CN110499396A

CN110499396A - 糖液的制造方法

Info

Publication number: CN110499396A
Application number: CN201910847246.5A
Authority: CN
Inventors: 栗原宏征; 石冢裕子; 山田胜成
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2014-07-08
Publication date: 2019-11-26
Also published as: CA2917307A1; JP6459514B2; EP3020820A1; JPWO2015005307A1; MY180037A; AU2014288309B2; US9976160B2; US20160145651A1; EP3020820A4; BR112015032515A8; BR112015032515A2; US10815501B2; AU2014288309A1; CN105452478B; AU2014288309B9; US20180237805A1; CA2917307C; WO2015005307A1; CN105452478A

Abstract

虽然由生物质获得的糖水溶液中包含各种发酵抑制物质，但是通过利用无葡萄糖和木糖同化性的微生物或源自该微生物的粗酶物对糖水溶液进行处理，可以简便且低成本地除去源自生物质的发酵抑制物质。

Description

糖液的制造方法

本申请是申请日为2014年7月8日、申请号为201480039216.7、发明名称为“糖液的制造方法”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及由生物质制造糖液的方法。

背景技术

以糖为原料的化学品的发酵生产工艺被用于各种工业原料生产中。作为成为该发酵原料的糖，现在工业上使用源自甘蔗、淀粉、甜菜等食用原料的糖，但是从今后世界人口增加引起食用原料价格的暴涨、或与食用竞争的伦理层面出发，构建由可再生的非食用资源、即含纤维素生物质有效地制造糖液的工艺，或者以所得糖液为发酵原料，有效地转化为工业原料的工艺成为今后的课题。

作为由含纤维素生物质制造糖液的方法，公开了使用浓硫酸将纤维素和半纤维素进行酸水解来制造糖液的方法(专利文献1或2)，在用稀硫酸将含纤维素生物质进行水解处理之后，进一步通过进行纤维素酶等酶处理来制造糖液的方法(非专利文献1)。此外，作为不使用酸的方法，公开了使用250～500℃左右的亚临界水将含纤维素生物质水解来制造糖液的方法(专利文献3)；此外，在将含纤维素生物质进行亚临界水处理之后，进一步通过酶处理来制造糖液的方法(专利文献4)；此外，在用240～280℃的加压热水将含纤维素生物质进行水解处理之后，进一步通过酶处理来制造糖液的方法(专利文献5)。

然而，在含纤维素生物质的水解中，存在下述问题：在纤维素或半纤维素成分等分解的同时，生成的葡萄糖、木糖等糖也进行分解反应，还生成糠醛、羟甲基糠醛等呋喃化合物，或甲酸、乙酸、乙酰丙酸等有机酸这样的副产物。此外，由于含纤维素生物质包含作为芳香族聚合物的木质素成分，因此，在酸处理工序中，木质素成分分解，同时作为副产物生成低分子量的酚类等芳香族化合物。这些化合物由于在利用微生物的发酵工序中起到抑制作用，引起微生物的增殖抑制，使发酵产物的收率降低，因此被称为发酵抑制物质，在将含纤维素生物质糖液作为发酵原料利用时是大问题。

作为在糖液制造过程中除去这样的发酵抑制物质的方法，公开了称为过量灰碱处理(over liming)的方法(非专利文献2)。在该方法是在对酸处理后的纤维素或糖化液添加石灰进行中和的工序中，通过加热到60℃附近并保持一定时间，从而将糠醛、HMF等发酵抑制物质与石膏成分一起除去的方法。然而，在过量灰碱处理中，存在甲酸、乙酸、乙酰丙酸等有机酸的除去效果少的问题。

此外，作为其他除去发酵抑制物质的方法，公开了通过向来自含纤维素生物质的糖液中吹入水蒸气，从而蒸发除去发酵抑制物质的方法(专利文献6)。然而，在这样蒸发除去的方法中存在下述问题：依赖于发酵抑制物质的沸点，特别是沸点低的有机酸等发酵抑制物质的除去效率低，为了获得充分的除去效率，必须投入大量的能量。

此外，也有用离子交换除去发酵抑制物质的方法(专利文献7)，但是存在成本方面问题；也有使用木质系碳化物、即活性炭等吸附除去的方法，但是存在除去对象限定于疏水性化合物这样的问题(专利文献8)。

此外，也考虑了使用纳滤膜或反渗透膜而将发酵抑制物质作为膜的透过液除去的方法，但是存在需要用于除去的附加分离设备、能量投入这样的问题(专利文献9)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表平11-506934号公报

专利文献2：日本特开2005-229821号公报

专利文献3：日本特开2003-212888号公报

专利文献4：日本特开2001-95597号公报

专利文献5：日本特许3041380号公报

专利文献6：日本特开2004-187650号公报

专利文献7：日本特表2001-511418号公报

专利文献8：日本特开2005-270056号公报

专利文献9：日本特许第4770987号公报

非专利文献

非专利文献1：A.Aden等，“Lignocellulosic Biomass to Ethanol ProcessDesign and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis andEnzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report(2002)

非专利文献2：M.Alfred等，“Effect of pH,time and temperature ofoverliming on detoxification of dilute-acid hydrolyzates for fermentation bySaccaromyces cerevisiase”Process Biochemistry,38,515-522(2002)发明的内容

发明所要解决的课题

如上所述，由于源自生物质的糖液中所包含的发酵抑制物质阻碍微生物的生长、代谢转化，因此为了除去这些发酵抑制物质，使用吸附处理、离子交换、加热蒸发、纳滤膜等，但是存在处理成本高，或者能够除去的发酵抑制物质限定于特定化合物这样的问题。

即，本发明所要解决的课题是提供包括以简便的处理、低成本地将各种发酵抑制物质全面除去的工序的糖液的制造方法。

用于解决课题的方法

本发明者发现，通过利用特定的微生物的代谢机制，能够使源自生物质的糖液中所包含的发酵抑制物质的浓度降低，能够利用所得糖液作为发酵原料，从而完成了本发明。

即，本发明由以下的[1]～[15]构成。

[1]糖液的制造方法，是由生物质制造糖液的方法，包括将由生物质得到的糖水溶液中所包含的发酵抑制物质利用无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物或源自该微生物的粗酶物进行分解的工序，所述发酵抑制物质是选自香豆酸、香豆酰胺、阿魏酸、阿魏酰胺、香草醛、香草酸、乙酰香草酮、糠醛和3-羟甲基糠醛中的1种或2种以上的化合物。

[2]根据[1]所述的糖液的制造方法，所述无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物是戴尔福特菌属微生物(Delftia sp.)。

[3]根据[1]或[2]所述的糖液的制造方法，所述无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物是选自食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)、湖生戴尔福特菌(Delftialacustris)、鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)和对虾戴尔福特菌(Delftialitopenaei)中的1种或2种以上。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的糖液的制造方法，糖水溶液是将含纤维素生物质进行水解而得的糖水溶液。

[5]根据[4]所述的糖液的制造方法，包括将含纤维素生物质进行选自酸处理、碱处理、水热处理和酶处理中的1种以上的处理，从而调制糖水溶液的工序。

[6]根据[1]～[3]中任一项所述的糖液的制造方法，糖水溶液是废糖蜜。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的糖液的制造方法，发酵抑制物质分解处理工序是在单糖浓度小于100g/L的条件下进行的处理。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的糖液的制造方法，所述发酵抑制物质分解处理工序是在pH6～11的范围进行的处理。

[9]糖液的制造方法，将通过前述[1]～[8]中任一项所述的糖液的制造方法获得的糖液进行膜浓缩和/或蒸发浓缩，从而提高糖浓度。

[10]糖固体的制造方法，将通过前述[1]～[8]中任一项所述的糖液的制造方法获得的糖液进行膜浓缩和/或蒸发浓缩，从而获得糖固体。

[11]通过前述[1]～[9]中任一项所述的糖液的制造方法获得的糖液。

[12]通过前述[10]所述的糖固体的制造方法获得的糖固体。

[13]糖液或糖固体，是源自含纤维素生物质或废糖蜜的糖液或糖固体，其中，杂质的含量为检测限以下，所述杂质是选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和组氨酸中的1种或2种以上的游离氨基酸。

[14]化学品的制造方法，包括：通过前述[1]～[9]中任一项所述的糖液的制造方法来获得糖液的工序；和以所得的糖液作为发酵原料来培养微生物，从而使糖转化为化学品的工序。

[15]化学品的制造方法，包括：通过前述[10]所述的糖固体的制造方法来获得糖固体的工序；和以所得的糖固体作为发酵原料来培养微生物，从而使糖转化为化学品的工序。

发明的效果

本发明中所得的糖液能够作为微生物的发酵原料使用，能够作为各种化学品的原料利用。

附图说明

图1是显示本发明的糖液的制造方法的实施步骤的流程图。

图2是显示本发明的糖液的制造方法的优选实施步骤的流程图。

图3是追踪鹤羽田戴尔福特菌引起的阿魏酰胺的经时变化的图。

图4是追踪食酸戴尔福特菌引起的阿魏酰胺的经时变化的图。

图5是追踪鹤羽田戴尔福特菌引起的香豆酰胺的经时变化的图。

图6是追踪食酸戴尔福特菌引起的香豆酰胺的经时变化的图。

图7是追踪本发明的糖固体经时变化的照片。

具体实施方式

本发明是由生物质制造糖液的方法。所谓生物质，分类为包含糖或多糖的制糖作物·谷物和含纤维素生物质。作为制糖作物·谷物，可以示例出甘蔗、甘薯、玉米、甜菜、木薯、米、小麦、大豆等。作为含纤维素生物质，可以示例出蔗渣、玉米秸秆、玉米芯、树木、树皮、木屑、废建材、EFB(空果串，Empty fruits bunch)、椰子壳、象草、紫狼尾草、蔗茅、柳枝稷、麦秸、稻秸、芦竹、竹、咖啡渣·茶渣等。即，本发明中的糖水溶液，是以这样的生物质为原料的糖液，是由前述生物质经过提取、浓缩、水解、晶析等工序而获得的糖水溶液，此外，是指至少包含后述的糖和发酵抑制物质的糖水溶液。

作为这样的糖水溶液，可举出由制糖作物·谷物通过制糖工序获得的废糖蜜(molasses：砂糖晶析后的母液或其浓缩物)、将含纤维素生物质进行水解而得的糖水溶液作为优选例。

糖水溶液中包含作为杂质的发酵抑制物质。所谓发酵抑制物质，是源自前述生物质中所包含的成分的化合物，或者由前述生物质通过化学转化生成的化合物，是指对利用微生物的发酵生产起抑制作用的化合物群。这里所说的抑制，是指由于存在发酵抑制物质，1)利用微生物的糖消耗慢，或者2)微生物的增殖慢，3)微生物的发酵产物的产量减少。对于这些1)～3)，通过将不包含发酵抑制物质的培养基作为基准来进行比较，可以确认抑制的有无。此外，具体而言，作为发酵抑制物质，可以示例出呋喃系化合物、芳香族化合物、有机酸等，特别是在本发明中，可以通过将呋喃系化合物、芳香族化合物分解而使其降低。呋喃系化合物是指具有呋喃骨架的化合物群，可以示例出糠醛、羟甲基糠醛等，前者通过从木糖转换而生成，后者通过从葡萄糖转换而生成。作为芳香族化合物，是具有芳香环的化合物，可以示例出香草醛、香草酸、丁香酸、香豆酸、香豆酰胺、阿魏酸、阿魏酰胺等。

本发明中使用的糖水溶液，是包含选自香豆酸、香豆酰胺、阿魏酸、阿魏酰胺、香草醛、香草酸、乙酰香草酮、糠醛和3-羟甲基糠醛中的1种或2种以上化合物作为发酵抑制物质的糖水溶液。糖水溶液中是否包含这些发酵抑制物质可以通过下述方法确定：使用反相色谱(HPLC)将前述发酵抑制物质的标准品分离，通过在特定分离条件下的保留时间，可以确定糖液中是否包含发酵抑制物质。在反相色谱中，通过测定各保留时间的溶出液在180～400nm的吸光度，可以得到色谱图。此外，可以使用发酵抑制物质的标准品，预先制作标准曲线，以糖液中相应的峰面积或峰高来确定糖液中所包含的发酵抑制物质的浓度。这样的分析可以将糖液浓缩或稀释，配合使用的分析方法或装置进行即可。

另外，所谓糖水溶液中包含选自香豆酸、香豆酰胺、阿魏酸、阿魏酰胺、香草醛、香草酸、乙酰香草酮、糠醛和3-羟甲基糠醛中的1种或2种以上发酵抑制物质，是指这些物质以能够检测的范围包含于糖水溶液中，优选包含1mg/mL以上，更优选为10mg/mL以上，进一步优选为100mg/L以上。此外，在本发明中的糖液的制造方法中，可以包含多种这些发酵抑制物质，可以包含2种以上、3种以上、4种以上。

糖水溶液中至少包含糖。所谓糖，是指单糖、多糖中溶解于水的成分，至少含有包含1个这样的糖的单糖或二糖、三糖。作为糖的具体例子，可以示例出葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、木糖醇、阿糖醇、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、纤维二糖、纤维三糖、木二糖、木三糖、麦芽糖、海藻糖等。本发明的糖水溶液中的糖浓度为0.01g/L以上，优选为0.1g/L以上，进一步优选为1g/L以上，最优选为10g/L以上，包含至少1种以上前述糖。

进而，除了前述发酵抑制物质和糖以外，糖水溶液中还可包含无机盐、有机酸、氨基酸、维生素等。作为无机盐，可以示例出钾盐、钙盐、钠盐、镁盐等。作为有机酸，可以示例出乳酸、柠檬酸、乙酸、甲酸、苹果酸、琥珀酸等。作为氨基酸，可以示例出谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸等。

在生物质是含纤维素生物质的情况下，糖水溶液是通过在将含纤维素生物质进行选自酸处理、碱处理、水热处理、酶处理中的1种以上处理中进行水解而获得的。所谓水解，是将含纤维素生物质中包含的纤维素、半纤维素等多糖水解为单糖或寡糖的处理，除了这些单糖或寡糖以外，水解物中还包含发酵抑制物质。

所谓酸处理，是通过将硫酸、乙酸、盐酸、磷酸等酸添加到生物质中进行的。此外，在酸处理中，可以进行水热处理。在进行硫酸处理的情况下，硫酸的浓度优选为0.1～15重量％，更优选为0.5～5重量％。反应温度可以设定在100～300℃的范围内，优选设定在120～250℃。反应时间可以设定在1秒～60分钟的范围内。对处理次数不特别限定，将前述处理进行1次以上即可。特别是在将上述处理进行2次以上的情况下，可以在不同的条件下进行第1次和第2次以后的处理。

所谓碱处理，是通过将氨、苛性钠、氢氧化钾等碱添加到生物质中进行的。此外，在碱处理中可以进行水热处理。氨处理依照日本特开2008-161125号公报或日本特开2008-535664号公报中记载的方法进行。例如，使用的氨浓度相对于生物质以0.1～15重量％的范围添加，在4～200℃、优选为在90～150℃下进行处理。添加的氨可以是液体状态或气体状态中的任一种。进而，添加的形态可以是纯氨或氨水溶液的形态。对处理次数不特别限定，将前述处理进行1次以上即可。特别是在将前述处理进行2次以上的情况下，可以在不同的条件下进行第1次和第2次以后的处理。

所谓水热处理，是通过对含纤维素生物质不添加酸和碱而只添加水并进行加热，从而进行处理的方法。在水热处理的情况下，添加水使生物质为0.1～50重量％，然后在100～400℃的温度下进行1秒～60分钟处理。通过在这样的温度条件下进行处理，纤维素发生了水解。对处理次数不特别限定，将该处理进行1次以上即可。特别是在将该处理进行2次以上的情况下，可以在不同的条件下进行第1次和第2次以后的处理。

所谓酶处理，是通过向含纤维素生物质中添加糖化酶来进行水解处理。利用糖化酶的水解的pH值优选为pH值3～9的范围，更优选为pH值4～5.5，进一步优选为pH值5。为了调节pH值，可以添加酸或碱进行调节，使其成为所期望的pH值。此外，可以使用适当的缓冲液。在酶处理中，为了促进纤维素和酶的接触，并且为了使水解物的糖浓度均匀，优选进行搅拌混合。优选加水使纤维素的固体成分浓度成为1～25重量％的范围，更优选为5～20重量％的范围。

糖化酶可以优选使用源自丝状菌的纤维素酶。作为丝状菌，可以示例出木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、腐质霉属(Humicola)、枝顶孢霉属(Acremonium)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌、褐腐菌等。在这样的源自丝状菌的纤维素酶中，优选使用纤维素分解活性高的源自木霉属的纤维素酶。

所谓源自木霉属的纤维素酶，是以源自木霉属微生物的纤维素酶为主成分的酶组合物。对木霉属微生物不特别限定，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)，具体地可以示例出里氏木霉QM9414(Trichoderma reesei QM9414)、里氏木霉QM9123(TrichodermareeseiQM9123)、里氏木霉RutC-30(Trichoderma reeseiRut C-30)、里氏木霉PC3-7(Trichoderma reesei PC3-7)、里氏木霉CL-847(Trichoderma reeseiCL-847)、里氏木霉MCG77(Trichoderma reesei MCG77)、里氏木霉MCG80(Trichoderma reeseiMCG80)、绿色木霉QM9123(Trichoderma viride9123)。此外，也可以是对源自前述木霉属的微生物通过突变剂或紫外线照射等进行突变处理、从而纤维素酶生产性提高了的突变株。

源自木霉属的纤维素酶是包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶等多种酶成分，具有将纤维素水解并糖化活性的酶组合物。源自木霉属的纤维素酶在纤维素分解中，通过多种酶成分的协同效果或互补效果，从而可以进行有效的纤维素的水解。特别是本发明中使用的纤维素酶优选包含源自木霉属的纤维二糖水解酶和木聚糖酶。

所谓纤维二糖水解酶，是以从纤维素的末端部分开始水解下去为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.91记载了归属于纤维二糖水解酶的酶群。

所谓内切葡聚糖酶，是以从纤维素分子链的中央部分开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.4、EC3.2.1.6、EC3.2.1.39、EC3.2.1.73记载了归属于内切葡聚糖酶的酶群。

所谓外切葡聚糖酶，是以从纤维素分子链的末端开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.74、EC3.2.1.58记载了归属于外切葡聚糖酶的酶群。

所谓β葡糖苷酶，是以作用于纤维寡糖或纤维二糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.21记载了归属于β葡糖苷酶的酶群。

所谓木聚糖酶，是以作用于半纤维素或特别作用于木聚糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.8记载了归属于木聚糖酶的酶群。

所谓木糖苷酶，是以作用于木寡糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.37记载了归属于木糖苷酶的酶群。

作为源自木霉属的纤维素酶，优选使用粗酶物。粗酶物源自在为了使木霉属的微生物产生纤维素酶而调制的培养基中将该微生物培养任意时间而得的培养上清。对使用的培养基成分不特别限定，但是为了促进纤维素酶的产生，一般可以使用添加了纤维素的培养基。而且，作为粗酶物，优选直接使用培养液，或使用仅除去了木霉菌体的培养上清。

对粗酶物中的各酶成分的重量比不特别限定，例如，源自里氏木霉的培养液中含有50～95重量％的纤维二糖水解酶，其余成分包含内切葡聚糖酶、β葡糖苷酶等。此外，木霉属的微生物在培养液中产生强的纤维素酶成分，另一方面由于β葡糖苷酶保持在细胞内或细胞表层，因而培养液中的β葡糖苷酶活性低，因此可以在粗酶物中进一步添加异种或同种的β葡糖苷酶。作为异种的β葡糖苷酶，可以优选使用源自曲霉属的β葡糖苷酶。作为源自曲霉属的β葡糖苷酶，可以示例出由ノボザイム社市售的Novozyme188等。作为在粗酶物中添加异种或同种的β葡糖苷酶的方法，可以是培养以向木霉属的微生物导入基因使其在其培养液中产生β葡糖苷酶的方式进行基因重组而得的木霉属的微生物，分离其培养液的方法。

优选将前述酸处理、碱处理、水热处理、酶处理适当进行多种组合，更优选对进行了酸处理、碱处理或水热处理的含纤维素生物质进一步进行酶处理。

在本发明中，将前述糖水溶液中所包含的发酵抑制物质通过无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物、优选为无葡萄糖和木糖同化性的微生物进行分解处理。所谓发酵抑制物质的分解处理，是指发酵抑制物质由于微生物或酶的作用而伴随化学结构变化，通过发酵抑制物质的低分子量化、氢氧化而使微生物毒性降低。在本发明中，在发酵抑制物质的分解处理中，使用无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物或源自该微生物的粗酶物。这样能够有效地分解除去大范围的发酵抑制物质。

本发明中的所谓无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物，是以在该微生物生长的培养基和培养条件下(最适pH值、最适温度、最适通气条件)，实质上作为碳源不消耗木糖和/或葡萄糖为特征的微生物。此外，例如，作为专性好氧菌已知的绿脓杆菌(Pseudomonasuaeruginosa)等在厌氧条件下同化葡萄糖和/或木糖，在好氧条件下消耗，像这种根据条件而不同化葡萄糖和/或木糖的微生物也包含在本发明所说的“无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物”中。另外，也可以是通过导入基因重组、基因变异而使葡萄糖和/或木糖同化性消失了的微生物。

作为本发明中可以优选使用的无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物，可以示例出属于戴尔福特菌属(Delftia.sp)、丛毛单胞菌属(Comamonas.sp)、Derxomyces.sp、Fellomyces.sp的微生物，其中更优选具有优异发酵抑制物质分解能力的戴尔福特菌属微生物。

作为戴尔福特菌属微生物，可以示例出食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)、湖生戴尔福特菌(Delftia lacustris)、鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)、对虾戴尔福特菌(Delftia litopenaei)。

另外，是否为戴尔福特菌属微生物的鉴定可以如下进行：确定作为鉴定对象的微生物的16S rDNA的碱基序列，与湖生戴尔福特菌(Delftia·lacustris322株：AccessionNo.EU888308)的16S rDNA的碱基序列进行序列比较，如果序列同一性为93％以上，则可以鉴定是戴尔福特菌属。

作为根据前述鉴定方法鉴定的微生物，也存在不归属于戴尔福特菌属、属名不同的微生物，但是只要具有不同化葡萄糖和/或木糖的特性、以及分解发酵抑制物质的特性，就可以作为本发明中包含于戴尔福特菌属微生物的微生物而用于本发明的糖液的制造方法。作为包含可能作为前述16S RNA的序列为93％以上的微生物而被包含、且具有分解发酵抑制物质特性的微生物的具体的微生物属名，可以示例出丛毛单胞菌属(Comamonas)、食酸菌属(Acidovorax)、吉斯伯吉氏菌属(Giesbergeria)、简单螺旋形菌属(Simplicispira)、嗜脂环物菌属(Alicycliphilus)、有益杆菌属(Diaphorobacter)、栖温胞菌属(Tepidecella)、嗜异生质菌属(Xenophilus)、短枝单胞菌属(Brachymonas)等。这些均是与戴尔福特菌属近缘的微生物，可能可以用于本发明。

此外，所谓源自无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物的粗酶物，是指包含2种以上源自前述微生物的酶成分的成分。这样的粗酶物可以通过将无葡萄糖和木糖同化性的微生物在适当的培养基中进行培养，从培养的菌体提取粗酶液进行调制。此外，通过分离无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物的基因，将基因导入适当的宿主并使基因表达，还可以作为异源重组蛋白质生产酶。优选为对无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物进行培养并从该微生物提取酶而得的成分，优选未进行特殊纯化操作的成分。由于粗酶物中包含2种以上酶成分，因此可以将多种发酵抑制物质同时分解且分解至抑制降低了的化合物。

发酵抑制物质的分解处理是通过将包含前述发酵抑制物质的糖水溶液和前述微生物或源自前述微生物的粗酶物混合，并在前述微生物的生长最适温度或生长最适pH值条件下孵育而进行的。作为具体的温度条件，优选为20～40℃的范围，更优选为25℃～32℃的范围。此外，pH值条件优选为pH值6.5～10的范围，更优选为pH值7～8.5的范围。

被分解的发酵抑制物质是选自香豆酸、香豆酰胺、阿魏酸、阿魏酰胺、香草醛、香草酸、乙酰香草酮、糠醛、3-羟甲基糠醛中的1种以上，优选为2种以上，更优选为3种以上，进一步优选为4种以上。

本发明中，将糖溶液中所包含的固体物预先通过固液分离除去即可。对固液分离的方法不特别限定，但是优选螺旋沉降器等离心分离、利用压滤机、精滤膜(微孔过滤)等的膜分离，更优选膜分离。

此外，糖水溶液还可以是用超滤膜(UF膜：Ultrafultration)进行了处理而得的。对超滤膜处理的方法不特别限定，但使用的超滤膜截留分子量为500～200,000Da，可以优选使用截留分子量10,000～50,000Da的超滤膜。特别是在使用的糖水溶液中包含在含纤维素生物质的水解中使用的酶的情况下，通过使用截留分子量小于该酶的分子量的超滤膜，能够分离回收水解中使用的酶。

作为超滤膜的材料，可以使用聚醚砜(PES)、聚1,1-二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素等材料的膜。超滤膜形状可以优选使用管状式、螺旋元件、平膜等。超滤膜的过滤可举出错流方式、死端过滤方式，在膜结垢、通量方面优选错流过滤方式。

无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物或源自该微生物的粗酶物可以从发酵抑制物质的分解处理后的糖液进行分离回收并再利用。在前述分离回收中，可以通过适当选择、组合离心分离、精滤膜、超滤膜等进行。另外，可以将前述微生物或源自前述微生物的粗酶物预先固定在树脂、凝胶、海绵、支持体等。由于通过固定化，从糖液分离微生物和粗酶成分和进行再利用变得容易，因而优选。特别是在固定微生物的情况下，优选无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物的附着性优异的纤维素海绵。

优选将由本发明获得的糖液提供给膜浓缩和/或蒸发浓缩工序来提高糖浓度。通过提高糖浓度，能够在将所获得的糖液作为原料的化学品的制造中优选使用，并且有助于保存中的稳定性、运输成本的削减，因而优选。

膜浓缩优选是利用纳滤膜和/或反渗透膜的浓缩。进而，作为膜浓缩的优选例子，通过WO2010/067785号记载的方法，即通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤，从而能够作为非透过液获得糖成分浓缩了的浓缩糖液。

所谓纳滤膜，也称为纳米过滤膜(nanofilter，NF膜)，是一般被定义为“一价离子透过、阻止二价离子的膜”的膜。是被认为具有数纳米程度的微小空隙的膜，主要用于阻挡水中的微小粒子、分子、离子、盐类等。

所谓反渗透膜，也被称为RO膜，是一般被定义为“具有包含一价离子在内的脱盐功能的膜”的膜。是被认为具有数埃至数纳米程度的超微小空隙的膜，主要用于海水淡水化、超纯水制造等离子成分除去。

作为本发明中使用的纳滤膜和/或反渗透膜的材料，可举出以乙酸纤维素系的聚合物作为功能层的复合膜(以下也称为乙酸纤维素系的反渗透膜)或以聚酰胺作为功能层的复合膜(以下也称为聚酰胺系的反渗透膜)。在这里，作为乙酸纤维素系的聚合物，可举出单独的乙酸纤维素、二乙酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸纤维素等纤维素的有机酸酯或者它们的混合物以及使用了混合酯的聚合物。作为聚酰胺，可举出以脂肪族和/或芳香族的二胺为单体的线状聚合物或交联聚合物。此外，不限定为由前述1种材料构成的膜，也可以是包含多种膜材料的膜。

纳滤膜优选使用螺旋型的膜元件。作为优选的纳滤膜元件的具体例子，可举出例如，作为乙酸纤维素系的纳滤膜元件的GE Osmonics社制GEsepa、以聚酰胺为功能层的アルファラバル社制纳滤膜元件NF99或NF99HF、以交联哌嗪聚酰胺为功能层的フィルムテック社制纳滤膜元件NF-45、NF-90、NF-200、NF-270或NF-400、或者包含以交联哌嗪聚酰胺为主成分的东丽株式会社制纳滤膜UTC60的东丽株式会社制纳滤膜元件SU-210、SU-220、SU-600或SU-610，更优选为NF99或NF99HF、NF-45、NF-90、NF-200或NF-400、或SU-210、SU-220、SU-600或SU-610，进一步优选为SU-210、SU-220、SU-600或SU-610。

作为反渗透膜的具体例子，可举出例如，除了作为东丽株式会社制聚酰胺系反渗透膜组件的超低压型的SUL-G10、SUL-G20，低压型的SU-710、SU-720、SU-720F、SU-710L、SU-720L、SU-720LF、SU-720R、SU-710P、SU-720P以外，还有包含UTC80作为反渗透膜的高压型的SU-810、SU-820、SU-820L、SU-820FA、东丽株式会社乙酸纤维素系反渗透膜SC-L100R、SC-L200R、SC-1100、SC-1200、SC-2100、SC-2200、SC-3100、SC-3200、SC-8100、SC-8200，日东电工株式会社制NTR-759HR、NTR-729HF、NTR-70SWC、ES10-D、ES20-D、ES20-U、ES15-D、ES15-U、LF10-D，アルファラバル制RO98pHt、RO99、HR98PP、CE4040C-30D，GE制GE Sepa，Filmtec制BW30-4040、TW30-4040、XLE-4040、LP-4040、LE-4040、SW30-4040、SW30HRLE-4040，KOCH制TFC-HR、TFC-ULP，TRISEP制ACM-1、ACM-2、ACM-4等。

与不进行发酵抑制物质分解处理的以往的糖液相比，本发明中所获得的糖液具有容易通过纳滤膜和/或反渗透膜这样的优点。推测这与糖液中的发酵抑制物质降低有关，但是详细要因不明。

所谓蒸发浓缩，是通过使糖液为加热和/或减压状态，从而使糖液中的水分气体化并除去，从而提高糖液浓度的方法。作为一般的装置，可以示例出蒸发器、闪蒸器、多重效用罐、喷雾干燥、冷冻干燥等。

本发明中获得的糖液中含有糖水溶液中所包含的单糖或多糖，含有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖、木二糖、木三糖等。作为这些糖液中糖成分的分析方法，可以利用HPLC，通过与标准品的比较进行定量。

本发明的糖液也可以通过进行膜浓缩和/或蒸发浓缩而制成糖固体。所谓糖固体，是指通过除去本发明的糖液中的水分，从而使水分量小于10％、优选为小于5％的固体状的物质。通过制成糖固体，具有糖中的水分或水分活性降低，从而能够降低微生物引起的污染这样的优点，还具有能够削减糖的运输成本的优点。此外，从通过本发明的糖液的制造方法获得的糖液获得的糖固体具有吸湿性低的特征。由于吸湿性低，因而保管、搬运时品质变化少，因此具有能够作为工业原料稳定地使用这样的实用上的优点。

本发明的糖液或糖固体具有杂质含量在检测限以下的特征，所述杂质为选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和组氨酸中的1种或2种以上的游离氨基酸。考虑这是因为，利用本发明中使用的无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物或源自该微生物的粗酶物来分解发酵抑制物质，结果糖水溶液中所包含的微量的游离氨基酸在微生物的增殖和/或代谢中被使用。另一方面，以肽或多肽状态被包含的氨基酸，具有在糖液或糖固体中残存一定程度的量的特征。因此，将本发明的糖液或糖固体作为发酵原料使微生物增殖时，肽或多肽状态的氨基酸可以作为微生物增殖的营养源利用。

本发明的糖液或糖固体中所包含的游离氨基酸的定量优选通过茚三酮法使用市售的氨基酸分析仪来进行测定。此外，在进行游离氨基酸分析时，可以对糖固体或将糖液干燥而得的糖固体约2mg，添加2％磺基水杨酸250μL并搅拌，然后进行10分钟超声波处理，调制出测定试样溶液，然后使用试样溶液25μL利用氨基酸分析仪进行分离定量。氨基酸分析仪优选株式会社日立制作所制的产品，最优选为氨基酸分析仪L-8800A型。

特别是对于糖固体，通过使选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和组氨酸中的1种或2种以上游离氨基酸的含量在检测限以下，优选为所有的这些游离氨基酸均在检测限以下，从而带来糖固体的吸湿性明显小这样的特征。

由本发明的糖液的制造方法获得的糖液或糖固体，通过将它们作为发酵原料来培养微生物，使糖转化为化学品，可以制造化学品。作为化学品的具体例子，可举出醇、有机酸、氨基酸、核酸等发酵工业中大量生产的物质。可举出例如，乙醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、甘油等醇，乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸等有机酸，肌苷、鸟苷等核苷，肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸，尸胺等胺化合物。还可以适用于酶、抗生素、重组蛋白质等的生产。

在将本发明中获得的糖液在用于化学品制造的发酵原料中使用的情况下，可以根据需要使其适当含有氮源、无机盐类、以及根据需要的氨基酸、维生素等有机微量营养素。进而根据情况，除了木糖之外，还可以补加葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖类、含有这些糖类的淀粉糖化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜、或乙酸等有机酸、或乙醇等醇类、甘油等作为碳源，从而作为发酵原料使用。作为氮源，使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其他辅助性使用的有机氮源、例如油粕类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其他氨基酸、维生素类、玉米浸渍液、酵母或酵母提取物、肉提取物、胨等肽类、各种发酵菌体和其水解物等。作为无机盐类，可以适当添加磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。

微生物的培养方法可以利用分批培养、补料分批培养、连续培养等公知的发酵培养方法。特别是本发明的糖液和/或浓缩糖液具有通过超滤膜等固体物被完全除去这样的特征，可以将发酵中使用的微生物通过离心分离、膜分离等方法分离回收，进行再利用。这样的微生物的分离回收和再利用可以在培养期间一边添加新的糖液和/或浓缩糖液一边连续地分离回收微生物，此外，也可以在培养结束后分离回收微生物，在下一批的培养中再利用。

实施例

以下举出实施例对本发明进行具体说明。但是，本发明不受这些限定。

(参考例1)糖浓度的测定

糖液中所包含的葡萄糖和木糖浓度在下述所示的HPLC条件下，通过与标准品的比较进行了定量。

柱：Luna NH₂(Phenomenex社制)

流动相：Milli-Q:乙腈＝25:75(流速0.6mL/分钟)

反应液：无

检测方法：RI(差示折射率)

温度：30℃。

(参考例2)发酵抑制物质的分析

水解物中所包含的芳香族化合物·呋喃系化合物在下述所示的HPLC条件下，通过与标准品的比较进行了定量。另外，各分析样品以3500G进行10分钟离心分离，将其上清成分提供给下述分析。

柱：Synergi HidroRP 4.6mm×250mm(Phenomenex制)

流动相：乙腈-0.1％H₃PO₄(流速1.0mL/min)

检测方法：UV(283nm)

温度：40℃。

乙酸、甲酸在下述所示的HPLC条件下，通过与标准品的比较进行了定量。另外，各分析样品以3500G进行10分钟离心分离，其上清成分提供给下述分析。

柱：Shim-Pack和Shim-Pack SCR101H(株式会社岛津制作所制)的串联

流动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/min)

反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/min)

检测方法：电导率

温度：45℃。

(参考例3)源自木霉属的纤维素酶的调制

源自木霉属的纤维素酶通过以下的方法来调制。

[前培养]

以玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加到蒸馏水中，将100mL加入500mL带挡板的三角烧瓶中，在121℃下高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加了另外分别在121℃下高压釜灭菌15分钟的PE-M和Tween80各0.01％(w/vol)。在该前培养培养基中接种里氏木霉PC3-7使其为1×10⁵个/mL，以28℃、72小时、180rpm振荡培养，作为前培养(振荡装置：TAITEC社制BIO-SHAKER BR-40LF)。

[主培养]

以玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、纤维素(Avicel，微晶纤维素)10％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14％(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加到蒸馏水中，将2.5L加入5L容量的搅拌罐(ABLE社制DPC-2A)容器中，在121℃下高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加另外分别在121℃下高压釜灭菌15分钟的PE-M和Tween80各0.1％，接种了250mL预先通过前述的方法在液体培养基中进行了前培养的里氏木霉PC3-7。然后，以28℃、87小时、300rpm、通气量1vvm进行培养，离心分离后，将上清进行膜过滤(ミリポア社制ステリカップ-GV材质：PVDF)。对以该前述条件调制的培养液，将β-葡糖苷酶(Novozyme188)以蛋白质重量比添加1/100量，将所得产物作为源自木霉属的纤维素酶在以下实施例中使用。

(实施例1)含纤维素生物质前处理物的调制

1.含纤维素生物质前处理物1的调制(氨处理)

使用稻秸作为含纤维素生物质。将稻秸放入小型反应器(耐压硝子工业制、TVS-N230ml)中，用液氮进行冷却。使氨气流入该反应器中，使试样完全浸渍在液氨中。关闭反应器的盖，在室温下放置约15分钟。接着，在150℃的油浴中进行1小时处理。处理后，将反应器从油浴中取出，在通风中立即泄去氨气，然后进一步用真空泵将反应器内抽真空至10Pa而使其干燥。将其作为生物质前处理物1用于以下实施例中。

2.含纤维素生物质前处理物2的调制(水热处理)

使用稻秸作为含纤维素生物质。将稻秸浸渍在水中，边搅拌边在210℃下进行20分钟高压釜处理(日东高压株式会社制)。处理后使用离心分离(3000G)进行固液分离为溶液成分(以下为水热处理液)和处理生物质成分。将所获得的水热处理液作为生物质前处理物2用于以下实施例中。

(实施例2)含纤维素生物质(实施例1的各前处理物)的水解

向由实施例1调制的生物质前处理物1(0.5g)中添加蒸馏水，添加由参考例3调制的源自木霉属的纤维素酶0.5mL，进一步添加蒸馏水使总重量为10g，用稀释硫酸或稀释苛性钠调节使pH值在4.5～5.3的范围。此外，相对于由实施例1调制的水热处理液10g，添加由参考例3调制的源自木霉属的纤维素酶0.1mL进行调制使总重量为10.1g，用稀释硫酸或稀释苛性钠调节使pH值在4.5～5.3的范围。

将调节了pH值的上述2种组合物移至带分支试管(东京理化器械株式会社制将本组合物移至带分支反应容器(东京理化器械株式会社制在50℃下保温和搅拌24小时进行水解(东京理化器械株式会社制：小型机械搅拌器CPS-1000、转换适配器、带三向龙头的添加口、保温装置MG-2200)。将水解物通过离心分离(3000G，10分钟)进行固液分离，分离为溶液成分(6mL)和固体物。将所获得的溶液成分进一步通过精滤膜(GE社制注射器过滤器)进行过滤，将所得滤液作为水解物1(源自生物质前处理物1)和水解物2(源自生物质前处理物2)。

此外，通过稀硫酸处理进行生物质的水解。将作为生物质的玉米芯浸渍在硫酸水(0.5重量％)中，边搅拌边在180℃下进行10分钟高压釜处理(日东高压株式会社制)。处理后使用离心分离(3000G)进行固液分离为溶液成分(以下为稀硫酸处理液)和处理生物质成分。将该稀硫酸处理液进一步通过精滤膜(GE社制注射器过滤器)进行过滤，将所得的滤液作为水解物3。

前述水解物1～3的糖浓度(葡萄糖和木糖浓度)和发酵抑制物质浓度通过参考例1和参考例2记载的方法进行了测定。将从前处理生物质1获得的水解物作为水解物1、从水热处理液获得的水解物作为水解物2用于以下实施例中。此外，将水解物1～3的糖分析、芳香族化合物的分析结果汇总于表1。

表1

	水解物1	水解物2	水解物3
				葡萄糖(g/L)	17.5	5	4
木糖(g/L)	11.0	14	11
				糠醛(mg/L)	2	600	452
羟甲基糠醛(mg/L)	1.5	120	98
				香草醛(mg/L)	90	12	13
阿魏酸(mg/L)	0.6	2	0
				阿魏酰胺(mg/L)	320	0	0
香豆酸(mg/L)	0	0	0
				香豆酰胺(mg/L)	120	0	0

在水解物1～3的芳香族化合物的分析中，虽然任意任一水解物所包含的成分或浓度有差异，但是可以确认包含选自香豆酸、香豆酰胺、阿魏酸、阿魏酰胺、香草醛、香草酸、乙酰香草酮、糠醛和3-羟甲基糠醛中的1种或2种以上的发酵抑制物质。

(实施例3)利用无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物分解发酵抑制物质

1.供试菌和前培养

作为无葡萄糖和/或木糖同化性的微生物，使用了戴尔福特菌属微生物(食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)NBRC14950、鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)NBRC16741)。供试菌分别在TB培养基(pH值7)中培养，进行24h振荡培养。培养后，菌体通过离心分离进行回收。

2.发酵抑制物质分解处理

将由实施例2获得的水解物1、水解物2、水解物3调节到pH值7，添加进行了前述前培养的菌体使O.D.600＝10。在30℃下保温24小时，然后，将所得糖液离心分离(15,000rpm、10min)，测定所得糖液上清中的糖浓度和发酵抑制物质浓度。将测定结果示于表2和表3。另外，将对水解物1、水解物2、水解物3用食酸戴尔福特菌进行了分解处理而得的糖液作为“糖液1DA”、“糖液2DA”、“糖液3DA”用于后述实施例。此外，将对水解物1、水解物2、水解物3用鹤羽田戴尔福特菌进行了分解处理而得的糖液作为“糖液1DT”、“糖液2DT”、“糖液3DT”。

表2

利用食酸戴尔福特菌的发酵抑制物质分解处理

	糖液1DA	糖液2DA	糖液3DA
				葡萄糖(g/L)	17.5	5	4
木糖(g/L)	11.0	14	11
				糠醛(mg/L)	0	14	20
羟甲基糠醛(mg/L)	0	18	16
				香草醛(mg/L)	0	2	9
阿魏酸(mg/L)	0	0	0
				阿魏酰胺(mg/L)	5	0	0
香豆酸(mg/L)	0	0	0
				香豆酰胺(mg/L)	10	0	0

表3

利用鹤羽田戴尔福特菌的发酵抑制物质分解处理

	糖液1DT	糖液2DT	糖液3DT
				葡萄糖(g/L)	17.5	5	4
木糖(g/L)	11.0	14	11
				糠醛(mg/L)	0	14	20
羟甲基糠醛(mg/L)	0	18	13
				香草醛(mg/L)	0	2	9
阿魏酸(mg/L)	0	0	0
				阿魏酰胺(mg/L)	5	0	0
香豆酸(mg/L)	0	0	0
				香豆酰胺(mg/L)	10	0	0

如表2和表3所示，确认了由于戴尔福特菌属微生物，作为发酵抑制物质的糠醛、羟甲基糠醛、香草醛、香豆酸、香豆酰胺、阿魏酰胺、阿魏酸的量减少。另一方面，可以确认糖液中的葡萄糖和木糖没有减少。

(比较例1)利用具有葡萄糖和木糖同化性的微生物的比较

作为具有葡萄糖和木糖同化性的微生物，使用了大肠杆菌JM109株(タ力ラバイ才株式会社)、酿酒酵母OC2株。供试菌分别在LB培养基(pH值7)培养，进行了24小时振荡培养。24小时培养后，通过离心分离回收菌体。

向由实施例2和实施例3获得的水解物1、水解物2、水解物3中添加进行了前述前培养的菌体使O.D.₆₀₀＝10。在30℃下保温24小时，然后，将所得糖液离心分离(15，000rpm、10min)，测定上清中的糖浓度和发酵抑制物质浓度。将测定结果示于表4和表5。

表4

大肠杆菌(JM109株)

	水解物1	水解物2	水解物3
				葡萄糖(g/L)	6.4	2	1
木糖(g/L)	10.0	13	9
				糠醛(mg/L)	2	560	422
羟甲基糠醛(mg/L)	1.5	111	93
				香草醛(mg/L)	88	10	10
阿魏酸(mg/L)	0.6	2	0
				阿魏酰胺(mg/L)	318	0	0
香豆酸(mg/L)	0	0	0
				香豆酰胺(mg/L)	121	0	0

表5

酿酒酵母(OC2株)

	水解物1	水解物2	水解物3
				葡萄糖(g/L)	1	0	0
木糖(g/L)	11.0	14	11
				糠醛(mg/L)	0	224	148
羟甲基糠醛(mg/L)	0	58	32
				香草醛(mg/L)	88	11	10
阿魏酸(mg/L)	0.3	1	0
				阿魏酰胺(mg/L)	298	0	0
香豆酸(mg/L)	0	0	0
				香豆酰胺(mg/L)	117	0	0

在使用大肠杆菌的情况下，确认了芳香族化合物基本未减少。此外，对于酿酒酵母，确认了糠醛、羟甲基糠醛减少了一些，但是可知香豆酰胺、香豆酸、阿魏酸、阿魏酰胺、香草醛几乎未减少。此外，还可以确认关于水解物1～3中所包含的葡萄糖和木糖大幅减少。

(实施例4)乙醇发酵试验

使用通过实施例3获得的糖液，进行了作为化学品的1种的乙醇发酵评价。使大肠杆菌KO11株(ATCC55124株)在LB培养基(2mL)，在30℃下在试管中进行前培养24h。对糖液1DA、糖液2DA、糖液3DA、糖液1DT、糖液2DT、糖液3DT调节到酵母提取物(5g/L)、胨(10g/L)、氯化钠5g/L、pH值7.0，调制出发酵培养基(2mL)。对各发酵培养基添加100μL的进行了前述前培养的前培养液，在30℃下进行24小时培养。24小时培养后，通过气相色谱法(使用Shimadzu GC-2010毛细管GC TC-1(GL science)15meter L.*0.53mm I.D.，df1.5μm，通过氢火焰离子化检测器进行检测、计算并评价。)测定了各糖液中生成的乙醇蓄积浓度。

表6

糖液1DA	糖液2DA	糖液3DA
			乙醇生产量(g/L)	14.2	10.6	6.8
糖液1DT	糖液2DT	糖液3DT
			乙醇生产量(g/L)	14.6	10.2	6.2

(比较例2)乙醇发酵试验

使用水解物1～3(实施例2)，进行了作为化学品的1种的乙醇发酵评价。

表7

	水解物1	水解物2	水解物3
				乙醇生产量(g/L)	7.2	1.3	1.5

将实施例4的乙醇发酵的结果(表6)与比较例2的乙醇发酵结果(表7)进行比较，结果为由于工序(2)中发酵抑制物质降低，实施例4的乙醇发酵的乙醇产量明显高。

(实施例5)戴尔福特菌属微生物的阿魏酰胺和阿魏酸的代谢分解

为了确认实施例3的水解物中芳香族化合物的分解是否是由基于戴尔福特菌属微生物的分解造成的，在添加了阿魏酰胺的模型反应体系中，追踪了其分解产物的鉴定和生成量的变化。

在TB培养基(pH值7)培养食酸戴尔福特菌(Delftia·acidovorans)NBRC14950和鹤羽田戴尔福特菌(Delftia·tsuruhatensis)NBRC16741，进行了64小时振荡培养。培养后，通过离心分离回收各菌体。将阿魏酰胺溶解于N,N-二甲基甲酰胺而得的溶液用10mMTris-HCl缓冲液进行稀释，调制出1g/L阿魏酰胺溶液，用氢氧化钠调节到pH值10。添加前述进行了前回收的各菌体使O.D.₆₀₀＝10，在30℃下保温72小时，经时地而回收反应液。将获得的反应液进行离心分离(15,000rpm、10min)，通过参考例1的方法测定了所得反应液上清中芳香族化合物浓度。将鹤羽田戴尔福特菌的结果示于图3，将食酸戴尔福特菌的结果示于图4。如图3和图4所示，无论在哪种戴尔福特菌属中，在保温开始同时阿魏酰胺浓度都急剧减少，并且6小时后阿魏酸的生成量达峰值。此外，进一步确认了阿魏酸之后在36小时以内消失，转化为香草酸。进一步确认了香草酸进而随保温时间而减少。从以上的结果确认了，在戴尔福特菌属的微生物中，按照阿魏酰胺、阿魏酸、香草酸的顺序转换，最终香草酸也被分解。

(实施例6)戴尔福特菌属微生物的香豆酰胺和香豆酸的代谢分解

为了确认实施例3的水解物中芳香族化合物的分解是否是由基于戴尔福特菌属微生物的分解造成的，在添加了香豆酰胺的模型反应体系中，追踪了其分解产物的鉴定和生成量的变化。

以与实施例5相同的步骤，将阿魏酰胺改为香豆酰胺，进行了代谢路径的鉴定。将鹤羽田戴尔福特菌的结果示于图5，将食酸戴尔福特菌的结果示于图6。如图5和图6所示，明确了在所有的戴尔福特菌属中，香豆酰胺从保温开始至48小时以上浓度逐渐减少。此外，随着香豆酰胺的减少，香豆酸浓度上升，在保温24小时时达峰值。此外，如图5所示，在鹤羽田戴尔福特菌中，随着香豆酸的减少确认了对羟基苯甲酸的生成。同样地，在食酸戴尔福特菌中，虽然微量但确认了对羟基苯甲酸的生成。从以上的结果确认了，在戴尔福特菌属的微生物中，按照香豆酰胺、香豆酸、对羟基苯甲酸的顺序转换，最终对羟基苯甲酸也被分解。

(实施例7)利用戴尔福特菌属微生物的发酵抑制物质分解中pH值的影响

将实施例2的水解物1调节为pH值4、pH值8.5、pH值10、pH值12，以与实施例4相同的步骤进行发酵抑制物质分解处理。供试菌使用鹤羽田戴尔福特菌(Delftia·tsuruhatensis)来进行。将结果示于表8。

表8

在pH值5、pH值12中，确认了芳香族化合物的减少较少。另一方面，在pH值8、pH值10中，确认了与pH值7(实施例3)相比芳香族化合物的量减少，特别是在香豆酰胺、阿魏酰胺中，确认了明显的减少。如参考例5所示，确认了戴尔福特菌属微生物在pH值10时不生长，推测虽然在pH值10时戴尔福特菌属微生物不增殖，但是戴尔福特菌属微生物所具有的芳香族转化酶发挥功能，从而芳香族化合物的分解进行。

(参考例4)戴尔福特菌属微生物的生长最适温度

研究了戴尔福特菌属的生长最适温度。使用实施例3的鹤羽田戴尔福特菌作为供试菌，使该菌在LB培养基(5mL)，在30℃、180rpm下，在试管中进行了前培养24小时。然后，对TB培养基(5mL、pH值7)添加50μL的进行了前述前培养的前培养液，在30℃～50℃、180rpm下，进行了24小时培养。24小时培养后，测定OD₆₀₀。将结果示于表9。

表9

	20℃	30℃	35℃	40℃	50℃
						OD<sub>600</sub>	6.4	9.7	4.8	0.08	0.03

可以确认在温度20℃～35℃的范围内增殖。但是，确认了如果超过40℃就不增殖。

(参考例5)戴尔福特菌属微生物的生长最适pH值

研究了戴尔福特菌属微生物的生长最适pH值。使用鹤羽田戴尔福特菌作为供试菌，使该菌在LB培养基(5mL)，在30℃、180rpm下，在试管中进行了前培养24小时。然后，对用TB培养基(5mL、pH值7)、盐酸和氢氧化钠将pH值分别调节为4.0、8.5、10的TB培养基，添加50μL的进行了前述前培养的前培养液，在30℃、180rpm下，进行了24小时培养。24小时培养后，测定OD₆₀₀。将结果示于表10。

表10

可以确认虽然pH值为8.5以下时戴尔福特菌属增殖，但pH值为10时完全不生长。此外，pH值为4时同样不增殖。

(实施例8)将糖液进行膜浓缩(反渗透膜)的工序

通过将实施例3中记载的糖液1DA、糖液2DA、糖液3DA各1300mL分别提供给具有0.22μm孔径的精滤膜(ステリ力ツプ一GV、ミリポア社制)，从而除去所包含的微粒。将所得液体使用反渗透膜(UTC-80、东丽株式会社制)，利用平膜小型错流过滤单元(SEPA CF-II、GE才スモニクス社制、有效膜面积140cm²)，在30℃下进行过滤。过滤是在错流过滤中随时进行调节使膜间压力差时常为4MPa，膜浓缩至液量约1/4为止(4倍浓缩)。测定浓缩所需要的时间、浓缩结束时的过滤速度、浓缩后的糖浓度，将该结果示于表8。此外，作为比较例(比较例3)，使用实施例3记载的水解物1～3(不进行利用无葡萄糖和木糖同化性的微生物分解发酵抑制物质的工序)，通过前述方法以与前述相同的步骤进行膜浓缩，将该结果同样示于表11。

表11

如表11所示，进行了利用无葡萄糖和木糖同化性的微生物分解发酵抑制物质的工序的糖液，将糖液进行4倍浓缩所需要的时间缩短。此外，浓缩结束时的过滤速度也是进行了利用无葡萄糖和木糖同化性的微生物分解发酵抑制物质的工序的情况快。由此判明了通过将各水解物提供给利用无葡萄糖和木糖同化性的微生物分解发酵抑制物质的工序，糖液膜浓缩时的滤过性改善了。

(实施例9)糖固体的调制

分别量取实施例8中记载的膜浓缩后的糖液1DA、和用于比较的同样是实施例8中记载的膜浓缩后的水解物1各15mL，移至圆底烧瓶后，在-70℃下进行冷冻。利用冷冻干燥机(EYLA：东京理科机械株式会社)，将冷冻了的前述糖液和水解物1在设定为-45℃下进行48小时冷冻干燥。干燥后的重量膜浓缩后的糖液1DA为1.41g，水解物1为1.37g。

将所得的糖固体0.5g(糖固体1DA：将膜浓缩后的糖液1DA冷冻干燥而得)、糖固体水解物1(将膜浓缩后的水解物1冷冻干燥而得)分别回收到玻璃小瓶(13.5mL容量)中。然后，将小瓶的盖打开，在室温(约25℃)下放置24小时，比较外观变化。将结果示于图7。对于糖固体水解物1，将冷冻干燥物从圆底烧瓶分取至小瓶的过程中开始吸湿，打开后立即拍的照片中，颜色变深且变为块状(图7A右侧)。另一方面，对于糖固体IDA，则保持粉末(图7A左侧)。然后，将打开小瓶的盖24小时后的照片示于图7B，对于糖固体水解物1完全吸湿，已经不再是粉末，变为粘质的糖蜜(图7B左侧)。另一方面，对于糖固体1DA，24小时后也可以观察到一些外观上的体积变小，推测是发生了吸湿，但是确认了仍然保持粉末状态这一显著差别。即，能够确认本发明的糖固体由于吸湿性低，显示了在空气开放下的形态稳定性极高，具有实用上的优点。

(实施例10)氨基酸分析

由实施例9获得的糖固体水解物1和糖固体1DA中所包含的氨基酸分析通过下述步骤进行。在氨基酸分析中进行了游离氨基酸浓度的测定。分析装置使用氨基酸分析仪L-8800A型(株式会社日立制作所)，测定条件使用茚三酮法，在检测波长：440nm(脯氨酸、羟脯氨酸)、570nm(除了脯氨酸、羟脯氨酸以外的氨基酸)。

从由实施例9获得的冷冻干燥物、糖固体水解物1(1.41g)和糖固体1DA(1.37g)中分别取2.05mg放入试管中，添加2％磺基水杨酸250μL并搅拌，然后进行超声波处理10分钟。将该溶液通过0.22μm过滤器进行过滤，作为测定用试样溶液。使用25μL的该试样溶液，在前述装置条件下进行分析。将分析值示于表12。

表12

检测浓度是所分析的糖固体单位重量g中所包含的各游离氨基酸浓度(mg)。所谓浓缩糖液中浓度换算，是换算为在提供给冷冻干燥的各膜浓缩糖液15mL中存在的浓度而得的值。由分析值可以确认在糖固体水解物1中包含所有的氨基酸。另一方面，在进行了利用无葡萄糖和木糖同化性的微生物分解发酵抑制物质的糖固体1DA中，检测不到丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸的游离氨基酸(检测不到)。因此，可以确认进行冷冻干燥之前的浓缩糖液中的游离氨基酸浓度为0mg/L。即，可以确认本发明的糖液和糖固体中前述游离氨基酸浓度在检测限以下。

接着，对各糖固体中包含的氨基酸总量同样进行了分析。关于氨基酸总量，除了游离氨基酸以外，也包含以肽或多肽的状态存在的氨基酸。因此，从由实施例9获得的冷冻干燥物、糖固体水解物1(1.41g)和糖固体1DA(1.37g)中分别量取2.05mg放入试管中，添加250μL的6mol/L的盐酸，在氮置换、减压封管之后在110℃下进行22小时水解。向将其减压干燥固化后的残渣中添加200μL的0.02mol/L的盐酸并溶解。将该溶液利用0.22μm离心过滤单元进行过滤，作为测定用试样溶液。使用25μL该试样溶液利用前述装置条件进行分析。将分析结果示于表13。

表13

无论在糖固体水解物1还是在利用无葡萄糖和木糖同化性的微生物进行了发酵抑制物质的分解的糖固体1DA中，都可以从分析值确认其包含所有的氨基酸。但是，确认了糖固体1DA包含的少。即，可以确认无葡萄糖和木糖同化性的微生物所消耗的主要是游离氨基酸，以肽或多肽状态存在的氨基酸未消耗而残留在糖液中。包含这样以肽或多肽存在的氨基酸在利用微生物的发酵生产中是重要的，可作为微生物增殖的氮源来利用。

(实施例11)利用无葡萄糖和木糖同化性的微生物的发酵抑制物质的分解2：废糖蜜(Molasses)的处理

作为包含发酵抑制物质的糖水溶液，使用废糖蜜(Molasses-Agri，才ーガニツクランド株式会社)进行调制。使用的废糖蜜是使用了源自作为生物质的甘蔗的废糖蜜约90％、源自甘薯的废糖蜜约10％的混合物。将本废糖蜜用RO水(纯净水)进行6倍稀释，在121℃下进行20分钟高压釜灭菌。灭菌后添加氢氧化钠将pH值调节到6.7。作为包含发酵抑制物质的糖水溶液使用(废糖蜜糖水溶液)。将芳香族化合物的分析结果示于表14。可以确认废糖蜜糖水溶液中含有葡萄糖、果糖、蔗糖作为糖，作为发酵抑制物质，含有3-羟甲基糠醛。按照实施例3的记载，将本糖水溶液利用鹤羽田戴尔福特菌进行了处理。将所得糖液作为废糖蜜DT，将其分析值(糖和芳香族化合物)示于表14。可以确认作为发酵抑制物质被包含的3-羟甲基糠醛完全分解并从废糖蜜DT中消失。

表14

	废糖蜜糖水溶液	废糖蜜DT
			葡萄糖(g/L)	53.7	53.4
蔗糖(g/L)	38.8	38.8
			果糖(g/L)	39.9	39.5
羟甲基糠醛(mg/L)	168.5	0.0
			香草醛(mg/L)	0.0	0.0
阿魏酸(mg/L)	0.0	0.0
			阿魏酰胺(mg/L)	0.0	0.0
香豆酸(mg/L)	0.0	0.0
			香豆酰胺(mg/L)	0.0	0.0

产业上的可利用性

本发明中的糖液的制造方法可以用于由生物质制造发酵抑制降低了的糖液。此外，通过本发明制造的糖液或糖固体可以作为各种化学品的发酵原料使用。

Claims

1.糖液或糖固体，是源自含纤维素生物质或废糖蜜的糖液或糖固体，其中，杂质的含量为检测限以下，所述杂质是选自丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和组氨酸中的1种或2种以上的游离氨基酸。