CN111999237B - 一种评估温和式杀孢方法效果的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种评估温和式杀孢方法效果的方法，包括：使用萌发剂对芽孢污染物萌发处理；使用待评估的温和式杀孢方法对萌发后的芽孢污染物进行杀菌处理，得到灭菌后的芽孢污染物；收集灭菌后的芽孢污染物中的芽孢并悬浮于第一悬浮介质中，得到第一悬浮液；将第一悬浮液进行离心处理，收集沉淀物悬浮于第二悬浮介质中，得到第二悬浮液；使用活细胞染料进行第一荧光标记，得到第一标记待测产物；使用核酸探针进行第二荧光标记，得到第三悬浮液；使用高灵敏度流式细胞仪对第三悬浮液中颗粒的荧光进行检测。本公开的方法可以缩短评估温和式杀孢方法效果的时间，还可以为杀孢剂的研制与优化提供有力的技术支持。
Description
技术领域
本公开涉及杀菌技术领域，具体地，涉及一种评估温和式杀孢方法效果的方法。
背景技术
芽孢是一些细菌在极端环境如营养条件缺乏时形成的一种圆形或椭圆形的休眠体。跟普通营养细胞相比，芽孢具有耐高温、耐辐射、耐干燥和耐多种有毒化学物质等抗逆性特点。细菌的营养细胞在70-80℃的条件下维持10分钟就死亡了，而芽孢在120-140℃的条件下还能存活几个小时；营养细胞在5％苯酚溶液中很快就会死亡，而芽孢却能存活15天。而且一些物种的芽孢是人类疾病的载体，如产气荚膜梭菌会引起气性坏疽、食物中毒和肌肉坏死；艰难梭菌会引起严重且常常致命的腹泻；炭疽芽孢杆菌芽孢是一种潜在的生物武器和生物恐怖主义的主要媒介，给人类的安全造成了严重的威胁。很多需氧性芽孢杆菌和厌氧性梭状芽孢杆菌是造成食物变质的元凶，威胁着商品的货架期及品质，给很多食品以及发酵工业都造成了巨大的经济损失。因此，如何彻底杀灭细菌芽孢成为制药、食品、生物防御工业和医疗环境卫生面临的巨大挑战。
现在使用的杀灭细菌芽孢的技术多为高温灭菌以及高浓度化学制剂长期浸泡等方法。这些方法会使食品的色泽、风味和营养成分等发生变化，也会对被消毒物品的品质造成一定的损害，甚至会给环境带来严重的污染。因此，使用一种更加温和的杀孢方法就变得十分重要。目前使用的温和式杀孢方法是依据萌发后的芽孢抗逆性消失，用比较温和的方法就可以实现对芽孢的杀灭这一原理提出的。但如何准确快速的评估这类温和式杀孢方法的杀孢效果成为目前亟待解决的问题。
发明内容
本公开的目的在于提供一种评估不同温和式杀孢方法效果的方法，该方法能够区分芽孢的几种不同形态，包括未萌发的芽孢、萌发后被杀死的芽孢和萌发后活的芽孢。
为了实现上述目的，本公开提供了一种评估温和式杀孢方法效果的方法，该方法的步骤包括：
S1、使用萌发剂对芽孢污染物萌发处理，得到萌发芽孢污染物；
S2、使用待评估的温和式杀孢方法对所述萌发芽孢污染物进行杀菌处理，得到灭菌后的芽孢污染物；
S3、收集所述灭菌后的芽孢污染物中的芽孢并悬浮于第一悬浮介质中，得到第一悬浮液；将所述第一悬浮液进行离心处理，收集沉淀物；将所述沉淀物悬浮于第二悬浮介质中，得到第二悬浮液；
S4、使用活细胞染料对所述第二悬浮液进行第一荧光标记，得到第一标记待测产物；使用核酸探针对所述第一标记待测产物进行第二荧光标记，得到第三悬浮液；
S5、使用高灵敏度流式细胞仪对所述第三悬浮液中颗粒的荧光进行检测。
可选地，步骤S5中，使用高灵敏度流式细胞仪对所述第三悬浮液中颗粒的400-800nm的散射光和荧光进行检测；根据所述第三悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号区分萌发后活的芽孢和其他状态的芽孢，所述其它状态的芽孢包括未萌发的芽孢和萌发后被杀死的芽孢；根据所述第三悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号区分芽孢的萌发状态。
可选地，以所述芽孢污染物的重量为基准，所述萌发剂的含量为5-100mM，优选为10-40mM。
可选地，以0.1mL的所述第二悬浮液为基准，所述活细胞染料的浓度为1-20μM，所述核酸探针的浓度为0.1-100μM；优选地，所述活细胞染料的浓度为10-15μM，所述核酸探针的浓度为1-10μM。
可选地，所述萌发剂选自营养物质和非营养化学物质中的至少一种；所述营养物质包括氨基酸、糖类、嘌呤和核苷中的至少一种；所述非营养化学物质包括阳离子表面活性剂、外源DPA和外源裂解酶中的至少一种；所述第一悬浮介质选自磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水；所述第二悬浮介质选自磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水。
可选地，所述活细胞染料选自Calcein-AM、CFSE和BCECF-AM中的至少一种；所述核酸探针选自SYTO 17、SYTO 59、SYTO 60、SYTO 61、SYTO 62和SYTO 63中的至少一种。
可选地，所述温和式杀孢方法选自加热杀菌、化学消毒剂杀菌和紫外杀菌中的其中一种；步骤S3中，所述离心处理的条件包括：离心时间为5-20min，离心转速为5000-10000rcf；步骤S4中，所述第一荧光标记的条件包括：避光孵育，温度为35-39℃，时间为10-40min，孵育完成后离心洗涤2-3次；所述第二荧光标记的条件包括：室温下避光孵育，时间为1-60min。
可选地，所述高灵敏流式细胞仪的操作方法步骤包括：
(1)使用鞘液通过流体动力学聚焦将所述第三悬浮液聚焦为微米级样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的细菌，所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；
(2)向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.01-10毫秒，优选为0.2-2毫秒；
(3)将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜系统收集由所述探测区发出的光信号；
(4)将通过透镜系统收集到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个细菌所发出的光的电信号；
(5)根据所述电信号对所述细菌进行区分与定量分析。
可选地，所述探测区的体积为1-5000fL，优选为50-500fL；所述样品液流的直径为0.1-20μm，优选为1-5μm；所述样品液流的流量为1-500nL/min，优选为1-100nL/min；所述鞘液的流速为1-100cm/sec，优选为1-10cm/sec；所述测量光的光束直径为所述样品液流的直径的1-150倍，优选为2-50倍。
可选地，所述芽孢污染物包括产芽孢菌产生的芽孢；所述产芽孢菌选自枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、酸土脂环酸芽孢杆菌和孢梭菌中的至少一种。
通过上述技术方案，本公开首先运用不同的温和式杀孢方法对芽孢污染物进行处理，然后利用活细胞染料和核酸染料对样品进行荧光标记，再选择相应的激光器并用高灵敏流式细胞仪对细菌荧光信号进行检测，区分不同生理状态的芽孢，从而实现对不同温和式杀孢方法效果的评估。本公开提供的方法适用于各种温和式杀孢方法杀孢效果的评估，所述温和式杀孢方法的具体流程为先将芽孢进行萌发处理使其抗逆性丧失，然后再用一种较为温和的方式杀死萌发后的芽孢，能够对芽孢的存活情况进行定量检测，不仅可以极大地缩短评估不同温和式杀孢方法效果的时间，还可以为杀孢剂的研制与优化提供有力的技术支持。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是一种评估温和式杀孢方法效果的方法的流程示意图，其中，a为芽孢污染物，b为萌发芽孢污染物，c为第二悬浮液，d为第三悬浮液，e为采用高灵敏度流式细胞仪对第三悬浮液检测后得到的双荧光散点图结果；
图2是本公开使用的高灵敏度流式细胞仪中的光路示意图；
图3是实例1中使用高灵敏度流式细胞仪对未萌发的芽孢、萌发后活的芽孢和萌发后被杀死的芽孢的检测结果。a1-a3是样品的散射信号图，图中，横坐标代表时间，纵坐标代表散射光信号强度；b1-b3是样品的绿色荧光信号图，图中，横坐标代表时间，纵坐标代表荧光信号强度；c1-c3是样品的红色荧光信号图，图中，横坐标代表时间，纵坐标代表荧光信号强度；d-f分别为萌发后活的芽孢、萌发后被杀死的芽孢、未萌发的芽孢的绿色荧光信号与红色荧光信号的双变量散点图，图中，横坐标代表绿色荧光信号，纵坐标代表红色荧光信号。
图4是实施例2对不同浓度的芽孢的检测结果，显示出本公开的方法与传统平板培养法所得检测结果的线性关系。
图5是实施例3中运用本公开提供的方法对先萌发后加热这种温和式杀孢方法的杀菌效果进行评估的检测结果。其中，a-e分别为65℃/30min、65℃/60min、80℃/10min、80℃/30min、80℃/60min这几种条件下杀孢的检测结果散点图，横坐标代表绿色荧光信号，纵坐标代表红色荧光信号。f为不同杀孢条件杀孢率的柱状图，横坐标为杀孢条件，纵坐标为杀孢率。
图6是实施例4中运用本公开提供的方法对先萌发后过氧化氢处理这种温和式杀孢方法的杀菌效果进行评估的检测结果。该图反映了杀孢率随过氧化氢浓度以及作用时间的变化趋势。
附图2标记说明
1、637nm激光器 9、物镜
2、反射镜 10、第一二向色滤波片
3、反射镜 11、第一光电倍增管
4、488nm激光器 12、第二二向色滤波片
5、半波片 13、第一带通滤波片
6、偏振分束器 14、第二光电倍增管
7、消色差双透镜 15、第二带通滤波片
8、流通池 16、第三光电倍增管
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开提供了一种评估温和式杀孢方法效果的方法，该方法的步骤包括：
S1、使用萌发剂对芽孢污染物萌发处理，得到萌发芽孢污染物；
S2、使用待评估的温和式杀孢方法对所述萌发芽孢污染物进行杀菌处理，得到灭菌后的芽孢污染物；
S3、收集所述灭菌后的芽孢污染物中的芽孢并悬浮于第一悬浮介质中，得到第一悬浮液；将所述第一悬浮液进行离心处理，收集沉淀物；将所述沉淀物悬浮于第二悬浮介质中，得到第二悬浮液；
S4、使用活细胞染料对所述第二悬浮液进行第一荧光标记，得到第一标记待测产物；使用核酸探针对所述第一标记待测产物进行第二荧光标记，得到第三悬浮液；
S5、使用高灵敏度流式细胞仪对所述第三悬浮液中颗粒的荧光进行检测。
在本公开中，首先运用不同的温和式杀孢方法对芽孢污染物进行处理，具体处理方法为：使用芽孢萌发剂使芽孢丧失抗性，然后在比较温和的条件下将萌发后的芽孢杀死。为了保证结果的准确性，统一采用芽孢菌悬液或者菌片进行实验，菌片的材质根据消毒对象不同进行选择，然后利用活细胞染料和核酸染料同时对样品进行荧光标记，再选择相应的激光器并用高灵敏流式细胞术对细菌荧光信号进行检测，从而实现对不同温和式杀孢方法效果的评估。
本公开中的芽孢污染物选用芽孢悬液或者芽孢菌片，芽孢悬液的浓度为5×107-5×108cfu/mL之间，芽孢菌片采用直径为10-14mm的圆形菌片，菌片的染菌量应为5×107-5×108cfu/片。其中，菌片的材质根据不同的消毒对象进行选择，所述菌片在染菌前应进行脱脂处理，具体操作如下：①将载体放在含肥皂的水中煮沸25-35min；②而后以蒸馏水洗净；③用蒸馏水煮沸9-12min；④用蒸馏水漂洗至pH呈中性，脱脂处理后再进行高温灭菌处理，最后在无菌环境(如超净工作台)中进行细菌滴染。本公开中的菌悬液和菌片的制备应严格按无菌要求进行操作。
本公开的所述第三悬浮液中的颗粒包括萌发后活的芽孢、萌发后被杀死的芽孢以及未萌发的芽孢，三种细胞都具有散射信号，为了进一步使这三类芽孢被明确分辨，作为本公开的一种优选的实施方式，步骤S5中，可以使用高灵敏度流式细胞仪对所述第三悬浮液中颗粒的400-800nm的散射光和荧光进行检测；根据所述第三悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号区分萌发后活的芽孢和其他状态的芽孢，所述其它状态的芽孢包括未萌发的芽孢和萌发后被杀死的芽孢；根据所述第三悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号区分芽孢的萌发状态，根据所述第三悬浮液中的颗粒的散射光判断杂质颗粒。
本公开的高灵敏度流式细胞仪优选为纳米流式检测仪，并选用488nm和637nm激光对所述第三悬浮液中颗粒的400-800nm的散射光和荧光进行检测。其中，纳米流式检测仪能够通过对检测样本中杂质颗粒和细菌颗粒的逐一分析获得颗粒散射和荧光信号的散点图和各参数的统计直方图，不受限于样本中可能含有杂质颗粒而带来的散射光信号及微弱荧光信号的影响。特别需要指出的是，采用纳米流式检测仪对细菌进行检测计数不受细菌荧光强度差异的影响，可适用于真实样品中任何细菌的特异检测及总菌定量检测。
根据本公开，以所述芽孢污染物的重量为基准，所述萌发剂的含量可以为5-100mM，优选为10-40mM。合适的萌发剂含量可以诱导芽孢萌发量达到99％以上，从而使是检测结果更加精确。
根据本公开，以0.1mL的所述第二悬浮液为基准，所述活细胞染料的浓度可以为1-20μM，所述核酸探针的浓度可以为0.1-100μM；优选地，所述活细胞染料的浓度可以为10-15μM，所述核酸探针的浓度可以为1-10μM。
发明人经过大量实验发现，活细胞染料可以对所述离心处理过的芽孢悬液中萌发后活的芽孢进行标记，但很难标记未萌发的芽孢以及萌发后被杀死的芽孢。这可能是因为活细胞染料进入细胞后被细胞内的酯酶剪切成为膜非渗透性的极性分子，从而被滞留在细胞内发出绿色荧光；而萌发后被杀死的芽孢内由于缺乏具有活性的酯酶而无法被标记，未萌发的芽孢由于其自身特殊的致密的多层膜结构使染料难以进入，也很难被标记。另外，由于芽孢特有的多层膜结构使得核酸染料标记萌发后芽孢的信号强度要远高于未萌发的芽孢。即经过第一荧光标记和第二荧光标记后，所述芽孢悬液中萌发后活的芽孢能被两种探针标记同时标记，在步骤S4中将同时发射两种荧光，而且荧光信号均很高；而萌发后被杀死的芽孢将发射信号很弱的第一荧光信号以及信号很高的第二荧光信号；未萌发的芽孢将发射信号很弱的第一荧光信号以及信号较弱的第二荧光信号，两种探针的荧光发射波段不同，因而在步骤S4中可根据荧光信号检测得到萌发后活的芽孢、萌发后被杀死的芽孢以及未萌发的芽孢。用萌发后被杀死的芽孢的数量与细菌的总数量(能被核酸探针标记的细菌)作比即可得到该温和式杀孢方法的杀孢率，从而可以用该方法来评估不同温和式杀孢方法的作用效果。
根据本公开，所述萌发剂选自一些营养物质以及非营养化学物质。所述营养物质主要包括氨基酸(如L-丙氨酸和L-甘氨酸)、糖类、嘌呤、核苷以及一些营养物质的组合，例如AGFK(L-天冬酰胺、D-葡萄糖、D-果糖和钾离子)；非营养物质主要包括阳离子表面活性剂(如十二胺)、外源DPA、外源裂解酶等。
根据本公开，所述第一悬浮介质可以选自磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水；所述第二悬浮介质可以选自磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水。
根据本公开，所述活细胞染料和所述核酸探针可以为本领域技术人员所熟知的，所述活细胞染料可以选自Calcein-AM、CFSE和BCECF-AM中的至少一种；所述核酸探针可以选自SYTO 17、SYTO 59、SYTO 60、SYTO 61、SYTO 62和SYTO 63中的至少一种。
根据本公开，所述温和式杀孢方法选自加热杀菌、化学消毒剂杀菌和紫外杀菌中的其中一种。其中，可以根据具体情况选择浸泡、喷洒等方式对芽孢污染物进行灭菌处理。
根据本公开，由于不同温和式杀孢方法处理后的芽孢中可能存在培养基、消毒剂等化学物质影响后续荧光标记。步骤S3中需要将第一悬浮液进行了离心处理，离心次数根据实际情况可选择2～5次，所述离心处理的条件可以包括：离心时间为5-20min，离心转速为5000-10000rcf，每次离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，所述悬浮介质可以为本领域的常规种类，例如磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水，另外，所述第一悬浮液的收集方法可以根据温和式杀孢方式的不同而有所不同。菌悬液实验体系中，可直接在杀孢处理后进行离心洗涤操作。而在菌片实验体系中，需要增加将菌片上的芽孢洗脱的步骤，具体操作为将菌片放入稀释液中震荡至菌几乎全部脱落，所述稀释液可选用磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水，所述震荡方式包括借助电动混合器混合15～60s或手动震荡50～100次。
根据本公开，步骤S4中，所述第一荧光标记的条件可以包括：避光孵育，温度为35-39℃，时间为10-40min，孵育完成后离心洗涤2-3次；所述第二荧光标记的条件可以包括：室温下避光孵育，时间为1-60min。
根据本公开，所述高灵敏流式细胞仪的操作方法步骤可以包括：
(1)使用鞘液通过流体动力学聚焦将所述第三悬浮液聚焦为微米级样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的细菌，所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；
(2)向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.01-10毫秒，优选为0.2-2毫秒；
(3)将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜系统收集由所述探测区发出的光信号；
(4)将通过透镜系统收集到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个细菌所发出的光的电信号；
(5)根据所述电信号对所述细菌进行区分与定量分析。
其中，所述鞘液可以为流式细胞仪中常规使用的各种鞘液，例如水、生理盐水和磷酸盐缓冲液中的至少一种，优选使用水作为鞘液，更优选为超纯水。所述流体动力学聚焦具有流式细胞术中常规的定义，具体是指所述鞘液包绕着样品液体流动，样品液体在所述鞘液的作用下形成液流，即样品液流。可以通过流式细胞术领域常规的调节方法，调节细菌在所述第三悬浮液中的浓度，使得所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动。
根据本公开，为了进一步提高所述纳米流式检测仪的灵敏度和精确度，所述探测区的体积可以为1-5000fL，优选为50-500fL；所述样品液流的直径可以为0.1-20μm；所述样品液流的流量可以为1-500nL/min；所述鞘液的流速可以为1-100cm/sec；所述测量光的光束直径可以为所述样品液流的直径的1-150倍。作为本公开的一种优选的实施方式，所述探测区的体积可以为50-500fL；所述样品液流的直径可以为1-5μm；所述样品液流的流量可以为1-100nL/min；所述鞘液的流速可以为1-10cm/sec；所述测量光的光束直径可以为所述样品液流的直径的2-50倍。
本公开中，在获得所述电信号后，根据所述电信号对细菌进行定量分析的方法可以为本领域常规的方法，例如将空白样品和/或标准样品(包括内标和外标)与待测样品的电信号进行比较。
根据本公开，所述芽孢污染物可以包括产芽孢菌产生的芽孢；所述产芽孢菌可以选自枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、酸土脂环酸芽孢杆菌和孢梭菌中的至少一种。
本公开提供的方法适用于各种温和式杀孢方法效果的评估，所述温和式杀孢方法的具体流程为先将芽孢进行萌发处理使其抗逆性丧失，然后再用一种较为温和的方式杀死萌发后的芽孢，能够对芽孢的存活情况进行定量检测，不仅可以极大地缩短评估不同温和式杀孢方法效果的时间，还可以为杀孢剂的研制及优化提供有力的技术支持。
以下通过实施例进一步详细说明本公开。实施例中所用到的原材料均可通过商购途径获得。其中：激光器1购自中国长春新产业光电技术有限公司，型号：MDL-XS-637nm-50mW-19090191；激光器4购自Coherent(Beijing)Commercial Company Ltd.，型号：apphire LP 488-200CW CDRH USB Laser System；物镜9购自Nikon，型号40×，NA＝0.60；第一二向色滤光片10购自Semrock Inc.，Rochester，NY，型号：DicF-500；第一光电倍增管11购自Hamamatsu，Japan，型号R928；第二二向色滤光片12购自Semrock Inc.，Rochester，NY，型号：DicF-605；第一带通滤波片13购自Semrock Inc.，型号BP520/35；第二光电倍增管14购自Hamamatsu，Japan，型号R928；第二带通滤波片15购自Semrock Inc.，型号BP700/40；第三光电倍增管16购自Hamamatsu，Japan，型号R928。
对待检测的悬液的检测方法为：参考图2所示的光路系统，用压力为15kPa的氮气将待测的样品液体压入密闭的样品管，调节氮气的压力，使得样品液流的流量为5nL/min。其中，样品管为内径为40μm外径为240μm的石英毛细管，毛细管末端被处理成约12度的锥形喷嘴。样品管轴向平行自上而下地插入鞘液室，鞘液室为由石英玻璃形成的截面为250μm×250μm且轴向长度为20mm的长方体腔体，样品管的末端位于所述鞘液室轴向且距离上端8mm处的位置。鞘液室中自上而下流动着流速为5cm/sec的鞘液。样品管的末端以上的样品液流的截面的半径大约为1μm。波长为488nm和637nm的激光经Thorlabs公司的型号为AC050-010-A1的消色差双合透镜，聚焦成束腰直径为10μm的激光光束。探测区的体积为0.8pL，样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.8毫秒。
激光器1发出的637nm的激光经反射镜2、3与由激光器4发出的488nm的激光经半波片5、偏振分束器6、反射镜3汇聚为一束激光，然后经消色差双胶合透镜7后照射至位于流通池8的样品管内，芽孢悬液样品由激光照射后发出光信号，物镜9收集，被第一二向色滤光片10分成两束，波长小于500nm的光信号(散射光)被90°反射入第一光电倍增管11中检测，大于500nm的光信号，被第二二向色滤光片12分成两束，波长小于605nm的光信号(第一荧光信号)被90°反射，经过第一带通滤波片13进入第二光电倍增管14中检测(该通道检测的荧光信号为活细胞染料发出的荧光信号)。波长大于605nm的光信号(第二荧光信号)经过第二带通滤波片15滤除杂散光及泄露的荧光信号，最终进入第三光电倍增管16检测(该通道检测的荧光信号为被核酸探针标记后发出的荧光信号)。
实施例1
本实施例用于说明使用纳米流式细胞术对实验室制备的未萌发的芽孢、萌发后活的芽孢、萌发后被杀死的芽孢的检测。
本实施例采用的实验室培养的芽孢为枯草芽孢杆菌(CRCFMCC 1.1630)产生的芽孢，其培养方法为：用灭菌的牙签挑取枯草芽孢杆菌菌落至2mL肉汤培养基中培养，于250rpm摇床上，37℃过夜培养。以1:10体积比吸取过夜菌液至产芽孢培养基中，于250rpm摇床上，37℃培养4-7天。最后将上述产芽孢培养基培养的芽孢在4℃冰箱存放5-7天，直至菌液中全部为芽孢，可用拍荧光显微镜或者流式细胞仪的方法对芽孢纯度进行检测。
本实例采用的萌发芽孢污染物的制备方法为：取1mL上述纯芽孢，离心洗涤两次，将培养基与其他杂质洗掉，离心条件分别为1200rcf，5min和8000rcf，5min，最后用PBS重悬，调节OD值为0.5左右。向上述芽孢悬液中加入L-丙氨酸，使其终浓度为5mM，将菌液放入37℃摇床中萌芽培养50min。
本实例采用的杀死萌发后芽孢的方法为加热法，具体操作为：将盛放上述萌发芽孢污染物的离心管用封口膜密封，放入65℃的水浴锅中，水浴锅液面要高于菌液的液面，加热处理30min。
收集灭菌后的芽孢污染物中的芽孢并悬浮于第一悬浮介质中，得到第一悬浮液；将第一悬浮液进行离心处理，收集沉淀物；将沉淀物悬浮于第二悬浮介质中，得到第二悬浮液。其中，离心时间为10min，离心转速为8000rcf，第一悬浮介质为PBS缓冲液；第二悬浮介质为PBS缓冲液。
依次使用Calcein-AM和SYTO 62对第二悬浮液进行第一荧光标记和第二荧光标记。在50μL菌液中加入0.5μL Calcein-AM(1mM)，37℃避光孵育30min。随后将菌液取出进行离心处理，8000rcf，5min离心洗涤，重复3遍后，最终重悬至50μL PBS中，制备得到第一标记待测产物。之后在第一标记待测产物中加入0.5μL核酸染料SYTO 62(0.1mM))，室温避光孵育10min，制备得到第三悬浮液。(以1mL的第二悬浮液为基准，Calcein-AM的终浓度为10μM，核酸染料SYTO 62的浓度为1μM)。使用纳米流式检测仪在488nm和637nm激光下对其进行检测，检测通道主要为第一荧光通道(BP520/35)和第二荧光通道(BP700/40)。检测结果如图3所示。
本实施例可以证明，采用本公开提供的方法能够对未萌发芽孢、萌发后活的芽孢和萌发后被杀死的芽孢这三种生理状态不同的芽孢进行很好的区分。
实施例2
本实施例用于说明本公开提供的方法对不同浓度芽孢的检测与传统平板培养法的检测结果的对比。
本实施例采用的菌株和芽孢的培养方法同实施例1。
取一定量的纯芽孢离心洗涤两次，离心条件分别为1200rcf，5min和8000rcf，5min，最后用PBS重悬，调节OD值为5(细菌浓度约为109)，用PBS做梯度稀释，稀释倍数分别为0、2、5、10、20、50、100倍。
采用与实施例1相同的染色方法对不同稀释倍数的芽孢进行Calcein-AM和SYTO62双染，使用超高灵敏流式细胞术在488nm和637nm激光激发下对上述实验室制备的不同浓度的芽孢的绿色荧光(FB520/35)和红色荧光(BP700/40)进行检测。
同时，取不同稀释浓度的芽孢进行与流式检测上样悬浮液相同的操作(不加染料)，8000rcf，5min离心洗涤，重复3遍后，最终重悬至50μL PBS中，制备得前处理菌液样本。之后在前处理菌液样本中加入0.5μL PBS缓冲液得到最终菌液样本，最后用传统平板培养法培养检测。
采用本公开的方法和传统平板培养法对不同浓度的芽孢进行检测，得到的线性关系如图4所示，横坐标代表传统平板培养法的检测结果，纵坐标代表采用本公开的方法得到的检测结果，可见，二者的计数结果具有很好的线性关系，相关系数R2等于0.9949。
本实施例可以证明，本公开的方法和传统方法的检测结果基本一致。
实施例3
本实施例用于说明本公开提供的方法对先萌发后加热这种温和式杀孢方法的杀菌效果进行评估。
本实施例采用的菌株、芽孢的培养方法和萌发芽孢污染物的制备方法同实施例1。
取萌发芽孢污染物5份，用封口膜在离心管外部缠绕2～3圈，然后将样品分别放入不同温度的水浴锅中，同时设置了几组不同的加热时间。具体条件为：65℃/30min、65℃/60min、80℃/10min、80℃/30min、80℃/60min。
收集灭菌后的芽孢污染物中的芽孢并悬浮于第一悬浮介质中，得到第一悬浮液；将第一悬浮液进行离心处理，收集沉淀物；将沉淀物悬浮于第二悬浮介质中，得到各条件下的第二悬浮液。其中，离心时间为10min，离心转速为8000rcf，第一悬浮介质为PBS缓冲液；第二悬浮介质为PBS缓冲液。
每种条件各取50μL加热处理过的第二悬浮液，采用与实施例1相同的方法使用Calcein-AM和SYTO 62第一荧光标记和第二荧光标记。使用纳米流式检测仪在488nm和637nm激光下对其进行检测，检测通道主要为散射通道(DicF-500)第一荧光通道(DicF-500，BP523/35，LP488)和第二荧光通道(DicF-500，DicF-605，BP700/40)，检测结果如图5所示，虚线圈出部分萌发后被杀死的芽孢，65℃/30min、65℃/60min、80℃/10min、80℃/30min、80℃/60min这几种条件下杀孢率分别为94％、94.5％、94.3％、93.8％、94.9％。经分析可知以上几种温和式杀孢条件均可以将萌发后的芽孢全部杀死，未达到百分之百杀孢率的原因可能在于芽孢并未全部萌发，可通过更换芽孢萌发剂来解决该问题。由纳米流式检测仪的检测结果得到这几种先萌发再加热杀孢的方法的杀孢效果都很不错，生活中可以根据具体的情景去选择不同的杀孢温度和杀孢时间。
本实施例可以证明，采用本公开的方法能够对先萌发后加热这种温和式杀孢方法的杀菌效果进行评估。
实施例4
本实施例用于说明本公开提供的方法对先萌发后过氧化氢处理这种温和式杀孢方法的杀菌效果进行评估。
本实施例采用的菌株、芽孢的培养方法和萌发芽孢污染物的制备方法同实施例1。
取32份萌发芽孢污染物进行离心洗涤，弃去上清，离心速度为8000rcf，离心时间5min。将离心去上清后的样品分为四组，分别用5％、7％、10％和15％的过氧化氢溶液重悬，每组各管的作用时间分别为1min、5min、10min、20min、40min、60min、90min、120min。作用到规定时间后，立刻进行离心洗涤，每次洗涤弃上清用PBS重悬，离心速度为8000rcf，离心时间5min，重复2遍，制备得第二悬浮液。
依次使用Calcein-AM和SYTO 62对第二悬浮液进行第一荧光标记和第二荧光标记，使用纳米流式检测仪在488nm和637nm激光下对其进行检测，检测通道主要为散射通道(DicF-500)、第一荧光通道(DicF-500，BP523/35，LP488)和第二荧光通道(DicF-500，DicF-605，BP700/40)，检测结果如图6所示，由图可知过氧化氢的杀孢效果和过氧化氢的浓度以及杀孢时间成正比，当作用到一定时间后杀孢率基本不发生变化。该结果对现实生活中过氧化氢杀孢剂的使用浓度以及作用时间的选择具有指导意义。如果想要减少对被消毒对象的伤害同时保证杀孢率，就可以选择浓度相对较低的过氧化氢，延长其作用时间；如果追求杀孢效果，则可加大过氧化氢的浓度同时延长作用时间。
本实施例可以证明，采用本公开的方法能够对先萌发后过氧化氢处理这种温和式杀孢方法的杀菌效果进行评估。
由实施例1-4可见，本公开的方法能区分未萌发的芽孢、萌发后活的芽孢和萌发后被杀死的芽孢，评估不同温和式杀孢方法的杀孢效果，检测结果精确。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (13)
1.一种评估温和式杀孢方法效果的方法，其特征在于，该方法的步骤包括：
S1、使用萌发剂对芽孢污染物萌发处理，得到萌发芽孢污染物；
S2、使用待评估的温和式杀孢方法对所述萌发芽孢污染物进行杀菌处理，得到灭菌后的芽孢污染物；
S3、收集所述灭菌后的芽孢污染物中的芽孢并悬浮于第一悬浮介质中，得到第一悬浮液；将所述第一悬浮液进行离心处理，收集沉淀物；将所述沉淀物悬浮于第二悬浮介质中，得到第二悬浮液；
S4、使用活细胞染料对所述第二悬浮液进行第一荧光标记，得到第一标记待测产物；使用核酸探针对所述第一标记待测产物进行第二荧光标记，得到第三悬浮液；
S5、使用高灵敏度流式细胞仪对所述第三悬浮液中颗粒的400-800 nm的散射光和荧光进行检测；
其中，步骤S5中，根据所述第三悬浮液中颗粒的第一荧光信号所转换得到的电信号区分萌发后活的芽孢和其他状态的芽孢，所述其它状态的芽孢包括未萌发的芽孢和萌发后被杀死的芽孢；根据所述第三悬浮液中颗粒的第二荧光信号所转换得到的电信号区分芽孢的萌发状态；根据所述第三悬浮液中的颗粒的散射光判断杂质颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，以所述芽孢污染物的重量为基准，所述萌发剂的含量为5-100 mM。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，以所述芽孢污染物的重量为基准，所述萌发剂的含量为10-40 mM。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，以0.1 mL的所述第二悬浮液为基准，所述活细胞染料的浓度为1-20 μM，所述核酸探针的浓度为0.1-100 μM。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述活细胞染料的浓度为10-15 μM，所述核酸探针的浓度为1-10 μM。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述萌发剂选自营养物质和非营养化学物质中的至少一种；所述营养物质包括氨基酸、糖类、嘌呤和核苷中的至少一种；所述非营养化学物质包括阳离子表面活性剂、外源DPA和外源裂解酶中的至少一种；
所述第一悬浮介质选自磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水；所述第二悬浮介质选自磷酸缓冲盐溶液、去离子水、蒸馏水、无菌水或纯水。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述活细胞染料选自Calcein-AM、CFSE和BCECF-AM中的至少一种；
所述核酸探针选自SYTO 17、SYTO 59、SYTO 60、SYTO 61、SYTO 62和SYTO 63中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S2中，所述温和式杀孢方法选自加热杀菌、化学消毒剂杀菌和紫外杀菌中的其中一种；
步骤S3中，所述离心处理的条件包括：离心时间为5-20 min，离心转速为5000-10000rcf；
步骤S4中，所述第一荧光标记的条件包括：避光孵育，温度为35-39 ℃，时间为10-40min，孵育完成后离心洗涤2-3次；所述第二荧光标记的条件包括：室温下避光孵育，时间为1-60 min。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述高灵敏流式细胞仪的操作方法步骤包括：
（1）使用鞘液通过流体动力学聚焦将所述第三悬浮液聚焦为微米级样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的细菌，所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；
（2）向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.01-10毫秒；
（3）将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜系统收集由所述探测区发出的光信号；
（4）将通过透镜系统收集到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个细菌所发出的光的电信号；
（5）根据所述电信号对所述细菌进行区分与定量分析。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.2-2毫秒。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述探测区的体积为1-5000 fL；所述样品液流的直径为0.1-20 μm；所述样品液流的流量为1-500 nL/min；所述鞘液的流速为1-100 cm/sec；所述测量光的光束直径为所述样品液流的直径的1-150倍。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述探测区的体积为50-500 fL；所述样品液流的直径为1-5 μm；所述样品液流的流量为1-100 nL/min；所述鞘液的流速为1-10 cm/sec；所述测量光的光束直径为所述样品液流的直径的2-50倍。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述芽孢污染物包括产芽孢菌产生的芽孢；所述产芽孢菌选自枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、酸土脂环酸芽孢杆菌和孢梭菌中的至少一种。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102245217A (zh) * | 2008-10-17 | 2011-11-16 | 3M创新有限公司 | 生物灭菌指示组合物、制品和方法 |
| CN106442453A (zh) * | 2016-11-17 | 2017-02-22 | 中南民族大学 | 一种快速定量测定芽孢浓度的方法 |
| CN107532140A (zh) * | 2015-03-25 | 2018-01-02 | 赛斯爱普有限公司 | 用于微生物蛋白质分泌检测和定量的传感器 |
| CN107942053A (zh) * | 2016-06-30 | 2018-04-20 | 华中农业大学 | 芽胞@Zr4+作为功能微球的制备及其在免疫检测中的应用 |
| EP3418738A1 (en) * | 2017-06-23 | 2018-12-26 | Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München | A ratio of immune cells as prognostic indicator of therapeutic success in allergen-specific immunotherapy |
| CN109423508A (zh) * | 2017-08-22 | 2019-03-05 | 厦门大学 | 一种对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法 |
| CN110218763A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-09-10 | 厦门大学 | 一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法 |
| CN110468067A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-11-19 | 南京市产品质量监督检验院 | 一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法 |
-
2020
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102245217A (zh) * | 2008-10-17 | 2011-11-16 | 3M创新有限公司 | 生物灭菌指示组合物、制品和方法 |
| CN107532140A (zh) * | 2015-03-25 | 2018-01-02 | 赛斯爱普有限公司 | 用于微生物蛋白质分泌检测和定量的传感器 |
| CN107942053A (zh) * | 2016-06-30 | 2018-04-20 | 华中农业大学 | 芽胞@Zr4+作为功能微球的制备及其在免疫检测中的应用 |
| CN106442453A (zh) * | 2016-11-17 | 2017-02-22 | 中南民族大学 | 一种快速定量测定芽孢浓度的方法 |
| EP3418738A1 (en) * | 2017-06-23 | 2018-12-26 | Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München | A ratio of immune cells as prognostic indicator of therapeutic success in allergen-specific immunotherapy |
| CN109423508A (zh) * | 2017-08-22 | 2019-03-05 | 厦门大学 | 一种对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法 |
| CN110218763A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-09-10 | 厦门大学 | 一种对食用生蛋中的致病菌及总菌数进行定量检测的方法 |
| CN110468067A (zh) * | 2019-08-13 | 2019-11-19 | 南京市产品质量监督检验院 | 一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| P-381 : 基于纳米流式检测技术的芽孢检测和分析;赵凡毓等;《第十一届全国化学生物学学术会议》;20191118;第1页 * |
| Probingminoritypopulationofantibiotic-resistantbacteria;Tianxun Huang等;《Biosensors andBioelectronics》;20160122;第323-330页 * |
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