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CN110468067B - 一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法 - Google Patents

一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法 Download PDF

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CN110468067B CN201910741881.5A CN201910741881A CN110468067B CN 110468067 B CN110468067 B CN 110468067B CN 201910741881 A CN201910741881 A CN 201910741881A CN 110468067 B CN110468067 B CN 110468067B
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Abstract

本发明提供了一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法，包括以下步骤：(1)使用选择性增菌培养基对含有环状芽孢杆菌的环境菌进行选择性增菌培养，降低非环状芽孢杆菌增殖，使环状芽孢杆菌高效增殖，所述选择性增菌培养基为含有头孢菌素类抗生素和青霉素钾的改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基；(2)将步骤(1)所得菌液在含有抗生素的哥伦比亚血琼脂平板培养，对出现溶血环的菌株进行分离，根据菌落形态进行鉴别。所述方法可进一步使用分子生物学方法对步骤(2)分离得到的菌株进行鉴定。本发明可简单快速的从环境菌对环状芽孢杆菌进行分离鉴定，具有较高的筛查精度。

Description

一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法。
背景技术
芽孢杆菌属 （Bacillus）是一种革兰阳性、有氧或兼性厌氧的内生孢子杆状细菌，因产抗逆性内生孢子，使芽孢杆菌属的微生物能够抵抗各种极端环境，如高温、极酸、极盐，且对各种杀菌剂具有抵抗力。芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等近50种。
常规对芽孢杆菌属的检测方法是根据菌落、菌体特征结合菌种鉴定材料进行判断， 而面对表型特征不明显或含有多种微生物的样品时容易出现误判现象，这些传统的微生物鉴定方法不能满足样本检测中的快速、准确的需要。基于DNA序列的特异(引物) 分子生物学技术是当今快速、准确鉴定菌种的方法之一。然而，当环境菌中杂菌数量过多时，大大增加了鉴定的工作量，导致工作效率低下。
环状芽孢杆菌是一种芽孢杆菌属条件致病菌，常在被土壤污染的食物以及食品包装用纸中筛出。为了保证食品包装用纸安全，对环状芽孢杆菌进行快速高效的分离鉴定具有很强的应用价值和社会意义，目前还没有可简单快速对环状芽孢杆菌从环境菌中进行分离鉴定的方法。
发明内容
本发明克服现有技术的缺点与不足，提供一种简单快速的环状芽孢杆菌分离鉴定方法。
本发明具体技术方案如下：
一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法，包括以下步骤：
（1）使用选择性增菌培养基对含有环状芽孢杆菌的环境菌进行选择性增菌培养，降低非环状芽孢杆菌增殖，使环状芽孢杆菌高效增殖，所述选择性增菌培养基为含有头孢菌素类抗生素和青霉素钾的改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基；
（2）将步骤（1）所得菌液在含有抗生素的哥伦比亚血琼脂平板培养，对出现溶血环的菌株进行分离，根据菌落形态进行鉴别。
本发明选择改良胰蛋白大豆肉汤作为基础培养基而不选用芽孢杆菌的增菌培养基，目的是为了降低其他高营养需求的芽孢杆菌的优势增殖。
优选的，所述步骤（1）选择性增菌培养基还可以通过高盐和调节pH抑制大部分不耐盐不耐碱细菌的生长，高效增强环状芽孢杆菌增殖。优选的，使用质量百分比7%的NaCl%，调节选择性增菌培养基pH=8。
本发明所述头孢菌素类抗生素优选为头孢噻呋或其盐，如所述头孢噻呋钠，优选选择性增菌培养基中头孢噻呋或其盐的含量为50-500μg/mL，青霉素钾含量为10-30U/mL。
更优选的，所述步骤（1）选择性增菌培养基还可以含有多黏菌素和/或萘啶酮酸或其盐，如萘啶酮钠，进一步抑制杂菌的生长。
本发明使用头孢菌素类抗生素、多黏菌素和/或萘啶酮酸或其盐抑制杂菌生长，使用青霉素钾使环状芽孢杆菌相对于其他芽孢杆菌优势增长，有利于后续的平板分离鉴定。
本发明所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，所述步骤（2）抗生素为香豆素类抗生素和/或萘啶酮酸或其盐，如萘啶酮钠。优选的，香豆素类抗生素为新生霉素。
本发明所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，所述步骤（1）和（2）的培养温度为36℃，培养24小时。
本发明所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，还包括步骤（3）使用分子生物学方法对步骤（2）分离得到的菌株进行鉴定。
所述分子生物学方法为现有技术下常规使用的方法，如16S rRNA/ rDNA 序列分析、随机扩增多态性 DNA、基因间重复序列分析技术、变性梯度凝胶电泳标记技术、特异PCR、多重 PCR、荧光定量 PCR中的一种或几种，优选16S rRNA/rDNA序列分析。
本发明另一目的在于提供一种环状芽孢杆菌选择性增菌培养基，包括改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基、头孢菌素类抗生素、青霉素钾。改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基为现有技术常规使用的培养基，可以商业购买或者按照配方配制。
优选的，环状芽孢杆菌选择性增菌培养基配方为：
胰蛋白胨 17.0 g
大豆蛋白胨 3.0 g
磷酸二氢钾（无水） 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
氯化钠 70 g
蒸馏水 1000.0 mL
各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，121 ℃灭菌15 min，加抗生素备用。
添加抗生素：
多黏菌素溶液：称取10mg多黏菌素B于10mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。每1000mL选择性增菌培养基添加10mL多黏菌素溶液。 头孢噻呋钠溶液：称取50mg头孢噻呋钠于10mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。每1000mL培养基添加10mL头孢噻呋钠溶液。 萘啶酮酸钠溶液：称取10mg萘啶酮酸于10mL0.05mol/L氢氧化钠溶液中，振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。每1000mL培养基添加10mL萘啶酮酸钠溶液。
青霉素钾溶液：称取10mg青霉素钾40万U于10mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。每1000mL培养基添加5mL青霉素钾溶液。
本发明另一目的在于提高一种用于环状芽孢杆菌分离鉴定的平板培养基，包括哥伦比亚血琼脂、香豆素类抗生素和/或萘啶酮酸或其盐。
哥伦比亚血琼脂为现有技术常规使用的培养基，可以商业购买或者按照配方配制。
优选的，平板培养基配方为：
胰酪蛋白胨 12.0 g
动物组织蛋白消化液 5.0 g
酵母提取物 3.0 g
牛肉提取物 3.0 g
玉米淀粉 1.0 g
氯化钠 5.0 g
琼脂 13.5 g
蒸馏水 1000.0 mL
各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，121 ℃灭菌15 min，加无菌脱纤维羊血5mL/100mL及抗生素摇匀后分装备用。
添加抗生素：
新生霉素 0.01 g
萘啶酮酸钠 0.01 g。
本发明优点：
本发明能够有效、快速从环境菌中筛出环状芽孢杆菌，筛查精度较高。
附图说明
图1为实施例4 PCR扩增电泳结果。
图2为实施例4培养24小时后培养状态图片。
图3为实施例4菌株测序结果。
图4为根据软件MEGA构建的菌株X1的进化树。
图5为根据软件MEGA构建的菌株X2的进化树。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1：最佳培养条件的确立
一般选择性增菌培养基的选择，是在基础培养基的基础上添加其他菌敏感、目标菌不敏感的营养成分或者抗生素成分。本实施例基础培养基为改良胰蛋白大豆肉汤，不选用芽孢杆菌的增菌培养基，是为了降低其他高营养需求的芽孢杆菌的优势增殖。
样品的准备：本实验的筛查主体为市场上购买及日常监督抽查及企业送检的食品接触性用纸。
对照品：取经实验验证无任何杂菌生长的样品25g，分别添加阳性菌株：环状芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、溶血性链球菌，获得1~9×104 /mL浓度的菌液（菌株接种营养肉汤，36℃培养24小时后的浓度范围为1~9×108，稀释104倍）添加100µL。制成单一性阳性样品。
基础阳性样品：取经检验有杂菌的样品取25g作为基础阳性样品。
培养基的配制：
胰蛋白胨 17.0 g
大豆蛋白胨 3.0 g
磷酸二氢钾（无水） 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
附加添加物/条件：
NaCl%（W/V）：3%，5%，7%
pH：6，7，8，9
蒸馏水 1000.0 mL
各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，121 ℃灭菌15 min。
实验操作：
将添加了不同阳性菌株单一阳性样品和基础阳性样品各25g分别加入添加有3%，5%，7% NaCl以及培养基pH 6，7，8，9条件下的增菌培养基225mL，进行18小时增菌培养，肉眼观察增菌液的浓度，分别考察杂菌和环状芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、溶血性链球菌的生长情况。
实验结果如表1所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
根据培养基中菌液浓度分为+++、++、+以及未观察到生长的-。
结果表明，环状芽孢杆菌在NaCl含量7%、pH8、培养温度36℃可以达到高效增菌，并大部分不耐盐细菌的生长受到抑制。
实施例2：抗生素和抑菌化合物选择
由于环境微生物组成比较复杂，在增菌过程中杂菌过多会在后期的鉴定过程中具备更多干扰，本实施例目的是通过在前增菌培养基中添加抗生素实现在众多微生物中环状芽孢杆菌的筛查，根据不同微生物对不同抗生素的敏感度，抑制杂菌生长，而保证环状芽孢杆菌优势增长。选用以下抗生素和抑菌化合物进行实验：
（1）头孢类抗生素抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、阴性菌均有效。敏感菌为多杀性巴氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌、链球菌、葡萄球菌等，某些铜绿假单胞、肠球菌耐药。
（2）盐酸林可霉素属于抑菌剂，敏感菌包括金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、梭杆菌及大多数放线菌等。
（3）新生霉素对革兰阳性球菌和杆菌(包括厌氧菌)的抗菌作用基本与青霉素相同，对粪肠球菌的作用较青霉素强。革兰阴性细菌中脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌、奇异变形杆菌、沙门菌等皆敏感。某些大肠埃希菌及某些志贺菌属也对敏感，但多数志贺菌属耐药，其他肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、脆弱拟杆菌等对其耐药。
（4）多粘菌素对革兰氏阴性菌作用较强。对绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜血杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、百日咳杆菌、巴斯德菌和弧菌等革兰氏阴性菌有抗菌作用。
（5）萘啶酮酸钠：抗细菌性合成化合物之一，具有宽广的抗菌谱，特别对革兰氏阴性菌有很强的效力。
在实施例1的含有7%NaCl、pH8的培养基基础上，根据表2分别添加相应的抗生素/抑菌剂，参照实施例1的方法制备对照品和基础阳性样品：
对照品：取经实验验证无任何杂菌生长的样品25g，分别添加阳性菌株：铜绿假单胞（革兰氏阴性菌）、金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）、环状芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，获得1~9×104 /mL浓度的菌液（菌株接种营养肉汤，36℃培养24小时后的浓度范围为1~9×108，稀释104倍）添加100µL。制成单一性阳性样品。
基础阳性样品：取经检验有杂菌的样品取25g作为基础阳性样品。
考察杂菌以及铜绿假单胞（革兰氏阴性菌）、金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）、环状芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌在不同的抗生素环境下的生长情况，实验操作参照实施例1。实验结果如表2所示。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE003
根据培养基中菌液浓度分为+++、++、+以及未观察到生长的-。
结果表明头孢噻呋钠可明显抑制大部分杂菌的生长，与新生霉素、萘啶酮酸钠、多粘菌素联用效果更好，但是这些抗生素对及环状芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌无抑制作用。青霉素钾10-30U/mL可明显抑制赖氨酸芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的生长，但是对环状芽孢杆菌无抑制作用。
根据实验结果确定合理的增菌培养基为
选择性增菌培养基：
胰蛋白胨 17.0 g
大豆蛋白胨 3.0 g
磷酸二氢钾（无水） 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
氯化钠 70 g
蒸馏水 1000.0 mL
调节培养基pH 8，
各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，121 ℃灭菌15 min，加抗生素备用。
添加抗生素：
多黏菌素溶液：称取10 mg多黏菌素B于10 mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀， 充分溶解后过滤除菌。每1000mL培养基添加10mL多黏菌素溶液。 头孢噻呋钠溶液：称取50 mg头孢噻呋钠于10 mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀， 充分溶解后过滤除菌。每1000mL培养基添加10mL头孢噻呋钠溶液。 萘啶酮酸钠溶液：称取10 mg萘啶酮酸于10 mL 0.05 mol/L氢氧化钠溶液中，振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。每1000mL培养基添加10mL萘啶酮酸钠溶液。
青霉素钾溶液：称取10 mg青霉素钾40万U于10 mL灭菌蒸馏水中，振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。每1000mL培养基添加5mL青霉素钾溶液。
实施例3：哥伦比亚血琼脂平板分离鉴定
根据实施例1和2的实验结果确定结合不同阳性菌株在抗生素中的生长状况，确定添加了新生霉素和萘啶酮酸钠抗生素的哥伦比亚血琼脂平板为分离鉴定培养基。
哥伦比亚血琼脂
胰酪蛋白胨 12.0 g
动物组织蛋白消化液 5.0 g
酵母提取物 3.0 g
牛肉提取物 3.0 g
玉米淀粉 1.0 g
氯化钠 5.0 g
琼脂 13.5 g
蒸馏水 1000.0 mL
各成分溶于蒸馏水中，加热溶解，121 ℃灭菌15 min，加无菌脱纤维羊血5mL/100mL及抗生素摇匀后分装备用。
添加抗生素：
新生霉素 0.01 g
萘啶酮酸钠 0.01 g
样品：取经检验有杂菌的样品取25g作为基础阳性样品，在基础阳性样品中添加铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌阳性菌株作为验证用实验样品备用。
接增菌液后，36℃培养24小时，在改良后的培养基上生长，挑选出现溶血环的菌落形态为1~3mm，米色，不透明，中有轻微突起，边缘不规则的单菌落，采用16S rRNA方法进行最后确定。
由于枯草芽孢杆菌在培养48小时后也会出现溶血环，因此必须在培养24小时后进行观察。
确定增菌培养基和分离鉴定培养基后，使用验证样品，重复以上实验步骤，最后在血琼脂平板上得到产生溶血环的不优势生长菌落X1和优势生长菌落X2，根据菌落形态，X2疑为环状芽孢杆菌。采用16SrRNA进行进一步鉴定。
实施例4：16SrRNA的扩增及序列测定
先将X1、X2用营养肉汤分别纯化培养，并在营养琼脂平板上划线培养，形成单个菌落，如图2所示。从平板上挑取单菌落未知菌X1（边缘光滑中午突起米色菌落）和X2（符合环状芽孢杆菌特征菌落），移入NB液体培养基培养，取对数生长期新鲜菌液1mL，12000g离心3min收集菌体，双蒸水洗涤一次，60μL双蒸水悬浮细胞，100℃水浴2min，13000g高速离心1min，上清作为DNA模板，-20℃备用，参考细菌通用引物序列，上游引物F1:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’ （SEQ ID No：3），下游引物R1:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ （SEQID No：4），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
反应体系为25μl反应体系：PCR master 12.5μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板（100ng/mL）0.5μL，加双蒸水至25μL。反应条件：95℃预变性2min；95℃ 1min，59.4℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；70℃延伸10min。
取5μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用DNA Marker 作为参照，结果如题1所示。将PCR产物进行序列测序。测序结果在GeneBank软件对相近序列进行同源性分析，构建系统发育树。
PCR扩增结果由图1可见，扩增出约为1500bp的特异性条带。
测序结果如图3所示。将测序结果在NCBI GeneBank数据库中进行Blast分析比对，发现未知菌X1的16S rRNA基因片段大小为1494 bp（16SrDNA的序列如SEQ ID No：1所示），未知菌X2 16S rRNA基因片段大小为1491 bp（16SrDNA的序列如SEQ ID No：2所示）。
测序结果在NCBI数据库中进行Blast比对分析，如表3和表4所示，发现与未知菌X1匹配度最高的集中全序列是赖氨酸芽孢杆菌的各株系的16s rRNA序列，未知菌X2匹配度最高为环状芽孢杆菌，其匹配度均高达99%。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE004
表4
Figure 399990DEST_PATH_IMAGE005
系统发育树 根据软件MEGA构建进化树见图4、图5，分析菌株X1与Lysinibacillus菌属的细菌具有较近的同源性。X2与Bacillus circulans具有较近的同源性。综合前述的形态学和生理生化试验鉴定结果，可判定试验分离得到的未知菌X1为赖氨酸芽孢杆菌，未知菌X2为环状芽孢杆菌。
经验证，成功筛选出环状芽孢杆菌。虽然赖氨酸芽孢杆菌和环状芽孢杆菌在血平板上都形成溶血环，但赖氨酸芽孢杆菌的菌落形态和环状芽孢杆菌存在明显区别，且16SrRNA也可以最后确认区别。
序列表
<110> 南京市产品质量监督检验院
<120> 一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1494
<212> DNA
<213> 赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus)
<400> 1
tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcga acagaaaagg 60
agcttgctcc tttgacgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggcaa cctaccttat 120
agtttgggat aactccggga aaccggggct aataccgaat aatctatttc acttcatggt 180
gaaatactga aagacggtct cggctgtcgc tataagatgg gcccgcggcg cattagctag 240
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caatgggcga aagcctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa 420
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tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggtcc tttaagtctg atgtgaaagc 600
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tgaagccgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380
ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tggggtaacc 1440
ttttggagcc agccgccgaa ggtgggatag atgattgggg tgaagtcgta acaa 1494
<210> 2
<211> 1491
<212> DNA
<213> 环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)
<400> 2
tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg actttaaaag 60
cttgctttta aagttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggcaacctg cctgtaagac 120
tgggataact tcgggaaacc ggagctaata ccggataatc cttttcctct catgaggaaa 180
agctgaaaga cggtttacgc tgtcacttac agatgggccc gcggcgcatt agctagttgg 240
tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca 300
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat 360
ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaaact 420
ctgttgttag ggaagaacaa gtacaagagt aactgcttgt accttgacgg tacctaacca 480
gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 540
cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtccttta agtctgatgt gaaagcccac 600
ggctcaaccg tggagggtca ttggaaactg ggggacttga gtgcagaaga gaagagtgga 660
attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac 720
tctttggtct gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gagggtttcc gccctttagt 840
gctgcagcaa acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gccgcaaggc tgaaactcaa 900
aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga 960
agaaccttac caggtcttga catcctctga cactcctaga gataggacgt tccccttcgg 1020
gggacagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag 1140
gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200
tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaaag ggcagcaaaa ccgcgaggtc 1260
gagcaaatcc cataaaacca ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa 1320
gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380
acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtggg gtaacctttt 1440
ggagccagcc gcctaaggtg ggatagatga ttgggggtga agtcgtaaca a 1491
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagagtttga tcctggct 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggaggtgat ccagccgca 19

Claims (4)

1.一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）使用选择性增菌培养基对含有环状芽孢杆菌的环境菌进行选择性增菌培养，降低非环状芽孢杆菌增殖，使环状芽孢杆菌高效增殖，所述选择性增菌培养基为pH=8的含有质量百分比7%的 NaCl、50-500μg/mL头孢噻呋或其盐、 10-30U/mL青霉素钾的改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基；
（2）将步骤（1）所得菌液在含有香豆素类抗生素和/或萘啶酮酸或其盐的哥伦比亚血琼脂平板培养，对出现溶血环的菌株进行分离，根据菌落形态进行鉴别。
2.如权利要求 1 所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤（1）选择性增菌培养基还含有多黏菌素和/或萘啶酮酸或其盐。
3.如权利要求 1 所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤（1）和（2）的培养温度为 36℃，培养 24 小时。
4.如权利要求 1 所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，其特征在于，还包括步骤（3）使用分子生物学方法对步骤（2）分离得到的菌株进行鉴定，所述分子生物学方法选自 16SrRNA/ rDNA 序列分析、随机扩增多态性 DNA、基因间重复序列分析技术、变性梯度凝胶电泳标记技术、特异 PCR、多重 PCR、荧光定量 PCR 中的一种或几种。
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