超过300个氨基酸。在某些实施方式中，所述N-和/或C-端延长部(B1和/或B2)是长度在约1至8个氨基酸之间的肽。在某些实施方式中，所述带电荷分子(C)是由带正电荷的氨基酸、带负电荷的氨基酸或带正电荷和带负电荷的氨基酸两者构成的肽，并且长度通常不超过16个氨基酸。
在优选实施方式中，所述肽抗原(A)是5至约50个氨基酸、通常约7至35个氨基酸之间，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽。在其他实施方式中，所述肽抗原(A)的长度为约50个氨基酸或更长。因此，在某些实施方式中，所述肽抗原(A)可以被认为是蛋白质。
注意，所述肽抗原(A)可以是最小表位(有时被称为min或ME)或包含最小表位的长肽(有时被称为LP或SLP)。因此应该理解，当最小表位或长肽被称为作为肽抗原偶联物递送时，则所述最小表位或长肽是所述肽抗原(A)，除非另有陈述。
在某些实施方式中，所述任选的带电荷分子(C)、抗原(A)、任选的延长部(B1和B2)和连接物前体X1是氨基酸，并且可以通过固相肽合成制备成连续肽序列，其有时被称为“肽抗原片段”。注意，所述肽抗原片段的净电荷或GRAVY的计算不包括所述连接物前体X1。
指称所述肽抗原的肽序列被称为“PA”，指称所述N-端延长部(B1)的肽序列被称为“PN”，并且指称所述C-端延长部(B2)的肽序列被称为“PC”。构成肽抗原(A)的氨基酸的序列用式PA1…PAn表示，其中PA表示构成肽抗原(A)的任何氨基酸残基，并且n是整数值。例如，8个氨基酸的肽抗原(A)可以被表示成PA1-PA2-PA3-PA4-PA5-PA6-PA7-PA8。构成N-端延长部(B1)的氨基酸的序列用式PN…PNn表示，其中PN表示构成N-端延长部的任何氨基酸残基，并且n是整数值。构成C-端延长部(B2)的氨基酸的序列用式PC1…PCn表示，其中PC表示构成C-端延长部的任何氨基酸残基，并且n是整数值。
肽修饰：肽可以被改变或以其他方式合成为具有如下所阐述的几种修饰中的一者或多者。此外，这些肽的类似物(非肽有机分子)、衍生物(从肽开始获得的化学官能化的肽分子)和变体(同源物)可用于本文描述的方法。本文描述的肽由一系列可以是L-和/或D-型的氨基酸、类似物、衍生物和变体构成。这些肽可以含有天然存在的和以其他方式产生的肽、类似物、衍生物和变体。
肽可以通过各种不同的化学技术进行修饰，以产生具有本质上与未修饰的肽相同的活性，并任选地具有其他所需性质的衍生物。例如，所述肽的羧酸基团，不论是在羧基端处还是在侧链处，可以被提供成可药用阳离子的盐的形式，或者被酯化以形成CC1-CC16酯，其中CC是指碳链(因此CC1是指单个碳，CC16是指16个碳)，或者被转变成酰胺。所述肽的氨基，不论是在氨基端处还是在侧链处，可以采取可药用酸加成盐的形式，例如HCl、HBr、乙酸、三氟乙酸、甲酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、酒石酸和其他有机酸盐，或者可以被修饰或转变成酰胺。
氨基酸可以被修饰，使得它通过共价连接含有PRR激动剂例如TLR激动剂，例如基于咪唑并喹啉的TLR-7或TLR-7/8激动剂。
肽可以被修饰以含有取代基，所述取代基含有正或负电荷或两者。所述正和/或负电荷可以受到所述肽所处于的pH影响。
所述肽侧链的羟基可以使用公认的技术转变成CC1-CC16烷氧基或CC1-CC16酯，或者所述羟基可以被转化(例如硫酸化或磷酸化)以引入负电荷。所述肽侧链的苯基或苯酚环可以被一个或多个卤素原子例如氟、氯、溴或碘，或者被CC1-CC16烷基、CC1-CC16烷氧基、羧酸及其酯或这些羧酸的酰胺取代。所述肽侧链的亚甲基可以延长到同源的CC2-CC4亚烷基。硫醇可用于形成二硫键或硫醚，例如通过与马来酰亚胺的反应。硫醇可以用大量公知的保护基团中的任一者例如乙酰胺基团来保护。本领域技术人员也将认识到将环状结构引入到本发明的肽中，以便为所述结构选择并提供构象约束，产生提高的稳定性的方法。对于可以对官能团做出的其他修饰的详情，可以参考Greene等，《Greene的有机合成中的保护基团》(Greene's Protective Groups in Organic Synthesis)第四版，John Wiley&Sons,Inc.2006。
设想了所述肽抗原(A)的肽模拟和有机模拟实施方式，由此使这些肽和有机模拟物的化学组分的三维排列模拟所述肽骨架和组分氨基酸侧链的三维排列，产生免疫原性肽的这种肽模拟物和有机模拟物，其具有可测量的诱导耐受或免疫抑制的能力或提高的产生刺激性免疫应答例如细胞毒性T细胞或抗体应答的能力。
可药用介质：在本公开中有用的可药用载体(介质)是常规的。《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA，第15版(1975)，描述了适合于一种或多种治疗性组合物例如一种或多种治疗性癌症疫苗和其他药剂的药学递送的组合物和剂型。
总的来说，所述载体的本质取决于所使用的具体施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括可药用且生理上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为介质。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)来说，常规的无毒性固体载体可以包括例如制药级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性的载体之外，待施用的药物组合物可以含有少量无毒性的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨糖醇单月桂酸酯。
极性：物质性质的一种描述。极性是相对术语，并且可以描述具有部分电荷分子或分子的一部分，所述部分电荷由分子中键合在一起的原子之间的电负性的差异产生，例如氮与氢之间的键。极性分子具有与其他极性分子相互作用的偏好性，并且通常不与非极性分子缔合。在特定的非限制性情况下，极性基团可以含有羟基或氨基或羧基或带电荷基团。在特定的非限制性情况下，极性基团可以具有与极性溶剂例如水相互作用的偏好性。在特定的非限制性情况下，其他极性基团的引入可以提高分子的一部分的溶解性。
聚合物：含有重复的结构单元(单体)的分子。正如在整个本公开中更详细描述的，聚合物可用于所述肽抗原偶联物的任意数量的组分，并且可以是天然的或合成的。在优选实施方式中，疏水或两亲性聚合物被用作所述疏水分子(H)并驱动所述肽抗原偶联物的粒子组装。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是包含氨基酸的聚合物。在某些实施方式中，所述延长部(B1和B2)包含聚合物例如PEG、聚(氨基酸)或其组合。在本公开的实施方式中包含的聚合物可以形成聚合物纳米粒子，所述聚合物纳米粒子可以被施用于对象而不引起不良副作用。在本公开的实施方式中包含的聚合物可以形成聚合物纳米粒子，所述聚合物纳米粒子可以被施用于对象以引起免疫应答或治疗和/或改善疾病。在本公开的实施方式中包含的聚合物可以包括具有官能团的侧链，所述官能团可以被用于例如便于连接到佐剂或用于诱导免疫抑制或耐受的分子例如大环内酯类如雷帕霉素。在几个实施方式中，所述聚合物可以含有通过连接物相连的两个或更多个聚合物嵌段以产生嵌段共聚物，例如两亲性二嵌段共聚物。在几个实施方式中，聚合物嵌段在特性上可以主要是疏水的。在几个实施方式中，所述聚合物由肽、它们的类似物、衍生物和变体构成。可用于本发明的实践的聚合物的各种不同组成在别处更详细地讨论。
聚合：一种化学反应，通常使用催化剂、热或光进行，其中单体合并以形成链状或交联的大分子(聚合物)。所述链也可以使用适合的取代基和化学反应，通过另外的化学合成进一步合并。所述单体可以含有反应性物质。聚合通常通过加成或缩合来进行。当引发剂、通常为自由基与所述单体中的双键反应时，发生加成聚合。所述自由基添加到所述双键的一侧，在另一侧上产生自由电子。该自由电子然后与另一个单体反应，并且所述链变得自动生长延伸，因此一次向生长中的链的末端添加一个单体单元。缩合聚合涉及两个单体的反应，导致分割出水分子。在其他形式的聚合中，通过分阶段引入活化的单体，例如在固相肽合成期间，一次向生长中的链添加一个单体。
纯化的：具有相对不含杂质或掺杂或污染物质的物质的组成。术语纯化的是相对术语，并且不需要绝对纯净。因此，例如，纯化的肽制剂是其中所述肽或蛋白质比所述肽或蛋白质在其自然环境中例如在细胞内更加富集的制剂。在一个实施方式中，制剂是纯化的，使得所述肽抗原偶联物占所述制备物的总含量的至少50％。显著纯化表示从其他蛋白质或细胞组分纯化。显著纯化的蛋白质为至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％纯。因此，在一个特定的非限制性实例中，显著纯化的蛋白质的90％不含其他蛋白质或细胞组分或污染的肽。
可溶的：能够在溶剂中变得分子或离子分散以形成均匀溶液。当指称肽时，可溶性肽被理解为在溶液中是单个分子，其不通过疏水或其他非共价相互作用组装成多聚体或其他超分子结构。可溶性分子被理解为在溶液中作为单个分子自由分散。在几个实施方式中，肽抗原可以是可溶性肽抗原，其在室温下在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中溶解至高达至少0.1mg/ml。在其他实施方式中，肽抗原偶联物在室温下在二甲基亚砜和/或其他有机溶剂中可以是可溶的，但在室温下在水性溶剂例如pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中可以不是可溶的。本文中描述的疏水分子是不溶至低达约0.1mg/mL。溶解性可以通过目测检查、通过浊度测量或通过动态光散射来确定。
对象：是指人类和非人类动物，包括鸟类和非人类哺乳动物，例如啮齿动物(例如小鼠和大鼠)、非人类灵长动物(例如恒河猴)、伴侣动物(例如家养的狗和猫)、家畜(例如猪、绵羊、奶牛、美洲驼和骆驼)以及非驯养动物(例如大型猫科动物)。
超分子：是指通过非共价相互作用缔合的两个或更多个分子。在某些实施方式中，所述分子由于疏水相互作用而缔合。在某些实施方式中，所述分子由于静电相互作用而缔合。所述缔合向所述超分子复合体赋予不被任一种组分分子享有的新的性质，例如尺寸增加，其影响材料与免疫系统的相互作用，和不同的免疫应答。例如，肽抗原偶联物可以团聚以形成超分子复合体。
T细胞：一种类型的白细胞，其是免疫系统的一部分，并且可以参与免疫应答。T细胞包括但不限于CD4 T细胞和CD8 T细胞。CD4 T细胞在其表面上展示CD4糖蛋白，并且这些细胞通常被称为辅助性T细胞。这些细胞通常协调免疫应答，包括抗体应答和细胞毒性T细胞应答，然而CD4 T细胞也可以抑制免疫应答，或者CD4 T细胞可以充当细胞毒性T细胞。CD8T细胞在其表面上展示CD8糖蛋白，并且这些细胞通常被称为细胞毒性或杀伤性T细胞，然而CD8 T细胞也可以抑制免疫应答。
遥爪：被用于描述具有一个或两个可以相同或不同的反应性末端的聚合物。该词源自于“telos”和“chele”，分别为末端和爪的希腊语单词。半遥爪聚合物描述了仅仅具有单个末端基团例如可以经历其他反应例如聚合的反应性官能团的聚合物。杂遥爪聚合物描述了具有两个末端基团例如具有不同反应性质的反应性官能团的聚合物。
在本文中，疏水分子(H)可以由在一个或两个末端处具有反应性基团的聚合物构成。在某些实施方式中，佐剂被放置在所述聚合物的一个末端处，所述聚合物的另一个末端可以与直接或通过延长部(B1或B2)或连接物(L)间接连接到肽抗原的连接物反应。在这个实例中，所述聚合物对于所述佐剂来说是半遥爪，意味着所述佐剂被附连到构成所述疏水分子(H)的聚合物链的仅一个末端。
治疗、预防或改善疾病：“治疗”是指在疾病或病理状态已开始发生后减少其征兆或症状或标志物的干预。例如，治疗疾病可以引起肿瘤负荷的降低，意味着肿瘤和/或转移肿瘤的数目和尺寸减小，或者治疗疾病可以引起免疫耐受，其减轻与自体免疫相关的症状。“预防”疾病是指抑制疾病的充分发展。可以完全阻止疾病发生。可以阻止疾病的严重性或程度或种类的发展。“改善”是指疾病例如癌症的征兆或症状或标志物的数目或严重性的降低。
减轻疾病或与疾病相关的病理状况的征兆、症状或标志物，是指所述治疗的任何可观察到的有益效果和/或对近端替代终点例如肿瘤体积的任何可观察到的效果，而不论所述终点是否有症状。减轻与肿瘤或病毒感染相关的征兆或症状，可以例如通过易感对象(例如具有尚未转移的肿瘤的对象或可能暴露于病毒感染的对象)中所述疾病的临床症状的延迟发生，所述疾病的一些或所有临床症状的严重性的降低，所述疾病的更缓慢的进展(例如通过延长具有肿瘤或病毒感染的对象的寿命)，所述疾病的复发数量的减少，所述对象的总体健康或幸福感的改善，或通过本领域中公知的其他参数(例如特异性针对特定肿瘤或病毒感染的参数)来证实。“预防性”治疗是被施用至未表现出疾病的征兆或仅表现出早期征兆的对象，目的在于降低发生疾病的风险或严重性的治疗。
在一个实例中，所需响应是在对象中诱导免疫应答，导致肿瘤的尺寸、体积、生长速率或数目(例如转移肿瘤)的减小。例如，所述一种或多种药剂可以诱导免疫应答，其与不存在所述药剂时的应答相比将肿瘤的尺寸、体积或数目减小所需的量，例如至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少50％、至少75％、至少90％或至少95％。
肿瘤或癌症或赘生：细胞的异常生长，其可以是良性或恶性的，通常但不总是引起临床症状。“赘生的”细胞生长是指对生理信号例如生长和抑制因子没有响应性的细胞生长。
“肿瘤”是赘生细胞的集合体。在大多数情况下，肿瘤是指形成实体肿块的赘生细胞的集合体。这些肿瘤可以被称为实体肿瘤。在某些情况下，赘生细胞可以不形成实体肿块，例如患有某些白血病的情况。在这些情况下，所述赘生细胞的集合体可以被称为液体癌症。
癌症是指作为固体或液体的赘生细胞的恶性生长。将癌症定义为恶性的癌症特征包括转移、对邻近细胞的正常功能的干扰、细胞因子或其他分泌产物以异常水平的释放以及炎性或免疫应答的抑制或加重、周围或远端组织或器官例如淋巴结的侵入等。
不存在显著的不良临床症状和/或缓慢生长的肿瘤被称为“良性的”。
“恶性的”意味着引起或可能在将来引起显著的临床症状。侵入周围组织和/或转移和/或通过对邻近或远端身体系统具有效应的化学介导物的生产和分泌来产生显著临床症状的肿瘤，被称为“恶性的”。
“转移性疾病”是指已离开原始肿瘤位点，并例如通过血流、通过淋巴系统或通过体腔例如腹腔或胸腔迁移到身体的其他部分的癌细胞。
个体中肿瘤的量是“肿瘤负荷”。所述肿瘤负荷可以作为肿瘤的数目、体积或质量来测量，并且通常通过身体检查、放射学成像或病理检查来评估。
“已建立的”或“现存的”肿瘤是在疗法开始时存在的肿瘤。通常，已建立的肿瘤可以通过诊断测试来分辨。在某些实施方式中，已建立的肿瘤可以被触诊。在某些实施方式中，已建立的肿瘤的尺寸为至少500mm3，例如至少600mm3、至少700mm3或至少800mm3。在其他实施方式中，所述肿瘤的长度为至少1cm。对于实体肿瘤来说，已建立的肿瘤通常具有新建立的且强健的血液供应，并且可能已经诱导调节性T细胞(Treg)和髓源抑制性细胞(MDSC)。
本领域普通技术人员将会认识到，上面提供的定义不打算包括不允许的取代模式(例如被5个不同基团取代的甲基等)。这些不允许的取代模式容易被本领域普通技术人员认出。除非在本文中另有指明，否则本文中公开的和/或上文定义的任何官能团可以是取代或未取代的。除非另有解释，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。单数术语包括复数指称物，除非上下文明确指明不是如此。术语“包含”意味着“包括”。因此，包含“A”或“B”是指包括A、包括B或包括A和B两者。还应该理解，为核酸或多肽给出的所有碱基尺寸或氨基酸尺寸和所有分子量或分子质量值都是近似值，并出于描述的目的被提供。尽管与本文中所描述的相似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或试验，但适合的方法和材料被描述在本文中。在有冲突的情况下，以本说明书、包括术语的解释为准。此外，所述材料、方法和实例仅仅是说明性的而不打算是限制性的。
免疫原性组合物
本文描述了新颖的免疫原性组合物，其包含含有肽抗原偶联物的粒子，所述肽抗原偶联物进一步包含连接到粒子(P)或疏水分子(H)的肽抗原(A)。肽抗原偶联物是指将所述肽抗原(A)连接、例如共价联结或以其他方式连接到所述粒子(P)或疏水分子(H)而产生的化合物。所述疏水分子(H)或粒子(P)引起所述肽抗原偶联物组装成粒子，导致针对所述肽抗原(A)的免疫应答的出人意料的改进。所述肽抗原偶联物还可以包含：任选的N-端延长部(B1)和/或C-端延长部(B2)，其分别连接到所述肽抗原(A)的N-和C-端，提供了制造和生物活性的出人意料的改进；任选的带电荷分子(C)，其提供了由肽抗原偶联物形成的粒子的稳定性的出人意料的改进，由此导致制造的改进和生物活性的改善；以及任选的连接物(L)，其由连接到所述肽抗原(A)的连接物前体X1与提供在所述疏水分子(H)或粒子(P)上的连接物前体X2的反应产生，由此将所述肽抗原(A)与疏水分子(H)和粒子(P)在高效的过程中联结，导致肽抗原偶联物的制造效率的出人意料的改进。构成所述肽抗原偶联物的组分可以通过任何适合的手段连接，并且在本文中各处更详细地描述。
在某些实施方式中，所述肽抗原(A)被直接连接到疏水分子(H)或粒子(P)，以形成式A-H或A-P的肽抗原偶联物。在其他实施方式中，所述肽抗原(A)通过连接物(L)被连接到疏水分子(H)或粒子(P)，形成式A-L-H或A-L-P的肽抗原偶联物。在另一些其他实施方式中，所述肽抗原(A)被连接到延长部(B1或B2)，所述延长部被直接地或通过连接物(L)连接到疏水分子(H)或粒子(P)，以形成式A-B2-H、A-B2-L-H、H-B1-A、H-L-B1-A、A-B2-P、A-B2-L-P、P-B1-A或P-L-B1-P中任一者的肽抗原偶联物。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)被直接地或通过延长部(B1和B2)连接到连接物前体X1，以形成式A-X1、A-B2-X1、X1-A或X1-B1-A的肽抗原片段，其与疏水分子(H)或粒子(P)上的连接物前体X2即X2-H或X2-P反应，以形成将所述肽抗原(A)联结到所述疏水分子(H)或粒子(P)的连接物(L)，产生下述式即A-L-H、A-L-P、A-B2-L-H、A-B2-L-P、H-L-A、P-L-A、H-B1-A或P-B1-A中任一者的肽抗原偶联物。在本公开中，这些实施方式被显示为在水性条件中形成粒子，所述粒子显示为可用于在对象中诱导免疫应答。
在某些实施方式中，所述肽抗原(A)被连接到两个延长部(B1和B2)。这些实施方式包括式B1-A-B2-H、B1-A-B2-L-H、B1-A-B2-P、B1-A-B2-L-P、H-B1-A-B2、H-L-B1-A-B2、P-B1-A-B2或P-L-B1-A-B2的肽抗原偶联物。在本公开中，这些实施方式显示出在水性条件中形成粒子，所述粒子被证实可用于在对象中诱导免疫应答。
在某些实施方式中，含有提供静电电荷的官能团的分子，即带电荷分子(C)，被直接地或通过所述任选的延长部(B1和/或B2)、任选的连接物(L)或疏水分子(H)或粒子(P)间接地连接到所述肽抗原(A)。由所述带电荷分子提供在所述肽抗原偶联物上的电荷使在水性条件中形成的所述超分子结构稳定。包含带电荷分子(C)的肽抗原偶联物的非限制性实例包括C-A-H、C-B1-A-H、C-A-B2-H、C-B1-A-B2-H、A-H(C)、A-B2-H(C)、B1-A-H(C)、B1-A-B2-H(C)、C1-A-H(C2)、C1-A-B2-H(C2)、C1-B1-A-H(C2)、C1-B1-A-B2-H(C2)、H-A-C、H-B1-A-C、H-A-B2-C、H-B1-A-B2-C、H(C)-A、H(C)-B1-A、H(C)-A-B2、H(C)-B1-A-B2、H(C1)-A-C2、H(C1)-B1-A-C2、H(C1)-A-B2-C2、H(C1)-B1-A-B2-C2、C-A-L-H、C-B1-A-L-H、C-A-B2-L-H、C-B1-A-B2-L-H、A-L-H(C)、A-B2-L-H(C)、B1-A-L-H(C)、B1-A-B2-L-H(C)、C1-A-L-H(C2)、C1-A-B2-L-H(C2)、C1-B1-A-L-H(C2)、C1-B1-A-B2-L-H(C2)、H-L-A-C、H-L-B1-A-C、H-L-A-B2-C、H-L-B1-A-B2-C、H(C)-L-A、H(C)-L-B1-A、H(C)-L-A-B2、H(C)-L-B1-A-B2、H(C1)-L-A-C2、H(C1)-L-B1-A-C2、H(C1)-L-A-B2-C2、H(C1)-L-B1-A-B2-C2、C-A-P、C-B1-A-P、C-A-B2-P、C-B1-A-B2-P、A-P(C)、A-B2-P(C)、B1-A-P(C)、B1-A-B2-P(C)、C1-A-P(C2)、C1-A-B2-P(C2)、C1-B1-A-P(C2)、C1-B1-A-B2-P(C2)、P-A-C、P-B1-A-C、P-A-B2-C、P-B1-A-B2-C、P(C)-A、P(C)-B1-A、P(C)-A-B2、P(C)-B1-A-B2、P(C1)-A-C2、P(C1)-B1-A-C2、P(C1)-A-B2-C2、P(C1)-B1-A-B2-C2、C-A-L-P、C-B1-A-L-P、C-A-B2-L-P、C-B1-A-B2-L-P、A-L-P(C)、A-B2-L-P(C)、B1-A-L-P(C)、B1-A-B2-L-P(C)、C1-A-L-P(C2)、C1-A-B2-L-P(C2)、C1-B1-A-L-P(C2)、C1-B1-A-B2-L-P(C2)、P-L-A-C、P-L-B1-A-C、P-L-A-B2-C、P-L-B1-A-B2-C、P(C)-L-A、P(C)-L-B1-A、P(C)-L-A-B2、P(C)-L-B1-A-B2、P(C1)-L-A-C2、P(C1)-L-B1-A-C2、P(C1)-L-A-B2-C2或P(C1)-L-B1-A-B2-C2。
所述带电荷分子(C)使由肽抗原偶联物形成的粒子稳定。所述带电荷分子(C)可以直接连接到所述肽抗原偶联物。或者，所述带电荷分子(C)可以被提供在与由肽抗原偶联物形成的所述粒子缔合的分开的分子上。在某些实施方式中，所述带电荷分子(C)被连接到疏水分子(H)，以形成式C-H或C-A’-H的带电荷分子偶联物(其中A’是保守抗原)，将其在水性条件下与式[C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H的肽抗原偶联物混合，其中[]表示所述基团是任选的，并且所述得到的粒子包含C-H或C-A’-H和所述肽抗原偶联物。
所述疏水分子(H)可以包含诱导所述肽抗原偶联物在水性条件中组装成粒子的任何适合的分子。在某些实施方式中，构成肽抗原偶联物的疏水分子(H)是具有有限的水溶性的聚合物。在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是温度或pH响应性聚合物，其在特定温度或pH值下具有有限的水溶性。在其他实施方式中，所述疏水分子(H)是脂质、脂肪酸或胆甾醇。许多疏水分子(H)可用于本公开并且在全文中各处更详细地描述。
由本文公开的肽抗原偶联物形成的粒子可用于在对象中诱导免疫应答。在某些实施方式中，将包含含有肿瘤相关抗原的肽抗原偶联物的粒子提供给对象，以诱导T细胞应答例如细胞毒性CD4或CD8 T细胞应答，用于癌症的治疗或预防。在某些实施方式中，将包含含有传染病抗原的肽抗原偶联物的粒子提供给对象，以诱导T细胞应答例如细胞毒性CD4或CD8 T细胞应答或抗体应答，用于传染病的治疗或预防。在某些实施方式中，将包含含有自体抗原的肽抗原偶联物的粒子提供给对象，以诱导耐受原性或抑制性T细胞应答，用于自体免疫疾病的治疗。
所述肽抗原偶联物包含肽抗原(A)、任选的N-和/或C-端延长部(B1和/或B2)、任选的连接物(L)、粒子(P)或疏水分子(H)和任选的带电荷分子(C)。这些组分中的每一者在下文中并在全文中各处更详细地描述。
肽抗原(A)
所述肽抗原(A)可以是可用于在对象中诱导免疫应答的任何抗原。取决于应用所需的免疫应答的本质，所述肽抗原(A)可用于诱导促炎性或耐受原性免疫应答。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是肿瘤相关抗原，例如自身抗原、新抗原或肿瘤相关病毒抗原(例如HPV E6/E7)。在其他实施方式中，所述肽抗原(A)是传染病抗原，例如源自于从病毒、细菌、真菌或原生动物微生物病原体分离的蛋白质的肽。在另一些其他实施方式中，所述肽抗原(A)是源自于已知或怀疑引起过敏症或自体免疫的过敏原或自体抗原的肽。
所述肽抗原(A)由能够在对象中诱导免疫应答例如T细胞或B细胞应答的氨基酸序列或肽模拟物构成。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)包含氨基酸或具有翻译后修饰的氨基酸、非天然氨基酸或肽模拟物。所述肽抗原可以是具有抗原或预测的抗原、即具有T细胞或B细胞表位的抗原的任何天然、非天然或翻译后修饰的氨基酸序列、肽模拟物或其任何组合。
免疫原性组合物可以包含一种或多种不同的肽抗原偶联物，所述肽抗原偶联物各自具有不同的肽抗原(A)组成。在某些实施方式中，所述免疫原性组合物包含的粒子具有多达50种不同的肽抗原偶联物，所述肽抗原偶联物各自具有独特的肽抗原(A)组成。在某些实施方式中，所述免疫原性组合物包含镶嵌粒子，其包含20种不同的肽抗原偶联物。在其他实施方式中，所述免疫原性组合物包含镶嵌粒子，其包含5种不同的肽抗原偶联物。在某些实施方式中，所述免疫原性组合物包含20种不同的粒子组成，其各自由独特的肽抗原偶联物组装(即每种粒子含有单一肽抗原偶联物组合物)。在其他实施方式中，所述免疫原性组合物包含5种不同的粒子组成，其各自由独特的肽抗原偶联物组装(即每种粒子含有单一肽抗原偶联物组合物)。在另一些其他实施方式中，所述免疫原性组合物包含由单一肽抗原偶联物组合物构成的单一粒子组成。
所述肽抗原(A)的长度取决于具体应用，并且通常在约5至约50个氨基酸之间。在优选实施方式中，所述肽抗原(A)在约7至35个氨基酸之间，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸。在其他实施方式中，所述肽抗原是多肽的片段。在其他情况下，所述肽抗原是全长多肽，例如可以被重组表达的蛋白抗原。基于肿瘤相关抗原、传染病抗原、过敏原或自体抗原的肽抗原(A)可以作为全长序列递送，尽管优选地长度不超过50个氨基酸。在优选实施方式中，所述肽抗原(A)为7至35个氨基酸，通常为约25个氨基酸。因此，对于长度超过25个氨基酸的肿瘤相关抗原、传染病抗原、过敏原或自体抗原例如100个氨基酸的抗原来说，所述抗原可以被分成7至35个氨基酸例如25个氨基酸的肽抗原(A)，其中每个肽抗原(A)含有独特的氨基酸组成；或者所述肽抗原(A)可以是交叠肽合并物，其中抗原被分成固定数目的7至35个氨基酸例如25个氨基酸的具有交叠序列的肽抗原(A)。例如，包含100个氨基酸的抗原的交叠肽合并物可以被分成8个25个氨基酸的肽抗原(A)，它们各自偏移12个氨基酸(即构成100个氨基酸的肽序列的每个后续25个氨基酸的肽，始于前一个肽的第13位氨基酸位置处)。本领域技术人员理解，为了从抗原产生肽合并物，存在许多排列。
在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是最小CD8或CD4 T细胞表位，其包含肿瘤相关抗原、传染病抗原、过敏原或自体抗原的在计算机上预测(或凭经验测量)将结合MHC-I或MHC-II分子的部分。对于肿瘤相关抗原来说，作为在计算机上预测(或凭经验测量)将结合MHC-I或MHC-II分子的最小CD8或CD4 T细胞表位的肽抗原(A)，也应该是对所述肿瘤细胞独有的氨基酸序列。用于预测MHC-I或MHC-II结合的算法是广泛可用的(参见Lundegaard等，Nucleic Acids Res.,36:W509-W512,2008和http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)。在用于特定对象(例如患者)的个性化疗法的某些实施方式中，构成肽抗原偶联物的肽抗原(A)可以包含来自于肿瘤相关抗原、传染病抗原、过敏原或自体抗原的最小CD8T细胞表位，其通常是7-13个氨基酸的肽，并被预测对由该对象表达的特定MHC-I等位基因具有<1,000nM的结合亲和性。在用于特定对象(例如患者)的个性化疗法的某些实施方式中，所述肽抗原(A)可以包含来自于肿瘤相关抗原、传染病抗原、过敏原或自体抗原的最小CD4 T细胞表位，其是10-16个氨基酸的肽，并被预测对由该对象表达的特定MHC-II等位基因具有<1,000nM的结合亲和性。在优选实施方式中，当不能为肿瘤相关抗原、传染病抗原、过敏原或自体抗原鉴定最小CD8或CD4 T细胞表位时，或者当所述肿瘤相关抗原、传染病抗原、过敏原或自体抗原含有多个CD8和CD4 T细胞表位时，所述肽抗原(A)可以在16-35个氨基酸之间，可以长达50个氨基酸，例如长达35个氨基酸、长达25个氨基酸或长达20个氨基酸或长达16个氨基酸，使得它可以含有所有可能的CD8或CD4 T细胞表位。
在本公开的某些实施方式中，所述肽抗原(A)源自于肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原可以是在健康细胞上存在，但偏好性地被肿瘤细胞表达的自身抗原，或者是新抗原，所述新抗原是对肿瘤细胞特异的并且对个体患者来说独特的畸变蛋白。适合的自身抗原包括偏好性地被肿瘤细胞表达的抗原，例如CLPP、周期蛋白-A1、MAGE-A1、MAGE-C1、MAGE-C2、SSX2、XAgE1b/GAGED2a、Melan-A/MART-1、TRP-1、酪氨酸酶、CD45、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、IGF2B3、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、Meloe、MUC5AC、存活蛋白、前列腺酸性磷酸酶、NY-ESO-1和MAGE-A3。新抗原从癌症的固有遗传不稳定性产生，所述不稳定性可以引起DNA、RNA剪接变体中的突变以及翻译后修饰中的变化，这些都潜在地产生新(de novo)蛋白产物，其被合称为新抗原或有时称为预测的新抗原。DNA突变包括DNA的变化，包括非同义错义突变、无义突变、插入、缺失、染色体倒位和染色体易位，都可能产生新的基因产物以及因此新抗原。RNA剪接位点变化可以产生新的蛋白产物，并且错义突变可以引入允许翻译后修饰(例如磷酸化)的氨基酸，所述翻译后修饰可以是抗原性的。肿瘤细胞的不稳定性还可以引起表观遗传学变化和某些转录因子的活化，这可能导致某些不被健康的非癌性细胞表达的抗原被肿瘤细胞选择性表达。
在个性化癌症疫苗中使用的肽抗原偶联物将包括包含肿瘤相关抗原的对肿瘤细胞来说独特的部分的肽抗原(A)。包含从错义突变产生的新抗原的肽抗原(A)将涵盖由一个或多个核苷酸多态性编码的氨基酸变化。包含从移码突变、剪接位点变异、插入、倒位和缺失产生的新抗原的肽抗原(A)将涵盖新的肽序列和新的肽序列的接合部。包含具有新的翻译后修饰的新抗原的肽抗原(A)将涵盖带有翻译后修饰例如磷酸或聚糖的氨基酸。在优选实施方式中，所述肽抗原(A)在由突变产生的氨基酸变化或新的接合部的任一侧翼上包含0-25个氨基酸。在一个实施方式中，所述肽抗原(A)是在由单核苷酸多态性产生的氨基酸变化的任一侧翼上包含12个氨基酸的新抗原序列，例如25个氨基酸的肽，其中第13位氨基酸是由所述单核苷酸多态性产生的氨基酸残基。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是在具有新的翻译后修饰的氨基酸的任一侧翼上包含12个氨基酸的新抗原序列，例如25个氨基酸的肽，其中第13位氨基酸是由所述新的翻译后修饰位点产生的氨基酸残基。在其他实施方式中，所述肽抗原(A)是在由插入、缺失或倒位产生的新的接合部的任一侧翼上包含0-12个氨基酸的新抗原序列。在某些情况下，包含由新的序列产生的新抗原的肽抗原(A)可以涵盖所述整个新的序列，包括在也可能产生的新的接合部的任一侧上的0-25个氨基酸。
适合作为肽抗原(A)用于本公开的免疫原性组合物的肿瘤相关抗原，可以通过本领域技术人员熟知的各种不同技术来鉴定。肿瘤相关抗原可以通过与健康细胞、即来自于对象的非癌性细胞相比评估肿瘤细胞的蛋白质表达来鉴定。用于评估蛋白质表达的适合方法包括但不限于免疫组织化学、免疫荧光、蛋白质印迹、层析(即尺寸排阻层析)、ELISA、流式细胞术和质谱术。偏好性地被肿瘤细胞表达但不被健康细胞表达或被有限数目的健康细胞表达的蛋白质(例如CD20)，是适合的肿瘤相关抗原。对患者的肿瘤活检组织进行DNA和RNA测序，然后通过生物信息学来鉴定编码蛋白质的DNA中被表达为RNA并产生预测将结合到患者的抗原呈递细胞(APC)上的MHC-I或MHC-II等位基因的肽的突变，也可用于鉴定适合作为肽抗原(A)用于本公开的免疫原性组合物的肿瘤相关抗原。
在优选实施方式中，适合作为肽抗原(A)用于免疫原性组合物的肿瘤相关抗原使用质谱术来鉴定。适合的肽抗原(A)是在从MHC分子洗脱后通过质谱术鉴定到的来自于患者的肿瘤活检组织但不来自于同一对象的健康组织的肽(即所述肽抗原仅仅存在于肿瘤细胞上，但不存在于来自于同一对象的健康细胞上)。质谱术可以单独地或与用于鉴定肿瘤相关抗原的其他技术相组合使用。本领域技术人员将会认识到，存在许多方法用于鉴定适合作为肽抗原(A)用于本发明的实践的肿瘤相关抗原，例如新抗原(参见Yadav等，Nature,515:572-576,2014)。
在优选实施方式中，用作肽抗原(A)的肿瘤相关抗原在赘生细胞群体内是克隆的或几乎是克隆的，所述赘生细胞群体在其他方面可以被认为是非均质的。
在个性化癌症疫苗接种方案中被选择用作肽抗原(A)的肿瘤相关抗原，可以在肽-MHC结合的质谱术确认和/或计算机预测的MHC结合亲和性和肿瘤内的RNA表达水平的基础上选择。这些数据提供了关于肿瘤相关抗原是否被肿瘤细胞表达并呈递以及因此是T细胞的适合靶点的信息。这些判据可用于选择在个性化癌症疫苗中使用的肽抗原(A)。
基于免疫原性组合物的个性化癌症疫苗可以包含一种或多种不同的肽抗原偶联物，所述肽抗原偶联物各自具有独特的肽抗原(A)组成。在某些实施方式中，个性化癌症疫苗可以含有10-50种不同的肽抗原偶联物组合物，其各自具有独特的肽抗原(A)。在优选实施方式中，免疫原性组合物包含20种不同的肽抗原偶联物，其各自包含长度在7-35个氨基酸之间，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸，通常不超过50个氨基酸的肽抗原(A)。在非限制性实例中，由20种不同的肽抗原偶联物形成的构成粒子的免疫原性组合物被用作个性化癌症疫苗，所述肽抗原偶联物包含长度为8个氨基酸的肽抗原(A)。在另一个非限制性实例中，由20种不同的肽抗原偶联物形成的构成粒子的免疫原性组合物被用作个性化癌症疫苗，所述肽抗原偶联物包含长度为25个氨基酸的肽抗原(A)。
对于患有具有超过50个肿瘤相关新抗原的高度突变的肿瘤的患者来说，可以使用向下选择方法来选择用于个性化癌症疫苗的构成肽抗原偶联物的肽抗原(A)。在某些实施方式中，使用向下选择方法来选择包含被预测具有最高MHC结合亲和性和肿瘤细胞内RNA表达水平的表位的肽抗原(A)。其他的判据可以应用于肿瘤相关自身抗原或新抗原的选择。例如，预测的免疫原性或预测的所述肽抗原(A)引起与其他自身抗原反应的T细胞并可能引起自身免疫的能力，是所考虑的其他判据。例如，包含肿瘤相关抗原并具有高的预测免疫原性但还具有低的引起自身免疫的潜力的肽抗原(A)，是用于选择在个性化癌症疫苗中使用的潜在肽抗原(A)的判据。在某些实施方式中，预期引起T细胞或抗体应答并且所述T细胞或抗体应答与健康细胞上存在的自身抗原反应的新抗原，不被选择用作肽抗原(A)。对于具有少于例如20-50个预测的新抗原的患者来说，向下选择方法可能不是关键的，因此所有20-50个预测的新抗原可以被用作个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)。
癌症疫苗可以包括包含患者特异性肿瘤相关抗原和/或在患者之间共有的肿瘤相关抗原的肽抗原(A)。例如，所述肿瘤相关抗原可以是保守的自身抗原例如NY-ESO-1(睾丸癌)或gp100(黑素瘤)，或者所述抗原可能是通常不被健康细胞表达但在患者之间是保守的隐蔽表位，例如Na17(黑素瘤)。本公开的免疫原性组合物可以包括由所谓的热点突变产生的肽抗原(A)，所述热点突变是在某些基因或基因区域中以比根据几率预测的更高的频率发生的频繁突变。热点突变的非限制性实例包括BRAF蛋白中的V600E突变，其对于黑素瘤、乳突性甲状腺癌和结肠直肠癌来说是常见的，或KRAS G12突变，其属于最常见的突变，例如KRAS G12C。由热点突变产生的大量适合的自身抗原以及新抗原是已知的，并且通过参考并入本文：参见Chang等，Nature Biotechnology,34:155-163,2016；Vigneron,N.等，CancerImmunology,13:15-20,2013。
在某些实施方式中，所述肽抗原(A)可以来自于血液肿瘤。血液肿瘤的非限制性实例包括白血病，包括急性白血病(例如11q23阳性急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓系白血病和成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓系白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高等级形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常。
在某些实施方式中，所述肽抗原(A)可以来自于实体肿瘤。实体肿瘤的非限制性实例例如肉瘤和上皮癌，包括纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴系恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌(包括基底细胞样乳腺癌、导管癌和乳腺小叶癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸癌、精原细胞瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(例如神经胶质瘤、星型细胞瘤、成髓细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤)。在几个实例中，肿瘤是黑素瘤、肺癌、淋巴瘤、乳腺癌或结肠癌。
在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是来自于乳腺癌例如导管癌或小叶癌的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是来自于前列腺癌的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，肽抗原(A)是来自于皮肤癌例如基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波斯肉瘤或黑素瘤的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是来自于肺癌例如腺癌、支气管肺泡癌、大细胞癌或小细胞癌的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是来自于脑癌例如成胶质细胞瘤或脑膜瘤的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是来自于结肠癌的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是来自于肝癌例如肝细胞癌的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是来自于胰腺癌的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，肽抗原(A)是来自于肾癌例如肾细胞癌的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是来自于睾丸癌的肿瘤相关抗原。
在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是源自于癌前病变例如原位癌的变种或外阴上皮内瘤样病变、宫颈上皮内瘤样病变或阴道上皮内瘤样病变的肿瘤相关抗原。
在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是来自于传染性因子例如病毒、细菌或真菌的抗原。在另外的实施方式中，所述肽抗原(A)是源自于传染性因子的肽或糖肽，例如HIV包膜融合肽或来自于HIV的V3或V1/V2糖肽。
在某些实施方式中，所述肽抗原(A)代表自体抗原。所述自体抗原可以在筛查对象自己的T细胞对在患者自己的MHC-I分子的背景中呈递的自身抗原的自体反应性的基础上来鉴定和选择。或者，所述肽抗原可以使用计算机模拟方法来选择，所述计算机模拟方法预测具有下述性质的潜在的自体抗原：(i)对结合对象自己的MHC-I分子具有预测的高亲和性，和(ii)被表达和/或已知与造成对象的自体免疫综合征的病理相关。在其他实施方式中，所述肽抗原代表源自于过敏原的CD4表位，并且在对患者自己的MHC-II分子具有高结合亲和性的肽抗原的基础上选择。
本领域技术人员认识到，引起免疫应答并可用于疾病的预防或治疗的任何肽、蛋白质或翻译后修饰的蛋白质(例如糖蛋白)可以被选择用作肽抗原(A)，以用于本发明的免疫原性组合物中。
延长部(B1和B2)：
所述任选的N-和C-端延长部(B1和B2)是指分别连接到所述肽抗原(A)的N-和C-端的分子。所述N-和C-端延长部B1和B2可以由下述任一者或多者构成：氨基酸，包括非天然氨基酸；亲水的环氧乙烷单体(例如PEG)；疏水的烷烃链；等，或其组合。所述N-和C-端延长部B1和B2通过任何适合的手段，例如通过稳定的酰胺键连接到所述肽抗原(A)。
在某些实施方式中，所述延长部(B1和B2)起到控制所述肽抗原(A)的降解速率的作用，但是也可以执行任一种或多种其他功能。在某些实施方式中，所述N-或C-端延长部(B1或B2)可以是游离的(其中所述N-或C-端延长部的一个末端被连接到所述肽抗原(A)，并且另一个末端不被连接到其他分子)并用于减缓所述肽抗原的降解；例如，基于肽的延长部B1可以通过酰胺键连接到所述肽抗原的N-端以减缓降解。在其他实施方式中，所述N-和/或C-端延长部(B1和/或B2)可以被连接到异源分子，并且可以起到连接物的作用并且也调节肽抗原(A)降解。提供连接物功能的N-和/或C-端延长部可以将所述肽抗原直接地或通过连接物(L)间接地连接到粒子(P)或疏水分子(H)和/或带电荷分子(C)。
在某些实施方式中，所述延长部(B1和/或B2)起到在任两个异源分子之间提供距离即间隔的作用。在其他实施方式中，所述延长部(B1和/或B2)起到为所述肽抗原偶联物提供疏水或亲水性质的作用。在另一些其他实施方式中，可以选择所述延长部(B1和/或B2)的组成以提供刚性或柔性。在其他实施方式中，所述N-和/或C-端延长部(B1和/或B2)可以帮助稳定化由所述肽抗原偶联物形成的粒子。
在某些实施方式中，所述延长部(B1和/或B2)包含带电荷的官能团例如带电荷的氨基酸残基(例如精氨酸、赖氨酸)，其在生理pH下提供静电荷。所述延长部中存在的带电荷残基的数目，可用于调节所述肽抗原偶联物的净电荷。本文中公开了一种算法，其描述了选择被蛋白酶识别并提供特定静电荷以起到使由所述肽抗原偶联物形成的粒子稳定的作用的基于肽的延长部(B1和/或B2)的系统性方法。
另外，在某些实施方式中，添加到肽抗原(A)的C-端延长部(B2)被选择成便于包含[C]-[B1]-A-B2-[X1]的肽的制造，其中[]表示所述基团是任选的，方法包括在固相肽合成期间将破坏β-折叠形成并防止序列截短的氨基酸序列并入到B2中。在非限制性实例中，在固相肽合成期间并入C-端二肽连接物(B2)Gly-Ser作为伪脯氨酸二肽(例如Gly-Ser(Psi(Me,Me)pro))。在另外的实施方式中，脯氨酸被包括在组织蛋白酶可切割的C-端延长部(B2)序列中，例如Ser-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO：21)；由此包含所述脯氨酸，以便既便于制造也促进所述延长部被胞内体蛋白酶的加工。
在某些实施方式中，所述肽抗原(A)在C-端被连接到B2延长部，所述B2延长部直接地或通过连接物(L)间接地连接到疏水分子(H)或粒子(P)。在某些实施方式中，将B1延长部连接到所述肽抗原的N-端并将B2延长部连接在所述肽抗原(A)的C-端，其中B1或B2中的任一者被直接地或通过连接物(L)连接到粒子(P)或疏水分子(H)。在其他实施方式中，肽抗原(A)在N-端连接到B2延长部，所述B2延长部被直接地或通过连接物(L)连接到粒子或疏水分子(H)。在某些实施方式中，将带电荷分子(C)连接到延长部B1或B2，所述延长部被分别连接到所述肽抗原(A)的N-或C-端，其中未被连接到带电荷分子(C)的延长部被直接地或通过连接物(L)连接到所述疏水分子(H)或粒子(P)。在另外的实施方式中，带电荷分子(C)被连接到B1和B2延长部两者，所述延长部被分别连接到所述肽抗原(A)的N-和C-端两者。在另外的实施方式中，带电荷分子(C)被连接到所述连接到肽抗原(A)的N-端的B1延长部，但不连接到所述附连到肽抗原(A)的C-端的B2延长部，所述B2延长部可以直接地或通过连接物(L)连接到疏水分子(H)或粒子(P)。连接物前体X1或连接物(L)可以通过任何适合的方式例如酰胺键连接到所述延长部(B1或B2)中的任一者。在优选实施方式中，所述延长部(B1和B2)是被选择用于被酶例如蛋白酶识别和水解的肽序列。所述延长部(B1和B2)优选为可切割的肽，包括被胞内体蛋白酶或免疫蛋白酶体中的任一者或两者识别的氨基酸。
正如在本文中更详细描述的，由可降解肽构成的延长部(B1或B2)的组成取决于所述延长部被连接到所述肽抗原(A)的N-端(B1)还是C-端(B2)。
在某些实施方式中，所述N-端延长部(B1)是长度在约1至8个氨基酸之间，例如1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸，通常长度不超过10个氨基酸的肽序列，其通过例如在所述延长部(B1)的羧基与所述肽抗原(A)的N-端残基的α胺基之间形成的酰胺键连接到所述肽抗原(A)。B1与肽抗原(A)之间的所述酰胺键可以被酶切割。应该理解，习惯上以距所述切割位点从近到远的次序对氨基酸位置编号，并且在所述切割位点的C-端的氨基酸位置用单引号指示(例如Pn’)。例如，对于连接到作为八肽(PA1’-PA2’-PA3’-PA4’-PA5’-PA6’-PA7’-PA8’)的肽抗原(A)的N-端的四肽延长部(PN4-PN3-PN2-PN1)例如PN4-PN3-PN2-PN1-PA1’-PA2’-PA3’-PA4’-PA5’-PA6’-PA7’-PA8’来说，PN1-PA1’之间的酰胺键被酶识别并水解。
在某些实施方式中，所述N-端延长部(B1)是被胞内体蛋白酶识别的酶可降解四肽，其中四肽延长部(例如PN4-PN3-PN2-PN1)的PN1位置优选地选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸，例如PN4-PN3-PN2-Arg；PN2选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；PN3选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸或亮氨酸；并且PN4选自甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。在某些实施方式中，所述N-端延长部(B1)是被胞内体蛋白酶识别的酶可降解三肽，其中三肽延长部(例如PN3-PN2-PN1)的PN1位置优选地选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸；PN2选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；并且PN3选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸或亮氨酸。在某些实施方式中，所述N-端延长部(B1)是被胞内体蛋白酶识别的酶可降解二肽，其中二肽延长部(例如PN2-PN1)的PN1位置优选地选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸；并且PN2选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在另外的其他实施方式中，所述N-端延长部(B1)是被胞内体蛋白酶识别的氨基酸，其中所述PN1位置优选地选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸。
在其他实施方式中，所述N-端延长部(B1)是被免疫蛋白酶体识别的酶可降解肽，其中四肽延长部(PN4-PN3-PN2-PN1)的P1位置优选地选自异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，例如PN4-PN3-PN2-Leu。
在另外的实施方式中，所述N-端延长部(B1)是被胞内体蛋白酶和免疫蛋白酶体两者识别的酶可降解肽，其中八肽延长部(PN8-PN7-PN6-PN5-PN4-PN3-PN2-PN1)的PN5和PN1位置，对于被组织蛋白酶识别的PN5位置来说选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸，并且对被免疫蛋白酶体识别的PN1位置来说选自异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，例如PN8-PN7-PN6-Arg-PN4-PN3-PN2-Leu。被组织蛋白酶和免疫蛋白酶体识别的N-端延长部(B1)的非限制性实例是Lys-Pro-Leu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Leu(SEQ ID NO：3)。
被免疫蛋白酶体识别的四肽N-端延长部(B1)的非限制性实例包括：Ser-Leu-Val-Cit，Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：4)，Ser-Pro-Val-Cit，Glu-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：5)，Ser-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：6)，Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)，Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO：8)，Lys-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：9)，Glu-Leu-Val-Cit，Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：10)，Glu-Pro-Val-Cit和Lys-Pro-Val-Cit。三肽N-端延长部(B1)的非限制性实例包括：Leu-Val-Cit，Leu-Val-Leu，Pro-Val-Cit，Leu-Val-Arg，Pro-Val-Arg，Pro-Leu-Arg，Gly-Val-Ser。二肽N-端延长部(B1)的非限制性实例包括：Val-Cit，Val-Leu，Val-Arg，Leu-Arg。单一氨基酸N-端延长部(B1)的非限制性实例包括Cit、Arg、Leu或Lys。在上述实例中，Arg可以被Lys代替；Lys可以被Arg代替；Glu可以被Asp代替；并且Asp可以被Glu代替。注意Cit＝瓜氨酸。
在某些实施方式中，所述延长部(B2)是连接到肽抗原(A)的C-端残基的可降解肽，并且由被某些蛋白酶识别并水解的氨基酸序列构成。在某些实施方式中，所述C-端延长部(B2)是长度在约1至8个氨基酸之间，例如1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸，通常不超过10个氨基酸的肽序列。在优选实施方式中，所述C-端延长部(B2)通过在所述肽抗原(A)的C-端羧基与所述延长部(B2)的N-端残基的α胺基之间形成的酰胺键连接到所述肽抗原(A)。B2与肽抗原(A)之间的酰胺键可以被酶切割。注意，习惯上以距所述切割位点从近到远的次序对氨基酸位置编号，并且在所述切割位点的C-端的氨基酸位置用单引号指示(例如Pn’)。例如，对于连接到八肽抗原(PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1)的C-端的四肽延长部(PC1’-PC2’-PC3’-PC4’)，例如PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1-PC1’-PC2’-PC3’-PC4’来说，PA1-PC1’之间的酰胺键被酶识别并水解。
在优选实施方式中，C-端延长部(B2)是被选择用于促进免疫蛋白酶体识别和切割并任选地促进胞内体蛋白酶识别的氨基酸序列。由于肽抗原(A)通常含有促进免疫蛋白酶体在例如邻近所述肽抗原(A)的C-端残基的酰胺键处水解的C-端残基例如亮氨酸，因此连接到所述肽抗原(A)的C-端的延长部应该被选择成促进免疫蛋白酶体在邻近所述肽抗原(A)的C-端的酰胺键处识别并切割。所述免疫蛋白酶体在邻近所述肽抗原(A)的C-端氨基酸PA1的PC1’位置处，例如PA1-PC1’之间的酰胺键处，更偏好小的不带电荷的氨基酸。然而，胞内体蛋白酶偏好大体积的疏水氨基酸(例如亮氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸或谷氨酰胺)和碱性氨基酸(即精氨酸和赖氨酸)。因此，C-端延长部可以被选择成促进被任一或两类蛋白酶的识别。
在某些实施方式中，将具有序列PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1的肽抗原(A)连接到具有序列PC1’…PCn’的C-端肽延长部(B2)，其中n是从1至8的整数值，例如,PA8-PA7-PA6-PA4-PA3-PA2-PA1-PC1’…PCn’。所述C-端延长部(B2)的组成依赖于使用的延长部序列的长度。在某些实施方式中，所述C-端延长部B2是选自Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、Cit、Gln、Thr、Leu、Nle或Met的单一氨基酸PC1’。在另外的实施方式中，所述C-端延长部B2是二肽PC1’-PC2’，其中PC1’选自Gly、Ala或Ser；并且PC2’选自Gly、Ala、Ser、Pro、Arg、Lys、Cit、Gln、Thr、Leu、Nle或Met。在另外的实施方式中，所述C-端延长部B2是三肽PC1’-PC2’-PC3’，其中P1’选自Gly、Ala或Ser；PC2’选自Gly、Ala、Ser或Pro；并且PC3’选自Gly、Ser、Arg、Lys、Cit、Gln、Thr、Leu、Nle或Met。
在另外的实施方式中，所述C-端延长部B2是四肽延长部PC1’-PC2’-PC3’-PC4’，其中PC1’选自甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸；PC2’选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸或亮氨酸；PC3’选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；并且PC4’选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸。在另外的实施方式中，所述C-端延长部B2是五肽PC1’-PC2’-PC3’-PC4’-PC5’，其中PC1’选自甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸；PC2’选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；PC3’选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸或亮氨酸；PC4’选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；并且PC5’选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸。在另外的实施方式中，所述C-端延长部B2是六肽PC1’-PC2’-PC3’-PC4’-PC5’-PC6’，其中PC1’选自甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸；PC2’选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或脯氨酸；PC3’选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；PC4’选自脯氨酸或亮氨酸；PC5’选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；并且PC6’选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸。
六肽C-端延长部(B2)的非限制实例包括Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：11)、Gly-Gly-Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO：12)、Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：13)、Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit、Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit、Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：14)、Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：15)、Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：16)。五肽C-端延长部(B2)的非限制性实例包括Gly-Ser-Leu-Val-Arg(SEQ IDNO：17)、Gly-Ser-Leu-Val-Cit、Gly-Lys-Pro-Val-Cit、Gly-Lys-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：18)、Gly-Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：19)、Gly-Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：20)。四肽C-端延长部(B2)的非限制性实例包括Ser-Leu-Val-Cit、Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：4)、Ser-Pro-Val-Cit、Glu-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：5)、Ser-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：6)、Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)、Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO：8)、Glu-Leu-Val-Cit、Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：10)、Glu-Pro-Val-Cit、Glu-Gly-Val-Cit。三肽C-端延长部(B2)的非限制性实例包括Gly-Ser-Gly、Gly-Ser-Arg、Gly-Ser-Leu、Gly-Ser-Cit、Gly-Pro-Gly、Gly-Pro-Arg、Gly-Pro-Leu、Gly-Pro-Cit。二肽C-端延长部(B2)的非限制性实例包括Gly-Ser、Gly-Pro、Val-Cit、Gly-Arg、Gly-Cit。单一氨基酸C-端延长部(B2)的非限制性实例包括Gly、Ser、Ala、Arg、Lys、Cit、Val、Leu、Met、Thr、Gln或Nle。在上述实例中，Arg可以被Lys代替；Lys可以被Arg代替；Glu可以被Asp代替；并且Asp可以被Glu代替。
连接到肽抗原(A)的C-端的C-端连接物(B2)可以被选择成被免疫蛋白酶体和胞内体蛋白酶两者识别(即水解)。在非限制性实例中，将具有序列PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1的肽抗原(A)在C-端处连接到具有序列PC1’-PC2’-PC3’-PC4’的C-端四肽延长部(B2)，其中PC1’选自甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸，并且PC4’选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸，例如Ser-P3-P2-Arg。在某些实施方式中，将具有序列PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1的抗原在C-端处连接到具有序列PC1’-PC2’-PC3’-PC4’-PC5’-PC6’的C-端六肽延长部(B2)，其中PC1’和PC2’选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，并且PC6’选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸，例如Gly-Gly-PC3’-PC4’-PC5’-Arg。促进被免疫蛋白酶体和组织蛋白酶两者的加工并且被连接到所述肽抗原(A)的C-端的C-端延长部(B2)的非限制性实例，是Gly-Gly-Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO：12)。连接在肽抗原(A)的C-端处并有利于被免疫蛋白酶体和组织蛋白酶的加工的C-端延长部(B2)的其他非限制性实例是Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit或Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit。
连接物(L)和连接物前体(X1和X2)
执行位点选择性偶联、即将所述肽抗原(A)与疏水分子(H)或粒子(P)联结或连接在一起的特定功能的一部分连接物，被称为“连接物(L)”。所述连接物(L)作为连接物前体X1与连接物前体X2之间的反应的结果而形成。例如，直接地或通过延长部(B1或B2)或带电荷分子(C)间接地连接到所述肽抗原(A)的连接物前体X1，可以与附连到所述疏水分子(H)或粒子(P)的连接物前体X2反应，以形成将所述肽抗原(A)连接到所述疏水分子(H)或粒子(P)的连接物(L)。所述连接物前体X1允许所述肽抗原(A)与粒子(P)或疏水分子(H)的位点选择性连接。在某些实施方式中，直接地或通过延长部(B1或B2)间接地连接到连接物前体X1的肽抗原(A)可以被生产并分离，然后分开地添加到含有连接物前体X2的粒子(P)或疏水分子(H)，其选择性反应以形成联结所述肽抗原(A)与所述粒子(P)或疏水分子(H)的连接物(L)。
连接物(L)或连接物前体X1可以直接地或通过N-端延长部(B1)或C-端延长部(B2)分别间接地在肽抗原(A)的N-或C-端处连接到所述肽抗原(A)。在优选实施方式中，所述连接物(L)或连接物前体X1通过酰胺键连接到所述肽抗原(A)或延长部(B1或B2)。注意，直接连接到所述肽抗原的N-或C-端的连接物(L)或连接物前体X1不被当作延长部。
适合的连接物前体X1是与所述粒子(P)或疏水分子(H)上的连接物前体X2选择性反应，不在所述肽抗原(A)或任选的延长部(B1和/或B2)或任选的带电荷分子(C)的任何其他位点处发生连接的连接物前体。这种选择性对于确保可以在所述肽抗原(A)与粒子(P)或疏水分子(H)之间形成连接而不修饰所述肽抗原(A)来说是重要的。所述连接物(L)可以通过共价和/或高亲和性相互作用，将肽抗原(A)直接地或通过延长部(B1或B2)连接到粒子(P)或疏水分子(H)。在优选实施方式中，所述连接物前体X1与所述粒子或疏水分子(H)上的连接物前体X2形成共价键。
在优选实施方式中，所述连接物(L)作为所述连接物前体X1与X2之间的生物正交“点击化学”反应的结果而形成。在某些实施方式中，所述点击化学反应是无催化剂的点击化学反应例如张力促进的叠氮化物-炔烃环加成反应，其不需使用铜或任何催化剂。允许生物正交反应的连接物前体X1的非限制性实例包括包含选自叠氮化物、炔烃、四嗪和反式环辛烯的官能团的分子。在某些实施方式中，包含叠氮化物的连接物前体X1与连接物前体X2反应以形成三唑连接物。在其他实施方式中，包含四嗪的连接物前体X1与包含反式环辛烯(TCO)的连接物前体X2反应，以形成包含逆需求Diels-Alder连接产物的连接物。在优选实施方式中，所述连接物前体X1是带有叠氮化物官能团的非天然氨基酸，其与包含炔烃的连接物前体X2反应，经历1,3-偶极环加成以形成稳定的三唑环。在优选实施方式中，连接到粒子(P)或疏水分子(H)的X2连接物前体包含经历张力促进的环加成的炔烃，例如二苯并环辛炔(DBCO)。在另外的实施方式中，所述X1连接物前体是炔烃，其与所述粒子(P)或疏水分子(H)上存在的包含叠氮化物的连接物前体X2反应。
在其他实施方式中，取决于所述肽抗原(A)的组成而允许位点选择性反应的连接物前体X1，可以包含包括硫醇、肼、酮和醛的官能团。在某些实施方式中，包含硫醇的连接物前体X1与包含吡啶基二硫化物或马来酰亚胺的连接物前体X2反应，以分别形成二硫化物或硫醚连接物。在其他实施方式中，包含肼的连接物前体X1与包含酮或醛的连接物前体X2反应，以形成腙连接物。在某些实施方式中，所述连接物前体X1是具有硫醇官能团的天然或非天然氨基酸残基例如半胱氨酸，其与包含硫醇反应性官能团例如马来酰亚胺或吡啶基二硫化物的连接物前体X2反应。
在某些实施方式中，所述连接物前体X1是肽序列，其被连接到提供在所述粒子(P)或疏水分子(H)上的构成连接物前体X2的另一个肽序列。在其他实施方式中，所述连接物前体X1通过高亲和性、非共价相互作用，例如通过卷曲螺旋相互作用或静电相互作用，结合到所述粒子(P)或疏水分子(H)上的构成所述连接物前体X2的互补分子。在其他实施方式中，所述连接物前体X1结合到蛋白质例如生物素，其与蛋白质例如链亲合素形成高亲和性相互作用。
本领域技术人员认识到，被选择用于连接物前体X1和X2的适合的成对官能团或互补分子，可以在X1与X2之间换位。例如，由三唑构成的连接物可以从分别包含叠氮化物和炔烃的连接物前体X1和X2，或者从分别包含炔烃和叠氮化物的连接物前体X1和X2形成。因此，产生连接物的任何适合的官能团对，可以被放置在X1或X2上。
本公开中提出的特定连接物前体(X1和X2)和连接物(L)提供了出人意料的可制造性的提高和生物活性的提高。许多这样的连接物前体(X1和X2)和连接物(L)可以适合于本发明的实践，并且在全文中各处更详细描述。
所述连接物前体(X1)可以被直接地或通过延长部(B1或B2)或带电荷分子(C)间接地附连到所述肽抗原(A)的N-或C-端。
在某些实施方式中，所述连接物前体X1是直接地或通过B2延长部或带电荷分子(C)间接地连接到所述肽抗原(A)的C-端的氨基酸，并具有下式：
其中官能团(FG)被选择成与连接物前体X2上的FG特异性反应，并且通常选自胺、叠氮化物、肼或硫醇；R1通常选自OH或NH2，并且y1是任何整数例如1、2、3、4、5、6、7或8，并且所述氨基酸的α胺基通常被连接到所述延长部B2的C-端氨基酸，或者如果不存在B2延长部的话连接到所述肽抗原(A)的C-端氨基酸。
在其他实施方式中，所述连接物前体X1被直接地或通过延长部(B1或B2)或带电荷分子(C)间接地连接到所述肽抗原(A)的N-端，并具有下式：
Figure BDA0002263670070000652
其中官能团(FG)被选择成与连接物前体X2反应，并且通常选自胺、叠氮化物、肼或硫醇；y2是任何整数，通常为1、2、3、4、5、6、7或8；并且所述羰基通常被连接到所述延长部B1或在B1不存在时肽抗原(A)的N-端氨基酸的α胺基。
提供在所述疏水分子(H)或粒子(P)上的连接物前体X2包含被选择成允许与所述连接物前体X1选择性反应以形成连接物(L)的官能团。在某些实施方式中，构成X2的官能团包括羰基例如活化的酯/羧酸或酮，其与提供在所述连接物前体X1上的胺或肼反应，以形成包含酰胺或腙的连接物(L)。在其他实施方式中，构成X2的官能团包括叠氮化物，其与提供在所述连接物前体X1上的炔烃反应以形成三唑。在另一些其他实施方式中，所述构成X2的官能团选自马来酰亚胺或二硫化物，其与提供在所述连接物前体X1上的硫醇反应，以形成包含硫醚或二硫化物的连接物(L)。所述连接物前体X2可以通过任何适合的手段附连到所述疏水分子(H)或粒子(P)。在某些实施方式中，所述疏水分子(H)包含肽，并且X2被连接到所述基于肽的疏水分子(H)的N-端。
所述连接物(L)可以包含在分别包含叠氮化物和炔烃的连接物前体X1与X2之间形成的三唑。在某些实施方式中，所述包含三唑的连接物由含有叠氮基的连接物前体X1与含有炔烃(例如环辛炔)的连接物前体X2的反应产生。在某些实施方式中，所述含有叠氮基的连接物前体X1是带有叠氮化物官能团的非天然氨基酸，其被连接到肽抗原(A)或延长部(B1)的N-端或所述肽抗原(A)或延长部(B2)的C-端。所述叠氮化物官能团提供了直接地或通过N-端延长部(B1)或所述C-端延长部(B2)间接地连接到所述肽抗原(A)的反应性手柄，并选择性地与连接到疏水分子(H)或粒子(P)的含有炔烃(例如环辛炔)的连接物前体X2反应，由此形成将所述肽抗原(A)联结到所述疏水分子(H)或粒子(P)的三唑连接物(L)。
在某些实施方式中，所述连接物前体X1是直接地或通过B2延长部或带电荷分子(C)间接地连接到所述肽抗原(A)的C-端的叠氮基氨基酸，并具有下式：
其中所述氨基酸的α胺基被连接到B2的C-端氨基酸，或者如果不存在B2延长部的话连接到肽抗原(A)的C-端氨基酸；R1选自OH或NH2，并且n是任何整数例如1、2、3、4、5、6、7、8。含有叠氮基的连接物前体X1的非限制性实例是5-叠氮基-2-氨基戊酸、4-叠氮基-2-氨基丁酸和3-叠氮基-2-氨基丙酸。
在其他实施方式中，当所述含有叠氮基的连接物前体X1被连接到所述N-端延长部(B1)或在B1不存在时直接连接到所述肽抗原(A)的N-端时，所述连接物前体X1具有下式：
Figure BDA0002263670070000672
其中所述羰基通常被连接到所述延长部B1或当B1不存在时所述肽抗原(A)的N-端氨基酸的α胺基；并且y2是任何整数，通常为1、2、3、4、5、6、7或8。含有叠氮基的连接物前体的非限制性实例包括6-叠氮基-己酸、5-叠氮基-戊酸、4-叠氮基-丁酸和3-叠氮基-丙酸。
在某些实施方式中，其中所述连接物前体X1包含叠氮化物，所述连接物前体X2包含炔烃组成部分。炔烃的非限制性实例包括脂族炔烃、环炔烃例如二苄基环辛炔(DBCO或DIBO)、二氟辛炔(DIFO)和二芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)。在某些特定实施方式中，所述含有炔烃的连接物前体X2包含DBCO分子。
在某些实施方式中，所述C-端延长部(B2)通过所述肽抗原(A)的C-端处的酰胺键连接到所述肽抗原(A)，进而通过所述连接物(L)连接到所述疏水区块(H)。这种C-端连接的肽抗原偶联物的实例是(A)7-35-B2-L-H，其中(A)7-35表示包含7至35个氨基酸的肽抗原。在非限制性实例中，具有八肽序列PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1的肽抗原(A)在C-端处连接到四肽延长部(B2)例如Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)，其被连接到含有叠氮基的连接物前体(X1)叠氮基-赖氨酸(6-叠氮基-2-氨基己酸，Lys(N3))，其进而与连接到所述疏水分子(H)的含有环辛炔的连接物前体(X2)的二苯并环辛炔(DBCO)组成部分反应，产生PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1-Ser-Leu-Val-Arg-Lys(N3-DBCO-H)。
在某些可替选实施方式中，所述肽抗原(A)在所述肽抗原(A)的N-端被连接到所述N-端延长部(B1)，其进而通过所述连接物(L)连接到所述疏水区块(H)。在非限制性实例中，具有序列PA1’-PA2’-PA3’-PA4’-PA5’-PA6’-PA7’-PA8’的肽抗原在N-端处连接到四肽延长部(PN4-PN3-PN2-PN1)例如Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)，所述四肽延长部被连接到叠氮基-戊酸(Azp)，其进而与连接到所述疏水分子(H)的含有环辛炔的连接物前体(X2)的二苯并环辛炔(DBCO)组成部分反应：H-DBCO-Azp-Ser-Leu-Val-Arg-PA1’-PA2’-PA3’-PA4’-PA5’-PA6’-PA7’-PA8’。
其他连接物和连接
连接物通常是指将所述肽抗原偶联物的任两个或更多个异源分子联结在一起的任何分子，并且可以另外执行下述功能中的任一者或多者：I)提高或降低水溶性；II)增加所述肽抗原偶联物的任两个组分即异源分子之间的距离；III)赋予刚性或柔性；或IV)控制/调节任两个或更多个异源分子之间的连接的降解/水解速率。本文中使用的连接物的具体类型被指定。连接物(L)是特定类型的连接物分子，用于直接地或通过延长部(B1或B2)间接地将所述肽抗原(A)位点特异性地连接到粒子(P)或疏水分子(H)。注意，分别放置在肽抗原(A)的N-和C-端处的N-和C-端延长部B1和B2，可以被连接到异源分子例如带电荷分子(C)、连接物(L)、粒子(P)或疏水分子(H)或任何异源分子，并因此起到连接物的作用。为清楚起见，尽管放置在所述肽抗原(A)的N-或C-端处的任何分子都是N-或C-端延长部(B1或B2)，但所述延长部当被连接到另一个分子例如带电荷分子(C)时，也可以充当连接物。因此，正如本文中所定义的，在抗原的N-或C-端处的连接物总是延长部(B1或B2)，但延长部不总是连接物。
所述用于联结所述肽抗原偶联物例如通过延长部(B1或B2)间接地连接到疏水分子(H)的肽抗原(A)的任两个组分的连接物，可以通过任何适合的方式。所述连接物可以使用共价或非共价方式来联结任两个或更多个组分即异源分子，例如肽抗原(A)和疏水分子(H)。
在优选实施方式中，连接物可以通过共价键来联结、即连接所述肽抗原偶联物的任两个组分。共价键是用于联结所述肽抗原偶联物的任两个组分即异源分子的优选连接，并且确保在施用于对象后没有组分能够立即与其他组分分散开，例如所述肽抗原和疏水分子(H)。此外，共价连接通常与非共价连接相比提供更高的稳定性，并有助于确保所述肽抗原偶联物的每个组分以等于或接近所施用的每种组分的比例共同递送到抗原呈递细胞。
在共价连接的非限制性实例中，点击化学反应可以产生三唑，其连接所述肽抗原偶联物的任两个组分，即将它们联结在一起。在几个实施方式中，所述点击化学反应是张力促进的[3+2]叠氮化物-炔烃环加成反应。炔烃基团和叠氮化物基团可以被提供在构成所述肽抗原偶联物的待通过“点击化学”连接的相应分子上。在某些实施方式中，带有叠氮化物官能团的配体例如TLR激动剂，被偶联到具有适合的反应性基团例如炔烃如二苄基环辛炔(DBCO)的疏水分子(H)。在另外的实施方式中，带有硫醇官能团的X1连接物前体被直接地或通过N-或C-端延长部(B1或B2)连接到所述肽抗原(A)。所述硫醇可以被连接到具有适合的反应性基团例如炔烃、烯烃、马来酰亚胺的疏水分子(H)，产生硫醚键，或者所述硫醇可以与吡啶基二硫化物反应，例如产生二硫键连接。在某些实施方式中，胺基被提供在一个分子上，并且可以通过将所述胺与任何适合的亲电基团例如羧酸、酰卤或活化的酯(例如NHS酯)反应以导致酰胺键形成，而连接到另一个分子，或者所述胺可以与烯烃(通过迈克尔加成)、醛和酮(通过席夫碱)反应。在优选实施方式中，所述连接物前体X1、任选的N-和C-端延长部(B1和B2)、任选的带电荷分子(C)和肽抗原(A)通过酰胺键连接在一起，作为通过固相肽合成生产的单个肽序列。存在大量适合的产生共价键即连接的可用反应，它们对于专业技术人员来说是熟知的。
用于联结所述肽抗原偶联物的任两个或更多个异源分子、即不同组分的连接物的类型，可以被选择成执行特定功能并满足应用的特定要求。通常，所述连接物能够在所述肽抗原偶联物的两个或更多个异源分子之间形成共价键，其中所述组分是肽抗原(A)、粒子(P)或疏水分子(H)、任选的N-和C-端延长部(B1和B2)、任选的连接物(L)、任选的带电荷分子(C)、任选的第二聚合物(其被连接到所述疏水分子(H))和任选的配体例如PRR激动剂。
存在许多本领域技术人员公知的适合的连接物，它们包括但不限于直链或支链碳连接物、杂环碳连接物、刚性芳族连接物、柔性环氧乙烷连接物、肽连接物或其组合。在某些实施方式中，所述碳连接物可以包括C1-C18烷烃连接物例如低级烷基C4；所述烷烃连接物可用于增加两个或更多个异源分子之间的间隔，而更长链烷烃连接物可用于提供疏水特征。或者，可以使用亲水连接物例如环氧乙烷连接物代替烷烃连接物，以增加任两个或更多个异源分子之间的间隔并提高水溶性。在其他实施方式中，所述连接物可以是提供刚性的芳族化合物或聚(芳烃)化合物。所述连接物分子可以包含亲水或疏水连接物。在几个实施方式中，所述连接物包括可降解肽序列，其可以被细胞内的酶(例如组织蛋白酶或免疫蛋白酶体)切割。
在某些实施方式中，所述连接物可以由聚(环氧乙烷)(PEG)构成。所述连接物的长度取决于所述连接物的目的。例如，所述连接物例如PEG连接物的长度可以被增加以分隔免疫原性组合物的组分，以例如减小空间位阻，或者在亲水PEG的情况下，连接物可用于提高水溶性。所述连接物例如PEG可以是短的连接物，其长度可以是至少2个单体。所述连接物例如PEG的长度可以在约4至约24个单体之间，例如长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个单体或更长。在某些实施方式中，配体通过PEG连接物连接到疏水分子(H)。
在某些实施方式中，当所述连接物包含碳链时，所述连接物可以包含长度在约1或2至约18个碳之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个碳或更长的链。在某些实施方式中，在所述连接物包含碳链时，所述连接物可以包含约12至约20个碳之间的链。在某些实施方式中，在所述连接物包含碳链时，所述连接物可以包含不超过18个碳的链。在某些实施方式中，配体例如PRR激动剂通过低级烷基连接到所述疏水分子(H)。
在某些实施方式中，所述连接物在细胞内条件下可切割，使得所述连接物的切割导致连接到所述连接物的任何组分例如肽抗原的释放。
例如，所述连接物可以被位于细胞内囊泡中(例如溶酶体或胞内体或质膜微囊内)的酶或被胞质溶胶中的酶例如蛋白酶体或免疫蛋白酶体切割。所述连接物可以是例如肽连接物，其被蛋白酶，包括但不限于位于细胞内囊泡中的蛋白酶，例如溶酶体或胞内体区室中的组织蛋白酶切割。所述肽连接物的长度通常在1-10个氨基酸之间例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸，或更长(例如多达20个氨基酸)例如长度为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸。已知某些二肽被蛋白酶包括组织蛋白酶例如组织蛋白酶B和D和纤溶酶水解(参见例如Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123)。例如，可以使用可被硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B切割的肽连接物(例如Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：23)连接物)。这种连接物的其他实例描述在例如美国专利号6,214,345中，其通过参考并入本文。在特定实施方式中，所述可以被细胞内蛋白酶切割的肽连接物是Val-Cit连接物或Phe-Lys连接物(参见例如美国专利号6,214,345，其描述了具有Val-Cit连接物的多柔比星的合成)。
所述连接物中可切割肽的特定序列可用于促进在细胞内摄取后被免疫细胞的加工。例如，本文公开的免疫原性组合物的几个实施方式在水性条件中形成粒子，其被免疫细胞例如抗原呈递细胞(例如树突状细胞)内化。所述可切割肽连接物可以被选择成促进所述肽连接物在细胞内摄取后被免疫细胞的加工(即水解)。所述可切割肽连接物的序列可以被选择成促进被细胞内蛋白酶例如细胞内囊泡中的组织蛋白酶或胞质溶胶空间中的蛋白酶体或免疫蛋白酶体的加工。
在几个实施方式中，使用由式Pn…P4-P3-P2-P1的肽序列构成的连接物来促进被组织蛋白酶的识别，其中P1选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸；P2选自甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；P3选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸或亮氨酸；并且P4选自甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。在非限制性实例中，式P4-P3-P2-P1的四肽连接物通过酰胺键连接到异源分子，并具有序列Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO：8)。为清楚起见，氨基酸残基(Pn)以距所述切割位点从近到远编号，所述切割位点在P1残基的C-端，例如P1-P1’之间的酰胺键被水解。促进被胞内体和溶酶体蛋白酶例如组织蛋白酶的切割的适合的肽序列在文献中被充分描述(参见：Choe等，J.Biol.Chem.,281:12824-12832,2006)。
在几个实施方式中，由肽序列构成的连接物被选择成促进被蛋白酶体或免疫蛋白酶体识别。式Pn…P4-P3-P2-P1的肽序列被选择成促进被蛋白酶体或免疫蛋白酶体识别，其中P1选自碱性残基和疏水支链残基，例如精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；P2、P3和P4任选地选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸和酪氨酸。在非限制性实例中，被蛋白酶体识别的式P4-P3-P2-P1的可切割连接物通过P1处的酰胺键连接到异源分子，并具有序列Tyr-Leu-Leu-Leu(SEQ ID NO：24)。促进被蛋白酶体或免疫蛋白酶体降解的序列可以单独地或与组织蛋白酶可切割连接物相组合使用。在某些实施方式中，将促进免疫蛋白酶体加工的氨基酸连接到促进被胞内体蛋白酶加工的连接物。促进被免疫蛋白酶体切割的大量适合的序列在文献中被充分描述(参见：Kloetzel等，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,2:179-187,2001；Huber等，Cell,148:727-738,2012和Harris等，Chem.Biol.,8:1131-1141,2001)。
在优选实施方式中，分别被连接到所述肽抗原(A)的N-和C-端的N-和C-端延长部(B1和B2)，分别被连接到另外的分子例如带电荷分子(C)和疏水分子(H)，并且由可切割肽构成。在几个实施方式中，可切割肽延长部被放置在所述肽抗原(A)的N-和/或C-端中的任一者或两者处。放置在所述肽抗原(A)的N-端处的可切割肽延长部是N-端延长部(B1)，但当所述延长部被连接到除了所述肽抗原之外的另一个分子例如带电荷分子(C)时，另外地起到连接物的作用。位于所述肽抗原(A)的C-端处的延长部是C-端延长部(B2)，但是当所述延长部被连接到另一个分子例如疏水分子(H)时，可以另外地起到连接物的作用。构成N-或C-端处的连接物(B1和B2)的可切割肽的优选序列是不同的，并且在全文中各处更详细地描述。
在其他实施方式中，所述肽抗原偶联物的任两个或更多个组分可以通过pH敏感性连接物联结在一起，所述pH敏感性连接物在酸性条件下对水解敏感。大量pH敏感性连接对于本领域技术人员来说是熟知的，并且包括例如腙、半卡巴腙、硫代半卡巴腙、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等(参见例如美国专利号5,122,368、5,824,805、5,622,929；Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville等，1989,Biol.Chem.264:14653-14661)。在优选实施方式中，所述连接在生理pH下例如约7.4的pH下稳定，但在溶酶体pH即～pH 5-6.5下经历水解。在某些实施方式中，将配体例如TLR-7/8激动剂通过形成pH敏感性键合的FG连接到疏水分子(H)，例如酮与肼之间形成pH不稳定的腙键的反应。在其他实施方式中，将肽抗原(A)直接地或通过延长部(B1或B2)间接地连接到连接物前体X1，所述连接物前体X1带有酮基并被连接到疏水分子(H)上的包含肼的连接物前体X2。pH敏感性连接例如腙，提供了所述键合在生理pH下即约pH 7.4下稳定，但在较低pH值例如细胞内囊泡的pH下被水解的优点。
在其他实施方式中，所述连接物包含在还原条件下可切割的连接，例如可还原的二硫键。用于引入二硫连键的许多不同的连接物在本领域中是已知的(参见例如Thorpe等，1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等，《免疫偶联物：癌症的放射影像学和疗法中的抗体偶联物》(Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagery andTherapy of Cancer)(C.W.Vogel主编，Oxford U.Press,1987)；Phillips等，CancerRes.68:92809290,2008；也参见美国专利号4,880,935)。在某些实施方式中，将肽抗原(A)直接地或通过延长部(B1或B2)间接地连接到连接物前体X1，所述连接物前体X1带有硫醇官能团，其与连接到疏水分子(H)的包含吡啶基二硫化物的X2连接物前体形成二硫键。
在其他实施方式中，所述肽抗原偶联物的任两个组分之间的连接可以通过下述方式来形成：酶反应，例如表达蛋白的连接或通过分拣酶(参见：Fierer,等，Proc.Natl.Acad.Sci.,111:W1176-1181,2014和Theile等，Nat.Protoc.,8:1800-1807,2013)，化学-酶反应(Smith等，Bioconjug.Chem.,25:788-795,2014)，或非共价高亲和性相互作用例如生物素-亲和素和螺旋卷曲相互作用(Pechar等，Biotechnol.Adv.,31:90-96,2013)，或本领域技术人员已知的任何适合手段(参见：Chalker等，Acc.Chem.Res.,44:730-741,2011；Dumas等，Agnew Chem.Int.Ed.Engl.,52:3916-3921,2013)。
粒子(P)或疏水分子(H)
本公开的免疫原性组合物包含肽抗原偶联物，所述偶联物还包含预先形成的粒子(P)或疏水分子(H)。包含粒子(P)的肽抗原偶联物在水性条件中作为粒子存在。在某些实施方式中，包含疏水分子(H)的肽抗原偶联物在有机溶剂(例如DMSO)中可能作为单一可溶性分子存在，但在水性条件中组装成粒子。在其他实施方式中，包含疏水分子(H)的肽抗原偶联物在有机溶剂(例如DMSO)和水性条件中，在一定的温度和pH范围内可能作为单一可溶性分子存在，但在水性条件中，在一定的温度和pH范围内例如在生理温度和pH下组装成粒子。
所述粒子(P)或疏水分子(H)的目的是使所述肽抗原偶联物转变成颗粒物格式，作为调节药代动力学和促进被抗原呈递细胞摄取的手段。由肽抗原偶联物形成的粒子应该具有直径在约10nm至10,000nm之间的尺寸。在优选实施方式中，所述粒子是纳米粒子，其具有能够被摄取到细胞(例如免疫细胞)的胞内体系统中的尺寸。所述纳米粒子可以具有直径为约10nm至约500nm的平均尺寸范围。因此，在某些实施方式中，所述纳米粒子的直径可以为平均约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约100nm、200nm、300nm、400nm或500nm。在其他实施方式中，所述纳米粒子的直径可以为平均约10-50nm或约10-100nm或约10-200nm或约10-500nm。在优选实施方式中，所述粒子尺寸的直径范围为约20-200nm。所述组合物中的粒子的尺寸可变，但通常落于本文中阐述的尺寸范围之内。例如，所述组合物中超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过91％、超过92％、超过93％、超过94％、超过95％、超过96％、超过97％、超过98％或超过99％的粒子将落于本文中阐述的尺寸范围之内。在某些实施方式中，所述肽抗原(A)可以被连接到延长部(B1或B2)，所述延长部被直接地或通过连接物(L)连接到粒子(P)或疏水分子(H)，它们组装成对于被免疫细胞摄取来说过大(例如大于约5,000nm的粒子)并且在注射位点处形成储库的粒子。
在某些实施方式中，所述肽抗原(A)被连接到预先形成的粒子(P)。所述粒子(P)可以由在水性条件中保持结构的疏水材料例如聚合物或脂质、交联的亲水聚合物例如水凝胶或交联的疏水聚合物例如交联聚苯乙烯构成。粒子(P)的非限制性实例包括聚合物粒子，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚合物囊体(polymersome)或泊洛沙姆；基于脂质的胶束、脂质体或多层囊泡；水包油乳液例如水包矿物油和矿物油包水乳液；以及无机盐粒子，例如磷酸铝或氢氧化铝盐粒子(即铝佐剂)。在某些实施方式中，所述粒子(P)是脂质体纳米粒子。在其他实施方式中，所述粒子(P)是铁粒子。在另一些其他实施方式中，所述粒子(P)是聚合物粒子。
肽抗原(A)连接到预先形成的粒子(P)的效率取决于所述肽抗原的本质和所使用的连接的类型。例如，肽抗原(A)可以被吸收或并入到所述粒子(P)内部，并且对于每种肽抗原(A)来说这个过程的效率可以凭经验确定，因为所述肽抗原(A)的本质可以影响吸收和并入。肽抗原(A)可以通过高亲和力相互作用(例如静电)或共价键连接到所述粒子(P)，其中粒子(P)具有固定数目的反应性位点，其决定了可以被连接到所述粒子(P)的肽抗原(A)的数目。对于包含多种不同肽抗原(A)例如20种不同肽抗原(A)的免疫原性组合物来说，每种类型的肽抗原(A)的多个拷贝可以在分开的粒子(P)上递送，或者所有20种肽抗原(A)的多个拷贝可以在同一粒子(P)上递送。
预先形成的粒子(P)的限制在于抗原与粒子(P)的比率不能容易地控制。可替选地，在优选实施方式中，所述肽抗原(A)被直接地或通过连接物(L)连接到在水性条件中促进粒子组装的疏水分子(H)。由任选地通过延长部(B1或B2)连接并直接地或通过连接物(L)连接到疏水分子(H)的肽抗原(A)构成的肽抗原偶联物是在分子上确定的实体，并且肽抗原(A)与所述疏水分子(H)的比例可以被精确地控制。在优选实施方式中，所述比例是1:1的肽抗原(A)比疏水分子(H)。在其他非限制性实例中，所述比例可以是1:3至3:1的肽抗原(A)比疏水分子(H)。
与预先形成的粒子相反，所述肽抗原偶联物可以通过将所述肽抗原(A)直接地或通过延长部(B1或B2)和/或连接物(L)间接地连接到疏水区块(H)，产生化学上确定的单一分子，来形成。所述疏水分子(H)是具有显著受限的水溶性的分子，或者在性质上是两亲的，并且能够在水性条件中组装成超分子结构例如胶束、纳米粒子或微粒。在优选实施方式中，所述疏水分子(H)在水性条件中是不溶的或形成胶束，溶解性低至约0.1mg/mL或约0.01mg/mL。
所述疏水分子(H)可以选自任何分子，包括高级烷烃、环状芳族化合物、脂肪酸、源自于萜烯/异戊二烯的化合物，或具有有限的水溶性和/或两亲特征，导致分子在水性条件中组装成粒子的聚合物。示例性的高级烷烃包括但不限于辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷和十八烷。示例性的环状芳族化合物包括但不限于苯和稠合的苯环结构或杂环芳族分子。示例性的饱和和不饱和脂肪酸包括但不限于肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或油酸。在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是脂肪酸例如肉豆蔻酸。在其他实施方式中，所述疏水分子(H)包含二酰基脂质，例如1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺或脂肽例如Pam2Cys。在某些实施方式中，所述基于脂肪酸或脂质的疏水分子(H)还可以包含PEG。示例性的源自于萜烯/异戊二烯的化合物包括甾醇衍生物例如胆甾醇和鲨烯。在某些实施方式中，所述疏水分子(H)包含胆甾醇。
在优选实施方式中，所述疏水分子(H)是具有有限的水溶性或者是两亲性的并且在水性条件中能够组装成粒子例如胶束的聚合物。示例性的聚合物包括但不限于PLGA、疏水聚(氨基酸)、聚(谷氨酸苯甲酯)、聚苯乙烯、基于环氧乙烷环氧丙烷单体的泊洛沙姆，以及温度响应性聚合物例如聚(N,N’-二乙基丙烯酰胺),聚(N-正丙基丙烯酰胺)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚[二(乙二醇)甲基丙烯酸酯甲基醚]，和某些PEG化的聚(氨基酸)例如聚(γ-(2-甲氧基乙氧基)酯基-L-谷氨酸)。在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是由疏水氨基酸构成的聚(氨基酸)。在优选实施方式中，所述包含聚(氨基酸)的疏水分子(H)由包含芳环的氨基酸构成。在其他实施方式中，所述疏水分子(H)是连接到配体例如PRR激动剂的聚(氨基酸)。在其他实施方式中，所述疏水分子(H)是A-B型二嵌段共聚物。在某些实施方式中，所述二嵌段共聚物是温度响应性的，并且能够对温度变化做出响应组装成粒子。在某些实施方式中，所述包含A-B型二嵌段共聚物的疏水分子(H)还包含连接到所述二嵌段共聚物的一个嵌段的配体例如PRR激动剂。可作为疏水分子(H)用于肽抗原偶联物的聚合物在下文中更详细描述。
聚合物
所述疏水分子(H)或粒子(P)可以包含直链或支链聚合物。所述聚合物可以是均聚物、共聚物或三元共聚物。所述聚合物可以由一种或多种不同类型的单体单元构成。所述聚合物可以是统计共聚物或交替共聚物。所述聚合物可以是嵌段共聚物例如A-B型，或者所述聚合物可以由接枝共聚物构成，其中两种聚合物通过聚合物类似的反应连接。
所述疏水分子(H)或粒子(P)可以包含含有天然存在的和/或非天然单体及其组合的聚合物。天然生物聚合物可以包括由氨基酸构成的肽(有时被称为聚(氨基酸))，具体实例是聚(色氨酸)。所述天然生物聚合物可以是化学修饰的。例如，由谷氨酸或赖氨酸残基构成的生物聚合物可以分别在γ羧基或ε氨基处被修饰，用于配体的附连。生物聚合物可以是多糖，其可以包括但不限于糖原、纤维素和葡聚糖。其他实例包括自然界中存在的多糖，包括藻酸盐和壳聚糖。聚合物也可以由天然存在的小分子例如乳酸或乙醇酸构成，或者可以是两者的共聚物(即PLGA)。
在某些实施方式中，所述疏水分子(H)或粒子(P)由阴离子(例如聚(酸性))聚合物或阳离子(例如聚(碱性))聚合物或阴离子和阳离子聚合物的组合构成。阳离子聚合物可以通过静电相互作用结合到带负电的肽，或者可用于络合带负电的核酸例如DNA和RNA。在某些实施方式中，所述聚合物在pH 7.4是水不溶性两性离子，但在低于约6的pH下带有净正电荷并且是水溶性的。在某些实施方式中，所述包含第一聚合物的疏水分子(H)带有分别与第二聚合物上的负或正电荷互补的正或负电荷，并且所述第一和第二聚合物通过电荷中和形成静电复合物，所述电荷中和使所述复合物不溶。在某些实施方式中，所述阳离子聚合物可以是天然存在的或合成的聚(胺)，例如聚(赖氨酸)或聚(乙烯亚胺)(PEI)。在另外的实施方式中，所述阳离子聚合物可以是从胺与双(丙烯酰胺)或双(丙烯基酯)的迈克尔加成反应产生的聚(酰胺基胺)(PAA)或聚(β氨基酯)(PBAE)。可以在本公开的实施方式中使用的阳离子聚合物的非限制性实例包括聚(乙烯亚胺)、聚(烯丙基阴离子盐酸盐；PAH)、腐胺、尸胺、聚(赖氨酸)(PL)、聚(精氨酸)、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚(丙烯亚胺)、氨基葡萄糖苷-多胺、二脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、尸胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙基酯、聚(组氨酸)、阳离子化明胶、树枝状聚合物、壳聚糖及其任何组合。所述阳离子聚合物可以含有季铵基团，例如在甲基化壳聚糖上存在的。或者，所述聚合物可以是阴离子聚合物。在某些非限制性实例中，所述聚阴离子聚合物是聚(谷氨酸)。在可替选实施方式中，所述聚阴离子聚合物是聚(天冬氨酸)。所述聚合物可以是基于聚磷酸酯的聚合物。所述聚合物可以包含天然阴离子多糖，包括例如由1-4连接的β-D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸构成的海藻酸。所述聚合物可以包含核苷酸。其他聚阴离子聚合物可能同等地适合。
在某些实施方式中，所述疏水分子(H)在一定的pH范围内是水溶性阳离子聚合物，但在生理pH 7.4附近的pH范围下不带电荷并且是水不溶性的。在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是包含芳族胺的聚合物，其中所述芳族胺的共轭酸的pKa低于7.5。在低于所述芳族胺的pKa的pH下，所述芳族胺被质子化，并因此赋予所述聚合物以正电荷。由包含芳族胺的聚合物构成的疏水分子(H)的非限制性实例是聚(苯丙氨酸胺)。在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是包含氮杂环的聚合物，其中构成所述杂环的氮原子的pKa低于7.5。在低于构成所述杂环的氮原子的pKa的pH下，所述氮被质子化并赋予所述聚合物以正电荷。由包含具有可质子化的(即碱性)氮原子的杂环的聚合物构成疏水分子(H)的非限制性实例是聚(组氨酸)。在本文中，我们报道了出人意料的发现，即由包含可质子化的氮(例如芳族胺)的聚合物构成的疏水分子，在制造、粒子稳定性和生物活性方面提供了出人意料的改进。
在某些实施方式中，所述疏水分子(H)可以是基于聚(二乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯)-(DEGMA)的聚合物。在另外的实施方式中，所述疏水分子(H)是可以包括(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、苯乙烯基和乙烯基组成部分的单体的聚合物。基于(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺以及苯乙烯基和乙烯基的单体的具体实例分别包括N-2-羟基丙基(甲基丙烯酰胺)(HPMA)、羟基乙基(甲基丙烯酸酯)(HEMA)、苯乙烯和乙烯吡咯烷酮(PVP)。所述聚合物可以是热响应性聚合物，其由N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMAm)、N,N’-二乙基丙烯酰胺(DEAAm)、N-(L)-(1-羟基甲基)丙基甲基丙烯酰胺(HMPMAm)、甲基丙烯酸N,N’-二甲基乙基酯(DMEMA)、甲基丙烯酸2-(2-甲氧基乙氧基)乙基酯(DEGMA)的单体构成。在某些实施方式中，所述疏水聚合物是包含HPMA或HPMA DEGMA单体的聚合物。在某些实施方式中，所述包含HPMA和DEGMA单体的聚合物是A-B型二嵌段聚合物。本文中报告的出人意料的发现是，连接到包含HPMA亲水嵌段的A-B型二嵌段共聚物的肽抗原(A)，组装成尺寸均匀的纳米粒子胶束，而与所述肽抗原(A)的组成无关。
所述疏水分子(H)也可以包含基于环状单体的聚合物，所述环状单体包括环状氨基甲酸酯、环状醚、环状酰胺、环状酯、环状酸酐、环状硫化物和环状胺。
基于包含环状单体的聚合物的疏水分子(H)可以通过开环聚合来生产，并包括聚酯、聚醚、聚胺、聚碳酸酯、聚酰胺、聚氨基甲酸酯和聚磷酸酯；具体实例可以包括但不限于聚己内酯和聚(乙烯亚胺)(PEI)。适合的聚合物也可以通过缩合反应来生产，并包括聚酰胺、聚缩醛和聚酯。
在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是可以包括3至10,000个单体单元的聚合物。在优选实施方式中，所述聚合物包括约3至300个单体单元，例如3至10个例如3、4、5、6、7、8、9、10个单体单元，或约10至100个单体单元，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个，或约100至200个单体单元，或约200至300个单体单元，通常不超过1,000个单体单元。在某些实施方式中，所述聚合物可以包含高达1,000至10,000个单体单元。通常，需要至少5个单体才能形成足够尺寸的疏水分子(H)以促进所述肽抗原偶联物的粒子形成，尽管出人意料地，由具有少至3个包含芳环的单体的聚合物构成的疏水分子(H)足以驱动肽抗原偶联物的粒子组装。将所述聚合物的长度从3个增加到5个单体和从5个增加到10个单体，提高了促进粒子形成的力的强度，导致由所述肽抗原偶联物形成更稳定且尺寸更大的粒子。在优选实施方式中，所述构成肽抗原偶联物的疏水分子(H)是由5-100个之间的单体构成的聚合物，这导致在水性条件中形成直径约10-300nm的粒子。在另外的实施方式中，构成所述疏水分子(H)的聚合物由约300个单体构成，并产生组装成约20至500nm或约100-500nm之间的粒子的肽抗原偶联物。
在某些实施方式中，构成所述疏水分子(H)的聚合物的平均分子量可以在约1,000至1,000,000g/mol之间。在优选实施方式中，所述聚合物的平均分子量在约1,000至60,000g/mol之间。在某些实施方式中，所述聚合物的分子量在约1,000至5,000之间，或约5,000至10,000之间，或约10,000至20,000之间，或约20,000至30,000之间，或约25,000至60,000之间。在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是A-B型二嵌段聚合物，其具有约10,000g/mol至约60,000g/mol之间，例如约10,000g/mol、20,000g/mol、30,000g/mol、40,000g/mol、50,000g/mol或60,000g/mol的平均分子量。在某些实施方式中，所述聚合物是A-B型二嵌段聚合物，其中所述A嵌段与B嵌段的分子量之比为约1:5至约5:1。在非限制性实例中，所述平均分子量为约60,000g/mol的A-B型二嵌段聚合物由下述嵌段构成：平均分子量为约10,000g/mol的A嵌段和平均分子量为约50,000g/mol的B嵌段；平均分子量为约20,000g/mol的A嵌段和平均分子量为约40,000g/mol的B嵌段；平均分子量为约30,000g/mol的A嵌段和平均分子量为约30,000g/mol的B嵌段；平均分子量为约40,000g/mol的A嵌段和平均分子量为约20,000g/mol的B嵌段；平均分子量为约50,000g/mol的A嵌段和平均分子量为约10,000g/mol的B嵌段。
所述聚合物的多分散性Mw/Mn可以在约1.0至约5.0的范围内。聚合物可以通过各种不同的聚合技术形成。肽和基于核苷酸的聚合物可以通过固相合成来制备，并且因为所述聚合物在分子上被限定，所以将具有1.0的多分散性。通过链生长聚合形成的聚合物将具有>1.0的多分散性。聚合物可以通过活性聚合技术或溶液自由基聚合来合成。在优选实施方式中，基于肽的生物聚合物通过固相肽合成来合成。包含具有芳环的氨基酸例如色氨酸的基于肽(或“聚(氨基酸)的聚合物尽管在水性条件中是疏水的，但与不含芳环的肽(或“聚(氨基酸)”)相比在通过固相合成的制造中提供了出人意料的改进。因此，在优选实施方式中，通过固相合成生产的基于肽的疏水分子(H)包括包含芳环的氨基酸。在另外的实施方式中，基于丙烯酰胺和丙烯酸酯的聚合物通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合来合成。在另外的实施方式中，聚(氨基酸)和聚(磷酸酯)通过开环聚合来合成。
在某些实施方式中，所述疏水分子(H)还可以包括包含一种或多种配体例如PRR激动剂的聚合物。在某些实施方式中，所述基于聚合物的疏水分子(H)可以包括包含至少一个官能团的单体，所述官能团可以被偶联到配体或连接物，所述连接物可以偶联到配体。在其他实施方式中，所述基于聚合物的疏水分子(H)可以包含连接到所述聚合物的末端和/或侧链的配体。
在用于治疗或预防癌症和传染病的免疫原性组合物的优选实施方式中，所述疏水分子(H)是连接到配体的聚合物。在某些实施方式中，被连接到基于聚合物的疏水分子(H)的配体包含芳环结构。在某些实施方式中，连接到所述聚合物的配体是疏水的，并且在水性条件中促进由所述肽抗原偶联物形成的粒子的稳定性的提高。在其他实施方式中，被连接到基于聚合物的疏水分子(H)的配体包含杂环芳环。在某些实施方式中，被连接到基于聚合物的疏水分子(H)的配体包含芳环，所述芳环还包含芳基胺的。在某些实施方式中，附连到疏水分子(H)的配体是包含杂环芳环的疏水配体，任选地其中所述疏水配体还包含芳族胺(即Ar-NH2)。在其中所述疏水分子(H)包含的配体包含芳族基团并任选地包含杂环和/或芳基胺的实施方式中，我们报道了出人意料的发现，即这些疏水分子(H)在可药用有机溶剂例如DMSO和乙醇中是高度可溶的，但在水性缓冲液中是不溶的。
在某些实施方式中，连接到基于聚合物的疏水分子(H)的配体是模式识别受体激动剂(PRRa)，例如具有佐剂性质的STING、NOD受体或TLR的激动剂。连接到聚合物的具有佐剂性质的配体可以是或源自于任何适合的佐剂化合物例如PRR激动剂。适合的具有佐剂性质的配体包括包含小的有机分子、即分子量小于约3,000道尔顿的分子的化合物，尽管在某些实施方式中所述佐剂可以具有小于约700道尔顿的分子量，并且在某些情况下所述佐剂可以具有约200道尔顿至约700道尔顿的分子量。
在用于治疗或预防癌症或传染病的免疫原性组合物的优选实施方式中，所述疏水分子(H)是连接到具有佐剂性质的配体的聚合物。所述具有佐剂性质的配体例如PRR激动剂，可以通过任何适合的连接物连接到所述聚合物的侧链或末端基团。在某些实施方式中，构成基于聚合物的疏水分子(H)的单体包含含有至少一个官能团的侧链，所述官能团可以被偶联到具有佐剂性质的配体或可以偶联到具有佐剂性质的配体的连接物。在其中所述基于聚合物的疏水分子(H)包含具有佐剂性质的配体的某些实施方式中，所述聚合物的所有单体都被连接到所述具有佐剂性质的配体。在其中所述疏水分子(H)包含具有佐剂性质的配体的其他实施方式中，不是所述聚合物中的所有单体都被连接到所述佐剂。
在其中所述疏水分子(H)包含通过沿着所述聚合物的骨架分布的单体单元连接到具有佐剂性质的配体的聚合物的某些实施方式中，提高所述聚合物上所述配体的密度导致针对所述肽抗原(H)的免疫应答的出人意料的提高。
在某些实施方式中，具有佐剂性质的配体例如PRR激动剂与所述聚合物的单体的摩尔比可以选自约1:100至1:1mol/mol(或约1mol％至约100mol％)，例如1:2.5至1:1mol/mol。
连接到所述聚合物的所述具有佐剂性质的配体例如PRR激动剂的密度，可以根据具体应用的需要而变。所述具有佐剂性质的配体例如PRR激动剂可以以1至100mol％例如1至10mol％或50-100mol％连接到所述聚合物。Mol％是指连接到具有佐剂性质的配体例如PRR激动剂的构成所述聚合物的单体的百分率。例如，10mol％的配体(例如PRR激动剂)等于总共100个单体单元中10个连接到所述配体的单体单元。剩余的90个可以是未被连接到所述配体的形成大分子的单体单元。
连接到基于聚合物的疏水分子(H)的配体例如具有佐剂性质的配体的密度应该被选择成确保所述肽抗原偶联物(i)在可药用有机溶剂例如DMSO中是可溶的，(ii)在生理温度和pH下能够在水性条件中形成稳定的纳米粒子，和/或(iii)能够在对象中诱导免疫应答，特别是T细胞应答。
连接到所述聚合物的配体例如PRR激动剂的最适密度，取决于聚合物组成、聚合物长度以及所述配体的组成。当所述配体是具有低水溶性的疏水/两亲分子例如基于咪唑并喹啉的Toll样受体-7和-8激动剂(TLR-7/8a)，并且单独的所述聚合物是水溶的(即未连接到所述配体的聚合物是水溶的)时，当所述聚合物由约5-30个之间的单体单元构成时所述配体通常以约20-100mol％的密度连接到所述聚合物；当所述聚合物由约30-100个之间的单体单元构成时所述密度为10-50mol％；或者当所述聚合物由100-300个之间的单体单元构成时所述密度在5-20mol％之间。通常，所述具有佐剂性质的配体的mol％，对于较短聚合物来说较高，并且对于较长聚合物来说较低。
附连到大于10,000g/mol并基于选自N-2-羟基丙基(甲基丙烯酰胺)(HPMA)、羟基乙基(甲基丙烯酸酯)(HEMA)、苯乙烯、乙烯吡咯烷酮(PVP)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMAm)、N,N’-二乙基丙烯酰胺(DEAAm)、N-(L)-(1-羟基甲基)丙基甲基丙烯酰胺(HMPMAm)、甲基丙烯酸N,N’-二甲基乙基酯(DMEMA)、甲基丙烯酸2-(2-甲氧基乙氧基)乙基酯(DEGMA)或取代的聚(磷酸酯)的共聚单体的亲水或温度响应性聚合物的具有佐剂性质的配体例如PRRa的最适密度，为约1％至25％，例如，附连到所述聚合物的佐剂的密度可以为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％或约25％。
在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是两亲性A-B型二嵌段共聚物，其中一个嵌段是疏水的并且另一个嵌段是亲水的。在其中所述疏水分子(H)是两亲性A-B型二嵌段共聚物并且所述配体是疏水的例如咪唑并喹啉TLR-7/8激动剂的某些实施方式中，所述配体优选地以约1至50mol％、通常约1至20mol％之间的密度连接到所述疏水嵌段。在其中所述疏水分子(H)是两亲性A-B型二嵌段共聚物并且所述配体是亲水的某些实施方式中，所述配体优选地以约1至20mol％之间的密度连接到所述亲水嵌段，或连接在所述亲水嵌段的亲水末端处，因此所述A-B型二嵌段共聚物对于所述配体来说是半遥爪的。在非限制性实例中，所述疏水分子(H)包括包含HPMA嵌段和DEGMA嵌段的温度响应性A-B型二嵌段共聚物，并且咪唑并喹啉TLR-7/8激动剂以约1至5mol％之间的密度连接到所述DEGMA嵌段。在其他非限制性实例中，所述疏水分子(H)包含包括HPMA共聚物疏水嵌段和HPMA均聚物亲水嵌段的A-B型二嵌段聚合物，并且咪唑并喹啉TLR-7/8激动剂以约20mol％的密度连接到所述HPMA共聚物疏水嵌段。在某些实施方式中，所述疏水分子是三嵌段共聚物例如A-B-A或其他多嵌段共聚物组合物。
本文中报告的一个出人意料的发现是，连接到包含连接到具有佐剂性质的配体的HPMA亲水嵌段的A-B型二嵌段共聚物的肽抗原(A)，组装成均匀尺寸的纳米粒子胶束，而与所述肽抗原(A)的组成无关，并且纳米粒子胶束形成的这种改进的可靠性伴有T细胞免疫的强度提高。在非限制性实例中，将肽抗原(A)通过三唑连接物(Lys(N3)-DBCO)连接到由HPMA共聚物疏水嵌段(即p[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)])和HPMA均聚物亲水嵌段(即p(HPMA))构成的二嵌段共聚物，以形成肽抗原偶联物p{[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(Lys(N3))-A，其中2B是TLR-7/8a，也被称为化合物1。在另外的实施方式中，将肽抗原(A)通过三唑连接物(Lys(N3)-DBCO)连接到由DEGMA共聚物疏水嵌段(即p[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)])和HPMA均聚物亲水嵌段(即p(HPMA))构成的二嵌段共聚物，以形成肽抗原偶联物p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(Lys(N3))-A，其中2B是TLR-7/8a，也被称为化合物1。在其他实施方式中，将肽抗原(A)通过三唑连接物(Lys(N3)-DBCO)连接到由连接到具有佐剂性质的配体的DEGMA均聚物(即2BXy-p[(DEGMA)]和HPMA均聚物亲水嵌段(即p(HPMA))构成的二嵌段共聚物，以形成肽抗原偶联物2BXy-p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO
-(Lys(N3))-A，其中所述肽抗原(A)和2BXy(TLR-7/8a，也被称为化合物2)被连接在所述聚合物的相反末端上的单一位点处，这使所述聚合物成为杂遥爪。
在几个实施方式中，所述疏水分子(H)是基于聚(氨基酸)的聚合物，其由谷氨酸或天冬氨酸和芳族/或疏水氨基酸例如苯丙氨酸、氨基苯丙氨酸胺(或“苯丙氨酸胺”)、色氨酸、酪氨酸、谷氨酸苯甲酯、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸和缬氨酸的共聚单体构成，并且一个或多个具有佐剂性质的配体例如PRRa通过所述谷氨酸的γ羧酸或天冬氨酸的β羧酸附连到所述聚合物。在优选实施方式中，所述疏水分子(H)是由谷氨酸和色氨酸的共聚单体构成的基于聚(氨基酸)的聚合物，其中一个或多个具有佐剂性质的配体例如PRRa通过γ羧酸连接到所述谷氨酸残基。在另外的实施方式中，所述疏水分子(H)是由赖氨酸和芳族和/或疏水氨基酸例如苯丙氨酸、氨基苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酸苯甲酯、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸和缬氨酸的共聚单体构成的基于聚(氨基酸)的聚合物，其中一个或多个具有佐剂性质的配体例如PRRa通过赖氨酸的ε胺基附连到所述聚合物。在优选实施方式中，所述疏水分子(H)是由赖氨酸和色氨酸的共聚单体构成的基于聚(氨基酸)的聚合物，其中一个或多个具有佐剂性质的配体例如PRRa通过ε胺基连接到所述赖氨酸。在其中所述疏水分子(H)是连接到一个或多个具有佐剂性质的配体例如PRRa的聚(氨基酸)共聚物的优选实施方式中，所述聚合物的长度在5-30个氨基酸之间，并且所述佐剂以20至100mol％例如30％、50％、60％、80％和100mol％的密度附连。在另外的实施方式中，所述配体仅仅被附连到所述聚(氨基酸)聚合物的单一末端，即半遥爪聚合物。在本文中，我们报道了出人意料的发现，即由还包含芳族基团例如芳族氨基酸(例如苯丙氨酸、氨基苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酸苯甲酯)或附连到聚合物的芳族配体(例如咪唑并喹啉)的基于聚(氨基酸)的共聚物构成的疏水分子(H)，与主要由脂族氨基酸或脂族配体构成的聚(氨基酸)相比，通过肽抗原偶联物的提高的有机溶剂溶解性和提高的粒子稳定性和生物活性，导致可制造性的出人意料的提高。因此，在优选实施方式中，由聚(氨基酸)或其他类型的聚合物构成的疏水分子(H)，包括一个或多个芳族氨基酸和/或包含芳族基团的配体。
在另外的实施方式中，所述疏水分子(H)是基于聚(氨基酸)的聚合物，其完全由谷氨酸、天冬氨酸或带有羧酸的非天然氨基酸残基构成，其中所述具有佐剂性质的配体被连接到所有的所述谷氨酸、天冬氨酸或非天然氨基酸残基，即所述具有佐剂性质的配体以100mol％的密度附连。在另外的实施方式中，所述疏水分子(H)是基于聚(氨基酸)的聚合物，其完全由赖氨酸或带有游离胺基的非天然氨基酸构成，并且所述具有佐剂性质的配体被连接到所有的所述赖氨酸或非天然氨基酸残基，即所述佐剂以100mol％的密度附连。在另外的实施方式中，包括PEG化的共聚单体例如γ-(2-甲氧基乙氧基)酯基-L-谷氨酸酯，以赋予所述共聚物以温度响应性质。在其他实施方式中，可以将温度响应性聚合物接枝到所述聚(氨基酸)的悬垂侧链，以形成接枝共聚物。在另外的实施方式中，可以将温度响应性聚合物连接到所述聚(氨基酸)聚合物的末端，以形成温度响应性二嵌段聚合物。在另外的实施方式中，可以将疏水的第二聚合物通过悬垂侧基连接到所述连接到具有佐剂性质的配体的聚(氨基酸)聚合物以形成接枝共聚物，或连接到所述聚(氨基酸)的末端以形成二嵌段共聚物。
在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是连接到配体例如疏水的具有佐剂性质的配体的基于聚(氨基酸)的聚合物，并具有下式：
Figure BDA0002263670070000891
在式I中，R2通常选自氢、羟基或胺基中的一者。在某些实施方式中，R2通过任何适合的连接物分子连接到配体或另一个聚合物。亚甲基单元的数目y3通常为1至6，例如1、2、3、4、5或6。式I的聚(氨基酸)的N-端胺基通常被连接到所述连接物前体X2，或者可以直接地或通过延长部(B1或B2)连接到所述肽抗原(A)。单体重复的数目由k指示，并且通常在3至300之间。任何适合的连接物X被用于将所述配体例如疏水的具有佐剂性质的配体连接到所述聚(氨基酸)骨架。在某些实施方式中，所述连接物X可以被连接到第二聚合物，所述第二聚合物被连接到配体。在某些实施方式中，所述单体k可以被连接到两个或更多个不同配体。
在某些实施方式中，所述式I的基于聚(氨基酸)的聚合物是：
其中y4是任何整数，例如0至6，例如0、1、2、3、4、5或6。所述配体可以通过任何适合的手段连接到所述官能团(FG)，并且所述FG是任何适合的官能团，包括胺基、羧酸、硫醇、羟基、叠氮化物、炔烃、肼、醛或酮，用于配体的直接或经由连接物的附连，即连接。
当y3等于1时，所述式I的基于聚(氨基酸)的聚合物是：
所述式I的聚(氨基酸)的N-端可以通过任何适合的方式，通过所述连接物(L)连接到所述肽抗原(A)。在某些实施方式中，所述式I的聚(氨基酸)的N-端被直接连接到所述肽抗原(A)的C-端，或通过酰胺键连接到所述B2延长部的C-端。在其他实施方式中，所述式I的聚(氨基酸)的N-端被连接到连接物前体(X2)，所述X2与直接或通过延长部(B1或B2)连接到所述肽抗原(A)的连接物前体(X1)反应。在某些实施方式中，将含有环辛炔(例如DBCO)的连接物前体(X2)附连到所述式I的聚(氨基酸)的N-端，并与含有叠氮基的连接物前体(X1)反应，以形成三唑键。
在某些实施方式中，基于聚(氨基酸)的疏水分子(H)可以包含疏水氨基酸(例如芳族氨基酸)或疏水氨基酸(例如芳族氨基酸)和连接到配体的氨基酸，以及其他氨基酸例如带电荷或亲水氨基酸，其可用于补偿或调节所述疏水分子(H)的物理和化学特征，以产生优选地在制造期间在有机溶剂中可溶，但在水性条件中能够形成粒子的材料。因此，在某些实施方式中，所述疏水分子(H)是具有下式的基于聚(氨基酸)的聚合物：
所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物通常包含单体l和任选的单体m、n和o。R3通常选自氢、羟基或胺基中的一者。在某些实施方式中，R3是配体例如具有佐剂性质的配体，或者是通过任何适合的连接物分子连接到所述疏水分子(H)的另一个聚合物。由y5、y6、y7和y8表示的亚甲基单元的数目通常为1至6，例如1、2、3、4、5或6。所述式I的聚(氨基酸)的N-端胺通常被连接到所述连接物前体X2，或者可以直接地或通过延长部(B1或B2)连接到所述肽抗原(A)。在典型实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含单体l，其选自任何天然或非天然氨基酸，其中R4选自低级烷基或芳族基团，并赋予所述聚合物骨架以疏水性质。在某些实施方式中，式II中包含的R4可以选自
Figure BDA0002263670070000912
Figure BDA0002263670070000913
Figure BDA0002263670070000921
Figure BDA0002263670070000931
或
Figure BDA0002263670070000932
其中R4的X是任何适合的连接物。
在某些实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含任选的共聚单体m，其选自任何天然或非天然氨基酸例如PEG氨基酸间隔物(例如式II的m是-NH-(CH2-CH2-O)y9-(CH2)y10-(CO)-，其中y9是通常在1至24之间的整数，并且y10是通常在1至3之间的整数)或具有小取代基的氨基酸，其中例如R5选自氢、低级烷基或包含羟基的低级烷基，并且被提供用于增加所述聚合物骨架的间隔或柔性。在某些实施方式中，式II中包含的R5可以选自-H、-CH3、
Figure BDA0002263670070000933
在某些实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含任选的共聚单体n，其选自任何天然或非天然氨基酸，其中R6选自包含永久地或在特定pH下带有电荷的官能团的任何基团。在某些实施方式中，式II中包含的R6可以选自
Figure BDA0002263670070000934
Figure BDA0002263670070000941
在某些实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含任选的共聚单体o，其选自任何天然或非天然氨基酸，其中配体通过任何适合的连接物X连接到所述单体o。所述配体可以是具有佐剂性质的配体。所述连接到式II的聚(氨基酸)的配体在性质上可以是疏水、亲水、两亲、带电荷或中性的。所述包含单体o的式II的基于聚(氨基酸)的聚合物还可以包含单体单元l、m和n，其补偿所述附连到单体o的配体的性质。
在式II的基于聚(氨基酸)的聚合物中，单体重复的数目由l、m、n和o指示，其中l、m、n和o之和通常为3至300之间的任何整数。所述不同类型的单体l、m、n或o中的每一者可以是相同或不同的。所述用“l”表示的单体赋予所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物以疏水性质，即使所述聚合物成为水不溶性疏水分子(H)。所述疏水单体l可以是相同或不同的，并通常包含芳环。在优选实施方式中，所述疏水单体l包含杂环和/或胺基取代的芳环。所述用“m”表示的任选的共聚单体可用于增加柔性或构成所述聚合物骨架的不同单体的间隔。所述用“n”表示的任选的共聚单体包含带电荷的官能团。所述用“o”表示的任选的共聚单体被用于配体例如PRR激动剂的附连。在某些实施方式中，所述通过任何适合的连接物连接到单体o的配体是PRR激动剂。在某些实施方式中，所述单体o被连接到带有正或负电荷的配体，并且与相反电荷的单体n相邻。在某些实施方式中，带电荷的共聚单体n被放置成与共聚单体o相邻，所述共聚单体o包含与构成所述共聚单体n的官能团相反电荷的官能团，并且所述相反的电荷产生零净电荷，因此所述单体n起到中和由附连到单体o的配体所携带的电荷的作用。
构成所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物的单体l、m、n和o的百分率取决于具体应用。在某些实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物完全由单体l构成。在其他实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物由共聚单体l和o例如5至95mol％之间的单体l和约95至5mol％的单体o构成。在某些实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含共聚单体l和m，其中m提供疏水单体l之间的间隔、即距离，并且可以降低聚合物刚性。在其他实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含单体l、m和o，其中单体m在构成单体l和o的大体积取代基之间提供间隔。在其他实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含单体l和o并任选地包含单体m和n，其中单体n被用于调节所述聚合物骨架的电荷。在某些实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物完全由单体m和o构成。在其他实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物完全由单体m、n和o或仅仅n和o构成。在另一些其他实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含单体l、m、n和o。
其中所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含佐剂，通过任何适合的连接物连接到佐剂的由单体o表示的构成所述聚合物的单体的百分率通常为10至60％，例如长度为20个氨基酸的聚合物的2至12个之间的氨基酸是单体o。在所述式II的聚(氨基酸)聚合物的某些实施方式中，l是主要的单体单元。在另外的实施方式中，所述式II的基于聚(氨基酸)的聚合物完全由l单体构成，即所有单体都是l单体，任选地其中所述佐剂被直接地或通过第二聚合物或通过任何适合的连接物分子间接地附连到所述聚(氨基酸)的末端。
其中所述式II的聚合物是包含o单体的共聚物，所述配体可以连接到沿着所述聚合物的骨架分布的悬垂官能团(FG)，例如这里所示：
Figure BDA0002263670070000961
其中y11表示亚甲基单元的数目并且是任何整数，例如0至6，例如0、1、2、3、4、5或6。所述官能团(FG)是任何适合的官能团，包括胺、羧酸、硫醇、羟基、叠氮化物、炔烃、肼、醛或酮，其允许配体的直接或通过连接物的附连，即连接。
在某些实施方式中，y5、y6、y7和y8等于1，并且所述式II的聚合物是：
Figure BDA0002263670070000962
具有佐剂性质的配体可以被连接到本公开的任何疏水分子(H)。在某些实施方式中，具有佐剂性质的配体被连接到式II的聚合物。具有佐剂性质的配体可以通过下述方式连接到式II的基于聚(氨基酸)的聚合物：通过o单体上的悬垂官能团(FG)；连接在所述聚合物的末端处；或间接地通过被接枝到所述悬垂官能团(FG)或所述聚合物的末端处的另一个分子或聚合物来连接。在优选实施方式中，单体o的官能团(FG)将所述具有佐剂性质的配体或其他配体分子通过共价键连接到所述聚(氨基酸)骨架。在某些实施方式中，构成式II的单体o的FG可以被连接到第二聚合物。所述式II中包含的FG可以选自羧酸、醛、酮、胺、肼、硫醇、叠氮化物或炔烃，或可用于将配体或另一个聚合物连接到所述聚合物骨架的任何适合的官能团。
在优选实施方式中，所述式II的聚(氨基酸)的N-端通过所述连接物(L)，直接地或通过连接物前体X1和X2的反应通过延长部(B1或B2)连接到所述肽抗原(A)。在某些实施方式中，所述式II的聚(氨基酸)的N-端被直接地(即不存在连接物(L))通过酰胺键连接到所述肽抗原(A)的C-端或连接到所述B2延长部的C-端。在其他实施方式中，所述式II的聚(氨基酸)的N-端被连接到含有环辛炔(DBCO)的连接物前体(X2)，所述X2与直接或通过延长部(B1或B2)连接到所述肽抗原(A)的含有叠氮基的连接物前体(X1)反应。
所述式I或式II的聚(氨基酸)是疏水分子(H)，其可以通过所述N-端胺、C-端羧酸或通过任选的侧链例如通过共聚单体的官能团，直接地或通过连接物(L)或延长部(B1或B2)间接地连接到肽抗原(A)。在某些实施方式中，所述式I或式II的聚(氨基酸)是疏水分子(H)，其被连接到肽抗原(A)，产生式[C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H或[B1]-A-[B2]-[L]-H(C)的肽抗原偶联物，其中[]表示所述基团是任选的。
在优选实施方式中，所述式I或式II的聚(氨基酸)是疏水分子(H)，其在N-端连接到连接物(L)，L被连接到C-端延长部(B2)，B2倍连接到肽抗原(A)的C-端，A在N-端连接到N-端延长部(B1)，B1被连接到带电荷分子(C)。
例如：C-B1-A-B2-T-H
在另外的实施方式中，所述带电荷分子(C)可以被直接连接到所述由式I或式II的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)，或通过经延长部连接到所述肽抗原(A)的连接物(L)。在这里，对于A-B2-L(C)-H来说，括号表示法旨在表明L被连接到C和H两者。
例如：A-B2-L(C)-H或A-B2-L-H(C)
在其他实施方式中，所述式I或式II的聚(氨基酸)是疏水分子(H)，其在N-端连接到连接物(L)，L被连接到任选的带电荷分子(C)和C-端延长部(B2)两者，B2被连接到肽抗原(A)的C-端。
例如：A-B2-(C-L)-H
在优选实施方式中，所述疏水区段包含聚(氨基酸)，其中具有佐剂性质的配体被附连到沿着所述聚(氨基酸)的骨架分布的侧基。所述具有佐剂性质的配体在性质上可以是疏水或亲水的、带电荷或不带电荷的。在优选实施方式中，所述具有佐剂性质的配体是PRR激动剂。
在几个实施方式中，所述具有佐剂性质的配体可以是模式识别受体(PRR)激动剂。模式识别受体(PRR)激动剂的非限制性实例包括TLR-1/2/6激动剂(例如脂肽和糖脂，例如Pam2cys或Pam3cys脂肽)；TLR-3激动剂(例如dsRNA例如PolyI:C，和核苷酸碱基类似物)；TLR-4激动剂(例如脂多糖(LPS)衍生物例如单磷酰脂质A(MPL)，和作为嘧啶并吲哚的衍生物或类似物的小分子)；TLR5激动剂(例如鞭毛蛋白)；TLR-7和-8激动剂(例如ssRNA和核苷酸碱基类似物，包括咪唑并喹啉的衍生物、羟基-腺嘌呤、苯并萘啶和洛索立宾)；和TLR-9激动剂(例如未甲基化的CpG)；干扰素基因(STING)激动剂的刺激物(例如环状二核苷酸例如环状二腺苷单磷酸)；C-型凝集素受体(CLR)激动剂(例如各种不同的单糖、二糖、三糖和聚合糖，其可以是直链或支链的，例如甘露糖、Lewis-X三糖等)；RIG-I样受体(RLR)激动剂；和NOD样受体(NLR)激动剂(例如肽聚糖和来自于细菌的结构基序，例如内消旋-二氨基庚二酸和胞壁酰二肽)；及其组合。在几个实施方式中，所述模式识别受体激动剂可以是TLR激动剂例如基于咪唑并喹啉的TLR-7/8激动剂。例如，所述具有佐剂性质的配体可以是被FDA批准用于人类应用的咪喹莫特(R837)或瑞喹莫德(R848)。
在几个实施方式中，所述具有佐剂性质的配体可以是TLR-7激动剂、TLR-8激动剂和/或TLR-7/8激动剂。大量这样的激动剂是已知的，包括许多不同的咪唑并喹啉化合物。
咪唑并喹啉可用于本文公开的方法中。咪唑并喹啉是合成的免疫调节药物，其通过结合抗原呈递细胞(例如树突状细胞)上的Toll样受体7和8(TLR-7/TLR-8)，在结构上模拟这些受体的天然配体病毒单链RNA来起作用。咪唑并喹啉是包含稠合喹啉-咪唑骨架的杂环化合物。其衍生物、盐(包括水合物、溶剂化物和N-氧化物)和前药也被本公开考虑到了。具体的咪唑并喹啉化合物在本领域中是已知的，参见例如美国专利号6,518,265和美国专利号4,689,338。在某些非限制性实施方式中，所述咪唑并喹啉化合物不是咪喹莫特和/或不是瑞喹莫德。
在某些实施方式中，所述具有佐剂性质的配体可以是具有稠合到5元含氮杂环的2-氨基吡啶的小分子，包括但不限于咪唑并喹啉胺和取代的咪唑并喹啉胺，例如酰胺取代的咪唑并喹啉胺、磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺、脲取代的咪唑并喹啉胺、芳基醚取代的咪唑并喹啉胺、杂环醚取代的咪唑并喹啉胺、酰胺醚取代的咪唑并喹啉胺、磺酰胺醚取代的咪唑并喹啉胺、脲取代的咪唑并喹啉醚、硫醚取代的咪唑并喹啉胺、羟基胺取代的咪唑并喹啉胺、肟取代的咪唑并喹啉胺、6-、7-、8-或9-芳基、杂芳基、芳氧基或芳基亚烷氧基取代的咪唑并喹啉胺和咪唑并喹啉二胺；四氢咪唑并喹啉胺，包括但不限于酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺、磺酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺、脲取代的四氢咪唑并喹啉胺、芳基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、杂环醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、酰胺醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、磺酰胺醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、脲取代的四氢咪唑并喹啉醚、硫醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、羟基胺取代的四氢咪唑并喹啉胺、肟取代的四氢咪唑并喹啉胺和四氢咪唑并喹啉二胺；咪唑并吡啶胺，包括但不限于酰胺取代的咪唑并吡啶胺、磺酰胺取代的咪唑并吡啶胺、脲取代的咪唑并吡啶胺、芳基醚取代的咪唑并吡啶胺、杂环醚取代的咪唑并吡啶胺、酰胺醚取代的咪唑并吡啶胺、磺酰胺醚取代的咪唑并吡啶胺、脲取代的咪唑并吡啶醚和硫醚取代的咪唑并吡啶胺；1,2-桥接的咪唑并喹啉胺；6,7-稠合的环烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并萘啶胺；四氢咪唑并萘啶胺；
Figure BDA0002263670070001003
唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺；
Figure BDA0002263670070001005
唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺；
Figure BDA0002263670070001004
唑并萘啶胺；噻唑并萘啶胺；吡唑并吡啶胺；吡唑并喹啉胺；四氢吡唑并喹啉胺；吡唑并萘啶胺；四氢吡唑并萘啶胺；和稠合到吡啶胺、喹啉胺、四氢喹啉胺、萘啶胺或四氢萘啶胺的1H-咪唑并二聚体。
在某些实施方式中，所述具有佐剂性质的配体是具有下式的咪唑并喹啉：
Figure BDA0002263670070001001
在式III中，R7选自氢、任选取代的低级烷基或任选取代的低级醚中的一者；并且R8选自任选取代的芳基胺或任选取代的低级烷基胺中的一者。R8可以任选地被连接到聚合物的连接物取代。出人意料的发现是，在其中R8选自低级烷基胺的某些化合物中，尽管所述化合物不如R8选自芳基胺的化合物强力，但应答的质量提高。因此，式III的中等效力的佐剂引起质量更好的应答。注意：式III的佐剂是一类配体，并且可以被称为式III的佐剂或具有佐剂性质的配体。
在某些实施方式中，式III中包含的R7可以选自氢、或
Figure BDA0002263670070001011
在某些实施方式中，R8可以选自 或
Figure BDA0002263670070001014
其中e表示亚甲基单元的数目，并且是1至4的整数。
在某些实施方式中，R8可以是
Figure BDA0002263670070001015
在某些实施方式中，R8可以是
Figure BDA0002263670070001016
在某些实施方式中，R7可以是并且R8可以是
Figure BDA0002263670070001018
由连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)的非限制性实例包括：
Figure BDA0002263670070001021
其中k在3-300之间。例如，当k＝5时，所述肽由连接到式III的佐剂的5个氨基酸构成。在某些实施方式中，由连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)可以直接地或通过连接物(L)和/或延长部(B1或B2中的任一者)间接地连接到肽抗原(A)，所述肽抗原(A)任选地通过任何适合的手段连接到带电荷分子(C)，以形成肽抗原偶联物。在某些实施方式中，所述连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)的N-端被直接连接到所述肽抗原(A)的C-端，或通过酰胺键连接到所述B2延长部的C-端。在其他实施方式中，连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)的N-端被连接到可点击的连接物前体X2例如炔烃或DBCO或硫醇反应性连接物前体X2例如马来酰亚胺，其与直接或通过延长部(B1或B2)连接到所述肽抗原(A)的连接物前体X2反应。在优选实施方式中，DBCO连接物前体X1被附连到所述连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)的N-端，并用于与直接或通过延长部(B1或B2)连接到肽抗原(A)的带有叠氮化物的连接物前体X2反应。
由连接到式III的佐剂的式II的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)的非限制性实例包括：
Figure BDA0002263670070001031
例如：
Figure BDA0002263670070001032
其中共聚单体l通常为3-300之间的整数，并且任选的共聚单体o通常是3-300个氨基酸残基之间的整数，其中l与o之和通常在约3-300之间。或者，o是0，并且所述聚合物完全由l构成，即所述聚合物是不连接到佐剂的聚(色氨酸)聚合物。在某些实施方式中，所述连接到式III的佐剂的式II的聚(氨基酸)的N-端通过任何适合的手段，直接或通过连接物(L)和/或延长部(B1或B2)间接地连接到肽抗原(A)。在某些实施方式中，所述连接到式III的佐剂的式II的聚(氨基酸)的N-端通过酰胺键被直接连接到所述肽抗原(A)的C-端或连接到所述B2延长部的C-端。在其他实施方式中，所述连接到式III的佐剂的式II的聚(氨基酸)的N-端被连接到可点击的连接物前体X2例如DBCO或硫醇反应性连接物前体X2例如马来酰亚胺，其与直接或通过延长部(B1或B2)连接到所述肽抗原(A)的连接物前体X1反应。在优选实施方式中，DBCO连接物前体X2被附连到所述连接到式III的佐剂的式II的聚(氨基酸)的N-端，并被用于与带有叠氮化物官能团的连接物前体X1反应。
本文中公开的出人意料的发现是，构成肽抗原偶联物的疏水分子(H)的连接到式III的佐剂的式I或式II中任一者的聚(氨基酸)的长度、即单体单元的数目，是影响针对所述肽抗原(A)产生的T细胞应答的强度的主要决定因素。因此，发现包含由具有5个或更多个单体单元的式I或式II的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)的肽抗原偶联物与长度小于5个氨基酸的相同式的聚(氨基酸)相比，促进质量和强度更高的T细胞应答。另一个发现是，连接到式I或式II的聚(氨基酸)的式III的佐剂的数目也对产生的免疫应答的强度有影响，其中包含含有3个或更多个式III的佐剂的式I或II的疏水分子(H)的肽抗原偶联物与包含含有少于3个式III的佐剂的式I或II的疏水分子(H)的肽抗原偶联物相比，引起更高强度的T细胞应答。这些发现的非限制性解释是连接到式III的佐剂的式I或式II的疏水分子(H)的增加的长度确保在连接到甚至亲水的肽抗原时形成胶束或其他超分子结构，并且这种粒子形成导致免疫应答提高，可能是通过归因于粒子而不是可溶性材料的改进的药代动力学和细胞摄取。另一个非限制性解释是包含连接到式III的佐剂的式I或式II的聚(氨基酸)的疏水分子(H)的长度的增加，导致由所述肽抗原偶联物在水性缓冲液中形成的粒子的稳定性例如动力学稳定性提高，所述粒子的稳定性提高确保所述粒子保持完整，由此延迟构成所述粒子的肽抗原偶联物的清除(肾或肝)并促进被抗原呈递细胞的摄取。
本文公开的另一个出人意料的发现是，发现构成肽抗原偶联物的疏水分子(H)的连接到式I或式II的聚(氨基酸)的式III的佐剂的效力，与多次免疫接种后针对肽抗原产生的T细胞应答的强度和广度反相关。因此，正如本文中公开的，我们显示了连接到其中并且
Figure BDA0002263670070001052
被称为化合物1的式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)，与连接到其中
Figure BDA0002263670070001053
并且
Figure BDA0002263670070001054
被称为化合物2的式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)相比，导致强度和广度更高的T细胞应答。
一种非限制性解释是与其中
Figure BDA0002263670070001055
的式III的佐剂相比，其中
Figure BDA0002263670070001056
的式III的佐剂的较低效力引起较低的炎性，并且由所述较低效力激动剂诱导的适度炎性导致T细胞应答的较少耗尽，提供了总体T细胞应答的更高的强度和广度。
基于这些发现，由连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)的优选实施方式是：
正如本文中公开的，我们报道了出人意料的发现，即基于连接到式III的佐剂的式II的聚(氨基酸)的疏水分子(H)，当所述聚(氨基酸)聚合物由5-10个之间的氨基酸构成，其中60-100％之间的所述共聚物由连接到其中
Figure BDA0002263670070001061
并且
Figure BDA0002263670070001062
的式III的佐剂即化合物1的共聚单体o构成，时，导致T细胞应答的强度和质量的显著提高。在优选实施方式中，共聚单体o包含20-60％之间的式II的聚(氨基酸)的单体单元，例如60％。
例如：
Figure BDA0002263670070001063
本文中公开的出人意料的数据揭示，构成所述疏水分子(H)的聚合物的长度和附连的具有佐剂性质的配体(即式III的TLR-7/8激动剂)的数目和效力，是针对作为肽抗原偶联物递送的肽抗原(A)产生的免疫应答的强度和质量的主要决定因素。这些数据表明，包含由疏水氨基酸和/或连接到配体的氨基酸构成的聚(氨基酸)的疏水分子(H)应该足够长，以便当连接到任何肽抗原(A)，包括与基于聚(氨基酸)的疏水分子(H)驱动粒子组装的倾向性相反的高亲水性肽抗原(A)时，允许粒子形成。长度不足例如长度少于3个氨基酸的聚(氨基酸)可能不提供用于在连接到某些肽抗原、特别是具有高电荷密度的亲水肽抗原时在水性条件中促进粒子形成的足够的疏水表面积。因此，正如本文中公开的，式I或式II的聚(氨基酸)的长度应该大于3个氨基酸，优选地长度在5-30个氨基酸之间，例如长度为5、6、7、8、9、10、20或30个氨基酸。更长的聚(氨基酸)，例如长度超过30个氨基酸例如约30、40或50个氨基酸的聚(氨基酸)，可以例如通过固相肽合成来产生。作为固相肽合成的可替选方案，溶液聚合反应可用于产生由疏水单体构成的长链聚(氨基酸)。
在本文中我们公开了另一个出人意料的发现，即针对TLR-7活性的体外确定的效价(即EC50)为108纳摩尔的化合物1与更强力的激动剂即针对TLR-7活性的体外确定的效价(即EC50)为18.7纳摩尔的化合物2相比，在重复的免疫接种后引起提高的T细胞应答。这些数据表明，可以调节包含在所述免疫原性组合物中的佐剂的效价以优化免疫应答，并且由所述佐剂提供的先天性免疫活化可以被节制，以提供优化T细胞免疫所需的适合的刺激水平。先天性免疫刺激的水平可以通过在肽抗原偶联物上递送多个、例如3个或更多个中等效价激动剂(即EC50>100纳摩尔的激动剂)或通过递送少于3个高效价激动剂(即EC50<100纳摩尔的激动剂)来节制。
各种不同的TLR-7、TLR-8和组合的TLR-7和-8激动剂的效价可以从文献容易地确定。基于咪唑并喹啉和腺嘌呤的TLR-7和TLR-7/8激动剂已被描述(参见：Shukla等，J.Med.Chem.,53:4450-4465,2010和Gerster,等，J.Med.Chem.,2005，美国专利号6,069,149，以及Hirota,等，J.Med.Chem.,45:5419-5422,2002，它们通过参考并入本文)，并揭示出与其中式III的佐剂的R2选自低级烷基的化合物相比，为式III的佐剂的R2选择芳族连接物例如苯甲基和二甲苯基连接物产生的化合物对TLR-7具有更高的效价。
基于本文中描述的出人意料的发现，由连接到式III的佐剂的式I或式II的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)的优选实施方式的长度通常在5-30个氨基酸之间，其中所述连接到式III的佐剂的共聚单体的密度在20-100mol％之间。任选地，当所述式III的佐剂包括选自低级烷基的R8例如化合物1时，连接到化合物1的氨基酸的密度应该在40-100％之间，例如60％。任选地，当所述式III的佐剂包括选自芳族化合物的R8例如化合物2时，连接到化合物2的氨基酸的密度应该低于20％，或者在每个聚合物上递送1-2个之间的化合物2分子。
在优选实施方式中，连接到分子量小于约10,000g/mol并基于选自N-2-羟基丙基(甲基丙烯酰胺)(HPMA)、羟基乙基(甲基丙烯酸酯)(HEMA)、苯乙烯、乙烯吡咯烷酮(PVP)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMAm)、N,N’-二乙基丙烯酰胺(DEAAm)、N-(L)-(1-羟基甲基)丙基甲基丙烯酰胺(HMPMAm)、甲基丙烯酸N,N’-二甲基乙基酯(DMEMA)、甲基丙烯酸2-(2-甲氧基乙氧基)乙基酯(DEGMA)或取代的聚(磷酸酯)的共聚单体的聚合物的式III的佐剂的密度为约5至100mol％，例如附连到所述聚合物的佐剂的密度可以为约5-6％、约6-7％、约8-9％、约9-10％、约10-11％、约11-12％、约12-13％、约13-14％、约15-16％、约17-18％、约18-20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在优选实施方式中，连接到分子量高于10,000g/mol并基于选自N-2-羟基丙基(甲基丙烯酰胺)(HPMA)、羟基乙基(甲基丙烯酸酯)(HEMA)、苯乙烯、乙烯吡咯烷酮(PVP)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMAm)、N,N’-二乙基丙烯酰胺(DEAAm)、N-(L)-(1-羟基甲基)丙基甲基丙烯酰胺(HMPMAm)、甲基丙烯酸N,N’-二甲基乙基酯(DMEMA)、甲基丙烯酸2-(2-甲氧基乙氧基)乙基酯(DEGMA)或取代的聚(磷酸酯)的共聚单体的聚合物的式III的佐剂的密度为约1至25mol％，例如附连到所述聚合物的佐剂的密度可以为约1-2％、约2-3％、约3-4％、约5-6％、约6-7％、约7-8％、约8-9％、约9-10％、约10-11％、约11-12％、约13-14％、约14-15％、约16-17％、约17-18％、约19-20％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％或约25％。
在另外的实施方式中，将由疏水和/或温度响应性单体构成的第二聚合物连接到式I或式II的聚(氨基酸)的末端或侧基，所述式I或式II的聚(氨基酸)连接到式III的佐剂。
在这里，为清楚起见，提供了由接枝到式I的聚(氨基酸)的基于温度响应性的DEGMA的聚合物构成的疏水分子(H)的非限制性实例，其中所述式I的聚(氨基酸)连接到式III的佐剂：
其中共聚单体k通常是3-300之间的整数，并且共聚单体k’通常是3-300个氨基酸残基之间的整数，其中k与k’之和通常在约3-300之间。在优选实施方式中，k在约3-10之间，并且k’在约1-10之间。所述连接物X可以是任何适合的连接物分子，并且m通常为约10-300个单体单元。所述聚(氨基酸)的N-端通过任何适合的手段被直接地或通过连接物(L)和/或延长部(B1或B2)间接地连接到所述肽抗原(A)，以形成可以另外包含带电荷分子(C)的肽抗原偶联物。
在这里，为清楚起见，提供了由连接到式I的聚(氨基酸)的末端的基于温度响应性的DEGMA的聚合物构成的疏水分子(H)的非限制性实例，其中所述式I的聚(氨基酸)连接到式III的佐剂：
Figure BDA0002263670070001101
其中共聚单体k通常是3-100个单体单元之间的整数。所述连接物X可以是任何适合的连接物分子。在优选实施方式中，k’是约3-10个之间的单体单元。所述聚(氨基酸)的N-端通过任何适合的手段被直接地或通过连接物(L)和/或延长部(B1或B2)间接地连接到所述肽抗原(A)，以形成可以另外包含带电荷分子(C)的肽抗原偶联物。
在这里，为清楚起见，提供了由连接到式I的聚(氨基酸)的末端的基于聚磷酸酯的聚合物构成的疏水分子(H)的非限制性实例，其中所述式I的聚(氨基酸)连接到式III的佐剂：
Figure BDA0002263670070001102
其中共聚单体k通常是3-100个单体单元之间的整数。所述连接物X可以是任何适合的连接物分子。在优选实施方式中，k在约5-10个单体单元之间，并且m在约10-300个单体单元之间。所述聚(氨基酸)的N-端通过任何适合的手段被直接地或通过连接物(L)和/或延长部(B1或B2)间接地连接到所述肽抗原(A)，以形成可以另外包含带电荷分子(C)的肽抗原偶联物。
在这里，为清楚起见，提供了由连接到连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)的末端的基于聚(谷氨酸苯甲酯)的聚合物构成的疏水分子(H)的非限制性实例：
Figure BDA0002263670070001111
其中共聚单体k通常是3-100个单体单元之间的整数，并且m通常是50-300个氨基酸残基之间的整数。所述连接物可以是任何适合的连接物分子。在优选实施方式中，x在约5-10个单体单元之间，并且m在约10-300个单体单元之间。所述聚(氨基酸)的N-端通过任何适合的手段被直接地或通过连接物(L)和/或延长部(B1或B2)间接地连接到所述肽抗原(A)，以形成可以另外包含带电荷分子(C)的肽抗原偶联物。
在非限制性实例中，肽抗原(A)被连接到粒子(P)或疏水分子(H)，并且还可以包含任选的延长部(B1和/或B2)和任选的连接物(L)，以得到式IV的肽抗原偶联物，其中[]表示所述基团是任选的：
[B1]-A-[B2]-[L]-P、[B1]-A-[B2]-[L]-H、P-[L]-[B1]-A-[B2]或
H-[L]-[B1]-A-[B2]
式IV
所述式IV的肽抗原(A)由整数n个氨基酸构成，其中n通常在7-35之间，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸，并且所述疏水分子(H)通常是连接到式III的佐剂的式I或II的聚(氨基酸)。
作为实例，在这里示出了由下述组分构成的式IV的肽抗原偶联物的分限制性实例：任选地在N-端处连接到组织蛋白酶可切割的四肽延长部(B1＝Lys-Pro-Leu-Arg SEQID NO：8)并在C-端处连接到合并的免疫蛋白酶体和组织蛋白酶可切割的六肽延长部(B2＝Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO：13)的肽抗原(A)，B2被连接到三唑连接物(L)，L被连接到由式I的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)，所述式I的聚(氨基酸)被连接到式III的佐剂：
任选的带电荷分子(C)
本文公开的肽抗原偶联物由连接到粒子(P)或疏水分子(H)的肽抗原(A)构成，并且还可以包含任选的延长部(B1和/或B2)、任选的连接物(L)和任选的带电荷分子(C)，其中C＝表示带有提供静电电荷的官能团的带电荷分子。本文公开的包含连接到粒子(P)或疏水分子(H)的肽抗原并在水性条件中组装成粒子的免疫原性组合物，在没有足够表面电荷以使粒子稳定的情况下可能絮凝。因此，可以将带电荷分子(C)任选地连接到肽抗原偶联物，作为使所述粒子稳定并防止絮凝的手段；或者，可以将带电荷分子(C)并入到包含肽抗原偶联物的粒子中，作为使粒子稳定化的手段。因此，所述带电荷分子(C)的目的是控制由肽抗原偶联物形成的粒子的净电荷，作为促进这些粒子的稳定性的手段。
带电荷分子(C)是指具有在约7.4的pH下在水性缓冲液中带有正或负电荷的一个或多个官能团的任何分子。构成所述带电荷分子(C)的官能团可以具有部分或全整数电荷值。带电荷分子(C)可以是具有单个带电荷官能团或多个带电荷官能团的分子。所述带电荷分子(C)的净电荷可以是正、负或中性的。构成所述带电荷分子(C)的官能团的电荷可能依赖于或不依赖于所述带电荷分子(C)分散在其中的溶液的pH，例如对于叔胺和季铵化合物来说情况就是如此，它们分别是pH依赖性和pH不依赖性的。分子的电荷可以在分子的路易斯结构和本领域技术人员已知的公认方法的基础上容易地估算。电荷可能由诱导效应产生，例如键合在一起的电子亲合势不同的原子可以产生极性共价键，产生带部分负电荷的原子和带部分正电荷的原子。例如，键合到氢的氮在氮上产生部分负电荷，并在所述氢原子上产生部分正电荷。或者，当指派给分子中的原子的电子数目小于或等于所述原子的原子序数时，该原子可以被认为具有全整数电荷值。所述分子的电荷通过将构成所述分子的每个原子的电荷求和来确定。本领域技术人员熟悉通过将分子中每个原子的形式电荷求和来估算分子的电荷的过程。
所述带电荷分子(C)可以携带净负电荷、净正电荷或中性电荷，并取决于本文公开的发明的具体应用所需的肽抗原偶联物的净电荷。例如，已知大多数细胞表面带有净负电荷。因此，带有净正电荷的粒子可以与所有细胞表面相互作用，不具有高度特异性。相反，带净负电荷的粒子将与大多数细胞表面静电排斥，但已显示促进被某些抗原呈递细胞群体的选择性摄取。例如，已发现静脉内递送到循环中的带正电荷粒子积累在肝和肺中以及脾脏中的抗原呈递细胞内，而带负电荷粒子已被发现在静脉内施用后偏好性地积累在脾脏中的抗原呈递细胞中。因此，可以调整所述带电荷分子(C)的净电荷，以满足应用的具体需求。
在某些实施方式中，所述带电荷分子(C)具有净负电荷，并由在生理pH下即在约7.4的pH下带有负电荷的官能团构成。带有净负电荷的适合的带电荷分子(C)包括带有在生理pH下即在约7.4的pH下作为酸的共轭碱存在的官能团(例如pKa低于约6.5的官能团)的分子。它们包括但不限于带有羧酸根、硫酸根、磷酸根、氨基磷酸根和膦酸根的分子。所述带有羧酸根的带电荷分子(C)可以是但不限于谷氨酸、天冬氨酸、丙酮酸、乳酸、乙醇酸、葡萄糖醛酸、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、马来酸和草酰乙酸及其衍生物。在优选实施方式中，所述带负电荷分子(C)由具有1-20个之间的带负电官能团，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个带负电荷官能团的分子构成，尽管通常不超过16个带负电荷官能团。在某些实施方式中，所述带电荷分子(C)是长度在2-6个氨基酸之间的聚(谷氨酸)肽。由1、2、3、4、5或6个氨基酸构成的聚(谷氨酸)序列预期在pH 7.4下分别带有-1、-2、-3、-4、-5和-6的负电荷。在另外的实施方式中，所述带电荷分子(C)是磷酸丝氨酸或磺基丝氨酸。
在某些实施方式中，所述带电荷分子(C)具有净负电荷，并且由1个或更多个带负电荷氨基酸构成。在优选实施方式中，所述具有净负电荷的带电荷分子(C)由1至20个、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个带负电荷氨基酸构成。在非限制性实例中，将由16个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO：25)用于制备具有-16的净负电荷的带电荷分子(C)；将由15个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp
(SEQ ID NO：26)用于制备具有-15的净负电荷的带电荷分子(C)；将由14个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO：27)用于制备具有-14的净负电荷的带电荷分子(C)；将由13个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO：28)用于制备具有-13的净负电荷的带电荷分子(C)；将由12个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQID NO：29)用于制备具有-12的净负电荷的带电荷分子(C)；将由11个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO：30)用于制备具有-11的净负电荷的带电荷分子(C)；将由10个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO：31)用于制备具有-10的净负电荷的带电荷分子(C)；将由9个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO：32)用于制备具有-9的净负电荷的带电荷分子(C)；将由8个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO：33)用于制备具有-8的净负电荷的带电荷分子(C)；将由7个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO：34)用于制备具有-7的净负电荷的带电荷分子(C)；将由6个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO：35)用于制备具有-6的净负电荷的带电荷分子(C)；将由5个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO：36)用于制备具有-5的净负电荷的带电荷分子(C)；将由4个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp-Asp(SEQ ID NO：37)用于制备具有-4的净负电荷的带电荷分子(C)；将由3个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp-Asp用于制备具有-3的净负电荷的带电荷分子(C)；将由2个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp-Asp用于制备具有-2的净负电荷的带电荷分子(C)；将由1个天冬氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Asp用于制备具有-1的净负电荷的带电荷分子(C)。在上述实例中，天冬氨酸(Asp)可以被任何适合的带负电荷氨基酸包括但不限于谷氨酸、磺基丝氨酸或磷酸丝氨酸代替，其中所述带负电荷氨基酸可以是相同或不同的。
在某些实施方式中，所述带电荷分子(C)具有净正电荷，并且由带正电荷的官能团构成。适合的带正电荷分子(C)包括具有在生理pH下即在约7.4的pH下带正电荷的官能团的分子，例如弱碱的共轭酸，其中所述碱的共轭酸的pKa大于约8.5。适合的带正电荷分子(C)包括但不限于带有伯胺、仲胺和叔胺以及季铵、胍、鏻和锍官能团的分子。适合的带有铵官能团的分子包括例如咪唑鎓盐和四烷基铵化合物。在某些实施方式中，所述带电荷分子(C)由不依赖于pH而带有永久正电荷的季铵化合物构成。
具有不依赖于pH的电荷的带正电荷官能团的非限制性实例包括：
Figure BDA0002263670070001171
其中X-是任何适合的平衡阴离子。
在另外的实施方式中，所述带电荷分子(C)由在生理pH下作为碱的共轭酸存在的官能团例如伯胺、仲胺和叔胺构成。在优选实施方式中，所述带正电荷分子(C)由1-20个之间的带正电荷官能团例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个带正电荷官能团构成，尽管通常不超过16个带电荷官能团。在某些实施方式中，所述带电荷分子(C)是长度在1-6个氨基酸之间的聚(赖氨酸)肽。由1、2、3、4、5或6个氨基酸构成的聚(赖氨酸)序列预期在pH 7.4下分别带有+1、+2、+3、+4、+5或+6的正电荷。在另外的实施方式中，所述带电荷分子(C)是长度在2-6个氨基酸之间的聚(精氨酸)肽。
在某些实施方式中，所述带电荷分子(C)具有净正电荷并且由1个或更多个带正电荷氨基酸构成。在优选实施方式中，所述具有净正电荷的带电荷分子(C)由1至20个之间、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个带正电荷氨基酸构成。在非限制性实例中，将由16个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：38)用于制备具有+16的净正电荷的带电荷分子(C)；将由15个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：39)用于制备具有+15的净正电荷的带电荷分子(C)；将由14个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：40)用于制备具有+14的净正电荷的带电荷分子(C)；将由13个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：41)用于制备具有+13的净正电荷的带电荷分子(C)；将由12个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：42)用于制备具有+12的净正电荷的带电荷分子(C)；将由11个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：43)用于制备具有+11的净正电荷的带电荷分子(C)；将由10个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：44)用于制备具有+10的净正电荷的带电荷分子(C)；将由9个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：45)用于制备具有+9的净正电荷的带电荷分子(C)；将由8个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：46)用于制备具有+8的净正电荷的带电荷分子(C)；将由7个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：47)用于制备具有+7的净正电荷的带电荷分子(C)；将由6个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：48)用于制备具有+6的净正电荷的带电荷分子(C)；将由5个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：49)用于制备具有+5的净正电荷的带电荷分子(C)；将由4个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：50)用于制备具有+4的净正电荷的带电荷分子(C)；将由3个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys-Lys用于制备具有+3的净正电荷的带电荷分子(C)；将由2个赖氨酸单体构成的带电荷分子(C)例如Lys-Lys用于制备具有+2的净正电荷的带电荷分子(C)；将由1个赖氨酸构成的带电荷分子(C)例如Lys用于制备具有+1的净正电荷的带电荷分子(C)。在上述实施例中，赖氨酸(Lys)可以被任何适合的带正电荷氨基酸包括但不限于三甲基赖氨酸或精氨酸代替，其中所述带正电荷氨基酸可以是相同或不同的。
带电荷分子(C)还可以包含小的不带电荷的亲水氨基酸或亲水连接物例如环氧乙烷，其起到i)提高水溶性和ii)增加带电荷官能团之间的距离以防止不完全电离的作用。例如，聚合物上的一个官能团的电离可能通过局部效应影响邻近官能团的pKa。例如，与第二个胺基非常接近的胺基的质子化可能降低所述第二个胺基的共轭酸的pKa。为了减少局部效应对相邻官能团的电离潜力的影响，可以使用连接物分子来增加构成所述带电荷分子的带电荷官能团之间的距离。所述连接物分子可以包含1-5个之间的小的不带电荷的亲水氨基酸，例如1、2、3、4和5个氨基酸。或者，所述连接物可以包含1-4个单体单元之间的环氧乙烷(即PEG)连接物，例如长度为1、2、3或4个环氧乙烷单体。在优选实施方式中，将1至2个小的不带电荷的亲水氨基酸置于构成所述带电荷分子(C)的相邻带电荷氨基酸之间，其中所述氨基酸通过酰胺键连接。在某些实施方式中，将丝氨酸置于构成带净正电荷的带电荷分子(C)的每个带电荷氨基酸之间。在优选实施方式中，所述带电荷分子(C)由重复的赖氨酸和丝氨酸的二肽构成，即(Lys-Ser)n，其中n通常是1-20之间的任何整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。作为其他实例，将丝氨酸置于具有+2净电荷的三肽带电荷分子(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Lys-Ser-Lys；将丝氨酸置于具有+3净电荷的5个氨基酸的带电荷分子(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Lys-Ser-Lys-Ser-Lys(SEQ ID NO：51)；将丝氨酸置于具有+4净电荷的7个氨基酸的带电荷分子(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser-Lys(SEQ ID NO：52)。在上述实例中，赖氨酸(Lys)可以被任何适合的带正电荷氨基酸包括但不限于三甲基赖氨酸或精氨酸代替，其中所述带正电荷氨基酸可以是相同或不同的。
在某些实施方式中，将丝氨酸置于构成具有净负电荷的带电荷分子(C)的每个带电荷氨基酸之间。在优选实施方式中，所述带电荷分子(C)由重复的天冬氨酸和丝氨酸的二肽构成，即(Asp-Ser)n，其中n通常是1-20之间的任何整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。例如将丝氨酸置于具有-2净电荷的三肽带电荷分子(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Asp-Ser-Asp；将丝氨酸置于具有-3净电荷的5个氨基酸的带电荷分子(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Asp-Ser-Asp-Ser-Asp(SEQ ID NO：53)；将丝氨酸置于具有-4净电荷的7个氨基酸的带电荷分子(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Asp-Ser-Asp-Ser-Asp-Ser-Asp(SEQ ID NO：54)。在上述实例中，天冬氨酸(Asp)可以被任何适合的带负电荷氨基酸包括但不限于谷氨酸、磺基丝氨酸或磷酸丝氨酸代替，其中所述带负电荷氨基酸可以是相同或不同的。
在另外的实施方式中，所述带电荷分子(C)由带负电荷和带正电荷氨基酸两者构成。由相反电荷的氨基酸构成的二肽例如Lys-Asp被称为两性离子二肽，因为它们被预测在pH 7.4下具有0的净中性电荷。一个或多个两性离子二肽可以被包括在所述带电荷分子(C)中，作为i)提高水溶性和ii)在一定pH范围内提供优势电荷(例如净负或净正电荷)的手段。例如两性离子二肽可用于增加肽序列的亲水特性，而不增加或减少肽序列在pH 7.4下的电荷。然而，所述两性离子可用于在特定pH下提供净电荷。例如，在这个实例中将所述N-端胺和C-端羧酸的贡献排除在外，所述两性离子二肽Lys-Asp在pH 7.4下具有0的净电荷，但在pH<4下具有+1的净电荷，并且在pH>10下具有-1的净电荷。一个或多个两性离子二肽可以被添加到带电荷分子(C)的序列；例如，一个二肽Lys-Asp；两个二肽Lys-Asp-Lys-Asp(SEQ IDNO：55)；三个二肽Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp(SEQ ID NO：56)等。在上述实例中，赖氨酸(Lys)可以被任何适合的带正电荷氨基酸包括但不限于三甲基赖氨酸或精氨酸代替，并且天冬氨酸(Asp)可以被任何适合的带负电荷氨基酸包括但不限于谷氨酸、磺基丝氨酸或磷酸丝氨酸代替，其中所述带正电荷或带负电荷氨基酸可以是相同或不同的。
所述带电荷分子(C)的组成被选择成提供用于特定应用的肽抗原偶联物所需的净电荷。在本文公开的几个实施方式中，所述带电荷分子(C)是由赖氨酸或精氨酸、或者赖氨酸或精氨酸和不带电荷氨基酸构成的带正电荷的聚(氨基酸)。在某些实施方式中，所述带电荷组成部分包含带有pH无关性正电荷的锍或季铵官能团。在本文公开的几个实施方式中，所述带电荷分子(C)是由谷氨酸或天冬氨酸、或者谷氨酸或天冬氨酸和不带电荷氨基酸构成的带负电荷的聚(氨基酸)。在某些实施方式中，所述带电荷组成部分包含磷酸或硫酸基团，例如磺基丝氨酸或磷酸丝氨酸。在另外的实施方式中，所述带电荷分子由赖氨酸或精氨酸和谷氨酸或天冬氨酸、或者赖氨酸或精氨酸和谷氨酸或天冬氨酸以及不带电荷氨基酸构成。带正电荷和带负电荷官能团两者可以被包含在同一个带电荷分子(C)上。所述带电荷分子(C)可以是正、负或中性的，但所述肽抗原偶联物的净电荷应该是非零的，例如大于+3或小于-3的净电荷是优选的，并取决于具体应用。
关于带电荷分子(C)的另一个考虑因素是所选的平衡离子。带有具有正电荷的官能团的带电荷分子(C)的非限制性实例包括但不限于卤化物包括氯化物、溴化物和碘化物阴离子，和酸的共轭碱包括磷酸根、硫酸根、亚硫酸根和羧酸根阴离子，包括甲酸根、琥珀酸根、乙酸根和三氟乙酸根。对于带有具有负电荷的官能团的带电荷分子(C)来书，适合的平衡离子包括但不限于氢和碱金属和碱土金属，包括例如钠、钾、镁和钙，或弱碱的共轭酸例如铵化合物。
所述带电荷分子(C)可以被直接地或通过延长部(B1或B2)、连接物(L)、连接物和延长部(B1或B2)或粒子(P)或疏水分子(H)间接地连接到肽抗原(A)，所述粒子(P)或疏水分子(H)直接地或通过连接物(L)和/或延长部(B1或B2)间接地连接到所述肽抗原。
在某些实施方式中，所述带电荷分子(C)被连接到任选的N-或C-端延长部(B1或B2)，所述N-或C-端延长部(B1或B2)被分别连接到肽抗原(A)的N-或C-端，所述肽抗原(A)分别在C-或N-端处连接到任选的延长部(B2)，所述B2被直接地或通过连接物(L)连接到粒子(P)或疏水分子(H)，以得到式V的肽抗原偶联物，其中[]表示所述基团是任选的：
C-[B1]-A-[B2]-[L]-P、C-[B1]-A-[B2]-[L]-H、P-[L]-[B1]-A-[B2]-C或
H-[L]-[B1]-A-[B2]-C
式V
在几个实施方式中，所述带电荷分子(C)被放置在式V的肽抗原偶联物的N-端处，其中所述带电荷分子(C)被连接到由组织蛋白酶可切割的四肽延长部构成的N-端延长部(B1)(B1＝PN4-PN3-PN2-PN1)，B1被连接到肽抗原(A)的N-端，所述肽抗原(A)在C-端处连接到由组合的免疫蛋白酶体和组织蛋白酶可切割的六肽延长部构成的C-端延长部(B2)(B2＝PC1’-PC2’-PC3’-PC4’-PC5’-PC6’)，B2被连接到连接物(L)，L被连接到疏水分子(H)或粒子(P)。式V的肽抗原偶联物的肽抗原(A)由整数数目n个氨基酸构成，其中n通常在7-35个氨基酸之间，并且所述疏水分子(H)通常是连接到式III的佐剂的式I或II的聚(氨基酸)。
在这里提供了式V的肽抗原偶联物的非限制性实例，其包含带电荷分子(C＝Lys-Lys)，C被连接到在肽抗原(A)的N-端处的组织蛋白酶可切割的四肽延长部(B1＝Lys-Pro-Leu-Arg SEQ ID NO：8)，所述肽抗原(A)在C-端处连接到组织蛋白酶可切割的六肽延长部(B2＝Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO：13)，B2被连接到三唑连接物(L)，L被连接到由式I的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)，所述式I的聚(氨基酸)被连接到式III的佐剂：
Figure BDA0002263670070001231
在另外的实施方式中，带电荷分子(C；或在存在两个带电荷分子时C1和C2)可以被直接连接到所述疏水分子(H)或连接到所述连接物(L)，L被连接到所述C-端延长部(B2)，B2被连接到肽抗原(A)的C-端，肽抗原(A)任选地在N-端处连接到N-端延长部(B1)，B1任选地连接到另外的任选的带电荷组成部分(C1)；或者所述带电荷分子(C；或在存在两个带电荷分子时C1和C2)可以被直接连接到所述疏水分子(H)或连接到所述连接物(L)，L被连接到所述N-端延长部(B1)，B1被连接到肽抗原(A)的N-端，肽抗原(A)任选地在C-端处连接到C-端延长部(B2)，B2任选地连接到另外的任选的带电荷组成部分(C2)，以得到式VI的肽抗原偶联物，其中[]表示所述基团是任选的：
[B1]-A-[B2]-L(C)-H、[B1]-A-[B2]-L-H(C)、[C1]-[B1]-A-[B2]-L(C2)-H、[C1]-[B1]-A-[B2]-L-H(C2)、H-L(C)-[B1]-A-[B2]、H(C)-[B1]-A-[B2]、H-L(C1)-[B1]-A-[B2]-C2或H(C1)-[B1]-A-[B2]-C2
式VI
在几个实施方式中，所述带电荷分子(C)被放置在式VI的肽抗原偶联物的C-端，其中所述带电荷分子(C)被连接到连接物(L)，L任选地连接到C-端延长部(B2)，B2由免疫蛋白酶体、组织蛋白酶或合并的免疫蛋白酶体和组织蛋白酶可切割的延长部构成，长度通常在1至6个氨基酸之间(B2＝PC1’、PC1’-PC2’、PC1’-PC2’-PC3’、PC1’-PC2’-PC3’-PC4’、PC1’-PC2’-PC3’-PC4’-PC5’或PC1’-PC2’-PC3’-PC4’-PC5’-PC6’)，B2被连接到肽抗原(A)的C-端，肽抗原(A)任选地在N-端处连接到长度通常在1至4个氨基酸之间的组织蛋白酶可切割的延长部(B1＝PN1、PN2-PN1、PN3-PN2-PN1或PN4-PN3-PN2-PN1)，其中所述连接物(L)被另外连接到疏水分子(H)，如这里所示：
Figure BDA0002263670070001241
所述式VI的肽抗原偶联物的肽抗原(A)由整数数目n个氨基酸构成，其中n通常在7-35个氨基酸之间或最多50个氨基酸，并且所述疏水分子通常是连接到式III的佐剂的式I或II的聚(氨基酸)。
提供了式VI的肽抗原偶联物的非限制性实例，其包含带电荷分子(例如C＝Lys-Lys)，C通过酰胺键连接到连接物(L)的C-端，L连接到合并的免疫蛋白酶体和组织蛋白酶可切割的六肽C-端延长部(例如B2＝Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO：13)，B2连接到肽抗原(A)的C-端，肽抗原(A)在N-端处连接到组织蛋白酶可切割的四肽N-端延长部(例如B1＝Lys-Pro-Leu-Arg SEQ ID NO：8)，其中所述连接物(L)另外地连接到由式I的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)，所述式I的聚(氨基酸)连接到式III的佐剂：
Figure BDA0002263670070001251
式VI的肽抗原偶联物的另一个非限制性实例B1-A-B2-L-H(C)包括带电荷组成部分(C＝Lys-Lys-Lys-Lys-Lys SEQ ID NO：49)，其通过连接物连接到由式I的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)，所述式I的聚(氨基酸)连接到式III的佐剂，所述疏水分子(H)连接到连接物(L)，L连接到合并的免疫蛋白酶体和组织蛋白酶可切割的六肽C-端延长部(B2＝Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO：13)，B2连接到肽抗原(A)的C-端，并且所述肽抗原(A)的N-端连接到组织蛋白酶可切割的四肽N-端延长部(B1＝Lys-Pro-Leu-Arg SEQ ID NO：8)：
Figure BDA0002263670070001261
在式VI的肽抗原偶联物的非限制性实例B1-(A)7-35-B2-L(-C)-H中，将具有序列Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala(SEQ ID NO：22)的肽抗原(A)连接到具有序列Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)的N-端延长部(B1)和具有序列Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)的C-端延长部(B2)，B2被连接到连接物前体X1例如Lys(N3)，X1被连接到由具有序列Glu-Lys的二肽构成的带电荷组成部分(C)和包含DBCO分子的连接物前体X2两者，X2被连接到疏水分子(H)，例如：Ser-Leu-Val-Arg-Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-Ser-Leu-Val-Arg-Lys(N3-DBCO-H)-Glu-Lys，其中所述Glu-Lys序列被连接到所述连接物(L)(Lys(N3-DBCO))的C-端，产生在pH 7.4下具有预测的+4的净电荷的肽抗原偶联物。在这里，假定所述疏水分子(H)对所述肽抗原偶联物的电荷具有可忽略的贡献。注意，所述带电荷组成部分(C)和延长序列(B1和B2)的组成可以被选择，以提供特定数目的带电荷残基，其提供构成所述肽抗原偶联物的肽序列的所需净电荷和亲水性，正如在下文中更详细描述的。在优选实施方式中，调节构成所述带电荷组成部分(C)的带电荷官能团的数目，使得包含所述带电荷组成部分(C)、肽抗原(A)、任选的延长部(B1和/或B2)、连接物(L)和疏水分子(H)的肽抗原偶联物的净电荷在约-3至-10之间或+3至+10之间。
其中所述带电荷组成部分(C)被连接到所述疏水分子(H)的式VI的肽抗原偶联物，对于个性化疗法例如个性化癌症疫苗的快速生产可以是有利的。所述被连接到带电荷分子(C)和连接物前体X2(例如包含环辛炔的X2)的疏水分子(H)可以被大批制备，然后容易地与带有连接物前体X1(例如包含叠氮化物的X1)的任何肽抗原(A)合并，以形成式VI的肽抗原偶联物[C1]-[B1]-A-[B2]-L-H(C2)或H(C)-L-[B1]-A-[B2]-[C2]，其中[]表示所述基团是任选的。
所述带电荷组成部分(C)的功能是使在水性条件下由肽抗原偶联物形成的纳米粒子稳定。在所述疏水分子(H)诱导肽抗原偶联物的粒子形成的同时，所述任选的带电荷分子(C)提供了阻止絮凝的抗衡力量，并且在某些实施方式中驱动所述肽抗原偶联物组装成具有由所述带电荷组成部分(C)提供的表面电荷的纳米粒子胶束。
在某些实施方式中，所述肽抗原偶联物不包含带电荷分子，例如[B1]-A-[B2]-[L]-H，其中[]表示所述基团是任选的。非限制性实例包括A-H、A-L-H、A-B2-H、A-B2-L-H、B1-A-B2-L-H。不包含带电荷分子(C)的肽抗原偶联物在水性条件中可能经历团集。为了提高由不包含带电荷组成部分(C)的肽抗原偶联物形成的粒子的稳定性，可以添加带电荷或两亲性分子。在某些实施方式中，将不包含带电荷组成部分(C)的第一肽抗原偶联物(即[B1]-A-[B2]-[L]-H)与包含带电荷组成部分的第二肽抗原偶联物(例如C-[B1]-A-[B2]-[L]-H)在DMSO溶液中混合，然后重悬浮在水性条件中，以形成稳定的纳米粒子。在其他实施方式中，将不包含带电荷分子(C)的肽抗原偶联物(即[B1]-A-[B2]-[L]-H)与连接到带电荷分子(C)的疏水分子(H)例如C-H在DMSO溶液中混合，然后重悬浮在水性条件中，以形成稳定的纳米粒子。
在某些实施方式中，将不包含带电荷分子(C)的肽抗原偶联物例如[B1]-A-[B2]-[L]-H，其中[]表示所述基团是任选的，与两亲性载体C-[B1]-[A’]-[B2]-[L]-H合并，其中[]表示所述基团是任选的，并且任选的A’是保守抗原(即不是患者特异性的)。在某些实施方式中，将包含带电荷分子(C)的肽抗原偶联物与两亲性载体合并。所述两亲性载体起到使纳米粒子例如由肽抗原偶联物形成的纳米粒子胶束稳定的作用。
带电荷分子和延长部(B1和B2)的选择
与任选的带电荷分子(C)一起的分别连接在肽抗原(A)的N-和C-端处的任选的延长部B1和B2的组成，应该被选择成：I)实现在生理温度和约7.4的pH下在水性缓冲液中使由所述肽抗原偶联物形成的粒子稳定所需的适合的净电荷和亲水与疏水特性的平衡；并且II)确保在所述肽抗原偶联物的背景中递送的肽抗原(A)可以被加工以释放出提供在所述肽抗原(A)上的最小CD4和/或CD8 T细胞表位，使得所述表位可以被呈递在I类和II类MHC分子的背景中。下面的描述公开了与带电荷分子(C)一起的B1和B2延长部的特定组成，其导致对由肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸和稳定性的控制的出人意料的改进和/或作为肽抗原(A)提供在这些粒子上的CD4和/或CD8 T细胞表位的加工和呈递的改进，这引起显著增强的T细胞应答。
本文公开的一个出人意料的发现是作为肽抗原偶联物例如式IV、V和VI的肽抗原偶联物递送的含有最小CD8 T细胞表位的肽抗原(A)，当在所述肽抗原(A)的C-端与疏水分子(H)之间使用C-端酶可降解延长部(B2)和/或当在所述肽抗原(A)的N-端与带电荷分子(C)之间使用N-端酶可降解延长部(B1)时，在体外被最高效地加工并在体内引起更高的CD8T细胞应答。在某些实施方式中，在所述带电荷分子(C)与肽抗原(A)之间包括包含组织蛋白酶可切割位点的B1延长部(例如C-B1-A-[B2]-[L]-H，其中[]表示所述基团是任选的)，导致最小T细胞表位从所述肽抗原偶联物的更高效的加工，并与体内更高强度的T细胞应答相关。因此，式V和VI的优选实施方式应该使用组织蛋白酶可切割序列作为N-端(B1)和C-端(B2)延长部，以允许作为包含肽抗原偶联物的粒子提供的肽抗原(A)的高效加工和呈递。
另一个出人意料的发现涉及使由肽抗原偶联物的某些实施方式形成的粒子稳定所需的净电荷的鉴定。作为肽抗原偶联物递送的高度疏水的肽抗原(A)在水性条件中具有团集的倾向性。为了抗衡这种倾向性，可以选择用于附连到所述肽抗原偶联物的带电荷分子(C)和某些延长部(B1或B2)，例如参见式V和VI，或者可以向包含肽抗原偶联物的粒子添加包含带电荷分子的偶联物(例如C-[A’]-[L]-H，其中A’是保守抗原，并且[]表示所述基团是任选的)。本文公开的一个出人意料的发现是使由肽抗原偶联物的某些实施方式例如包含基于聚(氨基酸)的疏水分子(H)的式V和VI的肽抗原偶联物形成的粒子稳定所需的电荷(例如净电荷)的量，取决于所述包含肽抗原(A)、任选的带电荷分子(C)和任选的延长部(B1和B2)的肽抗原片段的亲水性(即疏水性质)。我们报道了出人意料的发现，即可用于使由肽抗原偶联物的某些实施方式形成的粒子稳定的净电荷，可以在所述肽抗原(A)或肽抗原片段的亲水性的基础上确定。因此，在优选实施方式中，所述肽抗原偶联物的净电荷在所述肽抗原(A)的经计算的亲水性的基础上选择，并且受所述带电荷分子(C)和任选地所述延长部(B1和/或B2)调节。在其他实施方式中，所述肽抗原偶联物的净电荷在所述肽抗原片段的经计算的亲水性的基础上选择，并且受所述带电荷分子(C)调节。为清楚起见，所述连接物前体(X1和X2)、连接物(L)和疏水分子(H)或粒子(P)在用于选择肽抗原偶联物的净电荷的肽抗原(A)或肽抗原片段的亲水性值的确定中不被考虑。因此，肽抗原偶联物的亲水性等同于所述肽抗原片段的亲水性。
所述肽抗原(A)或包括肽抗原(A)、任选的带电荷分子(C)和任选的延长部(B1和/或B2)的肽抗原片段的亲水性，可以使用可用于确定肽的疏水/亲水特征的各种不同方法中的任一种来计算。作为非限制性实例，用于确定肽抗原(A)或所述肽抗原片段的亲水性的一种方法是如下所述使用Kyte和Doolittle的方法计算亲水性总平均(GRAVY)值。下面的亲水性值以及为非天然氨基酸(即瓜氨酸、磺基丝氨酸、磷酸丝氨酸和三甲基赖氨酸)提供的估算值，是基于Kyte和Doolittle的方法，并被用于计算本文中的GRAVY值：
Figure BDA0002263670070001301
所述用于确定肽的GRAVY值的方法是将构成所述肽的每个单个氨基酸的亲水性值求和，然后除以所述肽的总长度。例如，具有序列Val-Val-Ile-Ala-Ile-Phe-Ile-Ile-Leu(SEQ ID NO：57)的9个氨基酸的肽抗原(A)具有3.86的GRAVY值(例如(4.2+4.2+4.5+1.8+4.5+2.8+4.5+4.5+3.8)/9个氨基酸)。作为非限制性实例，将同一个肽抗原(A)即Val-Val-Ile-Ala-Ile-Phe-Ile-Ile-Leu(SEQ ID NO：57)通过固相肽合成制备为肽抗原片段，其中将带电荷分子(C＝Lys-Ser-Lys-Gly-Gly SEQ ID NO：58)连接到所述肽抗原的N-端处的N-端延长部(B1＝Lys-Pro-Leu-Arg SEQ ID NO：8)，并将所述肽抗原在C-端处连接到C-端延长部(B2＝Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg SEQ ID NO：11)，所述C-端被连接到连接物前体X1(其中X1是Lys(N3)-NH2)，成为：Ac-Lys-Ser-Lys-Gly-Gly-Lys-Pro-Leu-Arg-Val-Val-Ile-Ala-Ile-Phe-Ile-Ile-Leu-Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg-Lys(N3)-NH2，并具有0.75的GRAVY值和+6的净电荷。
所述肽抗原片段或肽(A)的GRAVY值的确定提供了肽序列的疏水/亲水特征的描述。一般来说，小于零的GRAVY值通常表明肽主要由亲水氨基酸构成，而大于零的GRAVY值表明肽主要由疏水氨基酸残基构成。本文中报道的一个出人意料的发现是随着肽抗原(A)或肽抗原片段的GRAVY值增加，使由包含所述肽抗原(A)(或肽抗原片段)的肽抗原偶联物形成的粒子稳定所需的净电荷(正或负)的大小也增加。因此，具有较高GRAVY值的肽抗原(A)或肽抗原片段通常具有较高净电荷才能确保由肽抗原偶联物形成的粒子的稳定性。
在所述肽抗原(A)、任选的带电荷分子(C)和/或任选的延长部(B1和/或B2)的氨基酸组成的基础上计算(并排除可能构成所述连接物前体(X1和X2)、连接物(L)和疏水分子(H)或粒子(P)的任何氨基酸的贡献)的肽抗原(A)或肽抗原片段的GRAVY值可以被计算，以确定确保肽抗原偶联物的某些实施方式的稳定粒子形成所需的净电荷。注意：所述肽抗原偶联物的GRAVY被认为等于所述肽抗原片段的GRAVY；因此肽抗原片段的GRAVY值也可以被称为所述肽抗原偶联物的GRAVY值。
在某些实施方式中，将所述肽抗原(A)的GRAVY值用于确定使由所述肽抗原偶联物形成的粒子稳定所需的净电荷。作为非限制性实例，当所述肽抗原(A)的GRAVY值大于0.75时，所述肽抗原偶联物应该具有≥(大于或等于)+6或≤(小于或等于)-6的净电荷；当所述GRAVY值在0.25-0.75之间时，所述净电荷应该≥(大于或等于)+5或≤(小于或等于)-5；当所述GRAVY值小于0.25时，所述净电荷应该≥(大于或等于)+4或≤(小于或等于)-4。在优选实施方式中，取决于需要净正电荷还是净负电荷，所述净电荷分别大于或等于+4或小于或等于-4。在某些实施方式中，具有小于0.25的GRAVY值的肽抗原(A)被合成作为肽抗原偶联物，其具有约+4至+15例如+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14或+15，尽管通常在约+4至+12之间的净正电荷；或具有约-4至-15例如-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14或-15，尽管通常在约-4至-12之间的净负电荷。在某些实施方式中，GRAVY值在0.25-0.75之间的肽抗原(A)被合成作为肽抗原偶联物，其具有约+5至+15例如+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15，尽管通常在约+5至+12之间的净正电荷；或具有约-5至-15例如-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14或-15，尽管通常在约-5至-15之间的净负电荷。在某些实施方式中，GRAVY值大于0.75的肽抗原(A)被合成作为肽抗原偶联物，其具有约+6至+15例如+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15，尽管通常在约+6至+12之间的净正电荷；或具有约-6至-15例如-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14或-15，尽管通常在约-6至-12之间的净负电荷。
在用于选择所述带电荷分子(C)和任选的延长部(B1和/或B2)以产生所需净电荷的肽抗原偶联物的方法的一个实施方式中，所述方法可以包括下述步骤：(i)确定所述肽抗原(A)的GRAVY和电荷；和(ii)选择带电荷分子(C)和任选的延长部(B1和/或B2)以获得足够数量的带电荷官能团，以达到所述净电荷。在非限制性实例中，肽抗原偶联物需要的净电荷可能按照下述判据随着所述肽抗原(A)的亲水性而变：对于GRAVY值大于0.75的25至35个氨基酸的肽抗原(A)来说，需要大于或等于+6的电荷；对于GRAVY值在0.25至0.75之间的25至35个氨基酸的肽抗原(A)来说，需要大于或等于+5的电荷；并且对于GRAVY小于0.25的25至35个氨基酸的肽抗原(A)来说，需要大于或等于+4的电荷。因此，在这个非限制性实例中，GRAVY值为2.0并且电荷为+2的25个氨基酸的肽抗原(A)应该与包含至少+4的净电荷的带电荷分子(C)和任选的延长部(B1和/或B2)组合，以获得+6的肽抗原偶联物的净电荷。在另一个非限制性实例中，肽抗原偶联物需要的净电荷可能按照下述判据随着所述肽抗原(A)的亲水性而变：对于GRAVY值大于0.75的25至35个氨基酸的肽抗原(A)来说，需要小于或等于-6的电荷；对于GRAVY值在0.25至0.75之间的25至35个氨基酸的肽抗原(A)来说，需要小于或等于-5的电荷；并且对于GRAVY小于0.25的25至35个氨基酸的肽抗原(A)来说，需要小于或等于-4的电荷。因此，在这个非限制性实例中，GRAVY值为2.0并且电荷为+2的肽抗原(A)应该与包含-8的净电荷的带电荷分子(C)和任选的延长部(B1和/或B2)组合，以获得-6的肽抗原偶联物的净电荷。
在某些实施方式中，所述包括任选的带电荷分子(C)、任选的延长部(B1和/或B2)和肽抗原(A)的肽抗原片段的GRAVY值的确定，被用于确定使由所述肽抗原偶联物形成的粒子稳定所需的净电荷。作为非限制性实例，当所述肽抗原片段的GRAVY值大于0.75时，所述肽抗原偶联物应该具有≥(大于或等于)+6或≤(小于或等于)-6的净电荷；当所述GRAVY值在0.25-0.75之间时，所述净电荷应该≥(大于或等于)+5或≤(小于或等于)-5；当所述GRAVY值小于0.25时，所述净电荷应该≥(大于或等于)+4或≤(小于或等于)-4。在优选实施方式中，取决于需要净正电荷还是净负电荷，所述净电荷分别大于或等于+4或小于或等于-4。在某些实施方式中，GRAVY值小于0.25的肽抗原片段具有约+4至+15例如+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14或+15，尽管通常在约+4至+12之间的净正电荷；或约-4至-15例如-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14或-15，尽管通常在约-4至-12之间的净负电荷。在某些实施方式中，GRAVY值在0.25-0.75之间的肽抗原片段具有约+5至+15例如+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15，尽管通常在约+5至+12之间的净正电荷；或约-5至-15例如-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14或-15，尽管通常在约-5至-12之间的净负电荷。在某些实施方式中，GRAVY值大于0.75的肽抗原片段具有约+6至+15例如+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15，尽管通常在约+6至+12之间的净正电荷；或约-6至-15例如-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14或-15，尽管通常在约-6至-12之间的净负电荷。
另一个出人意料的发现是使由肽抗原偶联物的某些实施方式例如式V和式VI的肽抗原偶联物形成的粒子稳定所需的净电荷的大小，通常随着所述肽抗原(A)的长度而增加。在某些实施方式中，7至14个氨基酸的肽抗原(A)被合成作为肽抗原偶联物，其具有大于或等于+6或小于或等于-6的净电荷；15至24个氨基酸的肽抗原(A)被合成作为肽抗原偶联物，其具有大于或等于+7或小于或等于-7的净电荷；并且25至35个氨基酸的肽抗原(A)被合成作为肽抗原偶联物，其具有大于或等于+8或小于或等于-8的净电荷。
在某些实施方式中，免疫原性组合物包含由式[B1]-A-[B2]-[L]-H的肽抗原偶联物和式C-[A’]-[L]-H的带电荷分子(C)偶联物构成的粒子，其中[]表示所述基团是任选的，并且A’是任选的保守抗原(即不是患者特异性的)，另外其中[B1]-A-[B2]-[L]-H与C-[A’]-[L]-H的摩尔比选自1:20至20:1的范围，例如1:20、1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1、10:1和20:1，并且所述C-[A’]-[L]-H的净电荷为负并选自-2至-20，例如-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19或-20，通常为约-4至约-12，或者为正并选自+2至+20，例如+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+15、+16、+17、+18、+19或+20，通常为约+4至+12。在非限制性实例中，免疫原性组合物包含的粒子包含1摩尔当量的肽抗原偶联物Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser-Lys(N3-DBCO-H)-NH2，其带有0的净电荷(注意所述肽片段具有C-端酰胺)，和1摩尔当量的由(Lys)5-Lys(N3-DBCO-NH)-NH2构成的带电荷分子(C)偶联物，其带有+6的净电荷；肽抗原偶联物与带电荷分子偶联物的比例为1:1，并且每组这两种分子的净电荷为+6。因此，所述粒子的净电荷可以通过调节所述肽抗原偶联物与所述带电荷分子(C)偶联物的比例或通过调节所述带电荷分子偶联物的净电荷来调整。在优选实施方式中，所述肽抗原偶联物与带电荷分子的比例为约1:4至4:1，并且所述带电荷分子的净电荷被选择成使得构成所述粒子的分子的平均净电荷为约+4至约+12或约-4至约-12。例如，包含1:1摩尔比的肽抗原偶联物与带电荷分子偶联物(C)的粒子，其中所述肽抗原偶联物具有0的净电荷，当所述带电荷分子(C)偶联物的净电荷为+8时，分子的平均净电荷为+4。
对于某些应用来说，带正电荷的肽抗原偶联物可能是有用的。在某些实施方式中，肽抗原偶联物可以包含肽抗原(A)、包含带正电荷官能团的带电荷分子(C)、疏水分子(H)或粒子(P)、任选的延长部(B1和/或B2)和任选的连接物(L)。选择带电荷分子(C)和任选的延长部(B1和/或B2)的组成，以最大化粒子稳定性和所述肽抗原偶联物的生物活性。在某些实施方式中，式V的肽抗原偶联物包含具有净正电荷的带电荷分子(C)，其被连接到N-端肽延长部(B1)，B1被连接到肽抗原(A)，A被连接到C-端肽延长部(B2)，B2直接地或通过连接物(L)连接到疏水分子(H)，并且所述得到的肽抗原偶联物具有净正电荷。在这个实例中，通过所述肽抗原(A)的C-端连接的疏水分子(H)起到诱导粒子形成的作用，并且通过所述肽抗原(A)的N-端连接的带电荷分子(C)通过这些粒子表面处的高正电荷密度，起到使所述粒子稳定的作用。因此，式V的带净正电荷肽抗原偶联物的邻近疏水分子(H)放置的任选的B2延长部，其中所述带电荷分子(C)通过肽抗原(A)的N-端连接，所述B2延长部优选地由不带电荷和疏水的氨基酸构成，其有助于促进粒子形成，并且通常选自：单一氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸；二肽，例如Gly-Cit、Gly-Ser或Gly-Leu；三肽，例如Gly-Ser-Cit、Gly-Pro-Cit或Gly-Pro-Gly；四肽，例如Ser-Pro-Val-Cit或Gly-Pro-Gly-Cit；五肽，例如Gly-Ser-Val-Leu-Cit、Gly-Pro-Val-Leu-Cit；或六肽，例如Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit或Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit。在某些实施方式中，使用包括单个带电荷氨基酸的C-端延长部(B2)，并且其通常选自：单个氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸；二肽，例如Gly-Arg或Gly-Lys；三肽，例如Gly-Ser-Arg或Gly-Ser-Lys；四肽，例如Gly-Pro-Gly-Arg(SEQ ID NO：59)、Gly-Ser-Val-Arg(SEQ ID NO：60)或Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)(其中Arg可以被Lys代替)；五肽，例如Gly-Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：17)(其中Arg可以被Lys代替)；和六肽，例如Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：13)或Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：61)(其中Arg可以被Lys代替)。式V的带正电荷的肽抗原偶联物的靠近带电荷分子(C)放置的B1延长部，其中所述带电荷分子(C)通过所述肽抗原(A)的N-端连接，所述B1延长部优选地含有带电荷氨基酸例如Arg或Lys，并且通常选自：单一氨基酸，其选自Arg或Lys；二肽，其选自Val-Arg或Leu-Arg(其中Arg可以被Lys代替)；三肽，其选自Pro-Val-Arg或Gly-Val-Arg(其中Arg可以被Lys代替)；或四肽，其选自Lys-Leu-Val-Arg(SEQID NO：62)、Lys-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：9)、Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO：8)、Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)和Ser-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：6)(其中Arg可以被Lys代替)。所述不同的延长部B1和B2可以与任何带电荷分子(C)、肽抗原(A)、疏水分子(H)或粒子(P)和连接物(L)组合，以获得预定应用所需的肽抗原偶联物的亲水性总平均(GRAVY)值和净电荷。
在某些实施方式中，具有净正电荷的式V的肽抗原偶联物包含带电荷分子(C)，其通常包含4至12个之间的带正电荷官能团例如(Lys)4-12，并被连接到二肽N-端延长部(B1)例如Val-Arg，B1被连接到通常包含7至35个氨基酸之间的肽抗原(A)，A被连接到C-端延长部(B2)例如Ser-Pro-Val-Cit，B2被连接到连接物(Lys(N3)-DBCO)，所述连接物被连接到由式I或式II的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)，H被连接到式III的佐剂。
对于某些应用来说，需要带负电荷的肽抗原偶联物。在某些实施方式中，肽抗原偶联物可以包含肽抗原(A)、包含带负电荷官能团的带电荷分子(C)、疏水分子(H)或粒子(P)、任选的延长部(B1和/或B2)和任选的连接物(L)。选择带电荷分子(C)和任选的延长部(B1和/或B2)的组成，以最大化粒子稳定性和所述肽抗原偶联物的生物活性。在某些实施方式中，式V的肽抗原偶联物包含具有净负电荷的带电荷分子(C)，其被连接到N-端肽延长部(B1)，B1被连接到肽抗原(A)，A被连接到C-端肽延长部(B2)，B2被直接地或通过连接物(L)连接到疏水分子(H)，并且所述得到的肽抗原偶联物具有净负电荷。因此，所述式V的带负电荷的肽抗原偶联物的靠近疏水分子(H)放置的B2延长部，其中所述带电荷分子(C)通过所述B1延长部连接在所述肽抗原(A)的N-端处，所述B2延长部优选地由不带电荷并且疏水的氨基酸构成，其有助于促进粒子形成，并且通常选自：单一氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸；二肽，例如Gly-Ser、Gly-Cit或Gly-Leu；三肽，例如Gly-Ser-Cit、Gly-Pro-Cit或Gly-Pro-Gly；四肽，例如Ser-Pro-Val-Cit、Ser-Pro-Val-Cit或Gly-Pro-Gly-Cit；五肽，例如Gly-Ser-Val-Leu-Cit、Gly-Pro-Val-Leu-Cit；或六肽，例如Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit或Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit或Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Cit。在某些实施方式中，使用包括单个带电荷氨基酸的C-端延长部(B2)，并且其通常选自：单一氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸；二肽Gly-Arg(其中Arg可以被Lys代替)；三肽，例如Gly-Ser-Arg(其中Arg可以被Lys代替)；四肽，例如Gly-Pro-Gly-Arg(SEQ ID NO：59)、Gly-Ser-Val-Arg(SEQ ID NO：60)、Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)、Asp-Leu-Val-Cit或Asp-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：63)(其中Asp可以被Glu代替，并且Arg可以被Lys代替)；五肽，例如Gly-Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：17)或Gly-Asp-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：64)或Gly-Asp-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：65)；和六肽，例如Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：13)或Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：61)(其中Asp可以被Glu代替，并且Arg可以被Lys代替)；或Gly-Ser-Glu-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：66)或Gly-Gly-Asp-Pro-Val-Arg(SEQ IDNO：67)(其中Asp可以被Glu代替，并且Arg可以被Lys代替)。式V的带负电荷的肽抗原偶联物的靠近所述带电荷分子(C)放置的B1延长部，其中所述带电荷分子(C)通过所述B1延长部连接到所述肽抗原的N-端，所述B1延长部优选地含有带电荷氨基酸例如Asp或Glu，并且通常选自：单一氨基酸，例如Cit、Leu、Arg或Lys；二肽，其选自Val-Cit、Leu-Cit、Val-Arg或Leu-Arg(其中Arg可以被Lys代替)；三肽，其选自Pro-Val-Arg、Pro-Val-Cit、Gly-Val-Arg或Gly-Val-Cit(其中Arg可以被Lys代替)；或四肽，其选自Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)、Ser-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：6)、Ser-Pro-Leu-Cit、Ser-Leu-Val-Cit、Ser-Pro-Val-Cit、Asp-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：68)、Asp-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：69)、Asp-Leu-Val-Cit、Asp-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：63)、Ser-Gly-Val-Cit或Asp-Pro-Val-Cit(其中Arg可以被Lys代替，并且Asp可以被Glu代替)。所述不同的延长部B1和B2可以与任何带电荷分子(C)、肽抗原(A)和疏水分子(H)或粒子(P)组合，以获得所需的肽抗原偶联物的亲水性总平均(GRAVY)值和净电荷。
在某些实施方式中，具有净负电荷的式V的肽抗原偶联物包含带电荷分子(C)，所述带电荷分子(C)通常包含6至14个之间的带负电荷官能团例如(Glu)6-14，所述带电荷分子(C)被连接到二肽N-端延长部(B1)例如Val-Cit，B1被连接到通常包含7至35个之间的氨基酸的肽抗原(A)，A被连接到C-端延长部(B2)例如Ser-Pro-Val-Cit，B2被连接到连接物(Lys(N3)-DBCO)，所述连接物被连接到由式I或式II的聚(氨基酸)构成的疏水分子(H)，H被连接到式III的佐剂。
在几个实施方式中，带电荷分子(C)和/或延长部(B1和B2)的添加降低了包含所述肽抗原(A)的肽抗原片段的GRAVY值并增加了所述序列的净电荷，这与所述肽抗原片段的制造的出人意料的改进相关。在几个实施方式中，包含一个或多个赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)氨基酸残基的带电荷分子(C)的添加，导致包含原本不可作为本源肽抗原(即不含其他修饰的本源肽抗原)制造的肽抗原(A)的肽抗原片段的成功合成和HPLC纯化。在几个实施方式中，连接到由一个或多个脯氨酸、伪脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)氨基酸构成的C-端延长部(B2)的肽抗原(A)，导致包含原本不可作为本源肽抗原(即不含其他修饰的本源肽抗原)制造的肽抗原(A)的肽抗原片段的成功合成。在几个实施方式中，向完全通过固相肽合成生产的肽抗原片段或肽抗原偶联物添加一个或多个芳族胺例如苯丙氨酸胺，导致包含原本不可作为本源肽抗原(即不含其他修饰的本源肽抗原)制造的肽抗原(A)的肽抗原片段或肽抗原偶联物的成功合成。用于个性化癌症疫苗的肽抗原(A)的选择
在某些实施方式中，构成所述肽抗原偶联物的肽抗原(A)对个体患者来说是特异的。所述包含对个体患者特异的肽抗原(A)的肽抗原偶联物可用于个性化疗法，例如用作个性化癌症疫苗或用于诱导耐受或抑制以治疗自体免疫或过敏症的个性化疫苗。
用于包含在个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)的选择是多步骤过程，其中某些步骤可能是非必要的。
第一步包括鉴定对所述肿瘤特异的，或者相对于正常组织被所述肿瘤过表达的肿瘤相关抗原。因此，获得肿瘤组织和正常组织。肿瘤组织和正常组织可以在福尔马林中固定并用石蜡包埋，或者可以是新鲜分离的组织。正常组织可以是含有白细胞的血液。对所述肿瘤组织和正常组织进行处理以分离DNA。所述DNA被进一步处理并测序，以鉴定所述肿瘤DNA与正常组织DNA之间的差异。这些DNA差异可以是产生非同义突变的单或二或更高阶核苷酸变化，产生移码突变的插入和缺失，产生可选剪接变体的剪接位点突变，或产生单一氨基酸缺失的可以通读的终止密码子。通过染色体易位或倒位或复制，可能产生其他突变。存在大量方式可以使DNA水平上的变化产生肿瘤特异性的异常肽序列和/或具有异常翻译后修饰的肽，并且它们可以被称为新抗原或预测的新抗原。
第二步包括确定所述在步骤1中鉴定的肿瘤相关抗原是否确实被所述肿瘤表达。分离肿瘤RNA，进行处理和测序，以确定通过步骤1鉴定的突变是否被所述肿瘤细胞表达成RNA。在RNA表达水平的基础上，可以选择用于包括在个性化癌症疫苗中的包含从肿瘤和正常组织的DNA测序所鉴定的突变的肽抗原(A)。此外，可以选择与非癌组织相比在肿瘤中产生更高RNA水平的肿瘤相关自身抗原作为用于包括在内的肽抗原(A)。其中未鉴定到RNA转录本的突变通常不被选为用于包括在疫苗中的肽抗原(A)。包含突变的肽抗原(A)或肿瘤相关自身抗原可以在所述突变的肽(即新抗原)或肿瘤相关自身抗原的RNA表达水平的基础上被优先考虑，例如可以优先考虑更高表达的突变或肿瘤相关自身抗原。在包括在个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)的选择中可以同时使用多种判据。例如，RNA表达水平和突变的肽(即新抗原)或肿瘤相关自身抗原包含的表位的预测的MHC结合亲和性可以一起用于选择用于包括在个性化癌症疫苗中的最佳的一组肽抗原(A)。在这种情形中，非常高表达的含有具有中等结合亲和性的T细胞表位的肽抗原(A)可以优先于含有具有更高结合亲和性的T细胞表位但被所述肿瘤以非常低的水平表达的不同肽抗原(A)。
另一个考虑因素是在构成肿瘤的不同肿瘤细胞之间突变或肿瘤相关自身抗原有多么纯系(clonal)或保守。突变的纯系性(clonality)通过对在肿瘤分离的DNA中所述突变的频率与野生型变体的频率进行比较来评估。肿瘤相关新抗原或自身抗原可以在它们包含的突变的纯系性或近似纯系性的基础上选择，用作用于包括在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)。例如，如果预测肽抗原(A)存在于>50％的肿瘤细胞、>75％的肿瘤细胞、>85％的肿瘤细胞、>95％的肿瘤细胞或>99％的肿瘤细胞中，则它们可以被优先考虑用于包括在内。
在某些实施方式中，用于包括在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)，可以在通过计算机模拟结合算法确定的所述抗原内包含的表位对给定I类和/或II类MHC分子的预测结合的基础上进一步考虑优先顺序。在非限制性实例中，首先通过测序鉴定每位对象的MHC类型。然后，测试通过任何适合的手段(例如DNA程序、RNA表达或质谱术)鉴定的每个突变的肽(即新抗原)或肿瘤相关自身抗原与所述对象中存在的每种MHC分子的预测结合，所述MHC分子在人类患者的情况下，例如可以是多达6个独特的I类MHC等位基因。存在几种可用于预测MHC结合的公开可用的算法，包括netMHC人工神经网络、稳定化矩阵方法和免疫表位数据库(IEDB)分析资源一致性算法。也可以使用非公开的算法。含有具有高的预测结合亲和性的表位的肽抗原(A)与含有具有低的预测结合亲和性的表位的肽抗原(A)相比，更可能诱导免疫应答。本文公开的一个出人意料的发现是，当使用本文描述的包含肽抗原偶联物的免疫原性组合物施用时，超过50％的具有通过IEDB一致性算法预测的结合亲和性小于0.5百分位数的表位的肽抗原(A)、包括预测的新抗原，能够产生T细胞应答(即CD8 T细胞应答)。在这个出人意料的发现的基础上，含有使用IEDB一致性算法获得的结合亲和性小于0.5百分位数的表位的肽抗原(A)、包括包含预测的新抗原的肽抗原(A)，可以被选择用于包含肽抗原偶联物的个性化癌症疫苗。
此外，结合到MHC的抗原的质谱术确认或抗原与MHC的结合的在质谱术上训练的算法，可用于选择用于包括在个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)。在这种情形中，对肿瘤组织进行处理以鉴定结合到MHC分子的肽。在肿瘤细胞但不在正常细胞的表面上鉴定到的可能是突变的肽(即新抗原)、蛋白酶体剪接变体或肿瘤相关自身抗原的肽，可以优先考虑用于包括在个性化癌症疫苗中。本文公开的一个出人意料的发现是，高比例(即7个中的7个)的在质谱术确认的结合到肿瘤细胞上的MHC的基础上被选择用于包括在个性化癌症疫苗中的预测的新抗原，当作为包含肽抗原偶联物的免疫原性组合物中的肽抗原(A)递送时，引起高强度的CD8 T细胞应答，表明质谱术或基于质谱术的预测性算法可能是选择在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中用作肽抗原(A)的新抗原的可靠的筛选器。
用于包含在内的肽抗原(A)也可以在T细胞识别测定法的基础上选择。例如，人们可以使用一种测定法，其中将包含预测的新抗原或肿瘤相关自身抗原的合成的肽(或在原位生产所述肽的表达系统)添加到从对象的血液、肿瘤组织或其他组织衍生的T细胞的体外培养物。给定肽的T细胞识别可以例如通过ELISpot测定法或通过流式细胞术来评估。在体外T细胞测定法中识别的抗原可以优先考虑作为肽抗原(A)用于包括在由肽抗原偶联物构成的个性化疫苗中。
最后，肽抗原(A)可以在许多预测性算法的基础上选择。可以使用在大的数据集上训练的预测性算法的基础上被预测为是免疫原性或有效的肽抗原(A)。此外，预测性算法可用于选择肽新抗原，其被预测引起对突变的表位但不对野生型表位特异的T细胞应答，即对自身抗原来说不是交叉反应性的T细胞。
可以使用上述方法的任何组合来鉴定和选择在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中使用的包含新抗原或肿瘤相关自身抗原等的肽抗原(A)。
用于个性化癌症疫苗的肽抗原(A)的长度及其对CD8和CD4 T细胞应答的诱导的影响
引起非同义氨基酸替换的单核苷酸多态性可以出现在结合到I类MHC的通常长度为8-13个氨基酸的肽表位中的任何位置中。因此，为了覆盖可能结合给定I类MHC的所有可能的表位，在个性化癌症疫苗中使用的包含新抗原的肽抗原(A)可以在所述非同义突变的任一侧上包括12个氨基酸，产生长度为25个氨基酸的肽，并且所述突变的氨基酸作为中间(第13个)残基。或者，肽抗原(A)可以仅包括被预测结合到I类MHC的最小表位(长度为8–13个氨基酸)。或者，个性化癌症疫苗可以含有包含所述25个氨基酸的新抗原的肽抗原(A)和仅包含新抗原的所述预测的最小表位的肽抗原(A)两者。
II类MHC的肽结合口袋通常结合12–16个氨基酸的肽，并且在某些情况下多达20或更多个氨基酸的肽。因此，由仅含有预测的结合I类MHC的最小表位(其通常长度为8-13个氨基酸)的肽抗原(A)构成的个性化癌症疫苗不太可能诱导CD4 T细胞应答。然而，含有25个氨基酸(或“25-mer”)的肽抗原(A)的癌症疫苗可能但不总是诱导靶向给定突变的CD4 T细胞应答。
在癌症疫苗中，25个氨基酸(或“25mer”)的肽抗原(A)与包含精确的～7至12个氨基酸的最小表位的肽抗原(A)相比可能诱导更低水平的CD8 T细胞应答，这可能是由于不同长度的肽抗原的加工和呈递的效率的差异。因此，包括在癌症疫苗中的25个氨基酸的肽抗原(A)可能引起与由包含最小表位的肽抗原(A)诱导的应答相比更低强度的CD8 T细胞应答。因此，在某些实施方式中，包括在由肽抗原偶联物构成的癌症疫苗中的25个氨基酸的肽抗原(A)不引起可检测的CD8 T细胞应答，而包含精确的最小表位的7至12个氨基酸的肽抗原(A)引起可检测的CD8 T细胞应答。在另外的实施方式中，包括在由肽抗原偶联物构成的癌症疫苗中的25个氨基酸的肽抗原(A)引起可检测的CD4 T细胞应答，包含精确的最小表位的7至12个氨基酸的肽抗原(A)不引起可检测的CD4 T细胞应答。基于这些出人意料的发现，在某些实施方式中，包含相同表位的两种长度的肽抗原(A)即最小CD8 T细胞表位(被称为“Min”或最小表位(ME))和所述25个氨基酸的肽(被称为合成的长肽(SLP)或长肽)两者，可以作为肽抗原(A)被包括在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中。在某些实施方式中，由最小CD4和CD8 T细胞表位构成的肽抗原(A)被包括在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中。在其他实施方式中，由最小CD8 T细胞构成的肽抗原(A)和包含通用CD4 T细胞表位肽的抗原(A)和任选地由最小CD4 T细胞表位构成的肽抗原(A)，被包括在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中。在优选实施方式中，包括在由肽抗原偶联物构成的个性化疫苗中的肽抗原(A)为7至35个氨基酸，通常为15至35个氨基酸，例如25个氨基酸。
组合免疫疗法
本文公开的肽抗原偶联物可用于免疫原性组合物中以治疗肿瘤或传染病。所述肽抗原偶联物可以单独地或与其他疗法相组合使用。对于癌症治疗来说，由肽抗原偶联物构成的免疫原性组合物可以在任何形式的治疗例如手术、放疗或化疗之前、期间或之后使用。在优选实施方式中，所述包含肽抗原偶联物的免疫原性组合物与免疫调节剂相组合使用，所述免疫调节剂例如细胞因子(例如IL-2)、抗肿瘤抗体、检查点抑制剂(例如抗PD1)抗体或逆转免疫抑制、直接杀死肿瘤细胞或增强针对肿瘤的免疫应答的其他小分子或生物制剂。在优选实施方式中，将基于肽抗原偶联物的癌症疫苗与检查点抑制剂(例如抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体)相组合提供给带有肿瘤的对象。在优选实施方式中，所述癌症疫苗例如个性化癌症疫苗在所述检查点抑制剂的施用之前提供给对象。本文公开的肽抗原偶联物也可用于异源初免-加强免疫接种，例如用肽抗原偶联物初免或加强并用异源疫苗例如病毒载体初免或加强。
组合物剂型
本文公开的由肽抗原偶联物构成的免疫原性组合物可以被配制成药物组合物，其被制备用于施用到对象，并包括治疗有效量的一种或多种本文中所描述的免疫原。所公开的化合物的治疗有效量取决于施用途径、对象的物种和待治疗的对象的身体特征。可以考虑在内的具体因素包括疾病严重性和阶段、体重、饮食和同时使用的药物。这些因素与确定本公开的化合物的治疗有效量的关系，被本领域技术人员了解。
用于施用到对象的免疫原性组合物可以是药物组合物，并且除了所选分子之外，可以包括至少一种其他可药用添加剂，例如载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。免疫原性组合物也可包括一种或多种其他活性成分，例如抗微生物剂、麻醉剂等。可用于这些剂型的可药用载体是常规的。《Remington制药学》(Remington’sPharmaceutical Sciences)，E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA，第19版(1995)，描述了适合于本文公开的化合物的药物递送的组合物和剂型。
总的来说，所述载体的本质取决于所使用的具体施用方式。例如，肠胃外剂型通常含有可注射流体，其包括制药上和生理上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为介质。除了生物学中性载体之外，待施用的药物组合物还可以含有少量无毒性辅助物质，例如润湿或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨糖醇单月桂酸酯。
为了配制所述免疫原性组合物，可以将本公开的纳米粒子组分或含有本公开的纳米粒子组分的溶液与各种不同的可药用添加剂以及用于分散所述纳米粒子的基料或介质合并。理想的添加剂包括不限于pH控制剂例如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸等。此外，可以包括局部麻醉剂(例如苯甲醇)、等渗剂(例如氯化钠、甘露糖醇、山梨糖醇)、吸附抑制剂(例如,Tween 80或Miglyol 812)、溶解增强剂(例如环糊精及其衍生物)、稳定剂(例如血清白蛋白)和还原剂(例如谷胱甘肽)。佐剂例如氢氧化铝(例如Amphogel，WyethLaboratories,Madison,NJ)、弗氏佐剂、MPLTM(3-O-脱酰基单磷酰脂质A；Corixa,Hamilton,IN)和IL-12(Genetics Institute,Cambridge,MA)以及许多其他本领域中公知的适合佐剂，可以包括在所述组合物中。当所述组合物是液体时，参考被当作单位的0.9％(w/v)生理盐水溶液的渗涨度(tonicity)所测量的所述制剂的渗涨度，通常被调整为在施用位点处不引起实质性的不可逆的组织损伤的值。通常，所述溶液的渗涨度被调整到约0.3至约3.0、例如约0.5至约2.0或约0.8至约1.7的值。
本公开的免疫原性组合物通常是无菌的，并且在制造、储存和使用条件下稳定。无菌溶液可以通过将所述化合物以所需的量与根据需求的本文中列举的成分中的一者或其组合一起并入到适合的溶剂中，然后进行过滤除菌来制备。通常，分散系通过将所述化合物和/或其他生物活性药剂并入到含有基础分散介质和所需的来自于本文中所列举的其他成分的无菌媒剂中来制备。在无菌粉剂的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其从之前无菌过滤的溶液产生化合物加上任何其他所需成分的粉剂。阻止微生物的作用，可以通过各种不同的抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。
本公开还包括药剂盒、包装和多容器单位，其含有本文中描述的免疫原性组合物、活性成分和/或用于它们的施用的工具，以用于在哺乳动物对象中预防和治疗疾病和其他病症。在一个实施方式中，这些药剂盒包括含有本文中描述的一种或多种免疫原性组合物的容器或制剂。在一个实例中，将所述免疫原性组合物配制成用于递送到对象的药物制剂。所述免疫原性组合物被任选地包含在批量分发容器或单位或多单位剂型中。可以提供任选的分发工具，例如肺部或鼻内喷雾施药器。包装材料任选地包括标签或使用说明，指示了与其一起包装的药剂可用于的治疗目的和/或使用方式。
诱导免疫应答的方法
包括本文中所描述的肽抗原(A)的免疫原性组合物可用于在对象中引发针对所述肽抗原(A)的免疫应答。可以从本公开的方法获益的对象包括人类和兽医学对象。
在某些实施方式中，由于例如暴露于或可能暴露于包含所述肽抗原的传染因子而患有由所述传染因子引起的感染或具有发生所述感染的风险的对象，被选择用于治疗。在施用治疗有效量的本公开的免疫原性组合物后，可以监测所述对象的所述感染、与所述感染相关的症状或两者。
在某些实施方式中，患有癌症例如恶性肿瘤或具有发生癌症的风险的对象，被选择用于治疗。在施用治疗有效量的本公开的免疫原后，可以监测所述对象的所述癌症的存在、肿瘤负荷的降低、所述癌症的任何适合的症状或其组合。
打算使用本公开的治疗剂和方法治疗的典型对象包括人类以及非人类灵长动物和其他动物。为了鉴定按照本公开的方法预防或治疗的对象，使用公认的筛查方法来确定与目标或怀疑的疾病或病症相关的风险因子，或确定对象中现有的疾病或病症的状态。这些筛查方法包括例如用于确定可能与所述目标或怀疑的疾病或病症相关的环境、家族、职业和其他这类风险因子的常规诊断检查，以及在本领域中可以获得并且公知用于检测和/或表征所述疾病或病症的诊断方法例如各种不同的ELISA和其他免疫测定方法。这些和其他常规方法允许临床医生选择需要使用本公开的方法和药物组合物的疗法的患者。根据这些方法和原则，可以将组合物按照本文中的教示或本领域普通技术人员已知的其他常规方法施用，作为独立的预防或治疗程序，或作为其他治疗的后随、辅助或配合治疗方式。
治疗有效量的包括本文中公开的肽抗原的免疫原性组合物的施用，可用于预防或治疗性目的。当预防性提供时，所述免疫原性组合物在任何症状之前，例如在感染或肿瘤发生之前提供。所述免疫原性组合物的预防性施用用于阻止或改善所述疾病或症状的后续发展。因此，在某些实施方式中，所述方法包括选择具有发生感染或发展出肿瘤的风险的对象，并施用治疗有效量的本公开的免疫原性组合物。因此，所述免疫原性组合物可以在预期暴露于传染因子或发生所述肿瘤之前提供，以便减弱感染或肿瘤和/或任何相关的疾病症状的预期的严重性、持续时间或程度。
当治疗性提供时，本公开的免疫原性组合物可以在疾病或病症的症状发作之时或之后提供，例如在感染的症状发生或感染的诊断或肿瘤的症状发生或肿瘤的诊断之后。所述感染或肿瘤的治疗可以包括在所述对象中延迟和/或减轻所述感染或肿瘤的征兆或症状。在某些实例中，使用本文公开的方法的治疗延长了所述对象的存活时间。
所述免疫原性组合物可以在配合免疫接种方案或组合制剂中使用。
在某些实施方式中，治疗有效量的本公开的免疫原性组合物可以被施用于对象，以在对象中治疗或抑制传染性因子。传染性因子是可以感染对象的因子，包括但不限于病毒、细菌和真菌。可以选择患有、怀疑患有所述传染性因子的感染或具有发生所述感染的风险的对象用于治疗。在某些实施方式中，所述传染性因子是如上所述的病毒、细菌或真菌，并且所述肽抗原包括来自于特定病毒、细菌或真菌的抗原。
在某些实施方式中，治疗有效量的本公开的免疫原性组合物可以被施用于对象，以在对象中治疗或预防肿瘤和/或癌症。可以选择患有、怀疑患有肿瘤和/或癌症或具有发生所述肿瘤和/或癌症的风险的对象用于治疗。在某些实施方式中，在所述对象中治疗所述肿瘤和/或癌症减少了所述肿瘤的生长和/或增殖。所述肿瘤可以是任何感兴趣的肿瘤，并且可以是良性或恶性的。
所述肿瘤的治疗通常在所述肿瘤诊断后或在前兆病症(例如异型增生或良性肿瘤的发生)开始之后开始。治疗可以在癌症的早期阶段开始，例如可以在对象表现出病症的症状之前，例如在I期诊断期间或在异型增生被诊断之时开始。然而，治疗可以在所述疾病的任何阶段例如但不限于I期、II期、III期或IV期癌症期间开始。在某些实例中，治疗被施用于这些具有可以转变成恶性或甚至转移肿瘤的良性肿瘤的对象。
在病症例如恶性癌症发生之后开始的治疗，可以导致降低所述病症中的一者的症状的严重性，或完全消除所述症状，或减少转移、肿瘤体积或肿瘤数目。在某些实例中，所述肿瘤在治疗之后变得不可检测。在本公开的一种情况下，肿瘤例如转移肿瘤的形成被延迟、阻止或减少。在另一种情况下，所述原发肿瘤的尺寸被减小。在另一种情况下，所述肿瘤的症状被减轻。在另一种情况下，肿瘤体积被减小。
在开始本公开的疗法之前可以筛查对象，以例如确定所述对象是否具有肿瘤。肿瘤的存在可以通过本领域中已知的方法确定，并且通常包括细胞学和形态学评估。所述肿瘤可以是已建立的肿瘤。所述细胞可以是体内或离体的，包括从活检组织获得的细胞。肿瘤的存在表明所述肿瘤可以使用本文中提供的方法来治疗。
所述治疗有效量取决于所述疾病的严重性和患者的健康总体状态。治疗有效量是提供症状的主观缓解或临床医生或其他有资格的观察者注意到的客观可鉴定的改善的量。在一个实施方式中，治疗有效量是抑制肿瘤生长所必需的量，或者是有效减轻所述肿瘤的征兆或症状的量。在另一个实施方式中，治疗有效量是抑制由传染性因子引起的感染所必需的量，或者是有效减轻所述感染的征兆或症状的量。所施用的药剂的治疗有效量可以随着所需效果和待治疗的对象而变。在某些实例中，治疗量是在所述对象中消除或减少所述患者的肿瘤负荷或阻止或减少转移细胞的增殖或减少传染性因子的载量的量。
所述免疫原性组合物的实际剂量随着多种因素而变，例如所述对象的疾病指征和具体状态(例如对象的年龄、体型、身体素质、症状的程度、易感性因子等)、施用的时间和途径、同时施用的其他药物或治疗，以及用于在所述对象中引发所需活性或生物应答的所述化合物的具体药理学。给药方案可以被调整，以提供最适预防或治疗响应。治疗有效量也是其中所述化合物和/或其他生物活性药剂的任何有毒或有害副作用在临床方面被治疗有益效果超越的量。
剂量可以由主治临床医生改变，以在靶位点(例如肺或系统循环)处维持所需浓度。更高或更低的浓度可以根据递送方式来选择，例如经表皮、直肠、口、肺、骨内或鼻内递送相比于静脉内或皮下或肌肉内递送。剂量也可以在所施用的制剂的释放速率的基础上选择，例如肺内喷剂相比于粉剂，持续释放口服剂相比于注射的颗粒剂或透皮递送制剂等。
任何施用方法可用于本公开的治疗剂，包括局部和系统施用。例如，可以使用局部、口服、血管内例如静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内、真皮内、鞘内和皮下施用。具体的施用方式和剂量方案由主治临床医生考虑到所述病例的细节(例如对象、疾病、涉及的疾病状态和治疗是否是预防性的)来选择。在施用超过一种药剂或组合物的情况下，可以使用一种或多种施用途径。
本公开的治疗剂可以被配制成适合于精确剂量的单独施用的单位剂量形式。此外，本公开的治疗剂可以在单剂中或多剂计划中施用。多剂计划是其中治疗的主要过程可能使用超过一剂分开的药剂例如1-10剂药剂，然后其他药剂根据需要在随后的时间间期提供，以维持或加强所述组合物的作用的计划。治疗可以包括在几天至数月或甚至数年的时间段内每日或每日多次给药化合物。因此，剂量方案也将至少部分在待治疗的对象的具体需要的基础上确定，并且将依赖于施用从业人员的判断。
实施例
化合物1
Figure BDA0002263670070001511
化合物1，1-(4-氨基丁基)-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺，被称为2B，按照图3中示出的方案来合成。
1-c.从2,4-喹啉二醇开始，如以前所述制备中间体1-b(Lynn GM等，NatBiotechnol 33(11):1201-1210,2015)。在剧烈搅拌下向210mL三乙胺(TEA)中的21g 1-b(87.8mmol，1eq)(10％w/w)添加16.34g(87.8mmol，1eq)N-boc-1,4-丁二胺。将所述反应混合物加热至70℃并通过HPLC监测，其在2小时后确认反应完成。在真空下除去三乙胺并将得到的油状物溶解在200mL二氯甲烷中，然后用3x100 mL DI H2O洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，然后在真空下除去，并将得到的油状物用1:1(v:v)己烷和二乙醚研磨，得到30.7g中间体1-c的黄色晶体。MS(APCI)对于C18H23ClN4O4的计算值为m/z 394.1，实测值为394.9。
1-d.在用氩气鼓泡的Parr反应器容器中将30.7g(76.4mmol)中间体1-c溶解在300mL乙酸乙酯中，然后添加3g 10％碳载钯。将所述反应容器保持在氩气下，然后排空并用H2(g)加压几次，然后在剧烈振摇的同时加压至55PSI H2(g)。连续添加H2(g)直至压力稳定在55PSI，此时确定所述反应完成。然后将来自于Parr反应器的反应混合物通过硅藻土过滤并蒸发至干，以获得黄色油状物，将其用1:1己烷/乙醚研磨，得到白色晶体，将其通过过滤收集，获得27.4g 1-d的光谱纯的白色晶体。MS(APCI)对于C18H25ClN4O2的计算值为m/z364.2，实测值为365.2。
1-e.向50mL THF中的10g(27.4mmol，1eq)1-d添加7.7mL三乙胺(54.8mmol，2eq)，然后在剧烈搅拌的同时逐滴添加30mL THF中的3.6g正戊酰氯(30.1mmol，1.1eq)，同时将所述反应混合物置于冰上。90分钟后，撤去冰浴并在真空下除去THF，得到黄色油状物，将其溶解在100mL二氯甲烷(DCM)中，用3x50 mL的pH 5.5 100mM乙酸盐缓冲液洗涤。在真空下除去所述DCM，得到油状物，将其用乙酸乙酯研磨，得到10.4g白色固体，将其溶解在含有1g CaO(s)的甲醇中，在剧烈搅拌下在100℃加热5小时。将所述反应混合物过滤并干燥，得到10.2g灰白色固体，即中间体1-e。MS(ESI)对于C23H31ClN4O2的计算值为m/z 430.21，实测值为431.2。
1-f.向10.2g(23.7mmol，1eq)1-e添加30.4g(284mmol，12eq)苯甲胺液体，将其在剧烈搅拌的同时加热至110℃。所述反应在10小时后完成，并将反应混合物添加到200mL乙酸乙酯，用4x100 mL 1M HCl洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，然后在真空下除去，将得到的油状物从乙酸乙酯重结晶，得到10.8g中间体1-f的光谱纯的白色晶体。MS(ESI)对于C30H39N5O2的计算值为m/z 501.31，实测值为502.3。
化合物1.将10.8g(21.5mmol)1-f溶解在54mL浓(>98％)H2SO4中，并将所述反应混合物剧烈搅拌3小时。3小时后，在剧烈搅拌的同时将粘稠的红色反应混合物缓慢添加到500mL DI H2O。将所述反应混合物搅拌30分钟，然后通过硅藻土过滤，添加10M NaOH直至所述溶液的pH为～pH 10。然后将水性层用6x200 mL DCM萃取，并将得到的有机层用Na2SO4干燥并在真空下缩减，得到光谱纯的白色固体。1H NMR(400MHZ,DMSO-d6)δ8.03(d,J＝8.1HZ,1H),7.59(d,J＝8.1Hz,1H),7.41(t,J＝7.41Hz,1H),7.25(t,J＝7.4Hz,1H),6.47(s,2H),4.49(t,J＝7.4Hz,2H),2.91(t,J＝7.78Hz,2H),2.57(t,J＝6.64Hz,1H),1.80(m,4H),1.46(sep,J＝7.75Hz,4H),0.96(t,J＝7.4Hz,3H)。MS(ESI)对于C18H25N5的计算值为m/z 311.21，实测值为312.3。
化合物2
化合物2，1-(4-(氨基甲基)苯甲基)-2-丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺，被称为2BXy，在以前被描述过(参见：Lynn GM等，增强疫苗免疫原性的聚合物连接的TLR激动剂的物理化学性质的体内表征(In vivo characterization of the physicochemicalproperties of polymer-linked TLR agonists that enhance vaccineimmunogenicity)，Nat Biotechnol33(11):1201-1210,2015，和Shukla NM等，作为Toll样受体7的探针的荧光咪唑并喹啉偶联物的合成(Syntheses of fluorescentimidazoquinoline conjugates as probes of Toll-like receptor 7)，Bioorg MedChem Lett 20(22):6384-6386,2010)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.77(dd,J＝8.4,1.4Hz,1H),7.55(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),7.35–7.28(m,1H),7.25(d,J＝7.9Hz,2H),7.06–6.98(m,1H),6.94(d,J＝7.9Hz,2H),6.50(s,2H),5.81(s,2H),3.64(s,2H),2.92–2.84(m,2H),2.15(s,2H),1.71(q,J＝7.5Hz,2H),1.36(q,J＝7.4Hz,2H),0.85(t,J＝7.4Hz,3H)。MS(APCI)对于C22H25N5的计算值为m/z 359.2，实测值为360.3。
化合物3
化合物3，被称为DBCO-2BXy3、2BXy3或DBCO-(Glu(2BXy)3)，从通过固相肽合成制备的Fmoc-(Glu)3-NH2前体开始合成。在室温下，在环境空气下，在剧烈搅拌的同时向3.25mLDMSO添加50mg Fmoc-(Glu)3-NH2(0.08mmol，1eq)、143mg化合物2(0.40mmol，5eq)、84mg 2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)(0.48mmol，6eq)和48.5mg 4-甲基吗啉(NMM)(0.48mmol，6eq)。反应进程通过HPLC监测(AUC 254nm)。在30分钟后添加另外1当量化合物2和另外2当量的CDMT和NMM两者。2小时后，反应完成，并将所述反应混合物添加到50mL 1MHCl溶液，以沉淀Fmoc保护的中间体，其通过在4℃下将所述溶液以3000g离心10分钟来收集。舍弃HCl溶液，所述Fmoc保护的中间体作为白色固体沉积物收集。将所述白色固体重悬浮在50mL 1M HCl溶液中，在4℃下以3000g离心5分钟；舍弃所述1M HCl溶液，并收集作为固体沉积物的产物。将这个过程重复，然后收集固体并在真空下干燥，以定量得率得到156.1mg Fmoc保护的中间体。然后将所述Fmoc保护的产物添加到1.5mL含20％哌啶的DMF溶液，在室温下30分钟以得到去保护的产物，然后将其从50mL乙醚沉淀，并在4℃下以3000g离心30分钟。收集作为固体沉积物的产物，然后用乙醚再洗涤两次，然后在真空下干燥，得到126.4mg中间体。然后将60mg得到的中间体NH2-(Glu-2BXy)3-NH2(0.042mmol，1eq)与18.6mg(0.046mmol，1.1eq)DBCO-NHS酯(Scottsdale,Arizona,USA)和8.5uL三乙胺(0.084mmol，2eq)在1mL DMSO中在室温下反应6小时。得到的产物化合物3在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内30-70％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在7.0分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到40.12mg(55.7％得率)光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C100H106N20O8的计算值为m/z 1714.85，实测值为858.9(M/2)+。
化合物4
Figure BDA0002263670070001551
化合物4，被称为DBCO-2BXy5,2BXy5或DBCO-(Glu(2BXy)5)，使用与为化合物3所描述的相同的程序来合成，区别在于将Fmoc-(Glu)5-NH2用作用于偶联化合物2的起始原料。化合物4在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内38-48％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在8.0分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到45.9mg(63.4％得率)光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C154H166N32O12的计算值为m/z 2655.34，实测值为886.6(M/3)+。
化合物5
Figure BDA0002263670070001561
化合物5，被称为DBCO-2B5、2B5或DBCO-(Glu(2B)5)，使用与为化合物3所描述的相同的程序来合成，区别在于使用Fmoc-(Glu)5-NH2作为起始原料用于偶联化合物1。化合物5在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内33-45％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在～10.0分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到25.2mg(62.6％得率)光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C134H166N32O12的计算值为m/z 2415.34，实测值为1209.3(M/2)+。
化合物6
Figure BDA0002263670070001571
化合物6，被称为DBCO-2B3W2、2B3W2或DBCO-(Glu(2B)3(Trp)2)，使用与为化合物3所描述的相同的程序来合成，区别在于使用Fmoc-Glu-Trp-Glu-Trp-Glu-NH2作为起始原料用于偶联化合物1。化合物6在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内33-47％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在～8分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到197mg(50.6％得率)光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C110H126N24O10的计算值为m/z 1943.01，实测值为973.0(M/2)+。
化合物7
Figure BDA0002263670070001581
化合物7，被称为DBCO-2B2W3,2B2W3或DBCO-(Glu(2B)2(Trp)3)，使用与为化合物3所描述的相同的程序来合成，区别在于使用Fmoc-Trp-Glu-Trp-Glu-Trp-NH2作为起始原料用于偶联化合物1。化合物7在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内35-65％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在～9分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到11.6mg(62.5％得率)光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C98H106N20O9的计算值为m/z 1706.85，实测值为854.9(M/2)+。
化合物8
Figure BDA0002263670070001582
化合物8，被称为DBCO-2B2W8、2B2W8或DBCO-(Glu(2B)2(Trp)8)，使用与为化合物3所描述的相同的程序来合成，区别在于使用Fmoc-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2作为起始原料用于偶联化合物1。化合物8在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内35-85％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在～8.0分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到3.3mg(16.3％得率)光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C153H156N30O14的计算值为m/z 2637.24，实测值为1320.2(M/2)+。
化合物9
化合物9，被称为DBCO-2B1W4、2B1W4或DBCO-(Glu(2B)1(Trp)4)，使用与为化合物3所描述的相同的程序来合成，区别在于使用Fmoc-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2作为起始原料用于偶联化合物1。化合物9在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内50-55％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在8.9分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到9.7mg(55.4％得率)光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C86H86N16O8的计算值为m/z 1470.68，实测值为736.6(M/2)+。
化合物10
化合物10，被称为DBCO-W3、W3或DBCO-(Trp)3，通过将50.2mg(0.08mmol，1eq)通过固相肽合成制备的三肽前体NH2-(Trp)3-NH2与35mg DBCO-NHS(0.096mmol，1.1eq)和44mg三乙胺(0.44mmol，5eq)在1.5mL DMSO中进行反应来合成。化合物10在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内30-95％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在～9分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到31.2mg(41.5％得率)光谱纯(在254nm下>95％AUC)的产物。
化合物11
Figure BDA0002263670070001602
化合物11，被称为DBCO-W5、W5或DBCO-(Trp)5，使用与用于化合物10的相同的程序来合成，区别在于使用NH2-(Trp)5-NH2(SEQ ID NO：70)作为用于偶联到DBCO-NHS的肽前体。化合物11在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内30-95％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在～10分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到28.7mg(44.1％得率)光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C74H66N12O7的计算值为m/z 1234.52，实测值为1235.6(M+H)+。
化合物12
Figure BDA0002263670070001611
化合物12，被称为DBCO-2BXy3W2、2BXy3W2或DBCO-(Glu(2BXy)3(Trp)2)，使用Fmoc-Glu-Trp-Glu-Trp-Glu-NH2和化合物2作为起始原料来合成。将500mg Fmoc-Glu-Trp-Glu-Trp-Glu-NH2(0.5mmol，1eq)、595.6mg噻唑啉-2-硫醇(TT)(5mmol，10eq)和575.7mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(3mmol，6eq)悬浮在26mL DCM中。添加18.3mg 4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)(0.2mmol，0.3eq)，并将所述反应混合物在室温下搅拌。反应进程通过分析HPLC来监测。4小时后，添加另外4当量TT和2当量EDC。在搅拌过夜后，添加2当量TT和半当量EDC。6小时后，反应完成。在真空下除去DCM，并将固体转移到6mL无水DMSO中。添加539.3mg化合物2(1.5mmol，3eq)，并将所述反应混合物在室温下搅拌2小时。然后将所述偶联的中间体从300mL 1M HCl沉淀，并在4℃下以3000g离心10分钟。收集沉积物，用1M HCl再洗涤一次，并用DI水再洗涤一次。将最终收集的沉积物冷冻并在真空下干燥。将809.06mgFmoc-2BXy3W2-NH2(0.4mmol，1eq)溶解在4mL含有20％哌啶的DMF中。将所述反应混合物在室温搅拌1小时。然后将所述去保护的中间体从100mL乙醚沉淀，并在4℃下以3000g离心10分钟。产物作为固体沉积物收集，然后用乙醚再洗涤两次，然后在真空下干燥，得到所述中间体。将729mg NH2-2BXy3W2-NH2(0.4mmol，1eq)溶解在6mL无水DMSO中。添加488.8mg DBCO-NHS(1.2mmol，3eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌1小时。将得到的产物在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内36-46％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分合并、冷冻并冻干，给出239mg(38.1％得率)光谱纯的白色粉末。MS(ESI)对于C122H126N24O10的计算值为m/z 2087.65，实测值为697(m/3)+。
化合物13
Figure BDA0002263670070001621
化合物13，被称为DBCO-2B6W4、2B6W4或DBCO-(Glu(2B)6(Trp)4)，使用与为化合物3所描述的相同的程序来合成，区别在于使用Fmoc-(Glu-Trp-Glu-Trp-Glu)2-NH2作为起始原料用于偶联化合物1。化合物13在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内24-45％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将所述级分收集、冷冻然后冻干，获得光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C201H236N46O18的计算值为m/z 3582.4，实测值为717.7(M/5)+。
化合物14
Figure BDA0002263670070001631
化合物14，被称为DBCO-2B4W6、2B4W6或DBCO-(Glu(2B)4(Trp)6)，使用与为化合物3所描述的相同的程序来合成，区别在于使用Fmoc-(Trp-Glu-Trp-Glu-Trp)2-NH2作为起始原料用于偶联化合物1。化合物14在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内24-45％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将所述级分收集、冷冻然后冻干，获得光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C177H196N38O16的计算值为m/z 3111.7，实测值为777.5(M/4)+。
化合物15
Figure BDA0002263670070001641
化合物15，被称为DBCO-2BXy1W4、2BXy1W4或DBCO-(Glu(2BXy)1(Trp)4)，使用与为化合物3所描述的相同的程序来制备，区别在于使用Fmoc-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2作为起始原料。化合物15在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用16分钟内40-70％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，获得3.4mg(73.3％得率)光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C90H85N15O9的计算值为m/z 1519.67，实测值为760.5(M/2)+。
化合物16
Figure BDA0002263670070001642
化合物16，被称为DBCO-(GG2B)5、2B5G10或DBCO-(Glu(2B)5(Gly)10)，使用与为化合物3所描述的相同的程序来合成，区别在于使用Fmoc-(Gly-Gly-Glu)5-NH2和化合物1作为起始原料。化合物16在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用12分钟内22-42％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在7分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到22.8mg(36.2％得率)光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C154H196N42O22的计算值为m/z 2985.51，实测值为598.5(M/5)+。
化合物17
Figure BDA0002263670070001651
化合物17，被称为DBCO-(GG2BGGW)2GG2B、2B3W2G10或DBCO-(Glu(2B)3(Trp)2(Gly)10)，从通过固相肽合成制备的Fmoc-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-Glu-NH2前体和化合物1来合成。将235.4mg Fmoc-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-Glu-NH2(0.15mmol，1eq)溶解在2mL含有20％哌啶的DMF中。30分钟后，反应完成，并将产物从100mL乙醚沉淀，在4℃下以3000g离心10分钟。收集作为固体沉积物的产物，然后用乙醚再洗涤两次，然后在真空下干燥，得到～200mg去保护的中间体。将200mg(0.15mmol，1eq)NH2-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-Glu-NH2溶解在2mL无水DMSO中，添加89.73mg DBCO-NHS(0.22mmol，1.5eq)，然后添加TEA(0.22mmol，1.5eq)。将所述反应混合物在室温下搅拌1小时。将得到的DBCO中间体在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内30-50％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分合并、冷冻并冻干，以给出中间体。将25mg DBCO-(Gly-Gly-Glu-Gly-Gly-Trp)2-Gly2-Glu-NH2(0.015mmol，1eq)和17.11mg化合物1(0.055mmol，3.6eq)溶解在1.2mL无水DMSO中。添加TEA(0.183mmol，12eq)，并将反应混合物在室温搅拌5分钟。添加19.17mg HATU(0.05mmol，3.3eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌。反应的进程通过LC-MS来监测。1小时后添加另外1.2当量化合物1和1.1当量HATU。2小时后，所述反应完成。将得到的产物在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用12分钟内30-60％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分合并、冷冻并冻干，以给出光谱纯的白色粉末。MS(ESI)对于C130H156N34O20的计算值为m/z 2515.96，实测值为839(m/3)+。
化合物18
化合物18，被称为Bis(TT)，使用辛二酸和2-噻唑啉-2-硫醇(TT)作为起始原料来合成。简单来说，将500mg辛二酸(2.87mmol，1eq)、752.7mg TT(6.31mmol，2.2eq)和1.431gEDC(7.46mmol，2.6eq)溶解在17.5mL无水DMSO中。添加70.15mg DMAP(0.57mmol，0.2eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌1小时。将所述反应混合物用DCM稀释，并用1M HCl洗涤两次，用DI水洗涤一次。将有机级分用硫酸钠干燥并在减压下蒸发，以定量得率提供黄色固体。
化合物19
Figure BDA0002263670070001671
化合物19，被称为2B-TT，使用化合物18和化合物1作为起始原料来合成。简单来说，将50mg(0.16mmol，1eq)化合物1溶解在0.6mL甲醇中，并逐滴添加到301.1mg化合物18(0.8mmol，5eq)在1.93mL DCM中的剧烈搅拌的溶液。30分钟后，将所述反应混合物直接进样到柱上，并通过快速层析使用2步梯度进行纯化：5个柱体积(CV)内含有5％甲醇的DCM，然后是20CV内含有5-50％甲醇的DCM的梯度。将所述级分合并并在真空下除去溶剂。MS(ESI)对于C29H40N6O2S2的计算值为m/z 568.27，实测值为569.3(m+H)+。
化合物20
Figure BDA0002263670070001672
化合物20被称为DBCO-(2BGWGWG)5、2B5W10G15或DBCO-(Glu(2B)5(Trp)10(Gly)15)，从通过固相肽合成制备的Fmoc-(Lys-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly)5-NH2肽前体和化合物19来合成。将49.8mg(0.01mmol，1eq)Fmoc-(Lys-Gly-Trp-Gly-Trp-Gly)5-NH2溶解在0.5mL无水DMSO中。向该溶液添加0.492mL作为在无水DMSO中的40mg/mL储用溶液的化合物19(0.03mmol，2.5eq)。添加TEA(0.01mmol，1eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌4小时。使用10分钟内45-65％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度的分析HPLC显示完全转变成五取代的中间体。通过添加氨基-2-丙醇(0.03mmol，2.5eq)将反应淬灭，然后添加0.5mL含有20％哌啶的DMF，并将所述反应混合物在室温搅拌30分钟。将反应混合物添加到50mL乙醚并在4℃下以3000g离心10分钟。收集作为固体沉积物的产物，然后用乙醚再洗涤两次，然后在真空下干燥，得到去保护的中间体。将73.4mg所述去保护的中间体(0.0131mmol，1eq)溶解在0.5mL无水DMSO中，然后添加0.066mL(0.0196mmol，1.5eq)DBCO-NHS(40mg/mL)和TEA(0.0131mmol，1eq)。将所述反应在室温搅拌1小时，然后通过添加氨基-2-丙醇(0.0196mmol，1.5eq)进行淬灭。然后将产物从50mL 1M HCl沉淀并在4℃下以3000g离心10分钟。收集作为固体沉积物的产物，然后用1M HCl再洗涤一次并用DI水再洗涤一次。将最终收集的沉积物在真空下干燥，得到15.1mg(26％得率)终产物。MS(ESI)对于C319H396N72O42的计算值为m/z 5909.1，实测值为1183(m/5)+。
化合物21
Figure BDA0002263670070001691
化合物21，被称为Mal-2B3W2或Mal-(Glu(2B)3(Trp)2)，从Fmoc-(Glu)3(Trp)2-NH2和化合物1开始来合成。将100mg Fmoc-(Glu)3(Trp)2-NH2(0.1mmol 1eq)和112.1mg化合物1(0.36mmol，3.6eq)溶解在8mL无水DMF中。添加TEA(1.2mmol，12eq)，并将所述溶液在搅拌的同时用冰浴冷却5分钟。添加HATU(0.33mmol，3.3eq)，并将所述反应混合物在4℃搅拌1小时。然后将所述反应混合物添加到50mL 1M HCl，并在4℃下以3000g离心10分钟。收集作为固体沉积物的产物，然后用1M HCl再洗涤一次并用DI水再洗涤一次，给出偶联的中间体。然后将188mg Fmoc-2B3W2-NH2(0.1mmol,1eq)溶解在2mL含有20％哌啶的DMF溶液中，并在室温搅拌30分钟。将所述去保护的中间体从100mL乙醚沉淀，并在4℃下以3000g离心30分钟。收集作为固体沉积物的产物，然后用乙醚再洗涤两次，然后在真空下干燥，得到去保护的中间体。将30mg NH2-2B3W2-NH2(0.018mmol，1eq)溶解在0.3mL无水DMSO中，然后添加22mg 6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸琥珀酰亚胺基酯(SMPH)(0.058mmol，3.2eq)。将所述反应混合物在室温搅拌1小时，并将得到的产物在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内30-50％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在4.75分钟时洗脱，将得到的级分合并、冷冻并冻干，以给出23mg(66.7％得率)光谱纯的白色粉末。MS(ESI)对于C104H129N25O12的计算值为1921.33，实测值为961(m/2)+。
化合物22
Figure BDA0002263670070001701
化合物22，被称为NHS-2B3W2，通过将125ug(0.0004mmol，1eq)3-叠氮基丙酸磺基-NHS酯(Az-NHS，点击化学工具)与0.8mg(0.0004mmol，1.0eq)化合物6在无水DMSO中反应来合成。HPLC显示完全转化成NHS活化的化合物，其被立即用于带有反应性胺基的偶联肽。MS(ESI)对于C117H133N28O17S的计算值为m/z 2234，实测值为1119(m/2)+。
化合物23
Figure BDA0002263670070001702
化合物23，被称为DBCO-2BXy，通过将5.0mg(0.01mmol，1eq)DBCO-NHS与4.91mg(0.011mmol，1.1eq)化合物2在无水DMSO中反应来合成。将所述DMSO溶液溶解在乙酸乙酯中，然后用1M HCl洗涤。在真空下除去有机层，以获得～3mg光谱纯的白色固体。MS(ESI)对于C41H40N6O2的计算值为646.31，实测值为647.3(m/2)+。
化合物24
Figure BDA0002263670070001711
化合物24，被称为DBCO-WWTTWW或W4TT，使用通过固相肽合成制备的NH2-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2来制备。将32.8mg NH2-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2(0.04mmol，1eq)溶解在0.5mL无水DMSO中，并添加15.5mg(0.04mmol，1eq)DBCO-NHS，然后添加TEA(0.04mmol，1eq)。将所述反应混合物在室温搅拌1小时。将得到的DBCO中间体在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用16分钟内40-70％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分合并、冷冻并冻干。为了TT活化所述DBCO-肽，将6.1mg DBCO-Trp-Trp-Glu-Trp-Trp-NH2(0.005mmol，1eq)、0.68mg TT(0.006mmol，1.1eq)和1.26mg EDC(0.007mmol，1.3eq)溶解在0.2mL DMSO和DCM的1:1溶液中。在室温下，在剧烈搅拌的同时向所述反应混合物添加0.06mg DMAP(0.001mmol，0.1eq)。2小时后，添加另外3.3当量TT、4.0当量EDC和0.1当量DMAP，并且所述反应在总共3小时后完成。所述DBCO-WWTTWW在后续步骤中被用作中间体。
化合物25
Figure BDA0002263670070001721
化合物25，被称为DBCO-WWPIWW、WW(PI)WW或PIW4。嘧啶并吲哚-Peg4-NH2(PI-NH2、TLR-4激动剂)如以前所述来制备(Lynn GM等，增强疫苗免疫原性的聚合物连接的TLR激动剂的物理化学性质的体内表征(In vivo characterization of the physicochemicalproperties of polymer-linked TLR agonists that enhance vaccineimmunogenicity)，Nat Biotechnol 33(11):1201-1210,2015)。向3.6mg PINH2(0.005mmol，2eq)添加DMSO中的3.31mg化合物33(0.0026mmol，1eq)和TEA(0.003mmol，1.1eq)，并在室温搅拌过夜。将得到的产物在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用16分钟内45-75％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分合并、冷冻并冻干。MS(ESI)对于C103H107N17O15S的计算值为m/z1854.77，实测值为928.6(m/2)+。
化合物26
Figure BDA0002263670070001731
化合物26，被称为Pam2Cys-TT或P2C-TT，其是一种TLR-2/6激动剂，使用与化合物24相同的程序来合成，区别在于使用Fmoc-Pam2Cys-Acid作为起始原料，并且所述反应使用TLC(DCM中的1％甲醇)来监测。所述程序以定量得率产生黄色固体，其在后续反应步骤中被用作中间体。
化合物27
Figure BDA0002263670070001732
化合物27，被称为DBCO-WWPam2CysWW、WW(P2C)WW或P2C(W)4，使用化合物24、PEG2-二胺和化合物26作为起始原料来制备。首先，向含有3.31mg化合物24(0.0026mmol，1eq)的反应混合物添加1.15mg Peg2-二胺(0.008mmol，3eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌1小时。将所述反应混合物添加到15mL DI水并离心。收集沉积物，用DI水再洗涤3次并冻干。将所述中间体(DBCO-WWPeg2NH2WW)转移到0.1mL无水DMSO中，并添加作为在DCM中的100mg/mL储用溶液的2.58mg化合物26(0.0026mmol，1eq)。将所述反应混合物在室温搅拌1小时，然后在真空下除去DCM，然后添加0.2mL含有20％哌啶的DMF。将所述反应混合物在室温搅拌30分钟，然后用DCM稀释并用DI水洗涤三次。将有机层用硫酸钠干燥并蒸发。将得到的油状物溶解在DMSO中，并在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，9.4x100mm，5μm上，使用16分钟内70-100％异丙醇/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分合并并蒸发，以提供产物DBCO-WWPam2CysWW。对于化合物27的肽抗原偶联物来说，产物的分子量在MS(ESI+)的基础上确认。
化合物28
Figure BDA0002263670070001741
化合物28，被称为NH2-GK(DBCO)GW5，使用通过固相肽合成制备的Fmoc-Gly-Lys-Gly-(Trp)5-NH2和DBCO-NHS作为起始原料来合成。将50mg Fmoc-Gly-Lys-Gly-(Trp)5-NH2(0.04mmol，1eq)溶解在0.25mL无水DMSO中。添加TEA(0.04mmol，1eq)并将所述溶液在室温搅拌5分钟。添加14.24mg DBCO-NHS(0.04mmol，1eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌1小时。将所述反应用氨基-2-丙醇(0.04mmol，1eq)淬灭，并添加0.5mL含有20％哌啶的DMF。将所述反应混合物在室温搅拌30分钟。然后将所述产物从50mL乙醚沉淀，并在4℃下以3000g离心10分钟。收集作为固体沉积物的产物，然后用乙醚再洗涤两次，然后在真空下干燥。将所述产物在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内25-45％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。所述产物在9.4分钟时洗脱，并将得到的级分合并、冷冻并冻干，以获得光谱纯的灰白色固体。MS(ESI)对于C84H84N16O10的计算值为m/z1477.64，实测值为739.6(m/2)+。
化合物29
化合物29，被称为CL264-叠氮化物、羟基腺嘌呤-叠氮化物或TLR-7-叠氮化物，其是一种TLR-7激动剂，使用CL264(Invigogen,San Diego,CA,USA)和叠氮基-丙基胺作为起始原料来合成。将5mg CL264(0.012mmol，1eq)和6.1mg叠氮基-丙基胺(0.061mmol，5eq)溶解在无水DMF中。添加TEA(0.073mmol，6eq)并将所述溶液使用冰浴冷却至0℃。添加27.6mgHATU(0.073mmol，6eq)，并将反应在0℃搅拌1小时。化合物29在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内20-40％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。产物在5分钟时洗脱，并将得到的级分合并、冷冻并冻干。MS(ESI)对于C22H29N11O3的计算值为m/z495.25，实测值为496.3(m+H)+。
化合物30
Figure BDA0002263670070001761
化合物30，被称为DBCO-GK(CL264)G-W5、Cl264-(W)5或DBCO-Gly-Lys(DBCO-CL264)-Gly-(Trp)5-NH2，使用化合物28和29作为起始原料来合成。将5mg化合物28(0.0034mmol，1eq)溶解在0.25mL无水DMSO中，添加1.68mg化合物29(0.0034mmol，1eq)，并将所述反应混合物搅拌2小时，然后添加1.5mg DBCO-NHS(0.0037mmol，1.1eq)和0.5eqTEA。将所述反应混合物在室温搅拌过夜，然后将所述产物在制备型HPLC系统上，在AgilentPrep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内25-55％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。所述产物在9.4分钟时洗脱，并将得到的级分合并、冷冻和冻干，以获得光谱纯的白色固体。MS(ESI)对于C125H128N28O15的计算值为m/z 2261.01，实测值为1132.2(m/2)+。
化合物31
Figure BDA0002263670070001771
化合物31，被称为DMXAA-叠氮化物，其是一种STING激动剂，使用与化合物29相同的程序来合成，区别在于使用DMXAA(Invivogen)作为起始原料。化合物31在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内35-65％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。所述产物在6分钟时洗脱，并将得到的级分合并、冷冻和冻干，以获得光谱纯的白色固体。MS(ESI)对于C20H22N4O3的计算值为m/z 366.42，实测值为365.2。
化合物32
化合物32，被称为DBCO-GK(DMXAA)-G-W5、DMXAA-(W)5、DMXAA-W5或DBCO-Gly-Lys(DBCO-DMXAA)-Gly-(Trp)5-NH2，使用与化合物30相同的程序来合成，区别在于使用化合物31作为激动剂货物(cargo)。化合物32在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep C-18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内45-85％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。MS(ESI)对于C123H121N21O15的计算值为m/z2131.94，实测值为1067.6(m/2)+。
化合物33
化合物33，被称为NH2-GRK(DBCO)GW5、NH2-Gly-Arg-Lys(DBCO)-Gly-(Trp)5-NH2，使用与化合物28相同的程序来合成，区别在于使用通过固相肽合成生产的Fmoc-GRKGW5-NH2作为起始原料。化合物33在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep C-18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内25-55％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。所述产物在7.5分钟时洗脱，并将得到的级分合并、冷冻并冻干。MS(ESI)对于C90H96N20O11的计算值为m/z 1633.74，实测值为817.5(m/2)+。
化合物34
Figure BDA0002263670070001801
化合物34，被称为胞壁酰基叠氮化物，其是一种NOD 2激动剂，使用胞壁酰基三赖氨酸(M-TriLys,Invivogen)和叠氮基丙酸磺基NHS作为起始原料来合成。将5mg胞壁酰基三赖氨酸(0.008mmol，1eq)溶解在0.5mL含有TEA(0.02mmol，2.5eq)的无水DMSO中，并添加2.2mg叠氮基丙酸磺基NHS(0.008mmol，1eq)。将所述反应混合物在室温搅拌2小时。将所述反应混合物用氨基-2-丙醇(0.008mmol，1eq)淬灭，并将所述中间体立即用于反应。
化合物35
Figure BDA0002263670070001811
化合物35，被称为DBCO-GRK(胞壁酰基)GW5、胞壁酰基-W5或DBCO(胞壁酰基)W5，使用与化合物30相同的程序来合成，区别在于使用化合物33和34作为起始原料。化合物35在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep C-18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内35-65％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。所述产物在4.6分钟时洗脱，并将得到的级分合并、冷冻并冻干。MS(ESI)对于C137H158N30O26的计算值为m/z 2639.2，实测值为1319.5(m/2)+。
化合物36
Figure BDA0002263670070001821
化合物36，被称为NH2-GGRK(DBCO)RGGW5，使用与化合物28相同的程序来合成，区别在于使用通过固相肽合成制备的Fmoc-GGRKRGGW5-NH2作为起始原料。化合物36在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内25-45％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。所述产物在7.8分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C100H114N26O14m/z的计算值为1902.9，实测值为951.4(m/2)+。
化合物37
Figure BDA0002263670070001831
化合物37，被称为DBCO-GGRK(AMP)RGW5或DBCO(AMP)W5，使用与化合物30相同的程序来合成，区别在于使用化合物36和用叠氮基-丙酸取代的腺苷单磷酸8-(6-氨基己基)氨基腺苷5′单磷酸(Sigma-Aldrich)作为起始原料。化合物37在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep C-18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内30-60％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。所述产物在5.2分钟时洗脱，并将得到的级分合并、冷冻并冻干，以获得光谱纯的白色固体。MS(ESI)对于C138H158N37O24P的计算值为2748.2，实测值为917.5(m/3)+。
化合物38
Figure BDA0002263670070001841
化合物38，被称为NH2-GRRK(DBCO)-RGW5，使用与化合物28相同的程序来合成，区别在于使用Fmoc-GRRKRGW5-NH2作为起始原料。化合物38在制备型HPLC系统上，在AgilentPrep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内25-55％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。所述产物在5.1分钟时洗脱，并将得到的级分收集、冷冻然后冻干，得到光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C102H120N28O13的计算值为m/z 1944.96，实测值为973.4(m/2)+。
化合物39
Figure BDA0002263670070001851
化合物39，被称为NH2-GK(DBCO)[GGK(DBCO)]2GW5，使用与化合物28相同的程序来合成，区别在于使用Fmoc-GK(GGK)2GW5-NH2作为起始原料，并且使用另外3当量的TEA和DBCO-NHS。化合物39在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内45-85％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，获得作为光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末的标题化合物。MS(ESI)对于C142H146N26O20的计算值为m/z 2535.12，实测值为1269(m/2)+。
化合物40
Figure BDA0002263670070001861
化合物40，被称为NH2-[GRK(DBCO)RG]3-W5，使用与化合物39相同的程序来合成，区别在于使用NH2-[GRK(DBCO)RG]3-W5作为起始原料。化合物40在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内35-65％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，获得光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C178H218N50O26的计算值为m/z 3471.31，实测值为695.6(m/5)+。
化合物41
化合物41，被称为E10-2B3W2，使用叠氮基-(Glu)10-NH2和化合物6作为起始原料来合成。将5mg叠氮基-(Glu)10-NH2(0.0035mmol，1eq)溶解在无水DMSO中，并添加作为在无水DMSO中的40mg/mL溶液的6.77mg化合物6(0.0035mmol，1eq)。将所述反应混合物在室温搅拌过夜。化合物41在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内25-45％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，以定量得率获得11.8mg光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)计算值为m/z3377.31，实测值为1127(M/3)+。
化合物42
Figure BDA0002263670070001871
化合物42，被称为K10-2B3W2，使用与化合物41相同的程序来合成，区别在于使用叠氮基-(Lys)10-NH2作为起始原料。化合物42在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内20-40％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，以定量得率获得光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)计算值为m/z 3367.58，实测值为482(M/7)+。
化合物43
化合物43，被称为DBCO-G5-2B3W2-G5-D9或DBCO-2B3W2(D)9，使用NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)9-NH2、化合物6和DBCO-NHS作为起始原料来合成。将5mg NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)9-NH2(0.0028mmol，1eq)溶解在0.1mL无水DMSO中，并添加6.56mg化合物6(0.0034mmol，1.2eq)。将所述反应混合物在室温搅拌过夜。添加3.55mg DBCO-NHS(0.0084mmol，3eq)，然后添加TEA(0.0028mmol，1eq)。将所述反应混合物在室温搅拌2小时。化合物43在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用12分钟内30-40％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，获得3.8mg(33.7％得率)作为光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末的标题化合物。MS(ESI)计算值为m/z 4008.31，实测值为1003.3(m/4)+。
化合物44，被称为DBCO-G5-2B3W2-G5-D8或DBCO-2B3W2(D)8，使用与化合物43相同的程序来合成，区别在于使用NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)8-NH2作为起始原料。化合物44在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用12分钟内30-40％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，获得作为光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末的标题化合物。MS(ESI)计算值为m/z 3894.52，实测值为974.6(m/4)+。
化合物45，被称为DBCO-G5-2B3W2-G5-D7或DBCO-2B3W2(D)7，使用与化合物43相同的程序来合成，区别在于使用NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)7-NH2作为起始原料。化合物45在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用12分钟内29-39％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，获得作为光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末的标题化合物。MS(ESI)计算值为m/z 3779.43，实测值为945.8(m/4)+。
化合物46，被称为DBCO-G5-2B3W2-G5-D6或DBCO-2B3W2(D)6，使用与化合物43相同的程序来合成，区别在于使用NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)6-NH2作为起始原料。化合物46在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用12分钟内29-39％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，获得作为光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末的标题化合物。MS(ESI)计算值为m/z 3664.35，实测值为917.1(m/4)+。
化合物47，被称为DBCO-G5-2B3W2-G5-D5或DBCO-2B3W2(D)5，使用与化合物43相同的程序来合成，区别在于使用NH2-(Gly)5-Lys(N3)-(Gly)5-(Asp)5-NH2作为起始原料。化合物47在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用12分钟内29-41％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，获得作为光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末的标题化合物。MS(ESI)计算值为m/z 3549.26，实测值为1184.1(m/3)+。
化合物48
Figure BDA0002263670070001901
化合物48，被称为DBCO-2B3W2-R6或DBCO-2B3W2(R)6，使用与化合物43相同的程序来合成，区别在于使用NH2-Lys(N3)-(Arg)6-NH2作为起始原料。化合物48在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用12分钟内26-36％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，获得17.8mg(51.8％得率)作为光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末的标题化合物。MS(ESI)计算值为m/z3338.19，实测值为478.1(m/7)+。
化合物49
Figure BDA0002263670070001911
化合物49，被称为Myr-DBCO或C14-DBCO，从肉豆蔻酰氯和DBCO-胺来合成。将50mgDBCO-胺(0.18mmol，1eq)溶解在0.5mL DCM中。添加TEA(0.22mmol，1.2eq)，并将所述溶液在室温搅拌5分钟。添加肉豆蔻酰氯(0.16mmol，0.9eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌1小时。TLC(DCM中的2.5％甲醇)显示出rf为0.5的新斑点，为Myr-DBCO。将所述反应混合物进样到快速层析柱上，使用12CV内DCM中0-3％甲醇的梯度进行纯化。收集所述级分并干燥，以定量得率提供86mg Myr-DBCO。MS(ESI)对于C32H42N2O2的计算值为m/z 486.32，实测值为487.3(m+H)+。
化合物50
Figure BDA0002263670070001912
化合物50，被称为Val-DBCO或C5-DBCO，使用与为化合物49所描述的相同的程序来制备，区别在于使用正戊酰氯作为起始原料。Val-DBCO在制备型HPLC系统上，在AgilentPrep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用12分钟内40-60％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。将得到的级分收集、冷冻然后冻干，以定量得率获得80mg Val-DBCO，MS(ESI)对于C23H24N2O2的计算值为m/z 360.18，实测值为361.2(m+H)+。
化合物51
Figure BDA0002263670070001921
化合物51，被称为Plm-DBCO或C16-DBCO，使用与为化合物49所描述的相同的程序来制备，区别在于使用棕榈酰氯作为起始原料。化合物51通过快速层析，使用12CV内DCM中的0-3％甲醇的梯度进行纯化。收集所述级分并干燥，以定量得率提供80mg Plm-DBCO。MS(ESI)对于C34H46N2O2的计算值为m/z 514.36，实测值为515.3(m+H)+。
化合物52
Figure BDA0002263670070001922
化合物52，被称为Myr-Peg11-DBCO或C14-PEG11-DBCO，使用肉豆蔻酰氯、Boc-Peg11-胺和DBCO-NHS作为起始原料来合成。将116.06mg Boc-Peg11-胺(0.18mmol，1eq)溶解在0.5mL DCM中。添加TEA(0.22mmol，1.2eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌5分钟。添加肉豆蔻酰氯并将所述反应在室温搅拌1小时。将所述反应混合物用DCM稀释，用1M HCl洗涤两次并用DI水洗涤一次。将有机层用硫酸钠干燥并蒸发。将所述中间体溶解在0.35mL DCM中，并添加0.15mL TFA。将所述反应混合物在室温搅拌30分钟，然后通过空气吹拂进行干燥，并在高真空下进一步干燥。将122.5mg油状物(0.162mmol，1eq)溶解在0.5mL DCM中。添加TEA(0.49mmol，3eq)，并将所述溶液在室温搅拌5分钟。添加65.19mg DBCO-NHS(0.162mmol，1eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌1小时。将所述反应混合物进样到快速层析柱上，并使用15CV内DCM中的0-15％甲醇的梯度进行纯化。收集级分并干燥，以提供Myr-Peg11-DBCO。产物分子量在化合物52的肽抗原偶联物的MS(ESI+)的基础上证实。
化合物53
Figure BDA0002263670070001931
化合物53，被称为Plm-Peg11-DBCO或C16-PEG11-DBCO，使用与化合物52相同的程序来合成，区别在于使用棕榈酰氯作为起始原料。Plm-Peg11-DBCO通过快速层析，使用15CV内DCM中的0-15％甲醇的梯度进行纯化。收集级分并干燥，以提供Plm-Peg11-DBCO。产物分子量在化合物53的肽抗原偶联物的MS(ESI+)的基础上证实。
化合物54
Figure BDA0002263670070001932
化合物54，被称为NH2-Pam2Cys-DBCO，使用化合物26和DBCO-胺作为起始原料来合成。将30mg化合物26(0.03mmol，1eq)制备成在DCM中的100mg/mL储用溶液。向该储用溶液添加也作为在DCM中的100mg/mL储用溶液的8.34mg DBCO-胺(0.03mmol，1eq)。将所述反应混合物在室温搅拌1小时，然后进样到快速层析柱上并纯化。使用的梯度是DCM中0-5％甲醇的步进梯度(保持5CV，每1CV将甲醇浓度提高1％)。收集级分并干燥，以提供DBCO中间体。将26mg Fmoc-Pam2Cys-DBCO(0.023mmol，1eq)溶解在1mL含有20％哌啶的DMF中，并在室温搅拌30分钟。将所述反应混合物用DCM稀释，并用DI水洗涤三次。将有机层用硫酸钠干燥并蒸发。将固体转移到0.5mL DCM中，进样到快速层析柱上并纯化。使用的梯度是DCM中0-5％甲醇的步进梯度。收集级分并干燥，以提供NH2-Pam2Cys-DBCO。产物分子量在化合物54的肽抗原偶联物的MS(ESI+)的基础上证实。
化合物55
化合物55，被称为NH2-Pam2Cys-Peg11-DBCO，使用化合物26、Boc-Peg11-胺和DBCONHS作为起始原料来合成。将60mg化合物26(0.06mmol，1eq)溶解在0.6mL DCM中。添加38.9mg Boc-Peg11-胺(0.06mmol，1eq)并将所述反应混合物在室温搅拌30分钟。在真空下除去DCM，将油状物转移到DMSO中并添加到DI水。将所述水以3000g离心5分钟，收集沉积物并在真空下干燥。将所述PEG化的中间体溶解在0.35mL DCM中，并添加0.15mL TFA。将所述反应混合物在室温搅拌30分钟，然后用空气吹干并在高真空下进一步干燥。将71.76mg Boc去保护的油状物(0.05mmol，1eq)溶解在1mL DMSO中，添加TEA(0.1mmol，2eq)，然后添加20.3mg DBCO-NHS(0.05mmol，1eq)。将所述反应混合物在室温搅拌1小时。添加0.5mL含有20％哌啶的DMF，并将所述反应混合物在室温搅拌30分钟。将所述反应混合物用DCM稀释并用pH 9.5碳酸氢钠洗涤三次。将有机层用硫酸钠干燥并蒸发。将固体转移到0.5mL DCM中，进样到快速层析柱上并纯化。使用的梯度是30CV内DCM中的0-10％甲醇。这以6.7％的总得率提供产物。产物分子量在化合物55的肽抗原偶联物的MS(ESI+)的基础上证实。
化合物56
Figure BDA0002263670070001951
化合物56，被称为Chol-TT，使用胆甾醇琥珀酸单酯和TT作为起始原料来制备。将100mg胆甾醇琥珀酸单酯(0.21mmol，1eq)、26.94mg TT(0.23mmol，1.1eq)和51.20mg EDC(0.27mmol，1.3eq)溶解在1mL DCM中。添加2.51mg DMAP(0.02mmol，0.1eq)，并将所述反应混合物在室温下搅拌。在1小时后，将亮黄色反应混合物用DCM稀释，用1M HCl洗涤两次并用DI水洗涤一次。将有机层用硫酸钠干燥并蒸发，以定量得率给出120mg黄色固体。产物分子量在化合物56的肽抗原偶联物的MS(ESI+)的基础上证实。
化合物57
Figure BDA0002263670070001952
化合物57，被称为Chol-DBCO，从化合物56和DBCO-胺来制备。将106.28mg化合物56(0.18mmol，1eq)和50mg DBCO-胺(0.18mmol，1eq)溶解在0.5mL DCM中并在室温搅拌。在1小时过程内，所述溶液的亮黄色消褪，并且DCM中的TLC指示化合物56完全不存在。将所述反应混合物进样到快速层析柱上，并使用12CV内DCM中的0-3％甲醇的梯度进行纯化。收集级分并干燥，以定量得率提供139mg Chol-DBCO。产物分子量在化合物57的肽抗原偶联物的MS(ESI+)的基础上证实。
化合物58
化合物58，被称为Chol-Peg11-DBCO，从化合物56、Boc-Peg11-胺和DBCO-NHS来制备。将50mg化合物56(0.085mmol，1eq)溶解在0.5mL DCM中。添加60.38mg Boc-Peg11-胺(0.09mmol，1.1eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌。在1小时过程内，所述溶液的亮黄色消褪，并且DCM中的TLC指示化合物56完全不存在。向所述反应混合物添加150uL TFA，以制造在DCM中的30％溶液。将所述反应混合物在室温搅拌30分钟，然后通过用空气吹拂进行干燥，并在高真空下进一步干燥。将86.25mg油状物(0.085mmol，1eq)溶解在0.5mL DCM中。添加TEA(0.26mmol，3eq)，并将所述溶液在室温搅拌5分钟。添加34.26mg DBCO-NHS(0.085mmol，1eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌1小时。将所述反应混合物进样到快速层析柱上，并使用15CV内DCM中的0-15％甲醇的梯度进行纯化。收集级分并干燥，以提供Chol-Peg11-DBCO。
化合物59
Figure BDA0002263670070001962
化合物59，被称为LA-TT，使用乙酰丙酸和TT作为起始原料来合成。将500mg乙酰丙酸(4.3mmol，1eq)、564.7mg TT(4.7mmol，1.1eq)和1.032g of EDC(5.4mmol，1.3eq)溶解在10mL无水DMSO中。添加52.6mg DMAP(0.4mmol，0.1eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌2小时。化合物59通过在乙酸乙酯中稀释，用1M HCl洗涤两次并用DI水洗涤一次，进行后处理。将有机层用硫酸钠干燥并在真空下除去。将固体从乙酸乙酯重结晶。MS(ESI)对于C8H11NO2S2的计算值为m/z 217.02，实测值为218(M+H)+。
化合物60
Figure BDA0002263670070001971
化合物60，被称为LA-2BXy，使用化合物59和化合物2作为起始原料来合成。将50mg化合物59(0.23mmol，1eq)和82.62mg化合物2(0.23mmol，1eq)溶解在1mL DMSO中。将所述反应混合物在室温搅拌1小时。TLC(己烷中的35％乙酸乙酯)显示出两种起始原料的消失。化合物60在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内15-30％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。MS(ESI)对于C27H31N5O2的计算值为m/z457.25，实测值为458.3(M+H)+。
化合物61
Figure BDA0002263670070001981
化合物61，被称为CTA-TT，使用与化合物59相同的程序来合成，区别在于使用4-氰基-4-(硫基苯甲酰基硫基)戊酸(CTA)作为起始原料并使用DCM作为溶剂。化合物61通过在DCM中稀释，用1M HCl洗涤两次并用DI水洗涤一次，进行后处理。将有机层用硫酸钠干燥并在真空下除去。将固体从乙酸乙酯重结晶。MS(ESI)对于C16H16N2OS4的计算值为m/z 380.01，实测值为381.1(M+H)+。
化合物62
化合物62，被称为CTA-DBCO，从“CTA-NHS”(4-氰基-4-(苯基硫代羰基硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺基酯，Sigma-Aldrich)和DBCO-胺(点击化学工具)来合成。将210mg CTA-NHS(0.56mmol，1eq)和167.8mg DBCO-胺(0.61mmol，1.1eq)溶解在2mL无水DMSO中，并在室温搅拌2小时。将所述反应混合物用DCM稀释，用1M HCl洗涤两次并用DI水洗涤一次。将有机层用硫酸钠干燥并蒸发。化合物62在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内50-70％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。MS(ESI)对于C31H27N3O2S2的计算值为m/z 537.7，实测值为538.2(M+H)+。
化合物63
Figure BDA0002263670070001991
化合物63，被称为CTA-2BXY，使用与化合物60相同的程序来合成，区别在于使用化合物61和化合物2作为起始原料。化合物63在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用12分钟内40-50％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。MS(ESI)对于C35H36N6OS2的计算值为m/z 620.83，实测值为621.2(M+H)+。
化合物64
Figure BDA0002263670070001992
化合物66，被称为ACVA-TT，使用与化合物59相同的程序来合成，区别在于使用4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)作为起始原料并将TT、EDC和DMAP的当量加倍以反映出活性位点的倍增。化合物66通过在乙酸乙酯中稀释，用1M HCl洗涤两次并用DI水洗涤一次，进行后处理。将有机层用硫酸钠干燥并在真空下除去。将固体从DCM:乙醚重结晶。MS(ESI)对于C18H22N6O2S4的计算值为m/z 482.65，实测值为483.1(M+H)+。
化合物65
Figure BDA0002263670070002001
化合物65，被称为ACVA-2BXy，使用与化合物60相同的程序来合成，区别在于使用化合物64作为起始原料并且将化合物2的当量加倍以反映出活性位点的倍增。化合物65在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，50x100mm，5μm上，使用10分钟内28-48％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。MS(ESI)对于C56H62N14O2的计算值为m/z 963.21，实测值为482.4(M/2)+。
化合物66
化合物66，被称为ACVA-DBCO，使用与化合物60相同的程序来合成，区别在于使用化合物64和DBCO-胺(点击化学工具)作为起始原料。化合物66通过快速层析，使用15CV内DCM中的0-3％甲醇的梯度进行纯化。MS(ESI)为C48H44N8O4的计算值为m/z 796.93，实测值为797.3(M+H)+。
化合物67
Figure BDA0002263670070002011
化合物67，被称为Azp-2BXY，从5-叠氮基-戊酸(Azp)和化合物2来合成。将16.2mgAzp(0.114mmol，1.1eq)、12.3mg TT(0.103mmol，1eq)和27.2mg EDC(0.142mmol，1.3eq)溶解在0.5mL无水DMSO中。添加1.4mg DMAP，并将所述反应混合物在室温搅拌2小时。添加37.09mg化合物2(0.103mmol，1eq)，并将所述反应混合物在室温搅拌1小时。化合物67在制备型HPLC系统上，在Agilent Prep-C18柱，30x100mm，5μm上，使用10分钟内22-42％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度进行纯化。MS(ESI)对于C27H32N8O的计算值为m/z 484.27，实测值为485.3(M+H)+。
化合物68
Figure BDA0002263670070002021
化合物68，也被称为(HPMA-2B)-b-(HPMA)-DBCO或p{[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO。形成胶束的二嵌段共聚物(A-B型)通过两个合成步骤中的RAFT聚合，使用如以前所述制备的前体HPMA和MA-b-Ala-TT(参见：Lynn GM等，Nat Biotechnol 33(11):1201-1210,2015)以及二硫代苯甲酸2-氰基-2-丙酯(“CTA-ABIN”，Sigma Aldrich)、偶氮双异丁腈(“AIBN”，Sigma Aldrich)、化合物1和化合物66来生产。疏水嵌段A通过使用CTA-AIBN作为链转移剂并使用AIBN作为引发剂，在叔丁醇/DMSO混合物中将HPMA与MA-b-Ala-TT在70℃共聚16h来制备。疏水嵌段B随后通过RAFT机制，通过在AIBN存在下添加HPMA，在70℃下进行另外16小时的链延伸聚合。通过沉淀分离所述A-B二嵌段共聚物p{[HPMA)-co-(MA-b-TT)]-b-p(HPMA)}-DTB，以得到绿色固体。通过在DMSO中与化合物66在80℃下反应2小时，然后添加化合物1，将所述共聚物的一个末端上的DTB基团取代。将产物沉淀，然后通过LH-20纯化，以得到化合物68，然后将其用于与肽抗原的反应，得到不同类型的肽抗原偶联物，例如在下文充分描述的p{[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(肽抗原)。
化合物69
Figure BDA0002263670070002031
化合物69也被称为(HPMA-NHNH-2BXy)-b-(HPMA)-DBCO或p{[(HPMA)-co-(MA-Acap-NHN＝CH-2BXy)]-b-p(HPMA)}-DBCO。形成胶束的二嵌段共聚物(A-B型)通过两个合成步骤中的RAFT聚合，使用如以前所述制备的前体HPMA和MA-Acap-NHNH-Boc(参见：Lynn GM等，Nat Biotechnol 33(11):1201-1210,2015)以及二硫代苯甲酸2-氰基-2-丙酯(“CTA-ABIN”，Sigma Aldrich)、偶氮双异丁腈(“AIBN”，Sigma Aldrich)、化合物60和化合物66来生产。疏水嵌段A通过使用CTA-AIBN作为链转移剂并使用AIBN作为引发剂，在叔丁醇/DMSO混合物中将HPMA与MA-Acap-NHNH-Boc在70℃共聚16h来制备。疏水嵌段B随后通过RAFT机制，通过在AIBN存在下添加HPMA，在70℃下进行另外16小时的链延伸聚合。通过沉淀分离所述A-B二嵌段共聚物p{[(HPMA)-co-(MA-Acap-NHN＝CH-2BXy)]-b-p(HPMA)}-DTB，然后在30％三氟乙酸TFA/DCM中进行Boc去保护。在真空下除去TFA/DCM，然后通过在DMSO中与化合物66在80℃下反应2小时，然后添加化合物60，将所述共聚物的一个末端上的DTB基团取代。将产物沉淀，然后通过LH-20纯化，以得到化合物69，然后将其用于与肽抗原的反应，得到不同类型的肽抗原偶联物，例如在下文充分描述的p{[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(肽抗原)。
化合物70
Figure BDA0002263670070002041
化合物70也被称为(DEGMA-2B)-b-(HPMA)-DBCO或p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO。温度响应性的形成胶束的二嵌段共聚物(A-B型)通过两个合成步骤中的RAFT聚合，使用如以前所述制备的前体DEGMA、HPMA和MA-b-Ala-TT(参见：Lynn GM等，Nat Biotechnol 33(11):1201-1210,2015)以及二硫代苯甲酸2-氰基-2-丙酯(“CTA-ABIN”，Sigma Aldrich)、偶氮双异丁腈(“AIBN”，Sigma Aldrich)、化合物1和化合物66来生产。温度响应性的疏水嵌段A通过使用CTA-AIBN作为链转移剂并使用AIBN作为引发剂，在叔丁醇/DMSO混合物中将DEGMA与MA-b-Ala-TT在70℃共聚16h来制备。疏水嵌段B随后通过RAFT机制，通过在AIBN存在下添加HPMA，在70℃下进行另外16小时的链延伸聚合。通过沉淀分离所述A-B二嵌段共聚物p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DTB，以得到绿色固体。通过在DMSO中与化合物66在80℃下反应2小时，然后添加化合物1，将所述共聚物的一个末端上的DTB基团取代。将产物沉淀，然后通过LH-20纯化，以得到化合物70，然后将其用于与肽抗原的反应，得到不同类型的肽抗原偶联物，例如在下文充分描述的p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(肽抗原)。
化合物71
Figure BDA0002263670070002051
化合物71也被称为(DEGMA-2BXy)-b-(HPMA)-DBCO或p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2BXy)]-b-p(HPMA)}-DBCO，使用与化合物70相同的程序来制备，区别在于使用化合物2作为配体。将产物沉淀，然后通过LH-20纯化，以得到化合物68，然后将其用于与肽抗原的反应，得到不同类型的肽抗原偶联物，例如在下文充分描述的p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2BXy)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(肽抗原)。
化合物72
Figure BDA0002263670070002052
化合物72也被称为2BXy-DEGMA-b-HPMA-DBCO。形成胶束的二嵌段共聚物(A-B型)通过两个合成步骤中的RAFT聚合，使用前体DEGMA、HPMA、化合物63、化合物65和化合物66来生产。疏水嵌段A通过使用化合物63作为链转移剂并使用化合物65作为引发剂，在叔丁醇/DMSO混合物中将DEGMA在70℃共聚16h来制备。疏水嵌段B随后通过RAFT机制，通过在AIBN存在下添加HPMA，在70℃下进行另外16小时的链延伸聚合。通过沉淀分离所述A-B二嵌段共聚物2BXy-[p(DEGMA)-b-p(HPMA)]-DTB，并通过在DMSO中与化合物66在80℃下反应2小时，将所述共聚物的一个末端上的DTB基团取代。将产物沉淀，然后通过LH-20纯化，以得到化合物72，然后将其用于与肽抗原的反应，得到不同类型的肽抗原偶联物，例如在下文充分描述的2BXy-p[(DEGMA)-b-p(HPMA)]-DBCO-(肽抗原)。
实施例2：肽抗原片段与疏水分子(H)产生肽抗原偶联物的反应
包含肽抗原(A)、任选的带电荷分子(C)、任选的延长部(B1和/或B2)和连接物前体X1的肽抗原片段，例如[C]-[B1]-A-[B2]-X1，其中[]表示在这个实施例中所述基团是任选的，可以与连接到疏水分子(H)的X2例如X2-H反应，以提供肽抗原偶联物例如[C]-[B1]-A-[B2]-L-H。在肽抗原片段包含含有叠氮化物例如有时也被称为K’的叠氮基-赖氨酸(Lys(N3))的连接物前体X1的情况下，所述肽抗原片段可以与连接到疏水分子(H)的包含炔烃例如DBCO的连接物前体X2反应，以形成三唑连接物(L)。作为非限制性实例，化合物3至5是另外连接到式III的佐剂(即TLR-7/8a)的带有DBCO连接物前体X2的式I的疏水分子(H)的实例；化合物6至11是另外连接到式III的佐剂(即TLR-7/8a)的带有DBCO连接物前体X2的式I的疏水分子(H)的实例；并且化合物10至11是带有DBCO连接物前体X2但不含具有佐剂性质的配体的式II的疏水分子(H)的实例。
图2中示出的非限制性实例是连接到包含DBCO的连接物前体X2的疏水分子(H)的反应，其以1.1比1的摩尔比与包含带有叠氮化物的连接物前体X1的肽抗原片段反应。正如在HPLC层析图中中指明的，疏水分子(H)上的DBCO与包含叠氮化物的连接物前体X1反应，产生连接到B2延长部的三唑连接物(L)，B2连接到肽抗原(A)，A被连接到B1延长部，B1被连接到带电荷分子(C)，由此将所述肽抗原(A)与疏水分子(H)联结，以提供肽抗原偶联物。在全文中描述了通过带有叠氮化物的肽抗原片段与带有DBCO的疏水分子(H)的反应形成的不同肽抗原偶联物的数百个实例。由于在产生的所有肽抗原偶联物中所述叠氮化物与DBCO的反应是可靠且一致的，因此没有提供用于形成所述偶联物的反应以及它们的表征的全面描述。注：从环加成反应产生的肽抗原偶联物的分子量是起始原料的质量之和。
在肽抗原片段包含含有硫醇的连接物前体X1例如有时被称为C的半胱氨酸(Cys)的情况下，所述肽抗原片段可以与带有包含马来酰亚胺的连接物前体X2的疏水分子(H)例如化合物21反应，产生基于硫醚的连接物(L)。在肽抗原片段包含含有胺的连接物前体X1例如有时被称为K的赖氨酸(Lys)的情况下，所述肽抗原片段可以与带有包含活化酯的连接物前体X2例如NHS的疏水分子(H)例如化合物22反应，导致酰胺键的形成。
实施例3：式IV的肽抗原偶联物的合成和生物学表征
以前的研究报道了将T细胞表位作为～20-40个氨基酸的合成的“长”肽(SLP或LP)与各种不同的疫苗佐剂相组合递送，作为诱导CD8 T细胞应答的手段。然而，肽长度和流体力学特性以及肽与免疫刺激剂例如TLRa的共同递送对免疫原性的影响，尚未被充分研究。为了对基于肽的抗原的不同参数如何影响T细胞免疫提供更多见解，我们系统性地评估了本文中描述的式IV的肽抗原偶联物的不同性质如何影响体内CD4和CD8 T细胞应答。
肽抗原流体力学特性、肽抗原(A)长度和TLR-7/8a的共同递送对CD8T细胞应答的影响
通过推理不能明了作为本公开的肽抗原偶联物递送的肽抗原(A)的长度将如何影响免疫原性，具体来说如何影响产生的CD8和/或CD4T细胞应答的强度和质量。
为了系统性调查肽抗原(A)长度如何影响式IV的肽抗原偶联物的免疫原性，将源自于鼠类肿瘤模型MC38的两种模型新抗原CD8 T细胞表位Irgq和Cpne1作为肽抗原偶联物生产，其中所述肽抗原(A)是26个氨基酸的合成的长肽(SLP或“LP”)或10个氨基酸的最小表位(ME或“Min”)(图4)。所述基于SLP的肽抗原(A)在C-端处连接到连接物前体X1——叠氮基-赖氨酸(K’)，X1被连接到连接物前体X2——DBCO，X2被连接到疏水分子(H)的N-端；而所述最小表位肽抗原(A)被连接到C-端延长部(B2)，B2被连接到连接物前体X2——DBCO，X2被连接到疏水分子(H)的N-端，以产生在图4中概述的式IV的肽抗原偶联物。
用于合成所述肽抗原偶联物的通用方案是将1.0当量的带有反应性叠氮化物的肽抗原片段与1.2当量的带有DBCO的疏水分子(H)在DMSO中，在室温下反应。所述反应在24小时后完成，并且不需要进一步纯化。
我们首先评估了所述肽抗原(A)和肽抗原偶联物的流体力学特性(图4)。值得注意的是，发现包含Irgq和Cpne1两者的最小表位(Min)和LP的肽抗原(A)是水溶性的，高达0.1mg/mL，然而将所述肽抗原(A)附连到两种疏水分子(H)W3或2BXy3中的任一者，导致得到的肽抗原偶联物经历粒子形成，例外的是递送附连到W3的包含Cpne1的LP的肽抗原(A)的肽抗原偶联物。这些结果表明式IV的肽抗原偶联物诱导水溶性肽的粒子形成，并且增加疏水分子(H)的长度或使用更加疏水的单体(例如Glu(2BXy)相比于色氨酸)提高了粒子形成的可靠性。
因此，出人意料地发现，当式I的疏水分子(H)由连接到式III的佐剂的5个或更多个单体单元构成时，试验的大多数肽抗原偶联物形成粒子，而具有少于5个单体单元例如1或3个单体单元的式I或II的疏水分子(H)，不太可靠地诱导粒子形成。在这些数据的基础上，在肽抗原偶联物中使用的疏水分子(H)的优选实施方式包含5个或更多个单体单元，以确保高度亲水和/或带电荷的肽抗原(A)的粒子形成。尽管在某些实施方式中所述疏水分子(H)可以长度为3个或更多个单体单元例如3、4、5、6、7、8、9、10、20、30个或更多个单体单元，但通常长度最多约300个单体单元。
接下来，我们评估了肽抗原偶联物的流体力学特性以及肽抗原(A)长度和构成所述肽抗原偶联物的TLR-7/8a佐剂的共同递送如何影响体内免疫原性。将递送由26个氨基酸的长肽(LP)或10个氨基酸的最小表位(Min)构成的肽抗原(A)的肽抗原偶联物与被称为2BXy的小分子TLR-7/8a化合物2混合；连接到疏水分子(H)W3并与2BXy混合；或者将所述肽抗原(A)连接到疏水分子(H)2BXy3，其形成粒子并确保所述肽抗原(A)与TLR-7/8a佐剂的共同递送(参见图4-6)。用递送连接到疏水分子(H)2BXy3的由最小表位构成的肽抗原(A)的肽抗原偶联物免疫接种的小鼠，在单次免疫接种后提供了最高强度的CD8 T细胞应答(总细胞中>1％的IFNg+CD8 T细胞)，表明最小表位与TLR-7/8a以粒子格式的共同递送是引发CD8 T细胞应答的高效途径。值得注意的是，与TLR-7/8a混合的可溶性最小表位和可溶性LP诱导最低的CD8 T细胞应答，其与原初组相比在统计上不显著，表明可溶形式的肽抗原(A)免疫原性最低(图5和6)。最后，尽管递送连接到疏水分子(H)2BXy3的由Irgq的最小表位或Irgq的LP构成的肽抗原(A)的肽抗原偶联物提供可比强度的CD8 T细胞应答，但递送由Cpne1的最小表位构成的肽抗原(A)的肽抗原偶联物与递送作为LP的Cpne1的肽抗原偶联物相比诱导高出接近10倍的CD8 T细胞应答。
为了进一步调查肽抗原(A)长度对免疫原性的作用以促进式IV的肽抗原偶联物的CD4和CD8 T细胞免疫，将源自于鼠类肿瘤模型B16的7种预测的最小CD8 T细胞表位(即预测的新抗原)作为27个氨基酸的合成的长肽(LP)或10个氨基酸的最小表位(被称为ME或Min)，作为构成式IV的肽抗原偶联物的肽抗原(A)递送(参见图7)。所述基于LP的肽抗原(A)在C-端被直接连接到连接物前体X1叠氮基-赖氨酸(K’)，X1被连接到连接物前体X2 DBCO，X2被连接到疏水分子(H)的N-端；而最小表位肽抗原(A)被连接到C-端延长部(B2)，B2被连接到连接物前体X2 DBCO，X2被连接到疏水分子(H)的N-端，以产生图7中概述的式IV的肽抗原偶联物。所述肽抗原(A)被连接到2BXy5或2B5疏水分子(H)，以形成肽抗原偶联物。将结构相似但在对TLR-7的效能方面不同的2BXy5与2B5相比，允许评估炎性如何影响免疫原性。将小鼠用包含递送作为最小表位(Min)、LP或所述最小表位和LP两者的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的免疫原性组合物进行免疫接种。在2次免疫接种后2周，评估CD4和CD8 T细胞应答的强度(图8)。
一个引人注目且出人意料的发现是接受递送包含最小表位(“Min”)的肽抗原的肽抗原偶联物的小鼠诱导最高强度的CD8 T细胞应答，而递送包含LP的肽抗原(A)的肽抗原偶联物诱导较低水平的CD8 T细胞应答。这种趋势对于疏水分子(H)2BXy5和2B5两者来说是明显的。因此，对于递送连接到疏水分子(H)2BXy5的包含LP的肽抗原(A)的肽抗原偶联物来说，CD8 T细胞应答为～0.35％，并且CD4 T细胞应答为～0.25％(图8)。相比之下，对于接受递送连接到疏水分子2BXy5的包含最小表位的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的小鼠组来说，CD8 T细胞应答为～1.9％，并且CD4 T细胞应答为～0.1％，与递送LP的肽抗原偶联物相比提供提高约6倍的CD8 T细胞应答，但CD4T细胞应答不可检测。在接受递送包含最小表位和LP两者(“LP+min”)的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的小鼠组中，CD8 T细胞应答为～0.6％，并且CD4 T细胞应答为～0.5％，提供了CD4和CD8 T细胞两者的平衡(图8)。
对于使用2B5疏水分子(H)的肽抗原偶联物来说，观察到类似的趋势，其包括与包括2BXy的疏水分子(H)2BXy5相比效能更低的TLR-7/8激动剂2B。因此，在接受包括2B5疏水分子(H)和包含LP的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的组中，检测到的CD8 T细胞应答为～1.0％并且CD4 T细胞应答为～0.75％，而在接受递送只包含Min的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的组中，CD8 T细胞应答为～4.5％并且CD4T细胞应答为～0.1％，CD8 T细胞应答提高接近4倍但CD4 T细胞应答不可检测。在接受包含递送连接到疏水分子(H)2B5的包含最小表位和LP的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的疫苗的组中，CD8 T细胞应答为～2.2％，并且CD4 T细胞应答为～0.95％(图8)。
概括来说，使用ME(或“Min”)作为式IV的肽抗原偶联物的肽抗原(A)，与包含LP的肽抗原(A)相比，引起CD8 T细胞应答的出人意料且显著的提高。然而，这也导致CD4 T细胞应答的降低。重要的是，在施用于小鼠的免疫原性组合物中包含递送作为肽抗原(A)的LP和Min的肽抗原偶联物，导致CD4 T细胞应答的恢复和与递送只由LP构成的肽抗原(A)的肽抗原偶联物相比出人意料地更高的CD8T细胞应答。另一个关键发现是炎性的量对免疫原性具有显著影响。疏水分子(H)2B5含有TLR-7/8a化合物1，其与在疏水分子(H)2BXy5上递送的化合物2 2BXy相比效能低接近10倍。因此，包含疏水分子(H)2B5的肽抗原偶联物与使用2BXy5的肽抗原偶联物相比CD4和CD8 T细胞应答提高接近3至4倍，表明通过佐剂效能的调节来节制炎性的量，可能对本公开的肽抗原偶联物获得最佳水平的免疫原性来说是优选的。事实上，在源自于MC38鼠类肿瘤细胞系的40种不同的基于肽的新抗原的免疫原性的筛查中，基于递送连接到疏水分子(H)2B5的由最小表位构成的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的个性化癌症疫苗，与连接到疏水分子(H)2BXy5的包含最小表位的肽抗原偶联物相比，导致实现的CD8T细胞应答的广度提高6倍(图9)。
另一个出人意料的发现涉及力图鉴定将多种不同的T细胞表位作为肽抗原偶联物给药的最佳手段的研究。以前的研究表明，在相同位点处给药结合相同MHC分子的多种T细胞表位，可能竞争与APC上的MHC分子的结合，并且这可能引起向T细胞的呈递的竞争，从而与在每个免疫接种位点处作为单一表位单独递送的表位相比，降低针对一起递送的表位的T细胞应答的强度。尽管我们观察到向小鼠施用包括包含单一表位的肽抗原偶联物的免疫原性组合物与将所述同一表位与包含都结合相同MHC分子的不同表位的3种不同肽抗原偶联物在1或4个位点处共同施用相比引起针对所述表位的更高强度的T细胞应答(图10)，但出人意料的发现是在同一动物中的4个分开位点处递送同样的4个表位(即每个位点1个独特表位)，与在4个位点处一起递送所有4个表位相比引起更低的应答(图10)。这是出人意料的并且与当前范例矛盾，所述当前范例建议最好在不同位点处给药多个表位以避免表位之间的竞争，而不是将多个表位一起在多个位点处递送。这些数据建议了一种在最大化其中施用每个表位的位点数目的基础上递送多种不同表位的新的范例。因此，在诱导免疫应答的优选方法中，将包含多种不同肽抗原(A)的免疫原性组合物在多个位点处给药，以最大化免疫应答。
实施例3：式V的肽抗原偶联物
先前的数据演示了式IV的肽抗原偶联物的参数如何影响免疫原性。这些数据显示，确保肽抗原(A)与TLR-7/8a在粒子中共同递送的肽抗原偶联物是用于诱导CD8 T细胞免疫的优选实施方式。式IV的肽抗原偶联物的限制在于，由于连接到疏水分子(H)的肽抗原(A)的组成的可变性，通过这种方法形成的粒子可能具有可变的尺寸和稳定性。使由肽抗原偶联物形成的粒子稳定的一种可能的手段是引入表面电荷，其阻止粒子团集并使所述由肽抗原偶联物形成的粒子在水性介质中稳定。
式V的肽抗原偶联物通过将带电荷分子(C)附连到连接到疏水分子(H)的肽抗原(A)，允许形成具有确定尺寸的稳定的粒子(图11)。然而，直接将带电荷分子(C)和/或疏水分子(H)偶联到紧邻肽抗原(A)可能导致干扰APC的加工和呈递机制，所述APC允许在MHC-I和MHC-II的背景中呈递最小表位。因此，为了确保使用式V的肽抗原偶联物递送的基于最小表位(Min)或LP的肽抗原(A)的高效加工，我们评估了将肽抗原(A)分别在N-和C-端处连接到带电荷分子(C)和疏水分子(H)的酶可降解延长部(B1和B2)的使用(图11)。
为了评估延长部(B1和B2)对来自于式V的肽抗原偶联物的最小CD8 T细胞表位的加工的影响，我们合成了一系列肽，其中将带电荷分子(C)连接到在最小表位Cpne1的N-端处的任选的延长部(B1)，所述最小表位在C-端处连接到任选的延长部(B2)，B2被连接到连接物前体X1(Lys(N3))，并评估带电荷分子(C)和延长部(B1和/或B2)如何影响肽抗原(A)活化Cpne1特异性CD8 T细胞的体外效能。如图12中所示，肽序列在所述最小表位的N-和C-端(B1和/或B)中的任一者或两者处使用组织蛋白酶可切割延长部或合并的组织蛋白酶可切割和免疫蛋白酶体延长部来制备。将这些连接到延长部(B1和/或B2)的肽抗原(A)序列以不同浓度添加到脾细胞培养物，以评估不同构建物促进最小表位Cpne1被APC摄取和呈递的效率。
正如预期，不需要加工并且可以被直接装载到MHC-I的背景中并呈递到APC的最小表位(■，图12)是最高效的，并提供最高的体外效能(最低的EC50)。然而，不使用可降解的延长部(B1)而将带电荷分子(C)(Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys SEQ ID NO：71)直接添加到最小表位的N-端
Figure BDA0002263670070002131
导致与单独使用最小表位相比效能降低接近10,000倍。值得注意的是，简单地通过在带电荷分子(C)与最小表位之间放置酶可降解的四肽延长部(B1)(即Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO：7)，最小表位的活性得以恢复(六边形，图12)。将另外的组织蛋白酶可切割延长部(B2)放置在C-端(即Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO：7)或将免疫蛋白酶体可降解的序列与所述组织蛋白酶可切割延长部合并在N-端(B1)(Ser-Leu-Val-Arg-Tyr-Leu-Leu-Leu SEQ ID NO：72)或C-端(B2)(Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO：13)，与在带电荷分子(C)与最小表位肽抗原(A)之间使用单一四肽延长部(B1)相比，对效能具有极小的额外影响。
接下来的研究力图使用其中疏水分子(H)是2BXy3的式V的肽抗原偶联物来评估酶可降解延长部(B1和B2)对体内抗原交叉呈递的效率的影响。
用于合成式V的肽抗原偶联物的通用方案是将1.0当量的带有反应性叠氮化物的肽抗原与1.2当量的带有DBCO的疏水分子(H)在DMSO中，在室温下反应。所述反应在24小时后完成并且不需进一步纯化。
如图13中所示，在最小表位Cpne1的N-和C-端处(B1和B2)使用酶可降解延长部的不同组合，合成了具有不同带电荷分子(C)(例如Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser SEQ ID NO：73、Glu-Ser-Glu-Ser-Glu-Ser SEQ ID NO：74和Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys SEQ ID NO：71)的肽抗原偶联物。在第0和14天将小鼠用图13中报告的不同免疫原性组合物疫苗接种，并在第10(图14A)和28天(图14B)从全血评估T细胞应答。与来自于图12的体外数据相一致，不使用B1延长部，在最小表位的N-端处放置三种带电荷分子(C)中的任一者，在评估用单次免疫接种初免的动物的全血中的应答后，引起CD8 T细胞应答的完全废除(总CD8+T细胞中～0.1％IFN-γ+)(图14)。然而，在带电荷分子(C)与由最小表位构成的肽抗原(A)的N-端之间放置组织蛋白酶可切割延长部(B1)，在使用带正电荷分子(C)(Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser SEQ ID NO：73)时导致肽抗原偶联物的CD8T细胞应答提高接近10倍，并且在使用ES和EK带电荷分子(C)时导致肽抗原偶联物的CD8 T细胞应答的温和提高(图14)。在用包含带正电荷分子(C)(Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser SEQ ID NO：73)的肽抗原偶联物疫苗接种的组中，N-端和C-端组织蛋白酶可切割延长部(B1和B2)两者的添加在单次免疫接种后产生约3.5％的CD8 T细胞应答，而在组织蛋白酶可切割序列之外在B1和/或B2处添加免疫蛋白酶体序列，仅仅导致CD8 T细胞应答强度的温和的进一步提高(图14)。对于使用所有3套带电荷分子(C)的肽抗原偶联物来说，在2次免疫接种后的数据中，趋势是一致的：在带电荷分子(C)和疏水分子(H)之间分别包括N-和C-端组织蛋白酶可切割延长部(B1和B2)通常引起最高强度的应答，通过添加免疫蛋白酶体连接物引起应答的很少至没有提高。
这些数据示例说明了下述出人意料的发现，即放置在式V的肽抗原偶联物的肽抗原的N-端处的组织蛋白酶可切割肽延长部(B1)例如Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)，是促进体外抗原呈递和体内CD8 T细胞交叉初免的优选实施方式。当将组织蛋白酶可切割肽延长部放置在N-和C-端两者处时，和当在C-端处的组织蛋白酶可切割延长部(B2)与额外有利于免疫蛋白酶体加工的序列(例如Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO：13的二肽Gly-Gly)合并时，观察到CD8 T细胞应答的温和的额外提高。概括来说，肽抗原偶联物的优选实施方式包括在肽抗原(A)的N-端与任何其他组分例如带电荷分子(C)之间的组织蛋白酶可切割延长部(B1)；以及任选地在C-端处的组织蛋白酶或合并的组织蛋白酶和免疫蛋白酶体可降解延长部(B2)。
为了扩展这些发现，我们合成了在最小表位Adpgk的N-和C-端处(B1和B2)具有组织蛋白酶可降解延长部的不同组合和组成的肽抗原偶联物(图15)。将图15中示出的肽的不同组合物以不同浓度添加到脾细胞培养物，以评估不同构建物促进最小表位Adpgk被APC摄取和呈递的效率。在N-和C-端处(B1和B2)具有组织蛋白酶可降解延长部的不同组合和组成的肽抗原Adpgk的体外确定的效能(EC50)，示出在图16中。为了确认所述体外发现，将图15中示出的基于式C-B1-A-B2-X1的一部分序列连接到疏水分子(H)2B3W2，然后施用于小鼠。在第13天评估CD8 T细胞应答(图17)，并且其与来自于体外筛查的结果相一致，证实了将肽抗原(A)在N-和C-端处分别连接到带电荷分子(C)和疏水分子(H)的组织蛋白酶可降解延长部，可以引起体外抗原呈递的提高以及体内抗原交叉呈递效率的提高。
净电荷和延长序列(B1和B2)对粒子尺寸的影响
尽管理解粒子的表面电荷影响它们在溶液中的稳定性，但肽抗原偶联物的电荷密度和净电荷对那些肽抗原偶联物的超分子组装体在水性溶液中的尺寸和稳定性的影响尚未被很好地研究。
为了对两亲性大分子的电荷密度和净电荷如何影响自组装粒子的流体力学特性提供更多理解，我们合成了具有肽抗原(A)、带电荷分子(C)、延长部(B1和B2)和疏水分子(H)的不同组成的一系列式V的肽抗原偶联物(图18)，并评估了这些参数如何影响悬浮在pH为约7.4的水性溶液中的由肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸和稳定性(图18)。
我们的初始研究调查了提高净电荷如何影响式V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和稳定性(图18和19)。我们的结果显示出电荷大小与由递送广范围的不同肽抗原(A)(N＝754)的式V的肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸之间的相反关系，其中约90％的作为净电荷(绝对值)>6的式V的肽抗原偶联物递送的肽抗原(A)组装成～20-40nm的纳米粒子胶束。值得注意的是，确保纳米粒子胶束化所需的净电荷的大小高度依赖于肽抗原(A)的长度和亲水性，其中当肽抗原偶联物具有+8或更高或-8或更低的净电荷时，大多数递送基于LP的肽抗原(A)的肽抗原偶联物形成胶束，但大多数高度疏水的抗原为了确保稳定的纳米粒子胶束形成需要多达+10或更高或-10或更低的净电荷。
对基于肽的PCV来说，主要挑战在于当使用可以从人类基因组得到的任何可能的肽抗原时它们必须确保制剂的一致性。为了评估SP-7/8a作为PCV的普遍适用性，我们首先计算了从经典转录本得到的所有可能的25个氨基酸的肽(11.3M 25-mer)、包括所有可能的错义突变(72.6M 24-mer)的电荷和亲水性频率分布。出人意料的是，我们的结果表明超过98％的25个氨基酸的基于肽的新抗原将具有-6至+6之间的电荷(在pH 7.4下)和+2至-2之间的亲水性总平均值(GRAVY)。这些结果表明，本文中使用的小鼠新抗原的电荷和亲水性分布代表了计算机预测的人类新抗原的特征(图19C&D)。值得注意的是，甚至净电荷的约2至4个整数单位的温和增加也导致由式V的肽抗原偶联物形成的粒子的稳定性的显著提高。因此，尽管约25％或更多的作为具有+6的净电荷的式V的肽抗原偶联物递送的LP新抗原团聚，但作为具有大于或等于+8的净电荷的式V的肽抗原偶联物递送的相同的LP新抗原组装成稳定的纳米粒子胶束(图19E)。这些结果显示，作为分别具有大于或等于+6和+8(或小于或等于-6和-8)的净电荷的式V的肽抗原偶联物递送的Min和LP肽抗原，可靠地组装成纳米粒子胶束。重要的是，这些出人意料的发现建议，为了确保向98％的可能的25个氨基酸的新抗原施加足够的净电荷，肽抗原偶联物必须能够安置电荷范围为约-6至约+6的25个氨基酸的肽抗原(A)；因此，需要至少13种独特的带电荷分子(C)和任选的延长部(B1和/或B2)组合来确保向肽抗原(A)添加足够量的电荷(例如带有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14个带电荷官能团)，以获得所述肽抗原偶联物需要的净电荷。
为了更充分地研究肽抗原偶联物的净电荷与在水性缓冲液中由所述肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸和稳定性之间的趋势，我们调查了构成所述肽抗原偶联物的肽序列(例如包括基于肽的带电荷分子(C)、肽延长部(B1和B2)和肽抗原(A)的肽抗原片段)的亲水性总平均值(GRAVY)值与形成的粒子的尺寸和稳定性之间的相互影响(图19F)。在GRAVY值、净电荷和粒子尺寸之间存在强烈的相互依赖性。因此，许多具有+4的净电荷和小于0的亲水性总平均值(GRAVY)值的肽抗原偶联物形成稳定的粒子(图19F)。相反，约25％的具有+4的净电荷和大于0的GRAVY值的抗原偶联物形成团聚体，而很少的具有+6的净电荷和大于0的GRAVY值的肽抗原偶联物形成团聚体。这些数据表明，在优选实施方式中，应该选择净电荷的大小以抵消递送的肽抗原(A)的GRAVY值。在优选实施方式中，所述带电荷分子(C)和延长部(B1和B2)的组成被选择成提供具有大于或等于+4的净电荷或小于或等于-4的电荷的肽抗原偶联物，以促进由肽抗原偶联物形成的稳定粒子的形成，其中大于+6或小于-6的净电荷被用于确保甚至最疏水的肽抗原(A)的稳定的纳米粒子形成(图19F)。事实上，高度疏水的基于LP的抗原可能需要甚至更大的净电荷的绝对值。因此，肽抗原偶联物应该具有下述净电荷：对于GRAVY值小于0.25的LP肽抗原(A)来说，大于或等于+8或小于或等于-8；对于GRAVY值在约0.25至0.75之间的LP肽抗原(A)来说，大于或等于+9或小于或等于-9；并且对于GRAVY值大于0.75的LP肽抗原(A)来说，大于或等于+10或小于或等于-10，其中LP被用于指称比最小表位更长的肽抗原(A)，例如大于15个氨基酸、通常20个或更多个例如25个氨基酸的肽抗原。
应该指出，我们的分析包括在电荷和亲水性方面具有极端组成的肽抗原。因此，代表了从4个鼠类肿瘤细胞系获取的总共1,377个预测的新抗原中最(即90th百分位数或更高)疏水的(Val-Val-Ile-Ala-Ile-Phe-Ile-Ile-Leu(SEQ ID NO：57))、正电荷最多的(Lys-Asn-His-Arg-Asn-Arg-Qln-Val-Ile SEQ ID NO：75)和负电荷最多的(Ser-Pro-Glu-Arg-Asn-Asp-Trp-Glu-Pro-Leu SEQ ID NO：76)序列的3个独特肽抗原以及经验证的CD8 T细胞表位(Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser(SEQ ID NO：2))，被选择用于评估。包含经验证的CD4 T细胞表位(PADRE＝Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala SEQ ID NO：22)的肽抗原(A)也被包括在本分析中，作为已知的通用CD4 T细胞表位(图18)。
疏水分子(H)的长度和组成对粒子尺寸的影响
尽管已发现肽抗原偶联物上的净电荷对促进形成的粒子的稳定性来说是关键的，但我们接下来探索了影响粒子尺寸的其他因素。以前的研究显示，可以调节构成胶束、脂质体和聚合物囊体的大分子的长度以改变形成的粒子的尺寸。因此，将模型CD8 T细胞表位用作作为式V的肽抗原偶联物递送的肽抗原(A)，我们评估了疏水分子(H)的长度和组成如何影响粒子尺寸(图20)。与以前的数据相一致，我们发现由肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸和稳定性高度依赖于肽抗原偶联物在使用的大量不同疏水分子(H)中的净电荷(图20)。使用+4或更高的净电荷，由5个色氨酸单元构成的最小疏水分子(H)W5产生平均直径为～10nm的最小的粒子，而本实施例中使用的最大疏水分子(H)2B2W8产生直径在30-100nm之间的粒子(图20)。值得注意的是，当净电荷大于或等于+4时，中等尺寸的疏水分子(H)2B5和2BXy5产生直径为～10-30nm的中等尺寸的粒子。
合在一起，这些结果提供了带电荷分子(C)和疏水分子(H)的精确确定的化学参数可以如何用于调节由肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸和稳定性的出人意料的发现。
净电荷对递送高度疏水的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的粒子尺寸和稳定性的影响
为了证实式V的肽抗原偶联物用于递送高度疏水的肽抗原(A)的耐受性，我们选择了来自于4个鼠类肿瘤细胞系的1,377种肽新抗原的文库中最疏水的LP新抗原，并合成了作为式V的肽抗原偶联物递送的作为LP或Min的肽抗原，所述偶联物自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(SNP-7/8a)(图21)。尽管为了使作为SNP-7/8a递送的疏水性Min(GRAVY＝3.96)稳定需要等于或大于8的净电荷，但为了使作为SNP-7/8a递送的疏水性LP(GRAVY＝2.0)稳定需要等于或大于10的净电荷(图21)。另一个出人意料的发现是所述本源LP和min不可通过固相肽合成制造；然而，在固相肽合成期间将带电荷分子(C)和延长部(B1和B2)添加到树脂上的肽抗原(A)，通过防止序列截短并由于在水性和有机溶剂中的溶解性提高而允许HPLC纯化，改进了制造。
肽抗原偶联物的带电荷分子(C)和疏水分子(H)的组成对免疫原性的影响
我们的上述结果表明净电荷对于使由肽抗原偶联物形成的纳米粒子胶束稳定来说是关键的。接下来我们调查了带电荷分子(C)和疏水分子(H)的组成对递送最小表位Adpgk的肽抗原偶联物的免疫原性的影响(图22至24)。尽管不含佐剂的式V的肽抗原偶联物不诱导CD8T细胞应答(图22)，但连接到TLR-7/8a的所有其他肽抗原偶联物的组合物都诱导强健的CD8 T细胞应答(图22)。值得注意的是，尽管不含带电荷分子(C)的式IV的肽抗原偶联物和具有基于赖氨酸(即聚(K))或精氨酸(即聚(R))的带电荷分子(C)的式V的肽抗原偶联物甚至在以低至0.25nmol的剂量施用时也诱导强健的CD8 T细胞应答，但作为具有基于天冬氨酸(即聚(D))的带电荷分子(C)的式V的肽抗原偶联物施用的同样的新抗原当以0.25或1nmol施用时不诱导CD8 T细胞应答，而是当以4和16nmol施用时诱导高强度的CD8 T细胞应答。值得注意的是，带负电荷的肽抗原偶联物(图22)在多次免疫接种后诱导最高强度的CD8 T细胞应答(总CD8 T细胞的～30％IFNg+)，比由式IV的肽抗原偶联物或带正电荷的式V的肽抗原偶联物诱导的CD8 T细胞应答高约1.5-2倍。这些结果表明，尽管自组装成微粒(图22)或带正电荷纳米粒子(图22)的肽抗原偶联物与带负电荷的肽抗原偶联物相比诱导CD8T细胞应答的效能更高，但自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(SNP-7/8a)的带负电荷的肽抗原偶联物可以诱导更加可加强的CD8 T细胞应答，在多次免疫接种后提供更高强度的应答。
为了扩展我们的发现，我们评估了在皮下施用途径后肽抗原偶联物的带电荷分子(C)的组成如何影响CD8 T细胞应答(图23)。值得注意的是，分别具有带负电荷或正电荷的基于聚(氨基酸)的带电荷分子(C)——聚(K)或聚(D)的式V的肽抗原偶联物，与具有中性的基于PEG的B1延长部的式V的肽抗原偶联物相比诱导更高强度的CD8 T细胞应答(图23)。
重要的是，发现自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(SNP-7/8a)的式V的肽-抗原偶联物对于在常见疫苗接种途径(肌肉内(IM)、皮下(SC))以及静脉内途径后引发CD8 T细胞应答来说是高度免疫原性的(图24)。
肽抗原偶联物的粒子尺寸和佐剂效能和组成对免疫原性的影响
以前不知道在单次或多次(“加强剂”)免疫接种后粒子尺寸和TLR激动剂的量和效能如何影响T细胞应答。现有技术状态暗示提高免疫刺激剂的量或效能将引起更高或至少不更低的CD8 T细胞应答；然而，免疫刺激剂例如TLR激动剂的量和效能对体内CD8 T细胞应答的引发和加强的影响尚未被很好地研究。因此，我们的下一项研究力图评估粒子尺寸和在式V的肽抗原偶联物上递送的激动剂的量和效能如何影响免疫原性。
为了确定粒子尺寸和激动剂组成如何影响免疫原性，将小鼠用包含两种肽抗原偶联物的免疫原性组合物疫苗接种，一种偶联物递送包含最小CD8 T细胞表位的肽抗原(A)，另一种递送包含最小CD4 T细胞表位的肽抗原(A)(图25)。所述式V的肽抗原偶联物在它们形成小的(直径～20-100nm的纳米粒子(NP))还是大的(直径～1,000nm的微粒(MP))粒子的基础上区分，所述粒子用来递送不同量和效能的TLR-7/8激动剂。在每一组小或大的粒子中，所述肽抗原偶联物包含的疏水分子(H)含有1、2、3或5分子的化合物1即2B或5分子的更高效能的激动剂化合物2即2BXy。将小鼠用给定的免疫原性组合物疫苗接种两次，并在每次疫苗接种后1周测量血液中的T细胞应答。
一个引人注目且出人意料的发现是对于所述小(20-100nm)和大粒子(～1000nm)两者来说，增加连接到疏水分子(H)的激动剂2B的量引起CD4和CD8 T细胞应答提高，其中连接到只包含单个2B分子的疏水分子(H)的肽抗原偶联物引起最低的CD8和CD4 T细胞应答。通过添加两个2B分子，CD4和CD8 T细胞应答都提高，并且在向疏水分子(H)添加3或5个2B分子后温和地额外提高。与显示出包含递送3个以上分子的效能较高的激动剂TLR-7/8a即2BXy的疏水分子(H)的肽抗原偶联物与包含递送3个以上分子的效能较低的激动剂即2B的疏水分子(H)的肽抗原偶联物相比在多次免疫接种后引起较低的CD8 T细胞应答的我们以前的出人意料的数据(图6和7)相一致，来自于图25的结果显示，2BXy5与使用递送中等效能的激动剂即2B5的疏水分子(H)相比引起较低的CD8和CD4 T细胞应答。效能更高的激动剂引起更低的免疫应答这个出人意料的发现，在以前文献中的发现的基础上未被预料到。
概括来说，向肽抗原偶联物增加激动剂化合物1即2B的数目引起通常更高的CD8 T细胞应答，但当所述内在刺激物改变成效能更高的激动剂时，这些应答的强度降低。因此，优选实施方式利用高密度的中等效能的TLR-7/8a激动剂或低密度的高效能TLR-7/8a，使用包含肽抗原偶联物的免疫原性组合物来诱导最适CD4和CD8 T细胞应答。
粒子尺寸
另一个引人注目且出人意料的发现是，包含形成小粒子即直径～10-200nm的粒子的肽抗原偶联物的免疫原性组合物，与形成大粒子(直径>1,000nm)的肽抗原偶联物相比引起更高强度的CD4和CD8 T细胞应答。例如，在接受包含连接到疏水分子(H)2B5并形成小粒子的肽抗原偶联物的免疫原性组合物的组中CD8 T细胞应答为约～2.5％，与此相比接受包含连接到疏水分子(H)2B5并形成大粒子的肽抗原偶联物的免疫原性组合物的组为～0.5％(图25)。同样地，在接受包含连接到疏水分子(H)2B3W2的作为小粒子的肽抗原偶联物的免疫原性组合物的组中，CD8 T细胞应答比接受包含连接到疏水分子(H)2B3W2的作为大粒子的肽抗原偶联物的免疫原性组合物的组高大约10倍。
概括来说，这些数据显示，由在免疫原性组合物中使用的肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸对CD8 T细胞应答具有大且出人意料的影响。因此，形成20-100nm的粒子的肽抗原偶联物是用于免疫原性组合物中以引发最适T细胞免疫的优选实施方式。
合在一起，这些研究阐述了在使用本公开的肽抗原偶联物时，对于最大化CD4和CD8 T细胞应答来说最佳的准确物理和化学参数。
另一个出人意料的发现是由肽抗原偶联物形成的粒子的流体力学特性和稳定性依赖于构成所述肽抗原偶联物的肽序列的净电荷和亲水性总平均值(GRAVY)两者，所述GRAVY值使用Kyte和Doolittle的方法来确定(参见：Kyte J,Doolittle RF，一种用于展示蛋白质的亲水特点的简单方法(A simple method for displaying the hydropathiccharacter of a protein)，J.Mol.Biol 157:105–32,1983)。注：GRAVY值和电荷确定排除连接物(L)和疏水分子(H)或粒子(P)的贡献。
因此，当肽抗原偶联物的净电荷≥(大于或等于)+6或≤(小于或等于)-6时，递送GRAVY值>0.75的高度疏水的肽抗原(A)的肽抗原偶联物在约pH 7.4的水性缓冲液中可靠地形成稳定的粒子；当肽抗原偶联物的净电荷≥(大于或等于)+5或≤(小于或等于)-5时，递送GRAVY值在0.25-0.75之间的适度疏水的肽抗原(A)的肽抗原偶联物在约pH 7.4的水性缓冲液中可靠地形成稳定的粒子；并且当所述净电荷≥(大于或等于)+4或≤(小于或等于)-4时，递送GRAVY值小于0.25的肽抗原(A)的肽抗原偶联物在约pH 7.4的水性缓冲液中可靠地形成稳定的粒子。因此，在我们的出人意料的发现的基础上，可以选择带电荷分子(C)和延长部序列(B1和B2)的适合的组成以调节电荷，作为促进递送任何组成的肽抗原(A)的肽抗原偶联物的稳定粒子形成的手段。
肽新抗原的流体力学特性对免疫原性的影响
接下来，我们评估了使用自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子(SNP-7/8a)的式V的肽抗原偶联物的更一致的制剂(图26)，与产生微粒/团聚体的将LP新抗原连接到不具有电荷稳定化的疏水聚合物-TLR-7/8a(MP-7/8a)或将LP新抗原与颗粒状佐剂混合的更常规的方法(LP+polyICLC)相比，是否将产生CTL应答的提高的免疫原性(图27)。我们选择了三种LP新抗原，即Adpgk、Cpne1和Irgq，用于评估。尽管Adpgk作为本源LP组装成粒子，但Cpne1和Irgq LP两者都是水溶性的(图27A)。
与我们更早的发现相一致，只有作为粒子递送的新抗原LP在体内诱导CD8 T细胞应答(图27B&C)。相应地，与pICLC混合的可溶性LP Cpne1和Irgq不诱导CD8 T细胞应答，而作为MP-7/8a(微粒/团聚体)或SNP-7/8a(纳米粒子)递送的同样的新抗原导致产生高强度的CD8 T细胞免疫(图27B-E)。尽管正如较早时描述的与pICLC混合的可溶性LP是无活性的，但LP Adpgk的粒子诱导超过背景的CD8T细胞应答的显著提高，表明可能是肽新抗原的物理形式而不是佐剂即pICLC造成了与pICLC混合的Cpne1和Irgq LP的弱的T细胞应答。
在以粒子格式递送新抗原的制剂中，基于式V的肽抗原偶联物的纳米粒子胶束(SNP-7/8a)提供了最高强度的应答，随后是微粒(MP-7/8a)制剂，最后是与佐剂混合的单独的LP(图27B-E)。值得注意的是，在单次免疫接种后由纳米粒子胶束(SNP-7/8a)引起的应答显著(～5-10倍)高于由微粒制剂引起的应答，而在两次或三次免疫接种后，所述应答是可比的，表明较小的纳米粒子胶束与微粒相比具有较快的T细胞诱导的动力学。
解释观察到的免疫原性差异的机理性研究揭示，形成稳定的纳米粒子胶束的肽抗原偶联物引起最大量的新抗原摄入到引流淋巴结中，并且在第1天早早出现浓度和被淋巴结APC摄取的峰值，而微粒显示出较慢摄入到淋巴结中，在第7天出现浓度峰值，这可能解释了由微粒引起的CD8 T细胞应答的较慢的动力学(图28)。相反，与可溶性或粒子佐剂混合的可溶性新抗原显示出新抗原在引流淋巴结中有限的摄入。尽管所有佐剂的粒子制剂在淋巴结中诱导强度和动力学可比的先天性免疫活化，但只有粒子形式的抗原引起CD8 T细胞应答。可溶性新抗原在淋巴结中有限的积累可能解释了它不能诱导CD8 T细胞应答。
肽长度对免疫原性的影响
肽长度被认为是影响肽抗原(A)免疫原性的主要因素。因此，我们调查了作为自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子的式V的肽抗原偶联物(“SNP-7/8a”)递送的肽新抗原的长度如何影响在体内产生的CD4和CD8 T细胞应答的强度(图29)。将源自于MC38肿瘤细胞系的7种肽新抗原制备成作为在这里被称为SNP-7/8a的式V的肽抗原偶联物递送的最小表位(min)或基于LP的肽抗原(A)，然后施用于小鼠。我们的结果显示，作为SNP-7/8a递送的min和LP两种形式的新抗原引发比背景高约10-100倍的可比强度的CD8 T细胞应答，包括针对以前被报道为无免疫原性的4种新抗原(图29A)。然而，正如预期的，与min相比，LP引发明显更高的CD4 T细胞应答，可能是由于所述min过短而不能编码CD4表位(图29B)。重要的是，这些结果表明肽长度对CD8 T细胞应答具有极小影响，并暗示含有制造起来更加高效的最小CD4或CD8表位的短肽(7-14个氨基酸)，当适合地配制成粒子时，可能比LP(>20个氨基酸)更加优选地用于疫苗中。事实上，MHC-II预测算法的改进将使得能够使用最小表位来引发CD4和CD8 T细胞应答两者，从而避开对使用LP的需求。
与常规方法相比标定作为肽抗原偶联物递送的肽新抗原的免疫原性
接下来，我们使用将本源LP与颗粒状佐剂polyICLC混合的基于肽的疫苗的常规方法，标定了我们的自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子的式V的肽抗原偶联物(“SNP-7/8a”)的活性(图30)。与Yadav等人的发现(Yadav M等，Nature 515(7528):572-576(2014))相一致，7种质谱术验证过的预测新抗原中只有两种(Reps1和Adpgk，两者都是颗粒状的)当与pICLC组合时是免疫原性的；然而，所有7种LP新抗原作为SNP-7/8a，即作为式V的肽抗原偶联物递送的肽抗原(A)时都引发高强度的CD8 T细胞应答(图30)。值得注意的是，图30中示出的所有7种新抗原都通过质谱术确认为结合肿瘤MHC-I，这提供了出人意料的发现，即质谱术是用于预测肽抗原(A)例如新抗原的免疫原性的可靠筛选方法。
最小表位的预测的结合亲和性与免疫原性之间的关系
我们的结果显示，作为自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子的式V的肽抗原偶联物(“SNP-7/8a”)递送的基于肽的新抗原，是用于引发CD4和CD8 T细胞应答的高效方法。通过提高疫苗平台的效率，可能可以完善用于免疫原性的预测算法。事实上，我们在体内使用SNP-7/8a筛查192个独特CD8 T细胞表位之后，观察到预测的MHC-I结合与免疫原性之间的强相关性，其中接近50％的高亲和性表位(IEDB一致性评分<0.5百分位数)引起CD8 T细胞应答，这与已发表的应答相比引发CD8 T细胞应答的效率提高接近5倍(图31)。这些结果显示，计算机预测的结合亲和性特别是IEDB一致性评分，对肽抗原(A)的免疫原性具有高度预测性。
肽抗原偶联物引发稳健的肿瘤相关(自身抗原、新抗原和病毒抗原)特异性CD8和CD4 T细胞应答，其在体内介导肿瘤清除
我们调查了针对以前报道的无免疫原性的表位的CD8 T细胞应答是否可以导致已建立的肿瘤的清除增加(图32-33)。我们的结果显示，来自于两种肿瘤模型MC38和B16.F10的以前被报道为无免疫原性的几种新抗原，当作为自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子的式V的肽抗原偶联物(“SNP-7/8a”)递送时，导致已建立的肿瘤的清除。值得注意的是，尽管Kreiter等人以前报道新抗原特异性CD4 T细胞应答主要介导已建立的B16.F10肿瘤的清除，但我们观察到疫苗效率的提高可以动员新抗原特异性CD4和CD8 T细胞应答两者来介导B16.F10的清除(图32和34)。重要的是，这些发现扩展到使用新抗原之外，因为作为SNP-7/8a递送的病毒抗原(HPV E6和E7，图35)和自身抗原(Trp1，图32)两者都引发高强度的CD8 T细胞应答，其与肿瘤清除提高相关。
包含多种不同肽抗原偶联物的粒子是稳定的并表现出均匀的粒子尺寸
PCV方法可能需要向患者施用多种不同表位以提高T细胞应答的广度。因此，我们评估了自组装成共同递送TLR-7/8a的纳米粒子的式V的肽抗原偶联物(“SNP-7/8a”)用于包含多种不同肽抗原偶联物的多抗原粒子疫苗中的耐受性(图36)。不论新抗原LP的组成如何，包含多种不同肽抗原偶联物的粒子提供了20-40nm之间的一致的粒子尺寸(图36)。
递送肿瘤相关自身抗原或传染病抗原的式V的肽抗原偶联物
为了扩展我们上述的发现，我们评估了使用肽抗原偶联物作为通用疫苗平台用于诱导T细胞免疫的普遍适用性。如图37中所示，递送包含癌基因(Kras)的肽抗原(A)、源自于病毒(HIV)的肽和外来抗原(即卵清蛋白)的式V的肽抗原偶联物都形成稳定的纳米粒子并在体内诱导高强度T细胞应答。
包含不同带电荷分子(C)或不同的连接到式III的佐剂的式II的基于聚(氨基酸)的疏水分子(H)的式V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和生物活性
正如上面演示的，肽抗原偶联物疫苗是模块化平台，其可以允许每种组分例如带电荷分子(C)、延长部(B1和B2)、肽抗原(A)、连接物(L)和疏水分子(H)的广范围的不同组成。在某些实施方式中，包括包含在大多数生理相关pH范围例如pH 4.5至约pH 8.5范围内是pH无关性的官能团的带电荷分子(C)，可能是重要的。因此，我们使用分别包含磷酸丝氨酸或三甲基-赖氨酸(pH无关性季铵)氨基酸的带电荷分子(C)，合成了具有净负电荷或净正电荷的肽抗原偶联物(图38)。我们的结果显示，包括基于磷酸丝氨酸或三甲基-赖氨酸的带电荷分子(C)的肽抗原偶联物形成稳定的纳米粒子并诱导高强度T细胞应答，而不含带电荷分子(C)的肽抗原偶联物形成团聚体。
为了扩展这些发现，我们生产了具有不同长度、即30个氨基酸(化合物20，被称为2B5W10G10)和15个氨基酸(化合物16，被称为2B5G10)的带有DBCO的连接到式III的佐剂的基于式II的聚(氨基酸)的疏水分子(H)的肽抗原偶联物。一个出人意料的发现是提高所述疏水嵌段上胺和芳族基团的含量引起有机溶剂溶解性提高，因此与具有较少芳族基团或按的疏水嵌段相比制造得以改进。因此，尽管链更长，但2B5W10G10及其肽前体与2B5G10及其前体相比制造起来更加高效。
将所述两种不同疏水分子(H)2B5W10G10和2B5G10通过三唑连接物(L)连接到包含作为肽抗原(A)的基于长肽的新抗原的肽抗原片段，以形成式V的肽抗原偶联物。与我们较早的发现相一致，稳定的纳米粒子形成依赖于包含不同疏水分子(H)的肽抗原偶联物的净电荷(图38)。出人意料的是，尽管疏水分子(H)上疏水基团的密度高，但两种肽抗原偶联物都形成稳定的纳米粒子胶束并在体内诱导高强度T细胞应答(图38)。在某些实施方式中，使用更长的疏水分子(H)以提高肽抗原偶联物的动力学稳定性，例如对于通过静脉内途径递送的疫苗来说可能需要的。
包含连接到不同PRR激动剂的的式II的基于聚(氨基酸)的不同疏水分子(H)的式V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和生物活性
尽管上述免疫原性组合物的实例主要使用包含连接到TLR-7/8a(例如式III的佐剂)或不连接到配体的疏水分子(H)的肽抗原偶联物，但疏水分子(H)可以被连接到任何配体。在某些实施方式中，具有佐剂性质的配体被包含在疏水分子(H)上，而在其他实施方式中，不具有佐剂性质的配体被包含在所述疏水分子上。为了证实递送不同的具有佐剂性质的配体的肽抗原偶联物的普遍适用性，我们合成了包含连接到不同配体包括TLR-4激动剂(即WW(PI)WW)、TLR-2/6激动剂(即WW(PI)WW)、TLR-7激动剂(即CL264-W5)、NOD激动剂(胞壁酰基-W5)和STING的激动剂(即DMXAA-W5)的式II的疏水分子(H)的式V的肽抗原偶联物。与我们较早的发现相一致，稳定的纳米粒子形成依赖于所述包含不同疏水分子的肽抗原偶联物的净电荷(图39)，其中基于包含不同的具有佐剂性质的配体的疏水分子(H)的所有不同的免疫原性组合物都诱导可测量的T细胞免疫。值得注意的是，TLR-7激动剂诱导最高强度的应答，因此在用于诱导T细胞应答以预防或治疗传染病或癌症的肽抗原偶联物的优选实施方式中使用TLR-7或TLR-7/8激动剂。
使用不同的连接物化学(酰胺和硫醚)将肽抗原(A)附连到疏水分子(H)
尽管肽抗原偶联物的优选实施方式使用点击化学从连接物前体X1和连接物前体X2形成连接物(L)，但其他类型的连接物化学是适合的。因此，使用基于酰胺或硫醚的连接物(L)将式V的肽抗原偶联物连接到疏水分子(H)，其中所述连接物(L)通过所述肽抗原(A)的N-或C-端连接。我们的结果显示，通过肽抗原的N-或C-端(通过B1或B2)延长部连接到包含酰胺或硫醚的连接物(L)的肽抗原(A)，产生的肽抗原偶联物形成稳定的纳米粒子，并在体内诱导高强度T细胞应答(图40)，尽管通过酰胺连接物(L)连接到疏水分子(B)的肽抗原(A)与使用硫醚连接物(L)连接的肽抗原(A)相比诱导更高强度的应答。因此，在优选实施方式中，使用稳定的酰胺或三唑连接物(L)将肽抗原(A)直接地或通过延长部(B1或B2)连接到疏水分子(H)。
包含基于脂肪酸、脂质和胆甾醇的不同疏水分子(H)的式V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和生物活性
尽管肽抗原偶联物的优选实施方式使用由聚合物例如聚(氨基酸)或A-B型二嵌段共聚物构成的疏水分子(H)，但疏水分子(H)可以基于各种不同的其他疏水分子，例如脂肪酸、脂质和胆甾醇。因此，将式V的肽抗原偶联物连接到基于肉豆蔻酸(Myr或C14，化合物49和52)、棕榈酸(Palm或C16，化合物51和53)、胆甾醇(Chol，化合物57和58)和二酰基脂质(Pam2Cys，化合物54和55)的疏水分子(H)。与我们较早的发现相一致，稳定的纳米粒子形成依赖于包含不同疏水分子(图41)的肽抗原偶联物的净电荷，其中大于或等于+6的净电荷导致稳定的纳米粒子形成。重要的是，以基于脂肪酸、胆甾醇和脂质的疏水分子(H)为基础的肽抗原偶联物的免疫原性组合物在体内诱导高强度T细胞应答(图41)。尽管基于脂肪酸、胆甾醇和脂质的粒子在粒子形成和作为肽抗原偶联物的生物活性方面表现出适合的性能，但一个限制是基于脂肪酸、胆甾醇和脂质的疏水分子(H)更难以制造，这是由于这些材料在许多溶剂中有限的溶解性(例如在DMSO、DMF和许多醇类中不良的溶解性)，从而需要在生物学上更苛刻的氯化溶剂(例如二氯甲烷和氯仿)，这使得与例如由包含芳族基团、在大多数有机溶剂(例如DMSO、甲醇、乙醇、乙腈等)中可溶的聚合物构成的疏水分子(H)相比，表征和纯化更具挑战性，特别是对于个性化疫苗策略来说，并提高了安全风险。
包含基于A-B型二嵌段共聚物的不同疏水分子(H)的式IV和V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和生物活性
通过将肽抗原(A)附连到基于HPMA的二嵌段共聚物，制备了式IV和式V的肽抗原偶联物(参见：化合物68至72)。出人意料的是，所述形成胶束的二嵌段共聚物形成高度稳定的纳米粒子胶束而与肽抗原片段的净电荷无关(图42)。因此，在其中疏水分子(H)是包含HPMA单体的二嵌段共聚物的某些实施方式中，式IV的肽抗原偶联物可以是优选的。所述二嵌段可能在水性条件下形成粒子而与温度无关，或者粒子形成可能是温度依赖性的。此外，配体可以被包括在所述两个嵌段中的任一者上，在所述二嵌段共聚物的末端或侧基处。我们的结果显示，包含HPMA单体的A-B型二嵌段聚合物，当作为包含肽抗原偶联物的免疫原性组合物的疏水分子(H)被包括时，确保了稳定的纳米粒子形成并产生高强度T细胞应答(图42)。
基于连接到粒子的肽抗原(A)的式V的肽抗原偶联物的粒子尺寸和稳定性
在优选实施方式中，所述肽抗原偶联物包含疏水分子(H)；然而，在某些实施方式中，所述肽抗原偶联物包含预先形成的粒子(P)。通过将具有不同净电荷的肽抗原片段(C-B1-A-B2-)附连到基于脂质体、聚苯乙烯、二氧化硅和氧化铁粒子的预先形成的粒子(P)，评估了基于包含粒子(P)的式V的肽抗原偶联物的粒子的稳定性对所述肽抗原片段的电荷的依赖性。与我们较早的发现相一致，稳定的纳米粒子形成依赖于包含不同疏水分子的肽抗原偶联物的净电荷(图43)。
用于诱导耐受的递送自体抗原的肽抗原偶联物的粒子尺寸和生物活性
肽抗原偶联物也可用于诱导耐受或抑制性调节T细胞。在用于诱导耐受或免疫抑制的优选实施方式中，通常不包括具有佐剂性质的配体。相反，所述肽抗原偶联物应该包含包括肽抗原(A)、疏水分子(H)或粒子(P)和任选的连接物(L)、带电荷分子(C)和延长部(B1和/或B2)的粒子，其中不包括具有佐剂性质的配体。为了评估本文中描述的肽抗原偶联物用于诱导耐受或抑制的普遍适用性，将用于诱导关节炎(即胶原蛋白II)和类似MS的CNS综合征(即髓鞘少突胶质细胞糖蛋白，“MOG”)的模型自体抗原生产为式V的肽抗原偶联物上的肽抗原(A)。与我们较早的结果相一致，在式V的肽抗原偶联物上递送的自体抗原组装成稳定的纳米粒子并诱导低水平的调节性T细胞应答(图44)。
由A-H+C-H或A-H(C)(式VI)构成的粒子的粒子尺寸和生物活性
在某些实施方式中，所述免疫原性组合物包含由与带电荷分子偶联物(例如C-[A’]-[L]-H])混合的无带电荷分子的肽抗原偶联物(例如A-[B2]-[L]-H)构成的粒子。例如，将包含LP新抗原(Adpgk)的肽抗原偶联物通过三唑连接物(L)连接到疏水分子2B3W2以形成肽抗原偶联物(A-L-H)，将所述抗原偶联物与带电荷分子偶联物(C-H)化合物42(K10-2B3W2)混合以形成稳定的纳米粒子，所述纳米粒子诱导高强度T细胞免疫(图45)。在另一个实施方式中，将包含LP新抗原(Adpgk)的肽抗原偶联物通过三唑连接物(L)连接到疏水分子2B3W2以形成肽抗原偶联物(A-L-H)，将所述抗原偶联物与另外包含保守抗原A’的带电荷分子偶联物(即C-A’-H)混合以形成稳定的纳米粒子，所述纳米粒子诱导高强度T细胞免疫(图45)。
或者，所述带电荷分子(C)可以被连接到疏水分子(H)，所述H被连接到肽抗原(A)，以形成式VI的肽抗原偶联物。在非限制性实例中，将肽新抗原(Adpgk)作为式A-[L]-H(C)的肽抗原偶联物上的肽抗原(A)递送，并发现得到的偶联物形成稳定的纳米粒子并诱导高强度T细胞免疫。因此，在包含粒子的免疫原性组合物的优选实施方式中，带电荷分子(C)可以通过直接或间接连接提供到肽抗原(A)或分开的分子上，所述分开的分子与由肽抗原偶联物形成的粒子缔合。
重要的是，本公开描述了被称为肽抗原偶联物的新颖的基于肽的疫苗方法，其导致针对肽抗原(A)包括肿瘤相关抗原(自身抗原、新抗原和病毒抗原)、传染病抗原和外来抗原产生的T细胞应答的强度和广度的出人意料的提高。还发现包含不含佐剂的肽抗原偶联物的免疫原性组合物诱导针对自身抗原的低水平的耐受原性/抑制性应答，这可能对治疗自体免疫和/或过敏症有用。
在本公开中，我们演示了一个出人意料的发现，即通过均作为由肽抗原偶联物构成的粒子递送，包含最小表位(ME)的肽抗原(A)与作为合成的长肽(SLP)递送的相同ME相比，当出于药代动力学原因将两者归一化时，可以引起更高强度的CD8 T细胞应答。此外，我们提供了实例，其中作为肽抗原偶联物在SLP内递送的ME在单次免疫接种后不引起CD8 T细胞应答，但作为肽抗原偶联物递送的ME则可以引起，这推测是通过更高效的加工，导致ME在MHC I分子的背景中被APC细胞表面呈递增加。发现这类基于ME的疫苗拓宽了T细胞应答的广度，这另外被显示在减少已建立的肿瘤的生长的情形中是有功能的。因此，基于我们的出人意料的发现，免疫原性组合物的优选实施方式使用递送基于最小表位或ME与SLP的组合的肽抗原(A)的肽抗原偶联物。尽管在某些实施方式中，所述肽抗原(A)是SLP(或“LP”)。
此外，为了提供对递送具有广泛性质的肽抗原(A)的粒子的材料装载和尺寸和稳定性的改进的控制，我们在本文中公开了一种用于将肽抗原(A)作为肽抗原偶联物递送的新方法，所述肽抗原偶联物在水性缓冲液中组装成胶束和纳米尺寸的超分子缔合物。重要的是，我们显示了可以如何优化肽抗原偶联物的组成包括任选的使粒子稳定的带电荷分子(C)、疏水分子(H)、任选的(连接物)和任选的延长部序列(B1和B2)来确保对任何可能的肽抗原(A)来说可以获得确定尺寸的稳定粒子。我们显示，可靠的粒子形成和提高的稳定性可以通过调节疏水分子(H)的长度和疏水特性以及通过调节由肽抗原偶联物形成的粒子的电荷来实现。
作为用于改进构成所述肽抗原偶联物的T细胞表位的加工的手段，我们演示了使用在水性条件下稳定但偏好性地被抗原呈递细胞的胞内体中的酶水解的N-和C-端延长部(B1和B2或“延长部”)，从而限制所述抗原的加工和向这些细胞的呈递，并促进所述最小CD8和/或CD4 T细胞表位在APC中的高效释放。
最后，在本公开中，我们系统性地评估了促进T细胞免疫所需的基于PRR激动剂的免疫刺激剂的最适组成、数目和效能。我们提供的数据表明，诱导IL-12和I型IFN的产生的TLR激动剂的数目和效能的逐步增加一开始引起T细胞应答强度的提高，但在新颖的且出人意料的发现中，进一步的增加引起抗原性广度变窄和T细胞应答强度的降低。因此，我们报道了对提供T细胞免疫的最适强度、质量和广度来说优选的附连到疏水分子(H)的免疫刺激剂(即PRR激动剂)的组成、数目和效能。
概括来说，本文公开的出人意料的发现涉及：
i.在癌症疫苗中用于确保T细胞免疫的可靠引发的肽抗原(A)的最适长度。
ii.肽抗原延长序列即N-和/或C-端延长部(B1和/或B2)的使用，其便于基于肽的疫苗的制造，促进粒子稳定性并便于加工以允许被APC高效呈递。
iii.诱导和稳定化对促进T细胞免疫来说最适尺寸的粒子所需的带电荷分子(C)的组成和肽抗原偶联物的净电荷。
iv.疏水分子的长度(H)和组成如何影响由肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸和稳定性以及它们在体内的免疫原性。
v.包含在疏水分子(H)上的配体(例如PRR激动剂)的效能和定性特征如何影响T细胞应答的广度、强度和质量。
在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有需要，否则短语“包含”和“包括”及其变化形式应该被理解为暗示包括所陈述的实体或成组实体，但是不排除任何其他实体或成组实体；或者包括所陈述的一种或多种组合物，但不排除任何其他一种或多种组合物。
在本说明书中对任何现有技术的引用不是并且不应被当作承认以任何形式暗示这些现有技术形成一般常识的一部分。
本领域技术人员应该认识到，本发明的用途不限于所描述的特定应用。本发明在本文中描述或描绘的特定要素和/或特点方面也不限于其优选实施方式。应该认识到，本发明不限于所公开的一个或多个实施方式，而是能够进行大量重新排列、修改和替换，而不背离由下面的权利要求书阐述和定义的本发明的范围。
序列表
<110> 阿维迪科技公司（Avidea Technologies, Inc.）
美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）
<120> 基于肽的疫苗、其制造方法及其用于诱导免疫应答的用途
<130> AVI-03-PCT
<150> US 62/481,432
<151> 2017-04-04
<150> US 62/617,519
<151> 2018-01-15
<160> 77
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 50
Lys Lys Lys Lys
1
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 51
Lys Ser Lys Ser Lys
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 52
Lys Ser Lys Ser Lys Ser Lys
1 5
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 53
Asp Ser Asp Ser Asp
1 5
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 54
Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
1 5
<210> 55
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 55
Lys Asp Lys Asp
1
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 56
Lys Asp Lys Asp Lys Asp
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 57
Val Val Ile Ala Ile Phe Ile Ile Leu
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 58
Lys Ser Lys Gly Gly
1 5
<210> 59
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 59
Gly Pro Gly Arg
1
<210> 60
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 60
Gly Ser Val Arg
1
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 61
Gly Gly Ser Pro Val Arg
1 5
<210> 62
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 62
Lys Leu Val Arg
1
<210> 63
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 63
Asp Leu Val Leu
1
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 64
Gly Asp Leu Val Leu
1 5
<210> 65
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 65
Gly Asp Leu Val Arg
1 5
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 66
Gly Ser Glu Leu Val Arg
1 5
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 67
Gly Gly Asp Pro Val Arg
1 5
<210> 68
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 68
Asp Leu Val Arg
1
<210> 69
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 69
Asp Pro Val Arg
1
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 酰胺化
<400> 70
Trp Trp Trp Trp Trp
1 5
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 71
Glu Lys Glu Lys Glu Lys
1 5
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 72
Ser Leu Val Arg Tyr Leu Leu Leu
1 5
<210> 73
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 73
Lys Ser Lys Ser Lys Ser
1 5
<210> 74
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 74
Glu Ser Glu Ser Glu Ser
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 75
Lys Asn His Arg Asn Arg Gln Val Ile
1 5
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 76
Ser Pro Glu Arg Asn Asp Trp Glu Pro Leu
1 5 10
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建物
<400> 77
Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met
1 5

Claims (57)

1.一种肽抗原偶联物，其包含：
a.肽抗原(A)；
和
b.疏水分子(H)或粒子(P)，
其中所述肽抗原(A)直接地或者通过连接到所述肽抗原(A)的N-端的任选的N-端延长部(B1)或连接到所述肽抗原(A)的C-端的任选的C-端延长部(B2)间接地连接到所述疏水分子(H)或所述粒子(P)，任选地其中所述疏水分子(H)或粒子(P)通过连接物(L)间接地连接到所述延长部(B1或B2)。
2.权利要求1的肽抗原偶联物，其还包含带电荷分子(C)。
3.权利要求2的肽抗原偶联物，其中所述肽抗原偶联物在pH为约7.4的水性缓冲液中具有大于或等于约+3或者小于或等于约–3的净静电荷。
4.权利要求1至3任一项的肽抗原偶联物，其中所述带电荷分子(C)与所述疏水分子(H)或所述粒子(P)直接地或分别通过所述任选的N-端延长部(B1)或任选的C-端延长部(B2)附连到所述肽抗原(A)的N-端或C-端。
5.权利要求2和3任一项的肽抗原偶联物，其中所述带电荷分子(C)与所述疏水分子(H)或所述粒子(P)附连到所述肽抗原(A)的相反末端。
6.权利要求5的肽抗原偶联物，其中(i)所述带电荷分子(C)通过所述N-端延长部(B1)附连到所述肽抗原(A)的N-端，并且(ii)所述疏水分子(H)或所述粒子(P)通过所述C-端延长部(B2)附连到所述肽抗原(A)的C-端。
7.权利要求1至6任一项的肽抗原偶联物，其中所述N-端延长部(B1)包含含有氨基酸PN1的酶可降解的肽序列，其中PN1选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸。
8.权利要求7的肽抗原偶联物，其中所述含有氨基酸PN1的酶可降解的肽序列还包含以下的至少一者：
a.选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸PN2；
b.选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸或亮氨酸的氨基酸PN3；
c.选自精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸PN4；或
d.a-c的任何组合。
9.权利要求7或权利要求8的肽抗原偶联物，其中所述酶可降解的肽序列包含选自以下的四肽：
a.Ser-Leu-Val-Cit；
b.Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：4)；
c.Ser-Pro-Val-Cit；
d.Gly-Pro-Val-Cit；
e.Gly-Pro-Leu-Cit；
f.Glu-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：5)；
g.Ser-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：6)；
h.Ser-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO：21)；
i.Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)；
j.Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO：8)；
k.Glu-Leu-Val-Cit；
l.Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：10)；
m.Glu-Pro-Val-Cit；或
n.Glu-Gly-Val-Cit，
其中Glu能够被Asp代替；和/或其中Arg能够被Lys代替。
10.权利要求1至9任一项的肽抗原偶联物，其中所述C-端延长部(B2)包含酶可降解的肽序列，所述酶可降解的肽序列包含：
i.单一氨基酸PC1’，其选自甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸；
ii.二肽，其中PC1’选自甘氨酸或丝氨酸；并且PC2’选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸；
iii.三肽，其中PC1’选自甘氨酸或丝氨酸；PC2’选自甘氨酸、丝氨酸或脯氨酸；并且PC3’选自甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸；
iv.四肽，其中PC1’选自甘氨酸或丝氨酸；PC2’选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸或亮氨酸；PC3’选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；并且PC4’选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸；
v.五肽，其中PC1’选自甘氨酸或丝氨酸；PC2’选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；PC3’选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸或亮氨酸；PC4’选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；并且PC5’选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸；或
vi.六肽，其中PC1’选自甘氨酸或丝氨酸；PC2’选自甘氨酸、丝氨酸或脯氨酸；PC3’选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；PC4’选自脯氨酸或亮氨酸；PC5’选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；并且PC6’选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸。
11.权利要求10的肽抗原偶联物，其中所述C-端延长部(B2)包含酶可降解的肽序列，所述酶可降解的肽序列包含：
a.选自以下的六肽：
i.Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：11)；
ii.Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：13)；
iii.Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：61)；
iv.Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit；
v.Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit；
vi.Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Cit；
vii.Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：14)；
viii.Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：15)；
ix.Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：16)；
x.Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Cit；并且
其中Glu能够被Asp代替；和/或其中Arg能够被Lys代替；或
b.选自以下的五肽：
i.Gly-Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：17)；
ii.Gly-Ser-Pro-Val-Cit；
iii.Gly-Ser-Pro-Leu-Cit；
iv.Gly-Ser-Leu-Val-Cit；
v.Gly-Lys-Pro-Val-Cit；
vi.Gly-Lys-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：18)；
vii.Gly-Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：19)；
viii.Gly-Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：20)；并且
其中Glu能够被Asp代替；和/或其中Arg能够被Lys代替；或
c.选自以下的四肽：
i.Ser-Leu-Val-Cit；
ii.Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：4)；
iii.Ser-Pro-Val-Cit；
iv.Ser-Pro-Leu-Cit；
v.Glu-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：5)；
vi.Ser-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO：6)；
vii.Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO：7)；
viii.Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO：8)；
ix.Glu-Leu-Val-Cit；
x.Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO：10)；
xi.Glu-Pro-Val-Cit；或
xii.Glu-Gly-Val-Cit，并且
其中Glu能够被Asp代替；和/或其中Arg能够被Lys代替；或
d.选自以下的三肽：
i.Gly-Ser-Gly；
ii.Gly-Ser-Arg；
iii.Gly-Ser-Leu；
iv.Gly-Ser-Cit；
v.Gly-Pro-Gly；
vi.Gly-Pro-Arg；
vii.Gly-Pro-Leu；
viii.Gly-Pro-Cit；或
e.选自以下的二肽：
i.Gly-Ser；
ii.Gly-Pro；
iii.Gly-Arg；
iv.Gly-Cit；或
f.选自Gly、Ser、Ala、Arg、Lys、Cit、Val、Leu、Met、Thr、Gln或Nle的单一氨基酸。
12.前述权利要求任一项的肽抗原偶联物，其中所述粒子(P)包含聚苯乙烯、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、脂质体、铝的矿物盐或乳液。
13.权利要求1至11任一项的肽抗原偶联物，其中所述疏水分子(H)是在pH为约7.4的水性缓冲液中不溶至低达约0.1mg/mL的支链、长链或环状脂族分子或脂肪酸、脂质或甾醇衍生物。
14.权利要求1至11任一项的肽抗原偶联物，其中所述疏水分子包含基于选自丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基(丙烯酸酯)、甲基(丙烯酰胺)、苯乙烯基单体、乙烯基单体、二氧杂磷杂环戊烷、环状酯、天然或非天然氨基酸的单体单元的聚合物，和由二醇或二胺与二异氰酸酯或多异氰酸酯的反应产生的聚合物，任选地其中将佐剂连接到构成所述聚合物的一个或多个单体。
15.权利要求14的肽抗原偶联物，其中所述疏水分子(H)是式I的聚(氨基酸)：
其中R2选自氢、羟基或胺中的一者，x在3至300之间；y3是1至8，并且所述配体通过任何适合的手段通过连接物X附连。
16.权利要求14的肽抗原偶联物，其中所述疏水分子(H)是基于式II的聚(氨基酸)：
其中l在3-300之间，并且o在0-300之间；R3选自氢、羟基或胺中的一者；R4选自氢、低级烷基、-CH2-OH、
Figure FDA0002263670060000071
Figure FDA0002263670060000072
中的一者，
y11通常选自1至8，并且FG是被连接到具有佐剂性质的配体的选自羧酸、醛、酮、胺、硫醇、叠氮化物或炔烃的官能团；并且N-端直接通过酰胺键或间接通过连接物，直接地或通过延长部(B1或B2)和/或连接物(L)或带电荷分子(C)连接到所述肽抗原。
17.权利要求14的肽抗原偶联物，其中所述疏水分子(H)包含由聚(亮氨酸)、聚(色氨酸)、聚(γ-谷氨酰基二乙二醇单甲醚)、聚(谷氨酸γ-苯甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAM)、聚[2(2-甲氧基乙氧基)乙基甲基丙烯酸酯)](DEGMA)或聚[N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺)(HPMA)构成的均聚物或共聚物。
18.权利要求15的肽抗原偶联物，其中包含式I的聚(氨基酸)的所述疏水分子(H)在末端处被接枝或连接到第二聚合物，所述第二聚合物基于聚(亮氨酸)、聚(色氨酸)、聚(γ-谷氨酰基二乙二醇单甲醚)、聚(谷氨酸γ-苯甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAM)、聚[2(2-甲氧基乙氧基)乙基甲基丙烯酸酯)](DEGMA)或聚[N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺)(HPMA)。
19.权利要求16的肽抗原偶联物，其中包含式II的聚(氨基酸)的所述疏水分子(H)在末端处被接枝或连接到第二聚合物，所述第二聚合物基于聚(亮氨酸)、聚(色氨酸)、聚(γ-谷氨酰基二乙二醇单甲醚)、聚(谷氨酸γ-苯甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAM)、聚[2(2-甲氧基乙氧基)乙基甲基丙烯酸酯)](DEGMA)或聚[N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺)(HPMA)。
20.权利要求18或权利要求19的肽抗原偶联物，其中所述第二聚合物包含约30至500个单体单元的多个单体单元。
21.权利要求14至20任一项的肽抗原偶联物，其中一个或多个佐剂作为悬垂侧基被连接到构成所述疏水分子(H)的聚合物。
22.权利要求14至20任一项的肽抗原偶联物，其中一个或多个佐剂被连接到所述聚合物的一个末端(半遥爪)。
23.权利要求21或权利要求22的肽抗原偶联物，其中所述佐剂是Toll样受体激动剂或STING激动剂。
24.权利要求23的肽抗原偶联物，其中所述Toll样受体激动剂是Toll样受体-7和/或-8的激动剂。
25.权利要求24的肽抗原偶联物，其中所述佐剂是式III的咪唑并喹啉：
Figure FDA0002263670060000081
其中R7选自氢、任选取代的低级烷基或任选取代的低级醚中的一者；并且R8选自任选取代的芳基胺或任选取代的低级烷基胺中的一者。
26.权利要求25的肽抗原偶联物，其中三个或更多的式III的咪唑并喹啉分子被连接到构成所述疏水分子(H)的聚合物，并且R8选自任选取代的低级烷基胺中的一者。
27.权利要求26的肽抗原偶联物，其中三个或更少的式III的咪唑并喹啉分子被连接到构成所述疏水分子(H)的聚合物，并且R8选自任选取代的芳基胺中的一者。
28.前述权利要求任一项的肽抗原偶联物，其中所述粒子(P)或疏水分子(H)在pH为约7.4的水性缓冲液中并且在约20℃至40℃的温度下不溶至低达0.1mg/mL。
29.前述权利要求任一项的肽抗原偶联物，其中所述肽抗原偶联物在pH为约7.4的水性缓冲液中组装成由胶束或其他类型的纳米或微米尺寸的超分子缔合物构成的粒子，所述粒子包含2个或更多个肽抗原偶联物，并且直径大于5nm。
30.权利要求29的肽抗原偶联物，其中所述肽抗原偶联物在pH为约7.4的水性缓冲液中组装成直径在约5至200nm之间的胶束。
31.权利要求29的肽抗原偶联物，其中所述肽抗原偶联物在pH为约7.4的水性缓冲液中是团聚体。
32.前述权利要求任一项的肽抗原偶联物，其中连接物前体X1被直接地或通过C-端延长部(B2)连接到所述肽抗原(A)，并与所述疏水分子(H)或粒子(P)上的连接物前体X2形成连接。
33.权利要求32的肽抗原偶联物，其中所述连接物前体X1具有下式：
Figure FDA0002263670060000101
其中所述标签的N-端胺被直接地或通过所述C-端延长部B2连接到肽抗原(A)；R1选自氢、羟基或胺中的一者；y1是1至8的整数；并且FG选自硫醇、胺、叠氮化物或炔烃(或DBCO)中的一者。
34.权利要求33的肽抗原偶联物，其中所述FG是叠氮化物并且y1是4，另外其中所述叠氮化物连接到DBCO分子，所述DBCO分子被连接到粒子(P)或疏水分子(H)。
35.权利要求1至32任一项的肽抗原偶联物，其中连接物前体X1被连接到所述N-端延长部(B1)并具有下式：
Figure FDA0002263670060000102
其中所述标签的羰基被直接地或通过B1延长部连接到肽抗原(A)的N-端；y2是1至8的整数；并且FG选自硫醇、胺、叠氮化物或炔烃(或DBCO)中的一者。
36.权利要求1至35任一项的肽抗原偶联物，其中所述肽抗原(P)、任选的N-端延长部(B1)、任选的C-端延长部(B2)和任选的带电荷分子(C)和任选的连接物前体X1通过固相肽合成被合成为单一肽，并且其中所述C-端延长部(B2)含有脯氨酸(或者在固相肽合成期间，当所述序列被附连到用于合成所述肽的树脂时，含有伪脯氨酸)。
37.权利要求2至36任一项的肽抗原偶联物，其中所述带电荷分子(C)包含选自伯胺、仲胺、叔胺、季胺、胍、咪唑鎓、铵、锍、鏻、羧酸根、硫酸根、磷酸根、氨基磷酸根或膦酸根的一个或多个官能团。
38.权利要求37的肽抗原偶联物，其中所述带电荷分子(C)包含带负电荷和带正电荷的官能团两者。
39.权利要求2至38任一项的肽抗原偶联物，其中构成所述带电荷分子(C)的带电荷官能团的数目被调整到以下：
a.当所述肽抗原(A)具有大于或等于约0.75的亲水值的总平均值时，所述肽抗原偶联物的净静电荷包括大于或等于约+6的正值；
b.当所述肽抗原(A)具有大于或等于约0.25并小于约0.75的亲水值的总平均值时，所述肽抗原偶联物的净静电荷包括大于或等于约+5的正值；
c.当所述肽抗原(A)具有小于约0.25的亲水值的总平均值时，所述肽抗原偶联物的净静电荷包括大于或等于约+4的正值；
d.当所述肽抗原(A)具有大于或等于约0.75的亲水值的总平均值时，所述肽抗原偶联物的净静电荷包括小于或等于约-6的负值；
e.当所述肽抗原(A)具有大于或等于约0.25并小于约0.75的亲水值的总平均值时，所述肽抗原偶联物的净静电荷包括小于或等于约-5的负值；或者
f.当所述肽抗原(A)具有小于约0.25的亲水值的总平均值时，所述肽抗原偶联物的净静电荷包括大于或等于约-4的正值。
40.权利要求39的肽抗原偶联物，其中所述肽抗原(A)、N-端延长部(B1)、C-端延长部(B2)、带电荷分子(C)和连接物前体X1被生产为单一肽，所述单一肽在约7.4的pH下在水性缓冲液中可溶至高达约1.0mg/mL。
41.一种粒子，其包含权利要求1至40任一项的肽抗原偶联物。
42.权利要求41的粒子，其中所述粒子包含多种不同的肽抗原偶联物。
43.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1至40任一项的肽抗原偶联物或权利要求41至42的粒子。
44.权利要求43的免疫原性组合物，其还包含疫苗佐剂。
45.权利要求43或权利要求44的免疫原性组合物，其中所述组合物包含多种不同的肽抗原偶联物。
46.权利要求1至40任一项的肽抗原偶联物、权利要求41和42任一项的粒子或权利要求43至45任一项的免疫原性组合物，其中所述肽抗原(A)包含肿瘤相关抗原。
47.权利要求46的肽抗原偶联物、权利要求46的粒子或权利要求46的免疫原性组合物，其中所述肿瘤相关抗原是新抗原。
48.权利要求1至40和46至47任一项的肽抗原偶联物、权利要求41至42和46至47任一项的粒子或权利要求43-47任一项的免疫原性组合物，其中所述肽抗原(A)是最小CD4或CD8 T细胞表位。
49.权利要求43至47任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含10至50种不同的肽抗原偶联物，所述肽抗原偶联物包含的肽抗原(A)选自最小CD4 T细胞表位、CD8T细胞表位或最小CD4和CD8 T细胞表位两者。
50.权利要求43至47任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含10至50种不同的肽抗原偶联物，所述肽抗原偶联物包含的肽抗原(A)选自最小CD4 T细胞表位、最小CD8 T细胞表位或最小CD4和CD8 T细胞表位两者以及包含CD8 T细胞表位和/或CD4 T细胞表位的15至35个氨基酸的合成的长肽。
51.权利要求48的肽抗原偶联物、权利要求48的粒子或权利要求48至50任一项的免疫原性组合物，其中所述最小CD8 T细胞或CD4 T细胞表位对于与所述对象匹配的MHC分子具有通过IEDB一致性算法预测的小于或等于0.5百分位数的结合亲和性。
52.权利要求43至51任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含其中所述肽抗原(A)是通用CD4 T细胞表位的肽抗原偶联物。
53.一种治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括向患有所述疾病的患者施用前述权利要求任一项的肽抗原偶联物或免疫原性组合物。
54.权利要求53的方法，其中所述方法还包括施用另外的免疫治疗模式，包括免疫检查点抑制剂例如抗PD1、抗PD-L1或抗CTLA-4抗体；基于肿瘤浸润性淋巴细胞和嵌合抗原受体T细胞的疗法；双特异性抗体；抗肿瘤抗体；或被设计用于克服免疫抑制的药物。
55.权利要求53或权利要求54的方法，其中所述方法包括异源免疫接种方案，其中将前述权利要求任一项的免疫原性组合物或肽抗原偶联物作为初免剂或加强剂与异源疫苗一起使用。
56.权利要求53至55任一项的方法，其中所述治疗与放疗、化疗或手术联合使用。
57.权利要求1至52任一项的肽抗原偶联物、粒子或免疫原性组合物在制造用于治疗疾病的药物中的用途。
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