CN110484483A

CN110484483A - 一种大肠杆菌菌株的制备方法

Info

Publication number: CN110484483A
Application number: CN201910736051.3A
Authority: CN
Inventors: 张沨; 王新飞; 王兴春
Original assignee: Shandong Huiguan Kangbo Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Huiguan Kangbo Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-08-09
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2019-11-22

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌菌株的制备方法，所述方法包括以下步骤：出发菌的活化，NTG诱变处理，产醇途径相关基因的转入，筛选目标突变株，本发明通过NTG诱变的方法对大肠杆菌J16进行多轮突变制作突变库，利用含有单一氨基酸的培养基进行筛选，在该过程中还加入大肠杆菌产醇途径相关基因leud，kivd和yqhd，最终获得的N65菌株能够利用L‑丙氨酸、L‑丝氨酸、L‑苏氨酸、L‑色氨酸、L‑甲硫氨酸、L‑赖氨酸、L‑苯丙氨酸、L‑谷氨酰胺、L‑谷氨酸和L‑组氨酸作为唯一碳源进行生长。

Description

一种大肠杆菌菌株的制备方法

技术领域

本发明涉及大肠杆菌菌株的制备技术领域，特别涉及一种大肠杆菌菌株的制备方法。

背景技术

蛋白质水解物是肽和氨基酸的混合物，在转化为生物燃料或化学品之前，它们的碳骨架必须通过脱氨、转氨或脱氢的酶反应从氨基中释放出来。然而，蛋白质水解产物的脱氨反应受到热力学可逆性和生物调节的双重限制。在自然界中，为了最大化养分的利用效率，微生物倾向于以氨基酸为单元将其再次合成为蛋白质，微生物缺乏多种氨基酸的降解途径。

为了使工程菌株能够将单一氨基酸或者蛋白质(20种氨基酸的混合物)定向转化为某一种或几种高附加值的生物产品，可能通过对代谢动力和生物调节进行适当地重组，使一些氨基酸可以直接脱氨基为α-酮酸,它可以通过具有广泛底物特异性的α-酮酸脱羧酶转化为许多化学物质,如醛,然后通过醇脱氢酶转化为醇类，其他氨基酸可以脱氨基成为三羧酸循环的中间体,其可以通过糖异生酶如苹果酸酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶导向生成丙酮酸(一种主要的代谢中间体)。因此通过建立突变库和定向筛选获得能够利用单一氨基酸生长特性的大肠杆菌菌株，可以实现利用其代谢通路高效的将蛋白质降解所产生的碳骨架转化为高附加值产品的目标。目前，用于L-氨基酸微生物发酵法生产的微生物菌株多是使用氨基酸类似物进行反复筛选得到。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌菌株的制备方法，以解决现有技术中微生物无法以单一氨基酸作为唯一碳源进行生长的问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种大肠杆菌菌株的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、出发菌的活化：以实验室保藏的大肠杆菌J16作为出发菌，将所述出发菌在固体培养基中划线，并在30℃-37℃的环境下培养出单菌落，将所述单菌落在液体培养基中培养，获得活化的菌体；

步骤2、NTG诱变处理：将涂布有菌体液的无菌载片置于处理源下进行诱变处理获得突变库，

所述菌体液包括活化的菌体和浓度为20％的甘油，且所述活化的菌体与所述浓度为20％的甘油的体积比为1:1；

步骤3、选择步骤2中获得的突变库中的多个单菌落涂布于筛选培养基上培养，选择能够正常生长的菌株作为目标突变株；

步骤4、产醇途径相关基因的转入：将leud，kivd和yqhd基因转入到步骤2获得的目标突变株中，得到诱变菌株；

步骤5、将步骤4中得到的目标突变株重复步骤2-4至少两次获得大肠杆菌诱变菌株N65。

可选的：所述固体培养基为LB固体培养基，所述液体培养基为LB液体培养基。

可选的：所述筛选培养基包括不含NH₄Cl的M9液体培养基中添加了单一的L-氨基酸和氨基酸类似物的培养基。

可选的：所述L-氨基酸包括20种天然氨基酸中的一种，所述氨基酸类似物包括正缬氨酸。

采用上述技术方案，通过NTG诱变的方法对大肠杆菌J16进行多轮突变制作突变库，利用含有单一氨基酸的培养基进行筛选，在该过程中还加入大肠杆菌产醇途径相关基因leud，kivd和yqhd，最终获得的N65菌株能够利用L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸和L-组氨酸作为唯一碳源进行生长。

附图说明

图1为本发明的大肠杆菌诱变菌株N65与出发菌J16的生长情况对比图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

一种大肠杆菌菌株的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、出发菌的活化：以实验室保藏的大肠杆菌J16作为出发菌，将所述出发菌在LB固体培养基中划线，并在30℃-37℃的环境下培养出单菌落，将所述单菌落在LB液体培养基中培养，获得活化的菌体；

步骤2、NTG诱变处理：NTG诱变法即N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍法，

将涂布有菌体液的无菌载片置于处理源下进行诱变处理获得突变库，

所述菌体液包括活化的菌体和浓度为20％的甘油，且所述活化的菌体与所述浓度为20％的甘油的体积比为1:1，活化的菌体需要先用无菌生理盐水洗涤活化，然后重悬菌体。

步骤3、从步骤2中获得的突变库中选择30个单菌落涂布于筛选培养基上培养，选择能够正常生长的菌株作为目标突变株；上述步骤得到的目标突变株的菌株可以利用丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺作为唯一的碳源。

其中，筛选培养基为含有2g/L的L-丙氨酸和2g/L的L-正缬氨酸的LB培养基。

步骤4、产醇途径相关基因的转入：将leud，kivd和yqhd基因转入到步骤3获得的目标突变株中，得到诱变菌株；

具体的，在本发明的实施例中，包括：

步骤501、再次进行NTG诱变处理得到突变库；

步骤502、将步骤501中得到的突变库用2g/L的L-丝氨酸和2g/L的L-正缬氨酸进行筛选：即选择步骤502中的30个单菌落接种到不同的氨基酸板上。筛选出一株能利用6种氨基酸的目标突变菌株，L-苏氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸和L-谷氨酰胺；

步骤503、将步骤502得到的目标突变菌株，转入产醇途径相关基因，得到诱变菌株；

步骤504、将步骤503得到的能够利用6种氨基酸的菌株进行第三轮NTG诱变处理得到突变库；

步骤506、将步骤504中得到的突变库用2g/L的L-丝氨酸和2g/L的L-正缬氨酸进行筛选：即选择步骤502中的30个单菌落接种到不同的氨基酸板上，筛选出一株能利用另外两种氨基酸，即L-谷氨酸和L-组氨酸作为唯一碳源的目标突变菌株；

步骤507、将步骤506得到的目标突变菌株，转入产醇途径相关基因，得到大肠杆菌诱变菌株N65。

下面观测大肠杆菌诱变菌株N65与其出发菌J16利用2g/L L-丝氨酸为唯一碳源的生长情况：

种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g。

三角瓶培养基组成为：磷酸二氢钠1-6g/L，磷酸二氢钾2-6g/L，氯化钠0.2-2g/L，硫酸镁0.5-1mM，氯化钙0.1-2mM，维生素B15-20mg/L和L-丝氨酸1-2g/L。

容量为250mL三角瓶加入三角瓶培养基100mL，121℃灭菌20分钟，冷却后接入N65，接种量为0.2％(V/V)，培养温度为37℃，摇床转速为250rpm，培养时间为15小时。

如图1所示，三角瓶培养结果显示，大肠杆菌诱变菌株N65在37℃，250rpm转速条件下培养12h后OD₆₀₀即能够达到0.23，而其出发菌J16几乎无法生长。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于：所述固体培养基为LB固体培养基，所述液体培养基为LB液体培养基。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于：所述筛选培养基包括不含NH₄Cl的M9液体培养基中添加了单一的L-氨基酸和氨基酸类似物的培养基。

4.根据权利要求3所述的大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于：所述L-氨基酸包括20种天然氨基酸中的一种，所述氨基酸类似物包括正缬氨酸。