CN110462061A - 检测级联 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测靶标分子的组合物和方法以及通过检测测定产生的可检测信号的扩增。更具体地，本发明涉及利用催化核酸酶产生和/或扩增指示靶标分子(例如核酸和蛋白质)存在的信号的方法以及用于该方法的组合物。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测靶标分子的组合物和方法以及通过检测测定产生的可检测信号的扩增。更具体地，本发明涉及利用催化核酸酶产生和/或扩增指示靶标分子(例如核酸和蛋白质)存在的信号的方法以及用于该方法的组合物。
背景技术
目前有许多测定可用于检测样品中的靶标核酸或其他分子。大多数测定法依赖于蛋白质酶的使用，而少数测试法利用如下所述的催化核酸修饰的核酸酶。
-催化核酸酶
催化核酸酶是能够修饰特定底物的非蛋白质酶。催化核酸酶包括DNA分子(在本领域中也称为脱氧核酶(DNAzyme)、脱氧核酶(deoxyribozyme)或DNA酶(DNA enzyme))、RNA分子(本领域中也称为核酶)，以及由多个DNA和/或RNA分子组成的多组分核酸酶(在本领域中也称为MNA酶或PlexZyme)。催化核酸酶可以通过例如切割或连接来修饰特定的核酸底物序列。一类独特的催化核酸酶(本领域称为辣根过氧化物酶-模拟脱氧核酶)可催化过氧化物酶反应，将特定的化学底物转化为其氧化产物，例如，可产生颜色变化或发出荧光或化学发光信号。
能够切割或连接RNA底物、DNA底物和/或嵌合DNA/RNA底物的脱氧核酶和核酶通常只能修饰满足最小序列要求的靶标核酸底物。例如，底物应该表现出与酶的底物结合臂(binding arm)足够的碱基对互补性，并且还需要在催化修饰位点处的特定序列。催化切割位点上此类序列要求的实例包括对脱氧核酶切割的嘌呤：嘧啶序列(10-23型)的要求、对二核苷酸连接(8-17型)的要求以及对序列尿苷：X的要求，其中对于锤头状核酶，X可以等于A、C或U但不等于G。10-23脱氧核酶是能够在特定RNA磷酸二酯键处切割核酸底物的脱氧核酶。该脱氧核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，其侧翼为两个底物识别结构域(臂)。在催化核心区域和切割位点偏好中，8：17的脱氧核酶与10:23脱氧核酶不同。8-17脱氧核酶不具有任何严格的底物序列要求，并且能够在所有四种类型的5'NG二核苷酸连接处(即5'GG、AG、CG和UG)切割核酸底物。在相关的接合点(junction)的组之间存在总体反应性等级，其大致遵循5'NG>NA>NC>NT的顺序，其中NG的接合点最易于裂解，并且嘧啶-嘧啶的接合点是最不易受影响的。8-17脱氧核酶具有14-15个脱氧核苷酸的催化结构域，其特征在于短的分子内3碱基对的茎-三环(stem-triloop)和4-5个单链的脱氧核苷酸区域。
多组分核酸酶(MNA酶，也称为PlexZyme)是另一类催化核酸酶。这些酶需要组装易化子(assembly facilitator)(例如靶标核酸)来进行组装和催化活性。多组分核酸酶由多种部分酶(part-enzyme或partzyme)组成，其在一种或多种组装易化子的存在下自组装并形成能够修饰底物的催化活性多组分核酸酶。部分酶具有多个结构域，包括与组装易化子结合的传感器臂(例如靶标核酸)；结合底物的底物臂和部分催化核心序列，其在组装多种部分酶组分时结合以提供完整的催化核心。可以设计多组分核酸酶以识别广泛的组装易化子，包括例如不同的靶标核酸序列。在组装易化子存在下，催化活性的多组分核酸酶可以从部分酶组分组装，然后结合并催化修饰底物以产生输出信号。组装易化子可以是存在于生物或环境样品中的靶标核酸。在这种情况下，多组分核酸酶的催化活性表明靶标的存在。已经报道了几种能够切割核酸底物的多组分核酸酶，并且可以连接核酸底物的另外的多组分核酸酶也是本领域已知的(参见例如WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084，以及相关的美国专利公开号2007-0231810、2010-0136536和2011-0143338)。
适体酶是特定类型的催化核酸(脱氧核酶、核酶或多组分核酸酶)，其与适体结构域连接以变构调节核酸酶，使得它们的活性取决于能够结合适体域的靶标分析物/配体的存在。通过与适体内的适体和部分催化核酸结构域结合，互补调节寡核苷酸已用于在不存在靶标分析物的情况下抑制适体活性。通过靶标配体与适体部分的结合，抑制适体的催化活性是可逆的，从而促进调节寡核苷酸的去除。
-信号放大技术
为了增加靶标检测的灵敏度，已经采用了靶标扩增(target amplification)或信号放大(signal amplification)的策略。采用靶标扩增的现有方法的实例包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、基于链侵入的扩增(SIBA)、转录物介导的扩增(TMA)、自持序列复制(3SR)或基于核酸序列的扩增(NASBA)。那些依赖于用于扩增的链置换的方法，例如SDA、RCA和LAMP，需要使用具有链置换活性的聚合酶。还描述了利用包括切口核酸内切酶的核酸酶的信号放大级联(例如，NESA)。
在现有的信号放大方法中存在许多限制。例如，在许多技术中，反应速度受最初存在于样品中的靶标DNA分子数量的限制。因此，这些方法和其他方法通常缺乏临床应用所需的速度和灵敏度。其他方法在缺失靶标的情况下会遇到假阳性信号的产生。因此，一直需要用于检测和定量核酸序列和掺入信号放大的其他靶标的方法。
还描述了利用催化核酸的信号放大级联。一个实例涉及使用由两个相邻的过氧化物酶模拟脱氧核酶组成的寡核苷酸，所述脱氧核酶通过核糖核苷酸接合点(ribonucleotide junction)而连接。该寡核苷酸的末端通过与每个末端杂交的短接头DNA连接在一起，从而形成准圆形结构。该结构的形成暂时抑制了脱氧核酶的催化活性。在其靶标组装易化子分子存在下组装的多组分核酸酶(MNA酶)直接与脱氧核酶杂交并切割它们之间的核糖核苷酸接合点。含有脱氧核酶的寡核苷酸的切割导致两种脱氧核酶彼此分离，并与短接头DNA分离，导致脱氧核酶的活化。这种策略的局限性在于信号的扩增仅限于每个多组分核酸酶切割事件激活的两个脱氧核酶，并且由于这些过氧化物酶模拟脱氧核酶没有修饰核酸底物的能力，因此这些脱氧核酶没有机制激活额外的脱氧核酶分子。因此，该策略不适合作为能够指数信号放大的循环反馈级联中的第一步。此外，多组分核酸酶的臂和脱氧核酶之间的互补性是初始切割事件发生所必需的，一旦它们从准圆形结构中释放出来，也可能导致脱氧核酶分子的螯合，有可能限制反应的敏感性。
另一种称为DoC的方法利用由暂时失活的脱氧核酶组成的准环状结构。通过与阻断片段(Blocker Fragment)杂交使脱氧核酶失活。通过多组分核酸酶切割阻断剂激活脱氧核酶，从而启动信号放大级联。然而，这种方法存在局限性，因为阻断剂的浓度需要高于脱氧核酶的浓度，使得很大比例的多组分核酸酶裂解无效。此外，这些准圆形结构可能是不稳定的，并且有可能在缺失靶标的情况下启动级联。
还描述了使用束缚在固体/固性支持物上的固定催化核酸酶信号放大策略。以这种方式将催化核酸酶、它们各自的组分和/或它们的底物束缚在固体/固性支持物上的目的是促进酶与其底物的空间分离，从而试图提高反应效率和/或特异性。然而，依赖于束缚在固定/非移动的固体支持物上的催化核酸酶、底物和其他组分的信号放大方法通常难以开发并且在许多情况下由于固有的缺点而证明是次优的。例如，在平衡(i)需要将大量浓度的催化核酸酶、底物和其他组分束缚以驱动有效反应和(ii)需要确保这些组分的密度不太高从而使分子拥挤抑制了由于空间位阻导致的其他反应组分的可及性之间存在显著的困难。其他困难包括(iii)可能干扰核酸催化结构域活性的不希望的构象变化和/或潜在的表面相互作用，和(iv)由扩散限制引起的反应速率降低和/或(v)需要确保所有去除未结合的催化核酸以防止在不存在靶标时引发级联反应。
存在对用于检测靶标分子的改进的测定的需求。优选地，改进的测定可通过改善的信号放大促进增加的灵敏度。
发明内容
本文所述的发明减轻了现有技术中至少一些与利用束缚在固定/非移动支持物上的反应组分的信号扩增测定有关的问题。本发明人设计了一种系统，该系统能够保持核酸酶及其组分(例如固体支持物的部分酶寡核苷酸组分)与其底物的空间分离，而不依赖于固定/固定化载体的测定的固有缺点。因此，本文所述的测定法实现了增强的反应效率和/或特异性，这是通过利用束缚在固定/非移动支持物上的反应组分的信号扩增测定法所寻求的。通常，本发明的测定法利用可牵引的永久性膜将核酸酶和/或其组分与其底物分离。这些组分在测定混合物中保持可移动性，这提供了优于依赖于固定/非移动支持物的测定的各种优点。在进行修饰(例如移动支持组分的裂解，电荷和/或尺寸的改变或其他)时，仅在存在靶标分子时触发，酶/酶组分变得能够渗透膜并由此进入与底物接触以修饰它们并提供信号。
更具体地，本发明人设计了利用底物酶寡核苷酸的快速检测测定，所述底物酶寡核苷酸各自包含催化核酸底物组分、催化核酸组分(完整催化核酸或其部分，例如部分酶寡核苷酸)、以及防止底物酶寡核苷酸移动通过测定中使用的其他可渗透膜的组分和/或性质。底物酶寡核苷酸在溶液中是可移动的，而不是例如被束缚在平面上。这提供了许多优点，包括但不限于改进的催化核酸对其底物的可接近性以及增加的向膜的相对侧的扩散速率，导致更快的检测。底物酶寡核苷酸的催化核酸组分以催化活性形式存在，而没有例如任何构象约束(例如杂交的抑制分子/寡核苷酸)，其在其靶标底物存在下会降低或阻止其催化活性。以不受抑制的形式提供催化核酸组分避免了与利用受构象限制的酶相关的催化活性的降低。在本文所述的测定中，靶标分子的存在触发底物酶寡核苷酸的切割，从底物酶寡核苷酸释放催化核酸组分并允许释放的催化核酸组分渗透膜。一旦通过膜，释放的催化核酸组分可切割包含其底物的其他底物酶寡核苷酸，从而释放其他催化核酸组分。这些可以反过来渗透到膜的另一侧以切割进一步的底物酶寡核苷酸，等等。因此，本发明的测定法依赖于在初始目标识别事件后跨膜转移催化活性核酸酶和/或其组分(例如部分酶寡核苷酸)。包含底物组分的裂解的底物酶的其余部分保留在膜的一侧并且仍然不能透过它。因此，本文描述的测定不依赖于或需要核酸酶底物跨膜转移。相反，它们依赖于提供催化活性核酸和/或其组分作为底物酶寡核苷酸的组分，以及它们随后在靶标识别事件后释放和转移穿过膜。
本文描述的测定的靶标识别事件利用“起始”催化核酸，其特异性地检测靶标并且在这样做时实现底物酶寡核苷酸的切割。本发明人已经观察到，与其他方法相比，以本文公开的方式使用起始酶可以提高检测测定的灵敏度和/或特异性，例如，依赖于靶标分子从催化核酸中去除抑制组分以促进其活性的那些方法。
本发明的测定可以包含反馈环，使得它们能够进行信号放大，而与存在的靶标分子的数量无关。单靶标分子可以启动级联，其中初始底物酶通过起始酶以靶标依赖性方式裂解。这释放了底物酶的催化核酸组分，其可以自由地渗透穿过膜。一旦穿过膜，释放的催化活性核酸和/或其组分可以接近并切割其底物，其作为另一种底物酶的组分存在。该事件又从裂解的底物酶中释放另一种催化活性核酸或其组分(例如，部分酶寡核苷酸)，所述底物酶可以穿过可渗透膜并切割其底物，所述底物也是另一种底物酶的组分。因此，底物酶切割事件可以以这种方式延续，并且建立反馈扩增环，其独立于存在的另外的靶标分子。这提供了优于例如线性级联(其中产生的信号量更受存在的靶标分子数量的限制)的显著优点。
因此，本发明通过至少部分地包含以下列出的实施方案1-59来解决现有靶标分子检测和/或信号扩增测定中至少一个明显的缺点：
实施方案1：一种用于确定样品中存在靶标的方法，所述方法包括：
-提供反应混合物，包括：
多核苷酸A群(PA)和多核苷酸B群(PB)，其中
每个PA多核苷酸包含催化核酸A和催化核酸底物A，
每个PB多核苷酸包含催化核酸B和催化核酸底物B，
催化核酸A能够催化修饰催化核酸底物B，和
催化核酸B能够催化修饰催化核酸底物A；
选择性渗透屏障，其能够将PA与PB物理分离，其中PA和PB不能渗透选择性渗透屏障，并且PA和/或PB在反应混合物中是可移动的；并且
(i)两种寡核苷酸各自能够与PA多核苷酸的催化核酸底物A特异性杂交，并且至少一种寡核苷酸能够与靶标特异性杂交，从而形成能够切割PA多核苷酸的催化核酸底物A的催化核酸C；或者
(ii)催化酶D，其能够切割通过靶标与PA的杂交形成的核酸双链体的一条或多条链；
-接触：
(i)使PA、PB和寡核苷酸与样品接触，并使用选择性渗透屏障将PA与PB分离，其中：
如果靶标存在于样品中，则两种寡核苷酸中的每一种与PA多核苷酸的催化核酸底物A杂交，并且至少一种与靶标杂交，从而形成催化核酸C，所述催化核酸C切割PA多核苷酸，从而释放PA多核苷酸的催化核酸A，其因此能够移动通过可渗透屏障；或者
(ii)使样品与PA、PB和催化酶D接触，并使用选择性渗透屏障将PA与PB分离，其中：
如果靶标存在于样品中，则靶标与PA多核苷酸杂交形成包含催化酶D的识别和切割位点的核酸双链体，
催化酶D的切割位点不在催化核酸A内，并且
催化酶D在切割位点处结合并切割核酸双链体，释放PA多核苷酸的催化核酸A，其因此能够移动通过可渗透的屏障；
-其中：
释放的催化核酸A移动通过可渗透的屏障，与PB多核苷酸的催化核酸底物B杂交，并切割PB多核苷酸，从而释放PB多核苷酸的催化核酸B，其因此能够移动通过渗透屏障；
释放的催化核酸B移动通过可渗透的屏障，与第二PA多核苷酸的催化核酸底物A杂交，并切割第二PA多核苷酸，从而释放第二PA多核苷酸的催化核酸A，其因此能够穿过可渗透屏障运动；
并且
检测到任何所述PA和/或PB多核苷酸的切割表明样品中存在靶标。
实施例2：根据实施例1的方法，其中：
催化核酸A不能催化性修饰催化核酸底物A，和/或
第二多核苷酸的催化核酸B不能催化性地修饰催化核酸底物B。
实施方案3：根据实施方案1或实施方案2的方法，其中催化核酸C不能切割PB多核苷酸的催化核酸底物B。
实施方案4：根据实施方案1至3中任一项的方法，其中在反应混合物多核苷酸中可移动的PA和/或PB的任一个包含：
附着的组分，和/或，
提供二级结构的自我互补区域，和/或
带电部分；
这可防止多核苷酸渗透穿过选择性渗透屏障。
实施方案5：根据实施方案4的方法，其中所述附着的组分是：
与配体杂交的适体，或
珠子(例如磁珠)，或
微粒，或
纳米粒子，或
带电部分。
实施方案6：根据实施方案4或实施方案5的方法，其中：催化核酸底物A的切割从PA多核苷酸的催化核酸A释放附接的组分或自身互补区，其因此能够通过可渗透屏障移动，和/或
催化核酸底物B的切割从PB多核苷酸的催化核酸B释放附接的组分或自身互补区，其因此能够通过可渗透屏障移动。
实施方案7：根据实施方案1至6中任一项的方法，其中催化核酸A和/或催化核酸B是脱氧核酶或核酶。
实施方案8：根据实施方案1至7中任一项的方法，其中：
催化核酸A和/或催化核酸B选自由8-17脱氧核酶、10-23脱氧核酶、9-86脱氧核酶、12-91脱氧核酶、GR-5脱氧核酶、17E脱氧核酶、RFD-EC1脱氧核酶、F-8脱氧核酶、39-E脱氧核酶、E2脱氧核酶、Mg5脱氧核酶、A43脱氧核酶、DAB22脱氧核酶、PS2.M脱氧核酶、锤头状核酶、L-组氨酸依赖性脱氧核酶和HRP脱氧核酶组成的组。
实施方案9：根据实施方案1至8中任一项的方法，其中：
催化核酸A和催化核酸B各自是不同种类的脱氧核酶。
实施方案10：根据实施方案1至9中任一项的方法，其中：
(i)催化核酸A是10-23脱氧核酶，催化核酸B是8-17脱氧核酶；和
催化核酸底物A是8-17脱氧核酶的底物，催化核酸底物B是10-23脱氧核酶的底物；或者
(ii)催化核酸A是8-17脱氧核酶，催化核酸B是10-23脱氧核酶；和
催化核酸底物A是10-23脱氧核酶底物，催化核酸底物B是8-17脱氧核酶底物。
实施方案11：根据实施方案1至10中任一项的方法，其中：
提供两种寡核苷酸，每种寡核苷酸能够特异性地与PA多核苷酸的催化核酸底物A杂交，并且至少一种能够与靶标特异性杂交，从而形成能够裂解PA多核苷酸的催化核酸底物A的催化核酸C；
靶标包括蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒、或其任何衍生物、其部分或其组合，或由以上组成；
催化核酸C包含能够与靶标结合的适体部分；
该方法还包括使样品与抑制剂接触，所述抑制剂与适体杂交，从而使催化核酸C失活；
抑制剂对适体部分的结合亲和力低于靶标对适体部分的结合亲和力；并且
当存在于样品中时，靶标与适体结合，该适体取代抑制剂并使催化核酸C具有活性，从而促进PA多核苷酸的催化核酸底物A的切割。
实施方案12：根据实施方案1至11中任一项的方法，其中：
催化核酸C是多组分核酸酶(MNA酶)，
并且
两种寡核苷酸是能够在靶标存在下自组装形成多组分核酸酶两种部分酶寡核苷酸，其。
实施方案13：根据实施方案1至10中任一项的方法，其中：
催化核酸C是多组分核酸酶(MNA酶)，
所述两种寡核苷酸是能够仅在靶标存在下自组装以形成多组分核酸酶的两种部分酶寡核苷酸，
靶标包含多核苷酸或由多核苷酸组成；并且
两种部分酶寡核苷酸各自在自组装期间与多核苷酸杂交以形成多组分核酸酶。
实施方案14：根据实施方案12的方法，其中：
靶标包括蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒、或其任何衍生物、其部分或其组合，或由以上组成；
两种部分酶寡核苷酸中的至少一种包含能够与靶标特异性杂交的DNA、RNA或肽适体部分；
该方法还包括使样品与多组分核酸酶组装易化子寡核苷酸接触，所述组装易化子寡核苷酸促进两种部分酶寡核苷酸自组装成多组分核酸酶，以及与抑制剂分子接触，所述抑制剂分子与适体杂交，使多组分核酸酶催化失活；
抑制剂对适体部分的结合亲和力低于靶标对适体部分的结合亲和力；并且
靶标与除去抑制剂并使多组分核酸酶具有催化活性的适体部分杂交。
实施方案15：根据实施方案1至10中任一项的方法，其中：
靶标是多核苷酸，
催化酶D是内切核酸酶或外切核酸酶。
实施方案16：根据实施方案1至15中任一项的方法，其中
催化核酸A从PA多核苷酸的催化核酸底物A的释放和/或催化核酸B从PB多核苷酸的催化核酸底物B的释放将荧光团与猝灭剂分离，从而提供信号便于检测靶标。
实施方案17：根据实施方案1至16中任一项的方法，其中所述检测包括
从反应混合物中分离释放的催化核酸A和/或释放的催化核酸B；
在适合于通过催化核酸切割催化核酸底物的条件下，将分离的催化核酸应用于包含催化核酸底物A和/或催化核酸底物B的第二反应混合物；
检测通过催化核酸对催化核酸底物的切割。
实施方案18：根据实施方案1至17中任一项的方法，其中所述检测包括实时定量释放的催化核酸A和/或释放的催化核酸B。
实施方案19：根据实施方案1至18中任一项的方法，包括：少于5个、少于6个、少于7个、少于8个、少于9个、少于10个、少于15个或少于20个的PA多核苷酸的切割，和/或
少于5个、少于6个、少于7个、少于8个、少于9个、少于10个、少于15个或少于20个的PB多核苷酸的切割，
以便于检测靶标。
实施方案20：一种用于确定样品中靶标的存在的方法，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，包括：
(i)多核苷酸A群(PA)、多核苷酸B群(PB)和多核苷酸C群(PC)，其中
每个PA多核苷酸包含催化核酸A和催化核酸底物A，
每个PB多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B1和催化核酸底物B，
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2，
其中：
部分酶寡核苷酸B1的底物臂能够与催化核酸底物A杂交，
部分酶寡核苷酸B2的底物臂能够与催化核酸底物A杂交，并且
催化核酸A能够催化修饰催化核酸底物B；
(ii)组装易化子寡核苷酸，其能够与部分酶寡核苷酸B1的传感器臂和部分酶寡核苷酸B2的传感器臂杂交；
(iii)能够将PA与PB物理分离的选择性渗透屏障，其中PA和PB不能渗透选择性渗透屏障，PA、PB和PC在反应混合物中可移动；以及下列之一：
(iv)两个部分酶寡核苷酸C1和C2各自能够与PA多核苷酸的催化核酸底物A特异性杂交，并且至少一个能够与靶标特异性杂交，从而形成能够切割PA多核苷酸的催化核酸底物A的催化核酸C；
或者
(v)能够切割通过靶标与PA杂交形成的核酸双链体的一条或多条链的催化酶D；
和
(b)接触：
(i)使部分酶寡核苷酸C1和C2与样品接触，并使用选择性渗透屏障将PB与PA分离，其中：
如果靶标存在于样品中，则每种部分酶寡核苷酸C1和C2的底物臂与PA多核苷酸的催化核酸底物A杂交，并且部分酶寡核苷酸C1和C2中的至少一种与所述靶标杂交形成催化核酸C，所述催化核酸C切割PA多核苷酸，从而释放PA多核苷酸的催化核酸A，其因此能够通过可渗透屏障移动；
或者
(ii)使催化酶D与样品接触，并使用选择性渗透屏障将PB与PA分离，其中：
如果靶标存在于样品中，则靶标与PA多核苷酸杂交形成包含催化酶D的识别和切割位点的核酸双链体，
催化酶D的切割位点不在催化核酸A内，并且
催化酶D在切割位点处结合并切割核酸双链体，释放PA多核苷酸的催化核酸A，其因此能够移动通过可渗透的屏障；其中：
释放的催化核酸A移动通过可渗透的屏障，与PB多核苷酸的催化核酸底物B杂交，并切割PB多核苷酸，从而释放PB多核苷酸的部分酶寡核苷酸B1，其因此能够通过可渗透屏障移动；
释放的部分酶寡核苷酸B1移动通过可渗透的屏障，每个部分酶寡核苷酸B1和B2的传感器臂与组装易化子寡核苷酸杂交，并且每个部分酶寡核苷酸B1和B2的底物臂与第二PA多核苷酸的催化核酸底物A杂交，从而形成催化核酸B，所述催化核酸B切割第二PA多核苷酸，从而释放第二PA多核苷酸的催化核酸A，其因此能够通过可渗透屏障移动；
和
检测到任何所述PA和/或PB多核苷酸的切割表明样品中存在靶标。
实施方案21：根据实施方案20的方法，其中：
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2和可被催化核酸A切割的催化核酸底物B，
释放的催化核酸A切割PC多核苷酸，从而释放PC多核苷酸的部分酶寡核苷酸B2，和
检测到任何PC多核苷酸的切割表明样品中存在靶标。
实施方案22：根据实施方案20的方法，其中
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2和催化核酸底物A，和
如果靶标存在于样品中，则每种部分酶寡核苷酸C1和C2的底物臂与PC多核苷酸的催化核酸底物A杂交，并且至少一种部分酶寡核苷酸C1和C2与靶标杂交形成催化核酸C，所述催化核酸C切割PC多核苷酸，从而释放PC多核苷酸的部分酶寡核苷酸B2。
实施方案23：根据实施方案20的方法，其中如果靶标存在于样品中，则靶标与PC多核苷酸杂交以形成核酸双链体，其包含催化酶D的识别和切割位点，催化酶D的切割位点不在PC多核苷酸的催化核酸A内，以及
催化酶D在切割位点结合并切割核酸双链体，从而释放PC多核苷酸的部分酶寡核苷酸B2。
实施方案24：根据实施方案20至22中任一个的方法，其中在反应混合物中可移动的PA、PB和/或PC多核苷酸的任一个包含：
附着的组分和/或，
提供二级结构的自我互补区域，和/或
带电部分；
其防止多核苷酸渗透穿过选择性渗透屏障。
实施方案25：根据实施方案24的方法，其中所述附着的组分是：
与配体杂交的适体，或
珠子(例如磁珠)或微粒，
或纳米粒子，或带电部分。
实施方案26：根据实施方案24或实施方案25的方法，其中：
催化核酸底物A的切割从PA多核苷酸的催化核酸A释放附接的组分或自身互补区域，其因此能够移动通过可渗透屏障，
和/或催化核酸底物B的切割从PB多核苷酸释放附接的组分或自身互补区域，因此PB多核苷酸能够移动通过可渗透屏障。
实施方案27：根据实施方案20至26中任一项的方法，其中：
催化核酸C是多组分核酸酶(MNA酶)，
和
两种寡核苷酸是两种部分酶寡核苷酸，其能够仅在靶标存在下自组装形成多组分核酸酶。
实施方案28：根据实施方案27的方法，其中：
靶标包括蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒，或其任何衍生物、部分或组合，或由以上组成；
两种部分酶寡核苷酸中的至少一种包含能够与靶标特异性杂交的DNA、RNA或肽适体部分；
该方法还包括使样品与多组分核酸酶组装易化子寡核苷酸接触，促进两种部分酶寡核苷酸自组装成多组分核酸酶，和与抑制剂分子接触，所述抑制剂分子与适体杂交，使多组分核酸酶催化失活；
抑制剂对适体部分的结合亲和力低于靶标对适体部分的结合亲和力；并且
靶标与适体部分杂交，除去抑制剂并使多组分核酸酶具有催化活性。
实施方案29：根据实施方案27的方法，其中：
靶标包含多核苷酸或由多核苷酸组成；以及
两个部分酶寡核苷酸各自在自组装期间与多核苷酸杂交以形成多组分核酸酶。
实施方案30：根据实施方案1至29中任一项的方法，其中：
反应混合物还包含在反应混合物中可移动的催化核酸底物A群，该群的每个催化核酸底物A包含荧光团分子和猝灭剂分子；并且
催化核酸B和/或催化核酸C切割催化核酸底物A群的成员，将荧光团与猝灭剂分离，从而提供便于检测靶标的信号。
实施方案31：用于检测样品中靶标的组合物，该组合物包含：
多核苷酸A群(PA)和多核苷酸B群(PB)，其中
每个PA多核苷酸包含催化核酸A和催化核酸底物A，
每个PB多核苷酸包含催化核酸B和催化核酸底物B，
催化核酸A能够催化性修饰催化核酸底物B，和
催化核酸B能够催化性修饰催化核酸底物A，
能够将PA与PB分离的选择性渗透屏障。
实施方案32：组合物，包含：
(i)多核苷酸A群(PA)，多核苷酸B群(PB)和多核苷酸C群(PC)，其中
每个PA多核苷酸包含催化核酸A和催化核酸底物A，
每个PB多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B1和催化核酸底物B，
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2，
其中：
部分酶寡核苷酸B1的底物臂能够与催化核酸底物A杂交，
部分酶寡核苷酸B2的底物臂能够与催化核酸底物A杂交，并且
催化核酸A能够催化修饰催化核酸底物B；
(ii)组装易化子寡核苷酸，其能够与部分酶寡核苷酸B1的传感器臂和部分酶寡核苷酸B2的传感器臂杂交；
(iii)能够将PA与PB物理分离的选择性渗透屏障，其中PA和PB不能渗透选择性渗透屏障，
其中，部分酶寡核苷酸B1底物臂和部分酶寡核苷酸B2底物臂与催化核酸底物A的杂交，以及部分酶寡核苷酸B1传感器臂和部分酶寡核苷酸B2传感器臂与组装易化子的杂交形成催化核酸B能够切割催化核酸底物A。
实施方案33：根据实施方案32的组合物，其中：
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2和所述催化核酸底物B，其能够被催化核酸A切割；或者
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2和所述催化核酸底物A。
实施方案34：根据实施方案31的组合物，其中PA和/或PB中的任何一种包含：
附着的组分和/或，
提供二级结构的自我互补区域，和/或
带电部分；
其可防止多核苷酸渗透穿过选择性渗透屏障。
实施方案35：根据实施方案32或实施方案33的组合物，其中任何PC包含：
附着的组分和/或，
提供二级结构的自我互补区域，和/或
带电部分；
其可防止多核苷酸渗透穿过选择性渗透屏障。
实施方案36：根据实施方案34或实施方案35的组合物，其中附着的组分是：
与配体杂交的适体，或
珠子(例如磁珠)，或
微粒，或
纳米粒子，或
带电部分。
实施方案37：根据实施方案31至36中任一项的组合物，其中：
催化核酸A不能催化修饰催化核酸底物A，和/或
第二多核苷酸的催化核酸B不能催化修饰催化核酸底物B。
实施方案38：实施方案31至37中任一项的组合物，其进一步包含两种寡核苷酸，每种寡核苷酸能够与PA多核苷酸的催化核酸底物A特异性杂交，并且至少一种寡核苷酸能够与靶标特异性杂交，从而形成催化核酸C，其能够切割PA多核苷酸的催化核酸底物A。
实施方案39：根据实施方案38的组合物，其中：
催化核酸C是多组分核酸酶(MNA酶)，
和
两种寡核苷酸是两种部分酶寡核苷酸，其能够仅在靶标存在下自组装形成多组分核酸酶。
实施方案40：实施方案31至36中任一项的组合物，还包含：
催化酶D，其能够裂解通过靶标与PA的杂交形成的核酸双链体的一个或多个位点；
其中：
至少一部分PA多核苷酸与靶标共享序列互补性，使其能够与靶标杂交以形成包含催化酶D的识别和切割位点的核酸双链体，和
催化酶D的切割位点不在PA多核苷酸的催化核酸A内。
实施方案41：根据实施方案40的组合物，其中：
靶标是多核苷酸，
催化酶D是内切核酸酶或外切核酸酶。
实施方案42：根据实施方案38的组合物，其中靶标包含蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒，或其任何衍生物、部分或组合，或由以上组成；
催化核酸C包含能够与靶标结合的适体部分；
该组合物还包含与适体杂交的抑制剂；并且
抑制剂对适体部分的结合亲和力低于靶标对适体部分的结合亲和力；
能够将PA与PB分离的选择性渗透屏障。
实施方案43：根据实施方案38或实施方案39的组合物，其中：
靶标包含多核苷酸或由多核苷酸组成；和
只有在靶标存在下才能自组装形成多组分核酸酶的两种部分酶寡核苷酸可以各自与靶标的多核苷酸和PA多核苷酸的催化核酸A底物杂交，从而自组装形成多组分核酸酶。
实施方案44：根据实施方案39的组合物，其中：
靶标包括蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒，或其任何衍生物、部分或组合，或由以上组成；
只有在靶标存在下能够自组装以形成多组分核酸酶的两种部分酶寡核苷酸中的至少一种包含能够与靶标特异性杂交的DNA、RNA或肽适体部分；
该组合物还包含多组分核酸酶组装易化子寡核苷酸，只有在靶标存在下能够自组装以形成MNA酶的两种部分酶寡核苷酸可以各自杂交至所述MNA酶组装易化子寡核苷酸，促进多组分核酸酶的自组装；
该组合物还包含抑制剂分子，其可以与适体杂交，从而使多组分核酸酶催化失活；
抑制剂对适体部分的结合亲和力低于靶标对适体部分的结合亲和力；并且
靶标可以与适体部分杂交以除去抑制剂并使多组分核酸酶具有催化活性。
实施方案45：根据实施方案31至44中任一项的组合物，其进一步包含通过催化核酸C和/或催化核酸B切割PA多核苷酸而释放的催化核酸A。
实施方案46：根据实施方案31至45中任一个的组合物，其进一步包含通过催化核酸A切割PB多核苷酸而释放的催化核酸B。
实施方案47：根据实施方案31至46中任一项的组合物，其中：
催化核酸A和/或催化核酸B是脱氧核酶或核酶。
实施方案48：根据实施方案31至47中任一项的组合物，其中：
催化核酸A和/或催化核酸B选自由8-17脱氧核酶、10-23脱氧核酶、9-86脱氧核酶、12-91脱氧核酶、GR-5脱氧核酶、17E脱氧核酶、RFD-EC1脱氧核酶、F-8脱氧核酶、39-E脱氧核酶、E2脱氧核酶、Mg5脱氧核酶、A43脱氧核酶、DAB22脱氧核酶、PS2.M脱氧核酶、锤头状核酶、L-组氨酸依赖性脱氧核酶和HRP脱氧核酶组成的组。
实施方案49：根据实施方案31至48中任一项所述的组合物，其中：
催化核酸A和催化核酸B各自是不同种类的脱氧核酶。
实施方案50：根据实施方案31至49中任一项的组合物，其中：
(i)催化核酸A是10-23脱氧核酶，催化核酸B是8-17脱氧核酶；和
催化核酸底物A是8-17脱氧核酶底物，催化核酸底物B是10-23脱氧核酶底物；或者
(ii)催化核酸A是8-17脱氧核酶，催化核酸B是10-23脱氧核酶；和
催化核酸底物A是10-23脱氧核酶底物，催化核酸底物B是8-17脱氧核酶底物。
实施方案51：根据实施方案31至50中任一项的组合物，其中PA和/或PB和/或PC在组合物中是可移动的。
实施方案52：根据实施方案31至51中任一项的组合物，其中PA多核苷酸和/或PB多核苷酸和/或PC多核苷酸各自包含荧光团和猝灭剂。
实施方案53：根据实施方案31至52中任一项的组合物，其进一步包含在组合物中可移动的催化核酸底物A群，该群的每个催化核酸底物A包含荧光团分子和猝灭剂分子，其中催化核酸B能够裂解催化核酸底物A群的成员，将荧光团与猝灭剂分离，从而提供便于检测靶标的信号。
实施方案54：根据实施方案38或实施方案39的组合物，其进一步包含在组合物中可移动的催化核酸底物A群，该群的每个催化核酸底物A包含荧光团分子和猝灭剂分子，其中催化核酸C能够切割催化核酸底物A群的成员，将荧光团与猝灭剂分离，从而提供便于检测靶标的信号。
实施方案55：一种多核苷酸，其包含：
催化核酸或其组分；
催化核酸底物；
以及以下的任何一个或多个：
(i)附接的组件，
(ii)提供二级结构的自我互补区域，
(iii)带电部分，
其能够防止多核苷酸渗透穿过选择性渗透的屏障；
其中催化核酸不能催化修饰催化核酸底物。
实施方案56：根据实施方案55的多核苷酸，其中所述附着的组分是：
与配体杂交的适体，或
珠子(例如磁珠)，或
微粒，或
纳米粒子，或
带电部分。
实施方案57：根据实施方案55或实施方案56的多核苷酸，其中催化核酸是脱氧核酶或核酶。
实施方案58：根据实施方案57的多核苷酸，其中脱氧核酶是10-23脱氧核酶或8-17脱氧核酶。
实施方案59：根据实施方案55或实施方案56的多核苷酸，其中其组分是多组分核酸酶的部分酶寡核苷酸组分。
附图说明
现在将参考附图，仅通过实例描述本发明的优选实施方案，其中：
图1描绘了根据本发明实施方案的两个示例性底物酶。在该图中，底物酶包括“底物”(Sub)，其是与“催化”(Cat)连接的酶的底物，“催化”(Cat)是催化核酸分子(如图1A所示)或催化核酸分子的组分(如图1B所示)。举例来说，图1A中的底物酶A可包含Cat A，其是10-23脱氧核酶和Sub A，其可被8-17脱氧核酶切割。或者，底物酶A可以包含Cat A，其是8-17脱氧核酶和Sub A，其可被10-23脱氧核酶切割。在其他实施方案中，如底物酶B(图1B)所示，底物酶可包含Cat B1，其是与通过催化核酸酶可切割的Sub B连接的多竞争核酸酶(MNA酶)的部分酶B1组分。
图2描绘了根据本发明实施方案的示例性亚基对，其能够交叉催化。两种底物酶被描述为附着于可选的磁珠(MB)，其可用于操纵亚酵母。举例来说，PA(底物酶A-MB)包含CatA和Sub A，PB(底物酶B-MB)包含Cat B和Sub B。举例来说，PA包含Cat A(10-23脱氧核酶A)与可被Cat B(8-17脱氧核酶B)切割的亚A连接；PB包含与B基因连接的Cat B(8-17脱氧核酶B)，其可被Cat A(10-23脱氧核酶A)切割。相反，PA包含与底物A连接的Cat A(8-17脱氧核酶A)，其可被Cat B切割(10-23脱氧核酶B)；PB包含与底物B连接的Cat B(10-23脱氧核酶B)，其可被Cat A(8-17脱氧核酶A)切割。此外，Sub A和/或Sub B可以被MNA酶切割，例如起始MNA酶；
图3描绘了根据本发明实施方案的可渗透屏障的示例性组件和构造，在本文中也称为“T袋”。T袋可以由廉价的部件构成，包括例如滤纸、胶带、胶和合成的寡核苷酸。图3A示出了通过将双面胶带放置在如所示的滤纸上而制成的“孔”。然后将附着于大颗粒如磁珠的寡核苷酸(底物酶)点样到孔中并使其干燥。可以将第二层滤纸放在上面，并且可以修剪T袋。图3B示出了通过将双面胶带折叠成两半而制成的T袋，使得粘性侧面自身向后折叠，仅暴露非粘性衬垫。“孔”可以使用打孔器并将孔放在如所示的滤纸条上。然后将附着于大颗粒如磁珠的寡核苷酸(底物酶)点样到孔中并使其干燥。第二层滤纸可放在上面，T袋可以修剪；
图4描绘了根据本发明实施方案的示例性方案，其中可渗透屏障(称为“T袋”)和底物酶用于在检测靶标后放大信号。该管含有PA(底物酶A-MB)、PB(在T袋内的底物酶B-MB)和所选目标的部分酶。在靶标存在下，部分酶对齐并形成Cat C(MNA酶)。MNA酶切割PA内的SubA(例如10-23底物)，将Cat A(例如8-17脱氧核酶A)与MB分离，使其能够通过T袋壁迁移，在那里它可以切割PB内的Sub B，从而分离来自MB的Cat B(例如10-23脱氧核酶B)。Cat B现在可以自由地从T袋迁移到溶液中，它可以在PA中切割Sub A并启动级联。孵育一段时间后，可以使用磁铁保留未切割的底物酶-MB和切割的MB片段，从而使含有游离脱氧核酶(Cat A和Cat B)的上清液转移到含有标记的Sub A和/或Sub B的另一个管中。通过脱氧核酶切割分离荧光团和猝灭剂后产生的荧光可以实时监测；
图5描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中进行了与人TFRC基因同源的寡核苷酸靶标的滴定。图显示在含有TFRC靶标(1pM、100fM、1fM和500μM)或无靶标的T袋孵育反应后监测底物切割。在该实验中，在不存在靶标寡核苷酸的情况下产生的背景信号之上容易检测到1pM和100fM的浓度。图表显示在T袋中孵育15分钟(5A)或20分钟(5B)后荧光底物裂解的实时监测。在实时监测10分钟后，检测到100fM是明显的。在这些实验条件下，1fM和500aM目标浓度未产生高于背景的信号；
图6描述了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中证明了成功检测到与TFRC同源的1pM合成寡核苷酸。相比之下，1nM的脱靶标寡核苷酸模板Bla-KPC和CT_Cds2未给出高于背景的信号(无靶标)。该图显示在含有靶标，脱靶标或无靶标的T袋培养反应后监测底物裂解；
图7描述了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中证明了成功检测10pM的OXA基因的合成寡核苷酸模板，其赋予对β-内酰胺酶的抗性。该图显示了在含有或缺乏靶标的T袋温育反应后监测底物裂解；
图8描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中证明了成功检测人基因组DNA中的人TFRC基因。该图显示了在含有或缺乏靶标的T袋温育反应后监测底物裂解。该实验在10％人血清的存在(8B)或不存在(8A)下进行；和
图9描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中证明了成功检测人基因组DNA中的人TFRC基因。在该实验中，使用靶标向人TFRC基因的三种MNA酶来引发反应。该图显示在20分钟T-袋温育反应后监测底物裂解，所述T-袋温育反应含有或缺乏gDNA靶标。
图10显示了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中证明了成功检测人基因组DNA中的人TFRC基因。在该实验中，靶标向人TFRC基因的MNA酶用于引发反应。图表显示在20分钟T-袋温育反应后监测底物裂解，所述温育反应含有gDNA，估计有168,000或270,000个拷贝的TFRC基因或缺少gDNA靶标；
图11描绘了涉及两种代表性底物酶的根据本发明实施方案的示例性测定的结果。实线是包含目标的反应，而虚线缺少目标。底物酶A(11c和11d)包含8-17催化核酸组分和10-23催化核酸底物组分。底物酶C(11a和11b)包含10:23催化核酸组分和非互补10-23催化核酸底物组分。结果表明，由8-17和10-23个催化核酸组分的混合物组成的底物酶比仅由10-23个催化核酸组分组成的底物酶具有更长的稳定性；
图12描绘了根据本发明实施方案的示例性底物酶的结果，其已被系在平面载玻片上。结果表明，非栓系亚基(混合物A)能够水解核酸底物并产生荧光，而用栓系亚基酶(混合物B)检测不明显；和
图13描绘了根据本发明实施方案的两个示例性底物酶对，两者都能够交叉催化。表示为多核苷酸A(PA)和多核苷酸B(PB)的两个底物酶对被描绘为附着于可用于操纵底物酶的任选磁珠(MB)。PA和PB可任选通过5'或3'末端连接到磁珠(MB)上。底物酶A-MB(PA)包括功能域，即(i)Cat A(例如8-17脱氧核酶)，(ii)Sub A(例如可被10:23核酸酶切割的底物A)，和任选地(iii)任一接头序列(图13A)或与靶标核酸互补的序列(图13B)，其另外包含内切核酸酶或外切核酸酶识别位点的一条链，例如限制酶(RE)/Nicking酶(NE)。底物酶B-MB(PB)包含功能域，即(i)Cat B(例如10:23脱氧核酶B)，(ii)Sub B(例如底物B，其可被8:17脱氧核酶/Cat A切割)和任选地(iii)接头序列(图13A和13B)。在图13A的方案中，靶标核酸的存在导致形成例如能够切割SubA的10：23MNA酶C(Cat C)。PA中Sub A的裂解导致Cat A的释放，其随后可以穿过选择性渗透屏障并在PB内切割Sub B以释放Cat B。然后Cat B可以穿过选择性渗透屏障并在内部切割新的Sub A。另一个PA并释放更多的Cat A，从而启动交叉催化信号放大级联。在图13B的方案中，靶标核酸的存在与PA中的靶标特异性序列(iii)杂交，从而产生双链双链体区，其形成催化酶D/Cat D(例如RE/NE)的识别位点。Cat D对PA的裂解可释放Cat A，其随后可移动通过选择性渗透屏障，并在PB内切割Sub B.PB的裂解释放Cat B，其可以依次穿过选择性渗透屏障并在另一PA内切割Sub A以释放更多Cat A，从而启动交叉催化信号放大级联；和
图14描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中使用限制性内切核酸酶来证明测定起始的第一步作为MNA酶的替代。该策略如图13B所示。该图显示了在含有或缺少切口核酸内切酶Nt.BstNBI(+/-4单位)和ompA目标(+/-2nM)的T袋培养反应后监测底物裂解。在该实验中，仅在切口内切核酸酶和ompA靶标的存在下观察到信号的增加，表明两者都是靶标诱导释放表面结合的脱氧核酶所需的(Cat A)；和
图15描绘了根据本发明实施方案的示例性方案，其中可渗透屏障(称为“T袋”)用作包封拴在珠子上的亚基的机制并在空间上限制它们使得它们不能与反应相互作用。组件限制在T袋透水屏障的外部。该管在T袋内含有PB(底物酶/珠子)。在不存在起始脱氧核酶(脱氧核酶A)的情况下，底物酶珠通过半透性屏障保持包封在T袋内。然而，当将引发脱氧核酶(脱氧核酶A)加入管中时，它可以通过T袋的壁迁移，在那里它可以切割底物酶珠中的底物B，从而将脱氧核酶B与珠子分离。脱氧核酶B现在可以自由地从T袋迁移到溶液中。如果使用磁珠，则可以任选地使用磁体在孵育一段时间后保留未切割的底物酶珠和切割的珠片段。含有游离脱氧核酶(脱氧核酶B)的上清液转移到另一个含有标记底物的试管中。通过脱氧核酶B裂解分离荧光团和猝灭剂后产生的荧光可以实时监测，和；
图16(A-F部分)描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中束缚在各种尺寸的磁珠上的底物酶在空间上限制在由不同尺寸的孔组成的膜制成的T袋的边界内。该图显示了在含有或缺乏起始脱氧核酶的T袋温育反应后监测底物裂解的结果。该策略如图15所示。结果显示在不存在起始脱氧核酶的情况下可忽略不计的信号，表明底物酶不能穿透T袋膜，同时束缚到直径大于膜孔径的磁珠。在起始脱氧核酶A存在时存在强信号，表明起始脱氧核酶可以扩散到T袋中，切割底物酶-MB并释放表面结合的脱氧核酶。它还表明释放的脱氧核酶能够迁移到T袋外部并切割荧光标记的底物分子。对于各种磁珠尺寸(2.8μm、6μm和8μm)和各种孔径(0.8μm和2.0μm)显示了类似的结果-参见A-F部分；和
图17描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中测试了每秒向底物酶-MB反应中添加PES膜以确定其对脱氧核酶的催化活性的影响。该图显示在含有或缺少PES膜(+/-膜)和/或引发脱氧核酶(+/-2nM Dz)的底物酶-MB孵育反应后监测底物切割。在该实验中，向底物酶-MB反应中添加PES膜似乎增强脱氧核酶活性。与缺乏膜的反应相比，观察到含有PES膜的反应的荧光随时间的增加更快；和
图18(A-C部分)描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中底物酶-MB在空间上限制在用聚醚砜(PES)制成的T-袋的边界内。此外，测试了三种不同孔径的PES膜。该策略如图15所示。该图显示在含有或缺乏起始脱氧核酶(2nM)的T袋温育反应后监测底物裂解。结果显示，在没有起始脱氧核酶的情况下信号可忽略不计，表明底物酶-MB不能迁移出PES膜，其具有0.65μm(A部分)、0.8μm(B部分)和1.2μm(C部分)孔径。在引发脱氧核酶A的情况下存在强信号，表明可以使用替代膜如PES用于底物酶-MB与其他反应组分的包封和物理分离；
图19描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中进行了与沙眼衣原体ompA基因同源的寡核苷酸靶标的滴定。图显示在含有ompA靶标(100fM、10fM和1fM)、脱靶标(1nM)、人基因组DNA(约2×105基因拷贝)或无DNA的T袋温育反应后监测底物切割。在该实验中，在不存在靶标寡核苷酸的情况下产生的背景信号之上容易检测到100fM、10fM和1fM的浓度。相比之下，人类基因组DNA和1nM脱靶标寡核苷酸模板PPIA和p273未发出高于背景的信号(无DNA对照)；
图20描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中证实了在沙眼衣原体总核酸(TNA)样品中成功检测沙眼衣原体ompA基因。该图显示了在含有或缺乏靶标的T袋温育反应后监测底物裂解；
图21描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中证实了在不到15分钟内快速检测与沙眼衣原体ompA基因同源的寡核苷酸靶标。该图显示在含有或缺少靶标寡核苷酸(0pM、1pM或500pM)的12分钟T袋温育反应后监测底物裂解(3分钟)；
图22描绘了根据本发明实施方案的示例性方案，其中可渗透屏障(称为“T袋”)和两种类型的底物酶促进靶标检测后的信号放大。PA(底物酶A)中的催化成分是脱氧核酶(Cat A)；在PB(底物酶B1)内是部分酶(Cat B1)；在PC(底物酶B2)中是部分酶(Cat B2)。在靶标的存在下，起始MNA酶(Cat C)在PA内形成并切割Sub A，从MB释放Cat A并允许其迁移通过T袋壁，在那里它可以切割PB内的Sub B。这将从MB释放Cat B1，使其能够从T袋迁移出来，在那里它可以与Cat B2(PC)和组装易化子(AF-B3)杂交，形成有效反馈MNA酶(Cat B)。Cat B还可以在PA中切割Sub A并继续级联。孵育后，磁铁可用于保留底物酶和仍附着于MB的片段。可以将含有游离Cat A、Cat B和Cat C的上清液转移到含有标记的Sub A和/或SubB的另一个管中。可以监测由脱氧核酶和/或MNA酶切割底物后产生的荧光。
图23描绘了根据本发明实施方案的示例性方案，其中可渗透屏障(称为“T袋”)和三个底物酶用于在靶标检测后放大信号。PA(底物酶A)中的催化成分是脱氧核酶(Cat A)；在PB(底物酶B1)内是部分酶(Cat B1)；并且在PC(底物酶B2)内是部分酶(Cat B2)并且PA、PB和PC与珠子缀合。反应如图22所述进行；但是，在这里，可以实现额外的分离水平，以便PA和PC与PB分离；
图24描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中示例性的一对底物酶能够交叉催化。在该实验中，证明两种不同类型的底物酶能够交叉催化，PA包含与底物连接的脱氧核酶，PB包含通过底物与珠子连接的部分酶。该策略如图22所示。该图显示在含有ompA靶标(2nM、200pM、50pM、10pM和1pM)或无靶标的T袋孵育反应后监测底物裂解。在该实验中，在不存在靶标寡核苷酸的情况下产生的背景信号之上容易检测到所有浓度的靶标；
图25描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中证明了使用完全由8-17个组分组成的底物酶的交叉催化反馈级联。结果表明该方法能够检测2nM、200pM和20pM的起始脱氧核酶。信号与无脱氧核酶对照有很好的区别；
图26(部分A和B)描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中使用二氧化硅珠作为用于T袋测定的替代大体积表面。该策略如图15所示。结果显示在不存在起始脱氧核酶A的情况下可忽略的信号，表明底物酶不能通过PES膜(26A)和PES膜(26B)扩散，同时拴在二氧化硅珠(1μm直径)上。在起始脱氧核酶A存在时存在强信号，表明起始脱氧核酶可以扩散到T袋中，切割底物酶珠并释放表面结合的脱氧核酶。结果表明，只要珠子大于膜孔的直径，珠子和膜就可以由各种材料组成；
图27描绘了根据本发明实施方案的示例性方案，其中可渗透屏障(称为“T袋”)和底物酶用于放大信号并在靶标检测后检测单管中的信号。PA(底物酶A)中的组分是脱氧核酶(Cat A)和Sub A；在PB(底物酶B1)内是部分酶(Cat B1)和Sub B；并且在PC(底物酶B2)内是部分酶(Cat B2)和任选的Sub B。在靶标的存在下，由部分酶C1和C2形成的起始MNA酶(Cat C)切割PA中的Sub A，从MB释放Cat A并允许它通过T袋壁迁移，在那里它可以切割PB内的Sub B。这将从MB释放Cat B1，使其能够从T袋迁移出来，在那里它可以与Cat B2(PC)和组装易化子(AF-B3)杂交，形成有效反馈MNA酶(Cat B)。Cat B可以在PA中切割Sub A并继续级联。Cat B还可以切割标记的Sub A-FQ并产生荧光；
图28描绘了根据本发明实施方案的示例性测定的结果，其中使用图27中所示的T袋法证明了成功检测500pM、200pM、100pM和50pM的合成寡核苷酸靶标。相反，MNA酶对照反应未给出高于背景的信号(无靶标)。
具体实施方式
定义
本文使用的某些术语和短语具有如下所述的含义。
如在本申请中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，术语“MNA酶”还包括多个MNA酶。除非上下文另有要求或有明确相反地陈述，否则本文所述的本发明的整数、步骤或元素作为单数的整数、步骤或元素清楚地包含所述整数、步骤或元素的单数和复数形式。
除非另有说明，否则术语“包含”和“具有”意指“主要包括但不一定只包括”。此外，词语“包括”的变体，例如“包括”和“包含”，具有相应变化的含义。因此，例如，“包含”靶标分子A的样品可以仅由靶标分子A组成，或者可以包括一种或多种不同类型的靶标分子(例如靶标分子B和/或靶标分子C)。
本文所用的术语“靶标”和“靶标分子”是指能够通过本文所述的分子复合物检测的任何分子，包括但不限于核酸、蛋白质、糖蛋白、脂质、脂蛋白、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、小有机化合物、全细胞和整个生物体。例如，靶标可以是用作指导MNA酶组装的组装易化子的核酸，或任何能够结合适体引起包含适体(例如，apta-MNA酶或其他适体酶)的催化核酸的活化的分子。靶标核酸包括但不限于DNA多核苷酸和RNA多核苷酸。
术语“催化核酸”、“催化核酸分子”、“催化核酸酶”和“核酸酶”在本文中可互换使用并具有相同的含义。这些术语包括能够对一种或多种底物(例如核酸底物)进行特异性识别和催化修饰的任何核酸或其部分。例如，一种或多种底物可以是核酸，并且催化修饰可以是连接或切割。本文所用的催化核酸酶包括DNA分子或含DNA的分子，RNA或含RNA的分子，以及DNA-RNA或含DNA-RNA的分子。催化核酸酶的非限制性实例包括脱氧核酶(DNAzyme)(也称为DNA酶(DNA enzyme)和脱氧核酶(deoxyribozyme))、核酶(也称为RNA酶(RNA enzyme)和核酶(RNAzyme))和多组分核酸酶(MNA酶)(在本领域中也称为PlexZyme)。
如本文所用，术语“底物酶寡核苷酸”(subZyme oligonucleotide)或“底物酶”(subZyme)是指包含作为催化核酸或其部分的组分(例如部分酶(partzyme)寡核苷酸)的寡核苷酸，和作为催化核酸底物的组分。底物酶寡核苷酸的催化核酸不能催化修饰相同底物酶寡核苷酸的催化核酸底物组分。催化核酸或其部分和催化核酸底物可以沿着底物酶寡核苷酸处于不间断的序列中，或者可以分离，例如通过插入核苷酸和/或通过本领域可获得的任何合适的接头。底物酶寡核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸碱基，和/或其类似物、衍生物、变体、片段或组合。
底物酶寡核苷酸可任选地包含另外的分子，作为非限制性实例，其可有助于其分离或纯化(例如来自反应混合物)，包括但不限于珠子(bead)、微粒和酶。底物酶寡核苷酸可包含能够使寡核苷酸附着于表面的另外的官能团。在本发明的一些实施方案中并且作为非限制性实例，底物酶寡核苷酸可包含选自10-23脱氧核酶和8-17脱氧核酶的底物，或8-17脱氧核酶和10-23脱氧核酶的底物。作为非限制性实例，底物酶可包含选自8-17脱氧核酶、10-23脱氧核酶、9-86脱氧核酶、12-91脱氧核酶、GR-5脱氧核酶、17E脱氧核酶、RFD-EC1脱氧核酶、F-8脱氧核酶、39-E脱氧核酶、E2脱氧核酶、Mg5脱氧核酶、A43脱氧核酶、DAB22脱氧核酶、PS2.M脱氧核酶、锤头状核酶、L-组氨酸依赖性脱氧核酶和HRP脱氧核酶的催化核酸。根据本发明的底物酶寡核苷酸/亚型可包含一部分催化核酸，例如部分酶寡核苷酸。与衍生其的完整核酸相比，部分催化核酸能够具有部分或完全酶活性。或者，部分催化核酸可能不具有催化活性，直到与衍生其的亲本催化核酸的其他部分(例如，部分酶寡核苷酸)组合。
底物酶寡核苷酸可任选地包含另外的分子，作为非限制性实例，其可有助于检测。实例包括但不限于用于荧光检测的荧光团和猝灭剂；用于SPR和/或比色检测的金或银颗粒；用于电化学和/或pH检测的酶和用于发光检测的酶和官能团。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用并具有相同含义，指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物，或类似物、衍生物、变体、片段或其组合，包括但不限于DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体和初级microRNA、其他非编码RNA、核糖体RNA、锁核酸、桥接核酸、肽核酸，其衍生物、其扩增子或其任何组合。作为非限制性实例，如本文所述的给定核酸的来源可以是合成的、哺乳动物的、人的、动物的、植物的、真菌的、细菌的、病毒的或古菌的来源中的任何一种或多种。
如本文所用，术语“寡核苷酸”(oligonucleotide)和“寡核苷酸”(oligo)可互换使用并且具有相同的含义，指的是脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸碱基的单链聚合物，或其类似物、衍生物、变体、片段或组合。根据本发明的寡核苷酸的非限制性实例包括用于通过本文所述的方法和组合物检测的核酸靶标；催化核酸酶(例如脱氧核酶、核酶、MNA酶)；MNA酶组分如部分酶寡核苷酸；适体；底物酶寡核苷酸；和核酸酶底物(例如，可以通过MNA酶、脱氧核酶和/或核酶修饰的那些)。寡核苷酸可包含至少一种添加或取代，包括但不限于下表1中列出的那些中的任何一种或多种。本文提及的寡核苷酸可以通过任何方法合成，包括例如通过化学合成(例如，从组分核苷酸，或将核苷酸添加到寡核苷酸的预先存在的片段)。还可以通过连接或以其他方式连接寡核苷酸的多个片段来构建寡核苷酸。本文提及的“连接产物”是包含由两个或多个寡核苷酸组成的寡核苷酸的核酸，所述寡核苷酸例如通过连接酶连接(接连)在一起。
本文使用的术语“核苷酸”和“核苷酸残基”和“碱基”具有相同的含义并涵盖包含碱基A、C、G、T或U的核苷酸，以及其衍生物或类似物(非限制性实例列于表1)。
本文所用的与核酸或核苷酸有关的术语“衍生物”包括任何功能等同的核酸或核苷酸，包括整体产生的任何融合分子(例如通过重组方法)或合成后添加的(例如通过化学方法)。这种融合可以包括本发明的寡核苷酸，其中RNA或DNA添加到其中或与多肽(例如嘌呤霉素或其他多肽)、小分子(例如补骨脂素)或抗体缀合。
本文所用的与核酸或核苷酸有关的术语“类似物”包括具有与DNA或RNA分子或残基相关的物理结构的化合物，并且能够与DNA或RNA残基或其类似物形成氢键(即它能够与DNA或RNA残基或其类似物退火以形成碱基对)，但所述化合物不需要包含在术语“类似物”内。这些类似物可以与它们在结构上相关的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基具有不同的化学和生物学特性。类似物的实例有甲基化、碘化、溴化或生物素化残基。已经描述了含有核苷酸类似物的活性脱氧核酶，包括脱氧肌苷、C-5-咪唑脱氧尿苷、3-(氨基丙炔基)-7-脱氮-dATP、2'-O-甲基RNA、2'O-甲基帽。其他类似物也可以与催化核酸酶的催化活性相容，例如脱氧核酶、核酶和MNA酶。具有催化活性的核酸的改变，例如通过用一个碱基取代另一个碱基，通过用类似物取代碱基，或改变糖组分或磷酸二酯骨架，对于技术人员来说可以是直接的。例如，可以在合成期间或通过在合成后修饰特定碱基来进行改变。包含诸如碱基变化或碱基类似物的改变的催化核酸的经验测试允许评估改变的序列或特定类似物对催化活性的影响。碱基A、C、G、T和U的类似物是本领域已知的，并且子集列于表1中。可以抑制核酸酶消化的类似物的非限制性实例也是本领域熟知的。可以策略性地将这些类似物置于寡核苷酸内以防止外切核酸酶和/或内切核酸酶切割。
表1：核苷酸类似物的实例
术语“多组分核酸酶”和“MNA酶”在本文中可互换使用，并且将具有相同的含义。它们由两种或更多种部分酶寡核苷酸形成，其仅在MNA酶组装易化子寡核苷酸或MNA酶组装易化子多核苷酸(例如靶标核酸)存在下组装形成催化活性核酸酶，其能够催化性地修饰一种或多种底物。例如，部分酶寡核苷酸A和B可各自通过与核酸靶标互补碱基配对而与靶标核酸结合。当部分酶A和B的传感器臂在靶标核酸上彼此相邻杂交时，MNA酶才形成。MNA酶的底物臂与底物接触，其修饰(例如切割或连接)由MNA酶的催化核心催化，通过部分酶寡核苷酸A和B上的部分催化结构域的相互作用形成。本文所用的术语“多组分核酸酶”和“MNA酶”包括所有已知的MNA酶和修饰的MNA酶，包括PCT专利公开号WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084、WO2012/065231、WO/2013/033792、WO/2013/123552和WO2013/188912、相关的美国专利号8394946、8945836、9127311、8962238和9506108，以及相关的美国专利公开号20140017669、20160348161和20160083785(这些文献中的每一个的内容通过引用整体并入本文)中的任何一个或多个中公开的那些。包括MNA酶和修饰的MNA酶的非限制性实例包括具有切割催化活性的那些(如本文举例说明的)、包含一种或多种组装抑制剂的分解或部分组装的MNA酶、包含一种或多种适体的MNA酶(“apta-MNA酶”)、包含的MNA酶一个或多个截短的传感器臂和任选的一种或多种稳定化寡核苷酸、包含一种或多种活性抑制剂的MNA酶、多组分核酸无活性酶原(MNAi)和具有连接酶催化活性的MNA酶(“MNA酶连接酶”)。
如本文所用的术语“适体酶”是指催化核酸(例如脱氧核酶、核酶或适体-MNA酶)，其已被修饰以掺入适体结构域以变构调节其活性，使得其依赖目标分析物的存在。将适体掺入催化核酸酶或催化核酸酶组分的方法包括但不限于将适体直接缀合至催化核酸或催化核酸组分的一个或多个结构域、掺入适体进入催化核酸的非功能区域、或与催化核酸的功能区域相邻的适体的缀合。适体酶的适体可以与抑制分子完全或部分杂交，以在不存在分析物的情况下抑制适体酶的催化活性。与靶标分子相比，抑制分子对适体的结合亲和力降低。
术语“组装易化子分子”(assembly facilitator molecule)、“组装易化子”(assembly facilitator)、“MNA酶组装易化子寡核苷酸”、“反馈组装易化子”(feedbackassembly facilitator)和“MNA酶组装易化子”在本文中可互换使用，是指可与一个或多个部分酶寡核苷酸的传感器臂杂交的核酸，从而促进催化活性MNA酶的组装。组装易化子可以促进具有切割、连接酶或其他酶活性的MNA酶的组装。组装易化子可以是单个分子或包含多个分开的分子，其与一个或多个部分酶寡核苷酸的传感器臂杂交。组装易化子可以是待检测或定量的靶标(例如，选自DNA、甲基化DNA、烷基化DNA、RNA、甲基化RNA、微小RNA、siRNA、shRNA、tRNA、mRNA、snoRNA、stRNA、smRNA、前体和初级微小RNA、其他非编码RNA、核糖体RNA，其衍生物、扩增子或其任何组合)。
如本文所用，术语“部分酶”，“部分酶组分”和“部分酶寡核苷酸”可互换使用并具有相同的含义，各自指含有DNA和/或含RNA的寡核苷酸，其中两个或更多个仅在MNA酶组装易化子存在下可以自组装成“MNA酶”。部分酶寡核苷酸包含三个结构域：“催化”结构域，其形成催化底物修饰的MNA酶催化核心的一部分；“传感器臂”结构域，其与易化子(例如靶标核酸)组装结合和/或结合；和“底物臂”结构域，其与底物结合和/或结合。
术语“底物”和“底物分子”在本文中可互换使用，是指能够通过催化分子(例如催化核酸酶或蛋白质酶)识别和催化修饰的任何分子。底物可包含，例如，能够通过催化核酸酶进行特异性识别和催化修饰的单链或双链核酸。可以通过间接和/或直接手段检测催化修饰的底物。例如，可以通过级联中的一个或多个后续步骤间接检测底物的催化修饰，所述级联依赖于催化修饰的底物。附加地或替代地，可以检测底物的催化修饰，例如，通过直接检测一种或多种修饰的底物产物和/或通过修饰底物直接产生的任何其他信号(例如通过切割底物产生的荧光信号，从而在空间上分离存在于未修饰底物上的先前配对的荧光团和猝灭剂分子)。可以通过催化分子催化修饰直接检测的底物在本文中也称为“报告底物”、“报告探针底物”、“报告探针”或“探针”。
如本文所用，术语“适体”包括核酸或肽序列，其由于其较高水平的结构(例如3-D结合结构域或口袋)而具有高亲和力和特异性地识别和结合一种或多种配体的能力。适体可以结合各种配体，其非限制性实例包括核酸、蛋白质、朊病毒、小有机化合物或整个生物体。本文优选的适体是短的单链DNA或RNA寡聚体，其可以例如通过吸附、回收和再扩增的迭代过程从合成核酸的复合文库中分离。可以产生适体以识别几乎任何靶标分子，范围从小分子如氨基酸、或抗生素到蛋白质、核酸结构或全细胞。
本文所用的术语“配体”是指能够以高亲和力和特异性结合适体的任何分子，包括但不限于蛋白质、朊病毒、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、小有机化合物、全细胞和整个生物体。配体也可称为“靶标分析物”或“分析物”。
本文提及两个或更多个核酸之间的“杂交”，或两个或更多个“杂交”的核酸，将被理解为需要全部或部分核酸之间的互补碱基配对。
术语“选择性渗透屏障”是指允许特定物质通过它(在一个方向或两个方向上)同时防止其他不同物质这样做的材料(例如膜)。因此，选择性渗透屏障可以设计用于保持两个不相同分子之间的物理分离。选择性渗透屏障可以基于其性质实现物理分离，包括但不限于促进基于电荷的分离、基于重量的分离、基于尺寸的分离、基于形状的分离、基于脂溶性的分离，以及/或基于对膜中存在的载体分子的亲和力的分离。作为非限制性实例，选择性渗透屏障可包括聚醚砜、聚碳酸酯、硝化纤维素、再生纤维素、乙酸纤维素、聚酰胺、丙烯、尼龙、氧化铝或聚四氟乙烯中的任何一种或多种。
缩略语
本文和整个说明书中使用以下缩写：
RE：限制酶/内切核酸酶
NE：切口酶/内切核酸酶
DSN：双链特异性核酸酶
LAMP：环介导的等温扩增RCA：滚环扩增
IMA：转录物介导的扩增
3SR：自持序列复制
NASBA：基于核酸序列的扩增
MNA酶：多组分核酸酶
脱氧核酶(DNAzyme)或Dz：脱氧核糖核酸酶；
PGR：聚合酶链反应；
F：荧光团染料分子；
O：猝灭剂分子；
JOE或6-JOE：6-羧基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基荧光素；
FAM或6-FAM：6-羧基荧光素。
TxR：得克萨斯红
Oligo：寡核苷酸
IB：爱荷华州布莱克
IDT：综合DNA技术
SPR：表面等离子体共振
Sub：底物
Pz：部分酶
Cat：催化核酸
PES：聚醚砜
MB：磁珠
以下详细描述足够详细地传达了本发明的示例性实施例，以使本领域普通技术人员能够实施本发明。所描述的各种实施例的特征或限制不一定限制本发明的其他实施例或整个本发明。因此，以下详细描述不限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
如上所述，目前可用于靶标分子检测的测定和设计用于扩增由这些测定产生的信号的方法存在许多限制。通过本发明的组合物、试剂盒和方法解决了这些限制中的一个或多个。
提供组合物、方法和试剂盒用于检测、鉴定和/或定量靶标。
组合物和试剂盒
本文提供了用于实施本发明方法的组合物和试剂盒。仅作为非限制性实例，组合物和试剂盒可包含任何一种或多种催化核酸酶(例如，MNA酶和/或其部分酶寡核苷酸组分、脱氧核酶和/或核酶)、底物酶寡核苷酸、催化核酸酶的底物，和/或包含蛋白酶识别位点的一条链的寡核苷酸。
组合物和试剂盒的各种组分可以以功能失活的形式提供。另外或可替代地，组合物和试剂盒的各种组分可以以功能活性形式提供。
以下提供适合包含在组合物和试剂盒中的组分的非限制性实例。
-催化核酸酶
本发明的组合物和试剂盒可包含一种或多种不同类型的催化核酸酶和/或其一种或多种组分(例如一种或多种部分酶寡核苷酸和/或组装易化子寡核苷酸)和/或催化核酸酶或其组分的互补物。
用于催化核酸的底物可以在催化修饰时提供可检测的信号。例如，底物可包含一种或多种可检测标记(例如荧光团和猝灭剂)。
组合物和试剂盒可包含任何合适的催化核酸酶(其非限制性实例包括脱氧核酶、MNA酶、核酶和/或适体酶)和/或其组分(例如，部分酶和/或组装易化子)，和/或作为较大实体的组分的那些，例如底物酶寡核苷酸。
例如，本发明的组合物和试剂盒可包含脱氧核酶。可以使用任何合适的脱氧核酶。脱氧核酶可以是已知/存在的脱氧核酶或通过体外选择新产生的。脱氧核酶可能能够切割或连接RNA或DNA分子。二价金属离子，例如Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和/或Pb2 +可以作为脱氧核酶的辅因子。脱氧核酶可包含两个非保守底物结合结构域(“杂交臂”)侧翼的催化结构域(催化核心)，其是特异性结合底物的序列区域。合适的脱氧核酶的非限制性实例包括10-23脱氧核酶，其包含侧翼为两个底物识别臂的15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，以及8-17脱氧核酶。
另外或可替代地，组合物和试剂盒可包含核酶。可以使用任何合适的核酶。核酶可以是天然核酶或人工产生的核酶。核酶可能能够切割或连接RNA或DNA分子。二价金属离子，例如Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和/或Pb2+和/或一价阳离子作为核酶的辅因子。核酶可包含两个非保守的底物结合结构域(“杂交臂”)侧面的催化结构域(催化核心)，其是特异性结合底物的序列区域。或者，考虑其他核酶结构，其中所述结构可包含单独的靶标和底物结合臂和催化核心。合适的核酶的非限制性实例包括锤头状核酶、发夹核酶、分支核酶、大核酶、I组核酶、II组内含子核酶、HDV核酶、RNase P、CPEB3核酶、glmS核酶、肽基转移酶23S rRNA、VS核酶、CoTC核酶和GIR1酶。
另外或可替代地，本发明的组合物和试剂盒可包含MNA酶、能够形成催化活性MNA酶的部分酶寡核苷酸组分、MNA酶组装易化子寡核苷酸/多核苷酸和/或MNA酶底物中的任何一种或多种。如本领域技术人员所熟知的，MNA酶是催化活性核酸酶，其在与合适的组装易化子(例如靶标)杂交后从两种或更多种部分酶自组装。每种部分酶寡核苷酸组分包含部分催化核心，其在组装MNA酶时结合形成能够修饰底物的单一催化核心。
合适的MNA酶的非限制性实例及其产生方法公开于例如PCT专利公开号WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084、WO2012/065231、WO/2013/033792、WO/2013/123552和WO2013/188912以及相关美国专利号8394946、8945836、9127311、8962238和9506108以及相关美国专利公开号20140017669、20160348161和20160083785中的任何一个或多个中(其中每个的全部内容通过引用并入本文)。合适的MNA酶包括具有切割催化活性的酶、具有连接活性的酶、包含一种或多种组装抑制剂的分解或部分组装的MNA酶、包含一种或多种适体的MNA酶(apta-MNA酶)、包含一个或多个截短的传感器臂的MNA酶以及任选的一种或多种稳定化寡核苷酸、包含一种或多种活性抑制剂的MNA酶、多组分核酸无活性酶原(MNAi)和具有连接酶催化活性的MNA酶(MNA酶连接酶)，其中的每一种都在WO/2007/041774、WO/2008/040095、WO2008/122084、US 2007-0231810、US 2010-0136536和/或US2011-0143338的一个或多个中详细描述。部分酶寡核苷酸在MNA酶组装易化子存在下自组装以形成MNA酶。在一些实施方案中，可以检测MNA酶的存在，并且指示靶标的存在，因为MNA酶仅在靶标存在下形成，其中靶标包含组装易化子。
如本领域技术人员已知的，MNA酶结构基于一种或多种脱氧核酶(例如10-23和8-17脱氧核酶)和/或核酶。MNA酶可包含核糖核苷酸碱基和/或脱氧核糖核苷酸碱基和/或其类似物。例如，MNA酶的传感器臂、底物臂或催化核心中的一个或多个可包含一个或多个核糖核苷酸碱基和/或一个或多个脱氧核糖核苷酸碱基和/或其一种或多种类似物。在一些实施方案中，MNA酶在MNA酶的催化核心内包含至少一个脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物。脱氧核糖核苷酸碱基或其类似物可能是催化活性所必需的。
组合物和试剂盒的MNA酶包含一个或多个取代，例如类似物、衍生物、修饰或改变的碱基、核糖核苷酸、糖或磷酸骨架的改变、各种缺失、插入、取代、重复或其他修饰，或这些的任何组合。这是本领域技术人员所熟知的。这些修饰、取代、缺失、插入等可以在传感器和/或底物臂和/或催化核心部分中进行，使得分子保持催化活性。可以很好地耐受结合底物或组装易化子的臂的取代和修饰，并允许将分子定制到不同的底物/组装易化子。例如，传感器臂的修改允许定制到不同的组装易化子，而底物臂的修改允许定制到不同的底物。
另外或可替代地，本发明的组合物和试剂盒可包含催化核酸酶的一种或多种组分。例如，组合物和试剂盒可包含MNA酶的单个组分(例如一种或多种部分酶寡核苷酸，和/或一种或多种组装易化子寡核苷酸)。
作为非限制性实例，组合物和试剂盒可包含单个部分酶，其在识别靶标分子后能够自组装以形成能够修饰一种或多种底物的催化活性MNA酶。如此形成的MNA酶可以设计成仅在部件酶传感器臂与某些组装易化子(可以是特定的靶标分子)杂交时组装和/或仅催化修饰某些能够与MNA酶的底物臂杂交的特定底物。因此，包含在组合物和试剂盒中的MNA酶可以设计成根据本发明启动检测和/或信号放大级联，因为需要存在靶标分子以自组装和催化修饰一种或多种底物成为级联发生所需的产品。
例如，通过仅改变部分酶的传感器臂，但通过保持底物臂不变，可以设计对各种靶标特异的多种MNA酶，所有这些MNA酶可以利用通用MNA酶底物进行检测。本领域技术人员将理解，这消除了对于每个目标消除对定制或独特底物的需求的优点。每个新目标仅需要一个或多个传感器臂部分中的一个或多个变化；底物臂部分和催化芯部分可保持恒定。因此，单个MNA酶底物可以使用MNA酶用于单个靶标，并且在使用改变的MNA酶的一系列测定中使用多个靶标。多个MNA酶底物允许多重使用多个MNA酶在单个测定中检测多个靶标，每个靶标一个。这种使用MNA酶的多重方法易于在溶液中或与支持系统连接。本文预期多重测定因此可以在涉及将一种或多种底物或MNA酶部分酶或组装易化子或其他酶活性连接至如本文所述的支持物的系统中完成。
类似地，可以将MNA酶工程化以特异性杂交并催化修饰某些底物。例如，通过仅改变部分酶的底物臂，但通过保持传感器臂保持不变，可以设计对给定靶标特异的多种MNA酶，其识别和催化修饰一系列不同的MNA酶底物。底物可以是报告底物，其能够在通过MNA酶催化修饰时提供可检测信号。
在某些实施方案中，组合物和试剂盒的MNA酶可以被工程化以特异性杂交并催化修饰通用或通用底物。通用MNA酶底物可用于通过允许容易的设计改变来产生识别不同靶标的新MNA酶，从而允许快速测定。部分酶的底物臂部分和催化核心部分可以保持不变，仅改变新靶标所需的一种或多种部分酶的传感器臂部分。提供了通用底物序列，因此可以将相同底物掺入许多不同靶标的测定中。此外，相同的底物可以掺入本文各种实施方案的方法中，包括其中底物在溶液中游离或被束缚或附着于支持物的测定。一系列通用底物可用于多重反应，允许同时检测多个靶标。使用通用底物的MNA酶策略提供了优于检测技术的主要优势，例如或Beacons或杂交探针，其需要设计和使用针对每个新靶标的探针。由于MNA酶底物是通用的并且可用于任何靶标，因此该通用MNA酶底物的切割允许在任何靶标存在下产生和扩增信号。
包含在本发明的组合物和试剂盒中的脱氧核酶、底物酶、核酶、部分酶、组装易化子寡核苷酸/多核苷酸和/或MNA酶底物可包含能够结合靶标分析物的适体。优选的适体可包含短的单链DNA或RNA寡聚体或肽，其可通过吸附、回收和再扩增的迭代过程从合成核酸或肽的复杂文库中分离。因此，可以针对几乎任何靶标分析物产生适体，范围从小分子如氨基酸或抗生素到蛋白质和核酸结构。在优选的实施方案中，适体包括，例如，核酸结合分子，其优选通过进化和选择技术产生。适体可包含DNA分子、RNA分子或两者的组合，包括但不限于核苷酸类似物，例如，如上表1所示。
将适体与核酶或脱氧核酶组合使用的策略是本领域已知的。此类分子通常是嵌合的并且包含适体结构域和脱氧核酶或核酶结构域，并且通过靶标配体的存在而被激活。响应于适体结构域与其分析物的结合，可以接通适体酶功能活性。产生适体酶的策略包括但不限于通过通信结构域将核酶或脱氧核酶与适体结构域融合在一起。通信结构域可以通过体外选择方法进化，以提高其仅在靶标分析物存在下允许核酶或脱氧核酶活性的能力。另一种示例性策略涉及将适体掺入非功能性茎环或发夹中，其仅在核酶或脱氧核酶中起结构作用。适体也可以与脱氧核酶或核酶连接，并且适体结构域和酶结构域可以与调节寡核苷酸部分杂交，其用于在不存在分析物的情况下抑制酶结构域的催化活性。在分析物存在下，适体可以与分析物结合，从酶结构域释放调节寡核苷酸并恢复其催化活性。在这种情况下，分析物的存在可以从脱氧核酶或核酶中除去调节寡核苷酸并恢复其催化活性。适体也可用于将脱氧核酶或核酶的两种或更多种组分桥接在一起，使得酶能够修饰其底物。还存在一类独特的脱氧核酶，其含有氯化血红素的适体，并且在其存在下可以模拟过氧化物酶的活性，催化各种化学底物以产生荧光、化学发光和比色信号。
将适体与MNA酶的组合使用的策略也是本领域已知的。含有与适体连接的MNA酶组分的适体酶也可称为Apta-MNA酶。例如，MNA酶的至少一种部分酶可以掺入适体(适体-部分酶)以及能够形成发夹并因此抑制MNA酶组装的互补序列。待检测的分析物或靶标可以与适体-部分酶结合，从而能够组装活性MNA酶。在不存在靶标分析物的情况下，适体-部分酶采用发夹结构，其抑制活性MNA酶的组装。在靶标分析物存在下，靶标分析物结合适体酶的适体结构域，从而破坏发夹结构并允许适体-部分酶参与活性MNA酶的装配。
在其他实施方案中，适体可以作为组装易化子寡核苷酸的一部分存在，所述组装易化子寡核苷酸掺入适体以及能够形成发夹结构的互补抑制剂序列。在不存在靶标分析物的情况下，组装易化子寡核苷酸采用发夹结构，其抑制该组分引导活性MNA酶组装的能力。在靶标分析物存在下，靶标分析物结合组装易化子的适体结构域，从而破坏发夹结构并允许该组分指导催化活性MNA酶的组装。本领域技术人员将理解，适体可以掺入组装易化子分子的任一末端或分子中。此外，应当理解，可以将多个适体掺入一种或多种部分酶寡核苷酸组分中。
在进一步的实施方案中，适体序列可以以部分酶的形式掺入部分酶的末端(形成适体-部分酶)，其中活性起始的Apta-MNA酶仅在靶标分析物的存在下形成。在这种情况下，检测策略所需的部分酶包括；标准的部分酶；适体-部分酶，其为一种末端掺入适体的部分酶；组装易化子，其与适体-部分酶和部分酶结合，使得能够装配活性起始的Apta-MNA酶(在靶标分析物存在下)；底物；和组装抑制剂，其与跨越至少部分适体序列和部分酶序列的底物结合臂的部分的区域中的适体-部分酶杂交。在不存在靶标的情况下，组装抑制剂寡核苷酸与适体-部分酶结合，防止报道探针底物的切割。在靶标存在下，靶标与适体-部件酶的适体序列结合，阻止装配抑制剂的结合并允许通过起始的Apta-MNA酶结合和切割MNA酶底物。因此，活性起始的Apta-MNA酶仅能在靶标分析物存在下形成和修饰MNA酶底物。
本领域技术人员还将理解，可以将一种或多种适体掺入任何寡核苷酸组分中，包括部分酶寡核苷酸，组装易化子寡核苷酸或MNA酶底物。
本发明的组合物和试剂盒中的催化核酸酶和/或其组分(例如，脱氧核酶、核酶、MNA酶、部分酶寡核苷酸、组装易化子寡核苷酸、底物和/或适体酶)可以作为通过互补碱基配对与其他分子杂交的分子复合物的组分提供。
在一些实施方案中，除了引发剂催化核酸酶和/或开关的催化核酸酶的催化功能所必需的辅因子之外(例如，二价金属离子如Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和/或Pb2+，和/或单价阳离子)，组合物和试剂盒可包含激活如本文所述的分子开关所必需的所有组分。
-底物酶寡核苷酸
本发明的组合物和试剂盒可包含一种或多种底物酶(SubZyme)寡核苷酸。通常，根据本发明的底物酶寡核苷酸包含至少一种催化核酸或其部分(例如部分酶寡核苷酸)和至少一种催化核酸底物。在许多实施方案中，底物酶寡核苷酸中的催化核酸或其部分不能催化修饰相同底物酶寡核苷酸的催化核酸底物组分。
催化核酸或其部分和催化核酸底物可以连续排列在底物酶寡核苷酸上，而没有插入序列或接头。因此，它们可以构成沿着底物酶寡核苷酸的不间断序列。
或者，可以例如通过插入核苷酸和/或通过本领域可获得的任何合适的接头或间隔分子来分离催化核酸或其部分以及底物酶寡核苷酸的催化核酸底物。
对于间隔核苷酸的数量没有特别限制，其可以是多于一个核苷酸、多于两个核苷酸、多于三个核苷酸、多于四个核苷酸、多于五个核苷酸、多于十个核苷酸、多于十五个核苷酸、多于二十个核苷酸、少于两个核苷酸、少于三个核苷酸、少于四个核苷酸、少于五个核苷酸、少于十个核苷酸、少于十五个核苷酸、少于二十个核苷酸、一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸、四个核苷酸、五个核苷酸、十个核苷酸、十五个核苷酸或二十个核苷酸。
对于可以存在于分离催化核酸或其部分的底物酶寡核苷酸和底物酶寡核苷酸的催化核酸底物中的接头或间隔物的特定形式或特征没有特别限制。间隔基和接头可用于在核酸底物和催化核酸组分之间提供不同量的分离。实例包括但不限于碳链、聚乙二醇(PEG)、聚-A、聚-T、无碱基呋喃、无碱基寡核苷酸或可光裂解的PC修饰。
接头和间隔物也可以掺入寡核苷酸和与其连接的表面之间。对于将给定的底物酶寡核苷酸与给定表面分开的接头或间隔物的特定形式或特征，没有特别的限制。通过产生更大的距离，接头和间隔物可以减轻空间或电荷的影响。可在底物酶寡核苷酸和固体表面之间使用的接头和间隔物的实例包括但不限于碳、葡聚糖、TEG、PEG、poly-A尾、poly-T尾、PNA、DNA或LNA。
底物酶寡核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸碱基，和/或其类似物、衍生物、变体、片段、接头、间隔区或其组合。
底物酶可以使用各种不同的附着化学物质附着在表面上。存在一系列寡核苷酸修饰，其能够将亚合酶固定在表面上，包括但不限于以下寡核苷酸官能团胺、羧基、二硫化物、酰肼、硫醇、丙烯酸酯、生物素、NHS酯(叠氮化物)、胆固醇TEG、洋地黄毒苷、氨氧基、腺苷酸化、脱硫生物素、己炔基、马来酰亚胺、炔烃、二硫醇、辛二炔基、醛和环氧。或者，底物酶可以与已经固定在表面上的其他寡核苷酸连接或杂交。
底物酶寡核苷酸可任选地包含或附着于另外的分子，作为非限制性实例，其可有助于其分离或纯化(例如来自反应混合物)。这些可以包括非限制性实例，磁性珠、乳胶珠、玻璃珠、琼脂糖珠或二氧化硅珠。在本发明的一些实施方案中并且作为非限制性实例，底物酶寡核苷酸可包含10-23脱氧核酶和8-17脱氧核酶的底物，或8-17脱氧核酶和10-23脱氧核酶的底物。在本发明的其他实施方案中，底物酶寡核苷酸可包含部分酶寡核苷酸和8-17脱氧核酶的底物，或部分酶寡核苷酸和10-23脱氧核酶的底物。
底物酶寡核苷酸可任选地包含或附着于另外的分子，作为非限制性实例，其可以使用检测系统帮助检测，所述检测系统包括但不限于电化学、荧光、比色、pH、SPR、磁共振和发光。另外的分子的非限制性实例包括磁珠、金颗粒、银颗粒、酶、荧光团、化学基团、猝灭剂和量子点。
底物酶寡核苷酸可任选地包含与待检测的靶标互补的额外序列。在优选的实施方案中，另外的靶标特异性序列可包括形成蛋白质核酸内切酶或核酸外切酶的识别位点所需的核苷酸。作为非限制性实例，另外的靶标特异性序列可包括限制酶的双链识别位点的一条链。
根据本发明的底物酶寡核苷酸/亚型可包含一部分催化核酸(例如部分酶寡核苷酸)。与衍生它的完整核酸相比，该部分催化核酸可以具有部分或完全的酶活性。或者，催化核酸的一部分可能不具有催化活性，直到与其衍生的亲本催化核酸的其他部分(例如另一种部分酶寡核苷酸和/或组装易化子)组合。在本发明的一些实施方案中并且作为非限制性实例，底物酶寡核苷酸可包含10-23部分酶寡核苷酸和另一种不同10-23脱氧核酶底物、10-23部分酶和8-17脱氧核酶的底物、8-17部分酶和10-23脱氧核酶的底物，或8-17部分酶和另一种不同8-17脱氧核酶的底物。
-外切核酸酶和内切核酸酶
本发明的组合物和试剂盒可包含一种或多种核酸外切酶和/或内切核酸酶。合适的核酸内切酶的非限制性实例包括限制性内切核酸酶、绿豆核酸酶、核酸内切酶IV(大肠杆菌)、RNase A、RNase I(大肠杆菌)、RNase III(大肠杆菌)或RNase H(大肠杆菌)。合适的外切核酸酶的非限制性实例包括外切核酸酶I(大肠杆菌)、外切核酸酶III(大肠杆菌)、外切核酸酶VII和T7外切核酸酶。内切核酸酶可以是识别和切割双链核酸双链体的两条链的限制酶，或者可以是识别双链核酸双链体但仅仅裂解链的酶切酶。
-寡核苷酸
包含在本发明的组合物和试剂盒中的寡核苷酸，例如脱氧核酶、底物酶寡核苷酸、核酶、适体酶，MNA酶、它们各自的底物和MNA酶组分(例如，部分酶寡核苷酸、组装易化子寡核苷酸)可以含有一个或多个取代物，例如类似物(例如，表1中列出的那些)、衍生物、修饰或改变的碱基、核糖核苷酸、糖或磷酸骨架的改变、各种缺失、插入、取代、重复或其他修饰，或这些的任何组合，这些是本领域技术人员公知的。只要寡核苷酸保留其功能，可以在任何位置进行这些修饰、取代、缺失、插入等。对寡核苷酸的取代和修饰可以很好地耐受，并允许使分子定制在某些条件下起作用或用于提高反应效率。本领域技术人员将理解，脱氧核酶、核酶、底物酶寡核苷酸及其底物、MNA酶及其底物和MNA酶组分(例如，部分酶、组装易化子寡核苷酸/多核苷酸)可包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或两者。寡核苷酸可包含至少一个脱氧核糖核苷酸，并且在一些情况下可由脱氧核糖核苷酸和/或其类似物组成。
-催化核酸底物
本发明的组合物和试剂盒可包含能够被催化核酸酶修饰的底物(例如，脱氧核酶、核酶、适体酶和/或MNA酶或适体-MNA酶)。
底物可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的任何单链或双链聚合物，或其类似物、衍生物、变体、片段或组合，其能够被包括催化核酸酶的酶识别，作用或修饰。
可通过各种酶活性修饰底物，包括但不限于裂解或连接，其中酶对底物的修饰可提供指示酶催化活性的可检测效应。
用于核酸酶的底物也可包含或附着于非核酸成分，例如氨基酸、肽或蛋白质或(“New strategies in Chemical synthesis and Catalysis”,B.Pignataro，Wiley-VCH,2012)的表6.1中概述的任何化学成分。
底物可以是包含一种或多种特征的报告底物，以便于定量和/或检测由于酶的催化活性而产生的底物的修饰形式。
报告底物可以在溶液中游离或结合(或“束缚”)，例如，表面或另一分子。报告底物可以通过多种手段中的任何一种进行标记，包括例如荧光团(具有或不具有一种或多种另外的组分，例如猝灭剂)、放射性标记、金和/或银颗粒、生物素(例如生物素化)或化学发光标记。这些各种标记可以提供在催化核酸酶修饰(例如切割)后产生可检测信号的手段。
底物可以是通用底物，其被多种催化核酸酶识别并作用催化作用。通用底物可以束缚在固体支持物上。包含在本发明的组合物和试剂盒中的底物可以作为能够通过催化核酸识别和修饰的离散组分提供。本发明的其他方面涉及可被一种以上催化核酸识别和切割的底物。举例来说，单核酸底物可以被脱氧核酶和MNA酶切割，条件是脱氧核酶的底物结合臂，以及MNA酶的部分酶组分的底物结合臂，都与相同的所述单个核苷酸互补。核酸底物。在这种情况下，脱氧核酶的特定催化核心序列和MNA酶的部分酶对的催化核心部分可以与底物内“切割”位点的切割相容。
-选择性渗透性屏障
本发明的组合物和试剂盒可包含选择性渗透的屏障，用于分离用于本文所述方法的各种组分。由于其性质，选择性渗透屏障通常允许某些测定组分通过，同时防止其它组分这样做。选择性渗透屏障可允许组分双向通过以用于本文所述的方法。
仅作为非限制性实例，选择性渗透屏障可用于将下列测定组分中的任何一种或多种与一种或多种其他测定组分分开：MNA酶、MNA酶组分(例如组装易化子寡核苷酸、部分酶寡核苷酸)、MNA酶底物、脱氧核酶、脱氧核酶底物、核酶、核酶底物、底物酶寡核苷酸。
在某些实施方案中，选择性渗透屏障可用于将不同类型的底物酶寡核苷酸彼此物理分离。在一些实施方案中，选择性渗透屏障用于物理分离第一底物酶寡核苷酸与不同的第二底物酶寡核苷酸。
第一底物酶寡核苷酸可包含催化核酸酶序列('cat A')和作为催化核酸酶的底物的组分('sub A')。第二底物酶寡核苷酸可包含催化核酸酶序列('cat B')和作为催化核酸酶的底物的组分('sub B')。cat A可能不能催化修饰(例如切割)sub A，并且可能能够催化修饰(例如切割)sub B。cat B可能不能催化修饰(例如切割)sub B，但可能能够催化修改(例如切割)sub A。
在其他实施方案中，底物酶寡核苷酸可包含一部分催化核酸酶(例如，部分酶寡核苷酸)，和作为催化核酸酶的底物的组分。催化核酸酶的部分可能不能与底物酶寡核苷酸的底物杂交。
选择性渗透屏障可以基于屏障的性质实现测定组分的物理分离，包括但不限于促进基于电荷的分离、基于尺寸的分离、基于形状的分离、基于重量的分离、基于脂溶性的分离、基于分子迁移率的分离和/或基于对膜中存在的载体分子的亲和力的分离的那些。
在一些实施方案中，选择性渗透屏障可以通过尺寸限制实现测定组分的物理分离。例如，屏障可包括特定最大尺寸的孔，以防止特定测定组分移动通过屏障。例如，诸如底物酶寡核苷酸的测定组分可以包含物理特征(例如，源自自身互补区域的二级结构)和/或可以附着于太大而无法穿过屏障的孔的实体(例如珠子或微粒)。
在其他实施方案中，选择性渗透屏障可以通过电荷特性实现测定组分的物理分离。例如，屏障可以包括具有一定电荷的孔(例如离子通道)，其阻止特定的测定组分移动通过屏障。例如，诸如底物酶寡核苷酸的测定组分可以包含一定电荷和/或可以附着到具有一定电荷的实体(例如珠子)上，该实体阻止其以相同或相似的电荷移动通过屏障的孔。
在其他实施方案中，选择性渗透屏障可以通过脂溶性特征实现测定组分的物理分离。例如，屏障可以包括脂质，如果它们是疏脂的，则防止某些测定组分移动通过屏障。例如，诸如底物酶寡核苷酸的测定组分可以包含疏脂元件和/或可以附着于具有疏脂特性的实体(例如珠子)，其防止其移动通过亲脂屏障。
在其他实施方案中，选择性渗透屏障可以通过形状限制实现测定组分的物理分离。例如，屏障可以包括某种形状的孔，其阻止特定的测定组分移动通过屏障。例如，诸如底物酶寡核苷酸的测定组分可以包含物理特征(例如，源自自身互补区域的二级结构)和/或可以附着于形状与穿过屏障的孔的运动不相容的实体(例如珠子或微粒)。
在进一步的实施方案中，选择性渗透屏障可以通过对屏障内存在的载体分子的亲和力实现测定组分的物理分离。例如，屏障可以包含载体分子，其有助于特定测定组分通过屏障的运输，但不对其他无帮助。例如，诸如底物酶寡核苷酸的测定组分可以包含物理特征和/或可以附着于实体(例如珠子)，所述实体具有促进附着于屏障中存在的载体分子的特征，从而促进底物酶寡核苷酸通过屏障。
技术人员将认识到，通过选择性渗透屏障对测定组分的物理分离可以通过本领域已知的任何标准方法实现，对本文具体描述的那些没有特别限制。
选择性渗透屏障可以由本领域已知的任何合适材料制成。通常，材料将与测定的工作组分相容。合适材料的非限制性实例包括聚醚砜、聚碳酸酯、硝化纤维素、再生纤维素、乙酸纤维素、聚酰胺、丙烯、尼龙、氧化铝或聚四氟乙烯。
-可检测标签
本发明组合物和试剂盒中的组分可包含能够产生输出信号的可检测标记物，所述标记物通过荧光光谱法、表面等离子体共振、质谱法、电化学、NMR、电子自旋共振、偏振荧光光谱法、圆二色性、免疫测定、色谱法、辐射测量、光度测定、闪烁扫描、电子方法、UV、可见光或红外光谱、酶促方法或其任何组合。
附着于寡核苷酸的纳米级和微观金颗粒可用于产生比色信号，由此近距离的金颗粒呈现蓝色并且当分离时呈现红色。例如，可以通过MNA酶或脱氧核酶切割底物或底物酶来实现分离。寡核苷酸可以用荧光团和猝灭剂染料标记，当分离时可以导致荧光增加。例如，可以通过MNA酶或脱氧核酶切割底物或底物酶来实现分离。
寡核苷酸可以在一端用金或银颗粒标记，并在另一端连接到传感器表面，以便于通过表面等离子体共振进行测量。例如，附着的颗粒可以通过MNA酶或脱氧核酶切割底物或底物酶而从传感器的表面释放，导致表面等离子体共振的可检测的变化。寡核苷酸可以在一端附着到表面并且在另一端附着到涉及电化学反应的酶。从表面释放酶使其可以参与电化学反应可以通过用MNA酶或脱氧核酶切割底物或底物酶来实现。
检测和信号放大方法
本发明提供了用于检测、鉴定和/或定量至少一种靶标的各种方法。此外，本发明提供了用于放大由这些方法产生的信号的各种级联。
该方法使用本发明的组合物及其组分。在许多实施方案中，该方法包括信号放大级联。
-根据本发明的示例性测定
图4中示出了根据本发明实施例的示例性方案。在该方案中，选择性渗透屏障被称为“T袋”，其封闭并物理地将某些测定组分与其它组分分开。底物酶用于在检测到目标后放大信号。示例性的酶对在图1和2中示出，并且示例性T袋制造过程在图3中示出。底物酶种类、PA(底物酶A-MB)和PB(底物酶B-MB)都附着在磁珠(MB)上，磁珠太大而不能通过选择性可穿透的屏障/T袋。虽然底物酶附着在MB上，但它们在溶液中是游离的，并且可以在由T袋定义的分析的单独隔室内移动。该反应包括底物酶A-MB，其位于T袋外部的可渗透屏障的一侧，而底物酶B-MB位于T袋内的可永久屏障的另一侧。另外，与待检测的靶标和底物酶A-MB内的底物序列互补的部分酶寡核苷酸存在于T袋外。在靶标存在下，部分酶寡核苷酸排列并形成Cat C(例如MNA酶)，其切割底物酶A-MB内存在的Sub A，导致Cat A从MB释放，其允许Cat A迁移通过和进入T袋。在释放的T-bag中，Cat A可以在底物酶B-MB内切割Sub B。结果，Cat B与MB分离。Cat B可以自由地从T袋内部迁移到T袋外部的溶液中，其中Cat B可以切割底物酶A-MB中的Sub A并引发级联反应。在这种情况下，一个目标分子可以通过与部分酶寡核苷酸杂交形成一个可以切割第一个底物酶的MNA酶来启动反应，能够切割第二个底物酶，这又可以切割更多的第一个底物酶并启动交叉催化级联反应，其中许多第一和第二亚型酶被切割以在单一起始事件后释放许多脱氧核酶。
孵育一段时间后，可以将未切割的底物酶-MB和切割的MB片段与释放的脱氧核酶(Cat A和Cat B)分离。如图4所示，这可以通过例如使用磁体将未切割的底物酶-MB和切割的MB片段与上清液中存在的脱氧核酶(Cat A和Cat B)分离来实现。可以将这些脱氧核酶转移到含有脱氧核酶可以切割的标记的底物A和/或B的另一个管或隔室中。可以实时监测在通过脱氧核酶切割分离荧光团和猝灭剂后产生的荧光。
如图2中所示，优选的实施方案可包括掺入不同类型的脱氧核酶和不同类型的底物序列的底物酶对。例如，可用于以下发明的底物酶对可包含含有8-17脱氧核酶的底物酶A(PA)和10-23底物用于包含10-23脱氧核酶和8-17底物的底物酶B(PB)。或相反亦然。由于10：23和8:17脱氧核酶对切割位点处的特定序列具有不同的要求，具有一种类型的脱氧核酶和另一种类型的底物的底物酶即使在低严格条件下储存或孵育也不具有自切割的可能性。然而，如图2所示，底物酶对可以以交叉催化方式彼此切割。底物酶可以是未标记的，或标记为允许在底物酶切割时产生信号，其可以实时监测或在反应结束时监测。在底物酶内使用标记的底物消除了将释放的脱氧核酶转移到含有底物酶底物的第二管或隔室的需要，其具有产生指示待检测靶标存在的信号的唯一功能。底物酶中存在的底物序列可适合于脱氧核酶和/或MNA酶的切割。作为非限制性实例，底物酶可以被脱氧核酶和MNA酶切割，所述脱氧核酶和MNA酶最初通过分裂脱氧核酶而衍生。
-级联启动
技术人员将认识到，本发明的信号放大级联可用于检测任何靶标，包括核酸和非核酸靶标(例如蛋白质，peprtides，分析物)。在靶标存在下引发级联的机制也可以变化。作为非限制性实例并参考图13，示出了两种能够交叉催化的示例性底物酶对以及反应引发的替代模式。表示为多核苷酸A(PA)和多核苷酸B(PB)的两个底物酶对被描绘为附着于可用于操纵底物酶的任选磁珠(MB)。底物酶A-MB(PA)包括功能域，即(i)催化核酸A(例如8-17脱氧核酶A)，(ii)可通过催化核酸B(例如10-23脱氧核酶B)切割的底物A，和任选地(iii)任一接头序列(图13A)或与靶标核酸互补的序列(图13B)，并且其另外包含用于限制酶或Nicking酶的内切核酸酶识别位点的一条链。底物酶B-MB(PB)包含功能域，即(i)催化核酸B(例如，10:23脱氧核酶B)，(ii)底物B，其可被催化核酸A(例如，8-17脱氧核酶)切割和任选的(iii)接头序列(图13A和13B)。
在图13A所示的方案中，靶标核酸的存在导致形成能够切割Sub A A的催化核酸C(MNA酶C)。在PA内切割Sub A导致Cat A的释放，其可以随后移动通过选择性渗透屏障并在PB内切割Sub B以释放Cat B。技术人员将认识到，虽然图13A中显示了MNA酶(Cat C)对PA的切割以从移动支持物释放Cat A，MNA酶对PA的裂解可以改变PA的其他特征，包括但不限于电荷、大小、形状、重量、脂溶性等，其中任何一种都可以赋予渗透选择性渗透屏障的能力。Cat B可以依次穿过选择性渗透屏障并在另一个PA内切割新的Sub A并释放更多Cat A，从而启动交叉催化信号放大级联。
在图13B的示例性方案中，靶标核酸与PA中的特定序列(iii)(参见最上面的图)杂交，从而产生双链双链体区，其形成催化酶D(例如核酸酶等)的识别和切割位点。作为限制酶(RE)或切口酶(NE))。RE可以用于切割靶标-PA双链体的两条链，而NE可以用于切割靶标-PA双链体的PA链。靶标杂交的PA中的序列(iii)可以位于脱氧核酶A底物序列和MB之间(如图所示)，使得在裂解位点处催化酶D的裂解导致Cat A的释放。技术人员将认识到可以利用其他布置，例如，当靶标杂交的PA中的序列(iii)位于A亚序列(ii)和Cat A之间，或者可选地，其中序列(iii)在靶标杂交的PA中，位于Cat A和MB之间，使得催化酶D在切割位点处的切割导致Cat A的释放。技术人员将认识到形成催化酶D切割位点不排除靶标核酸的组分也与PA的A亚序列的一些或全部，或PA的一部分或全部Cat A序列杂交。催化酶D对PA的裂解可以以允许其渗透通过选择性渗透屏障的方式改变PA(图13B中描绘为从活动支持物释放CatA)。本领域技术人员将认识到，虽然图13B中显示催化酶D(此处为内切核酸酶)对PA的裂解以从移动支持物释放Cat A，但PA的裂解可改变PA的其他特征，包括，但不限于电荷、尺寸、形状、重量、脂质溶解度等，其中任何一种都可赋予渗透选择性渗透屏障的能力。释放的CatA渗透膜并与PB内的Sub B接触并切割。PB中亚B的裂解释放Cat B，其可以进而穿过选择性渗透屏障并在另一PA内切割Sub A以释放更多Cat A，从而启动交叉催化信号放大级联。
本领域技术人员将认识到除限制酶及其亚型切口酶之外还存在许多其他酶，其可在靶标与PA内任选的靶标特异性区域杂交后切割PA。作为非限制性实例，如果PA在靶标特异性区域中含有例如四个或更多个核糖核苷酸，则可以使用核糖核酸酶H(RNAse H)来启动级联。RNAse H是非序列特异性内切酶，其可以催化RNA/DNA双链体中RNA的切割。靶标底物酶杂交体的形成可提供RNA酶H酶可切割的RNA/DNA双链体，同时使底物酶的其他单链区域和靶标保持完整。
作为第二个非限制性实例，双链特异性核酸酶(DSN)可用于在RNA或ssDNA靶标存在下启动级联。DSN是一种核酸酶，显示出在DNA-RNA双链体和双链DNA中切割DNA的强烈偏好，然而，它本身对单链DNA、单链RNA和双链RNA无活性。靶标和底物酶杂交体的形成可以提供可被DSN酶切割的RNA/DNA双链体，同时使底物酶的其他单链区域和靶标保持完整。
技术人员将认识到除内切核酸酶之外还存在许多其他酶，例如限制酶及其亚型切口酶，其可用于在与靶标杂交后切割PA多核苷酸。作为非限制性实例，可以使用外切核酸酶如外切核酸酶III或T7来启动级联。外切核酸酶III酶从钝端或凹陷末端或DNA双链体的3'末端去除核苷酸，但在单链DNA上无活性。T7外切核酸酶从DNA双链体或DNA/RNA双链体的5'末端去除核苷酸。目标亚酶杂交体的形成可以提供可被外切核酸酶III或T7切割的双链体，同时保留底物酶的其他单链区完整。
-其他示例性实施例
在图22所示的示例性方案中，可渗透屏障(称为“T-袋”)和底物酶用于在检测到靶标后放大信号。该策略不同于图4中所示的方案，因为采用了两种不同类型的底物酶。PA(底物酶A)包含与底物(Sub A)连接的Cat A(8-17脱氧核酶A)，其可被Cat B和Cat C(10-23MNA酶)切割。PB(底物酶B1)包含与底物(Sub B)缀合的Cat B1(10:23部分酶B1)，其可被Cat A(8-17脱氧核酶A)切割。PC包含Cat B2(10:23部分酶B2)。该管包含附着于MB(磁珠)的PA(底物酶A-MB)、PC、组装易化子AF-B3、用于所选靶标的部分酶C1和C2，以及附着于T-袋中的MB(底物酶B2-MB)内的PB。在靶标存在下，部分酶C1和C2对齐并形成起始MNA酶(Cat C)。MNA酶切割PA中的Sub A，将Cat A(8-17Dz)与MB分离，使其能够迁移通过T袋壁，在那里它可以切割PB内的Sub B，从而将部分酶Cat B1与MB分离。Cat Bl现在可以自由地从T袋内部迁移到可以与Cat B2(PC)和自组装易化子AF-B3杂交的解决方案中，形成有效的反馈MNA酶(CatB)。Cat B可以在PA中切割Sub A并继续级联。孵育一段时间后，可以使用磁铁保留未切割的底物酶A-MB和切割的MB片段，从而使含有游离脱氧核酶A和部分酶B1和B2、PC、AF-B3、部分酶C1和C2以及靶标的上清液成为转移到含有标记的底物A和/或B的另一个管中。可以实时监测在通过脱氧核酶和/或MNA酶裂解标记的底物分离荧光团和猝灭剂后产生的荧光。
在图23所示的示例性方案中，可渗透屏障(称为“T袋”)和底物酶用于在检测到靶标后放大信号。该策略不同于图4中所示的方案，因为采用了两种不同类型的底物酶。PA(底物酶A)包含与底物(Sub A)连接的Cat A(8-17脱氧核酶A)，其可被Cat B和Cat C(10-23MNA酶)切割。PB(底物酶B1包含缀合至Sub B(8-17底物)的Cat B1(10:23部分酶B1)，其可被CatA(8-17脱氧核酶A)切割。PC包含与相同的Sub B缀合的Cat B2(10:23部分酶B2)，其可被CatA切割。PA、PB和PC任选地与珠子缀合，例如如所描绘的磁珠(MB)。该管含有PA(底物酶A-MB)；PC(底物酶B2-MB)、组装易化子AF-B3、用于所选靶标的部分酶C1和C2，其在溶液中游离，并且PB(底物Bl-MB)在如图3B所示构建的T袋内。在靶标存在下，部分酶C1和C2对齐并形成起始MNA酶C(Cat C)。MNA酶C切割PA内的A，将Cat A与MB分开，这允许其迁移通过T袋壁，在那里它可以切割PB内的Sub B，从而将Cat B1(部分酶B1)与MB分离。Cat A还可以切割PC的Sub B以从MB释放Cat B2(部分酶B2)。部分酶B1现在可以自由地从T袋内部迁移到溶液中，其中它可以与部分酶B2和组装易化子AF-B3杂交以形成活性反馈MNA酶(Cat B)。Cat B可以在PA中切割Sub A并继续级联。孵育一段时间后，可以使用磁铁保留未切割的底物酶-MB和切割的MB片段，从而使上清液含有游离脱氧核酶A(Cat A)、部分酶C1、C2、B1和B2、AF-B3和靶标。转移到含有标记的Sub A和/或Sub B的另一个管中。可以实时监测在通过脱氧核酶和/或MNA酶切割分离荧光团和猝灭剂后产生的荧光。
在图27所示的示例性方案中，可渗透屏障(称为“T袋”)和底物酶用于在检测到目标后放大信号。该策略不同于图4、图22和图23中所示的方案，其中荧光标记的底物(Sub A-FQ)在初始孵育期间存在于反应管内，从而将反应简化为单一步骤并且否定需要将释放的脱氧核酶转移到第二个管中。PA(底物酶A)包含与A A连接的Cat A，其可被Cat B和Cat C切割。PB(底物酶B1)包含与Sub B缀合的Cat B1(部分酶B1)，其可由Cat A PC切割。PC(底物酶B2)包含缀合至相同Sub B的Cat B2(部分酶B2)，其可被Cat A切割。PA、PB和PC缀合至珠子，例如如图所示的磁珠(MB)。Sub A-FQ包含Sub A，其用荧光团标记5'并用猝灭剂标记3'并且可由Cat B和Cat C切割。PB(Cat B1)与PC(Cat B2)的物理分离，通过使用可渗透屏障(T袋)抑制活性MNA酶B(Cat B)与组装易化子B3(AF-B3)的形成，使得它不能水解Sub A-FQ。这允许在反应中存在Sub A-FQ以使孵育和检测步骤能够在单个步骤中组合。Sub A-FQ只能通过在靶标存在下启动MNA酶(Cat C)和通过切割PB并通过MNA酶B(Cat B)从T袋内部释放CatB2来切割。该管包含用于所选靶标的Sub A-FQ、PA、PC、AF-B3、部分酶C1和C2以及如图3B所示构建的T袋内的PB。在靶标存在下，部分酶C1和C2排列并形成起始MNA酶C(Cat C)。MNA酶C切割PA内的A区，将Cat A与MB分开，使其能够通过T袋壁迁移，在那里它可以切割PB内的SubB，从而将Cat B1与MB分离。Cat A还可以切割PC的Sub B以从MB释放Cat B2。Cat Bl现在可以自由地从T袋内部迁移到溶液中，在那里它可以与Cat B2和AF-B3杂交形成活性CatB.Cat B可以在PA中切割Sub A并继续级联。在孵育期间，可以测量在通过Cat B和Cat C裂解在Sub A-FQ内分离荧光团和猝灭剂之后产生的荧光。在一个替代实施例中，组装易化子，例如Cat B的AF-B3组件，可以连接到珠子，例如MB，作为PB或PC连接到珠子的替代。
-使用多酶分析多个靶标的方法
技术人员将认识到，本文提供的方法可用于检测每个反应的单个靶标，或用于检测单个反应中的多个靶标。当检测多个靶标时，可以使用一种或多种MNA酶，这取决于测定和待检测的内容。例如，当检测多个相关结构时，单个MNA酶就足够了，例如，一组序列共享关键序列(由MNA酶识别)并且仅在例如长度上或在关键序列之外的序列中变化。可以检测具有关键序列的任何序列。当检测相关序列相差少至单个核苷酸或甚至需要检测到极其不同的靶标时，预期多个MNA酶是有用的，并且希望知道每个的存在或不存在。
-检测离子化合物
在另一种策略中，提供了用于确定样品(例如环境样品或生物样品)中离子化合物缺失，检测离子化合物的存在和/或定量离子化合物的方法。离子化合物可以是一价或二价离子。离子化合物可以是催化核酸酶活性所需的金属离子辅因子。
该方法包括提供如本文所述的分子复合物(分子开关)和至少一种能够激活开关的附加组分，从而提供可检测的信号。附加组分的功能活性可取决于待测样品中离子化合物的存在。例如，所述方法可包括使怀疑含有离子化合物的样品与分子开关接触，所述分子开关包含与阻断寡核苷酸杂交并功能性失活的第一催化核酸酶，和引发剂催化核酸酶(例如脱氧核酶、核酶、组装的MNA酶、或能够组装成MNA酶的组分。
离子化合物还可以是复合物的第一催化核酸酶的催化活性所需的辅因子。
因此，该方法可以利用需要特定金属离子辅因子用于催化活性的催化核酸(例如脱氧核酶、核酶、适体酶和/或MNA酶)，以检测样品(例如环境或生物样品)中金属离子的存在或确定不存在。例如，该方法可以促进脱氧核酶介导的环境样品(例如水)中Pb2+的检测。
适体
本领域技术人员将容易理解，本文所述的方法可以用适体进行，其中所述适体可以促进包括除核酸之外的靶标的靶标检测、鉴定和/或定量。
考虑了使用MNA酶检测靶标(包括非核酸实体)的方法。此类方法可以使用适体，其可以包含具有识别一种或多种配体的能力的核酸或蛋白质、多肽或肽或其组合。适体可结合靶标配体，例如蛋白质、多肽、肽或核酸、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、整个生物体、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒或其任何衍生物、部分或组合，或任何其他实体。
本文优选的适体可包含短的单链DNA或RNA寡聚体或肽，其可通过吸附，回收和再扩增的迭代过程从合成核酸或肽的复杂文库中分离。因此，可以针对几乎任何靶标/配体产生适体，范围从小分子如氨基酸或抗生素到蛋白质和核酸结构。在一些实施方案中，适体包括例如核酸结合分子，其优选通过进化和选择技术产生。适体可包含DNA或RNA分子，或两者的组合，包括但不限于核苷酸类似物，例如，如上表1所示。
本领域技术人员将理解，适体可以掺入脱氧核酶、核酶或任何MNA酶组分中。与适体偶联的脱氧核酶和核酶在本领域中称为适体酶。这些适体酶可通过对其适体组分具有亲和力的配体的存在而开启或关闭其催化活性。此外，应当理解，可以将多个适体掺入一种或多种部分酶寡核苷酸组分中。
在进一步的示例性实施方案中，适体序列可以以部分酶(适体-部分酶)的末端掺入，其中活性MNA酶仅在靶标分析物存在下形成。在这种情况下，MNA酶检测策略的部分酶包括：标准的部分酶；适体-部分酶，其是一种末端掺入适体的部分酶；组装易化子，其与适体-部分酶和部分酶结合，使得能够组装活性MNA酶(在靶标存在下)；底物；和组装抑制剂，其在跨越至少部分适体序列和部分酶序列的区域中与适体-部分酶杂交。在不存在靶标的情况下，组装抑制剂与适体-部分酶结合，从而阻断报道探针底物的结合(和切割)。在靶标存在下，靶标与适体-部分酶的适体序列结合，阻止装配抑制剂的结合并允许MNA酶底物的结合和切割。因此，活性MNA酶仅能在靶标存在下形成和修饰MNA酶底物。
-使用不溶性支持物的方法
还应理解，通常本发明的方法可以使用不溶性支持物，其上连接有一种或多种反应组分，例如底物酶、脱氧核酶、MNA酶组分(底物、部分酶或组装易化子/靶标)。例如，本文考虑了使用MNA酶检测靶标的方法，其中反应组分(例如，底物酶、脱氧核酶、MNA酶或其组分)可以锚定在支持物上。支持物可以是不溶性物质或基质，其保留反应组分并使其不能在大部分反应混合物中自由移动。或者，支持物可以是不溶性材料或基质，其保留反应组分，但另外允许反应组分在反应混合物中的移动性，因为它不固定在另一个表面上。使用信号放大方法具有优势，其中催化核酸酶、底物和其他组分固定在移动实体上，例如珠子，而不是固定的支持物/表面。例如，珠子具有增加的表面积与体积比，这允许改善系留组分的表面密度。其它优点包括小型化，其可以促进(i)通过更快的扩散提高反应速率，和(ii)减少反应体积，这最终降低试剂成本。此外，珠子在其制备和掺入装置方面表现出高度的实用性。技术人员将理解，支持物可以选自各种形式的基质、聚合物等，包括便于用于微阵列的珠子，以及与反应条件相容的其它材料。在某些实施方案中，支持物可以是塑料材料，例如塑料珠或晶片、金属材料、磁化材料、或其中进行特定测定的孔或管的材料。在某些实施方案中，支持物可以是微载体或纳米载体。在某些实施方案中，可以编码支持物。
-优化方法
技术人员将容易理解，可以使用各种实验参数优化本文所述的方法，以增强靶标的检测、鉴定和/或定量。优化的特定实验参数和这种优化的水平将取决于所采用的特定方法和寻求检测，识别和/或量化的特定目标。这些参数包括但不限于时间、温度、pH、盐和缓冲液的浓度和特性、寡核苷酸浓度、辅因子、洗涤剂、阳离子和其他试剂，包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)、EDTA、ATP、甘油、互补长度、GC含量和MNA酶、底物酶、脱氧核酶、底物的核酸组分的熔点(Tm)。
在一些实施方案中，例如，可以优化那些涉及检测特定核酸序列的方法，包括进行该方法的温度的实验参数，以区分MNA酶组分与包括或不包括序列变异的靶标核酸的结合。可以进行这些方法的温度可以在约20℃至约96℃、约20℃至约75℃、20℃至约60℃或约20℃至约55°的范围内。
在某些实施方案中，提供了用于实施本文所述方法的优化反应。在这种优化的反应中，检测到的信号比未优化的反应增加高达10％、20％或30％。更优选的反应条件可以将检测到的信号改善至少35％、或40％、优选至多50％或更多。在其他实施方案中，优化的反应可以提供超过50％、高达66％、75％或甚至100％的催化活性的增加。在其他实施方案中，完全优化的反应方法可以提供信号检测的100％、200％或甚至300％或更多的增加。与未优化的反应条件一起实施的方法相比，其它优选的反应条件可以将催化活性提高至多1000％或更多。用于优化本文提供的方法的高度优选的反应条件是包含某些二价阳离子。大多数核酸酶和蛋白质核酸修饰酶的催化活性可以通过二价阳离子的浓度以浓度依赖性方式受到影响。针对Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和Pb2+中的一种或多种优化优选的优化反应。
试剂盒
本发明还提供了用于实施本文公开的方法的试剂盒。通常，用于实施本发明方法的试剂盒包含实施该方法所需的所有试剂。
试剂盒可包含根据本发明的任何组合物或其组分。仅作为非限制性实例，试剂盒可包含催化核酸酶(例如，MNA酶和/或其部分酶组分、脱氧核酶、底物酶、适体酶、和/或核酶)。试剂盒可任选地含有内切核酸酶或核酸外切酶。
试剂盒可以是本文定义的片段化试剂盒或组合试剂盒。片段化试剂盒包含容纳在单独容器中的试剂，并且可包括小玻璃容器、塑料容器或塑料或纸条。这样的容器可以允许试剂从一个隔室有效地转移到另一个隔室，同时避免样品和试剂的交叉污染，以及以定量方式将每个容器的试剂或溶液从一个隔室添加到另一个隔室。这种试剂盒还可包括接受测试样品的容器、含有测定中使用的试剂的容器、含有洗涤试剂的容器、和含有检测试剂的容器。通常，本发明的试剂盒还包括使用试剂盒组分进行适当方法的说明书。本发明的试剂盒和方法可以与自动分析设备和系统结合使用，例如，包括但不限于实时PCR机器、分光光度计、电化学平台或表面等离子体共振平台。
例如，该试剂盒可包括第一容器和第二容器。第一容器可包含催化核酸和/或其部分(例如，MNA酶、脱氧核酶、部分酶寡核苷酸)和/或底物酶)。与第一容器的内容物相比，第二容器可包含催化核酸底物和/或不同类型的催化核酸和/或其部分，和/或不同类型的底物酶。试剂盒可以是本文定义的片段化试剂盒或组合试剂盒。
试剂盒还可以包含一个或多个容器，其包含例如洗涤试剂和/或实施本发明方法所需的其他试剂。
对于不同靶标的检测、鉴定或定量的应用，可以应用本发明的单个试剂盒，或者可以需要不同的试剂盒，例如含有对每个靶标特异的试剂。本发明的方法和试剂盒可用于需要检测、鉴定或定量任何实体的任何情况。
实施例
现在将通过参考以下具体实施例更详细地进一步描述本发明，这些实施例不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例一：材料和方法
-序列和注释
以下实施例在许多情况下通过序列识别号(SEQ ID NO)涉及各种核苷酸序列。以下实施例中使用的具体序列列于下表2中。
表2：实施例部分使用的序列
-试剂
链霉抗生物素蛋白功能化的Dynabeads(M-270)购自Invitrogen。由制造商提供的链霉抗生物素蛋白官能化Dynabeads(M-270)的特征和性质如下：超顺磁性，亲水性珠表面，直径2.8μm，尺寸分布(CV<3％)，未使用阻断蛋白，等电点pH 4.5，高电荷(pH 7下为-50mV)，铁含量为14％，高盐溶液中珠粒聚集率低。
链霉抗生物素蛋白功能化的BioMAG Plus珠(1.5μm)、ProMag珠(1μm)、ProMag HP珠(3μm)和COMPEL磁珠(6μm和8μm)购自Bangs Laboratories,Inc。由制造商提供的这些珠粒的特征和性质如下：球形，分散在聚合物基质中的氧化铁晶体，各自的磁铁矿含量为26.5wt％、16wt％、>90wt％、5.7wt％和wt％各自的密度为1.8g/cm3、1.4g/cm3、2.5g/cm3、1.1g/cm3和1.1g/cm3。除了以5.0mg/mL固体提供的BioMAG Plus珠粒外，所有珠粒均以1％固体(w/v)供应。
NaOH(5M)购自Australian Chemical Reagents(ACR)。Tris缓冲液(pH8.0)、NaCl(5M)、MgCl2(1M)和无核酸酶的水购自Ambion。10X PCR Buffer II购自AppliedBiosystems。硝酸纤维素膜购自Bio-Rad，聚醚砜膜和聚碳酸酯膜购自Sterlitech，双面胶带购自Sellotape。
人基因组DNA购自Promega(193ng/L)。所有合成的寡核苷酸购自Integrated DNATechnologies(IDT)，并使用不含核酸酶的水制备成20μM储备溶液。沙眼衣原体(CT)(血清型D)TNA样品使用如下所述的标准组织培养技术在体外获得。
人上皮细胞系(HEp-2)(ATCC CCL-23TM)在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS)(Sigma Aldrich)的Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM)(Sigma Aldrich)中生长，将100mg/mL链霉素(Gibco，Invitrogen Corporation)，50mg/mL庆大霉素(LifeTechnologies)和20mM谷氨酰胺(Sigma Aldrich)在37℃下与5％CO2温育。
将沙眼衣原体接种在HEp-2单层上，其存在于T75烧瓶(NuncTM，Thermo Fisher)上，感染复数(MO I)为1。通过在28℃的温度下以500g离心辅助接种30分钟完成感染，随后温育。在感染后4小时(PI)，通过添加1mg/mL的环己酰胺(Sigma Aldrich)替换DMEM，并再次在37℃下与收获的5％CO2孵育。在PI 24小时的指数生长期，使用细胞刮刀和蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)缓冲液(250mM蔗糖，10nM磷酸钠和5mM L-谷氨酸)手动收获细胞。收获的材料储存在-80℃下进一步加工。使用QIAamp MinElute Virus Spin Kit(QIAgen)按照标准方案提取总核酸样品(TNA)。
-底物酶珠复合物(SubZyme Bead)的制备
以下实施例中描述的测定使用底物酶A至K(SEQ ID No：1-12)，其使用以下两种方案之一附着于珠子。实施例2-7使用附着方法一(3A)，实施例10-11和13-20使用附着方法二(3B)。当底物酶序列附加到珠子时，其名称包括“珠”(bead)。当底物酶序列附着到磁珠上时，其名称包括“MB”(例如，附着于磁珠的底物酶A被命名为“底物酶-MB”)。
附着方法1：将M270 Dynabead储存瓶涡旋并充分混合以确保磁珠(MB)均匀分散。将Dynabead洗涤三次以除去防腐剂，并通过用100μL洗涤缓冲液A'(100mM NaOH，50mMNaCl)洗涤两次，每次3分钟，并用100μl洗涤缓冲液B(100mM NaOH)洗涤一次3分钟来使任何核糖核酸酶变性。使用高度特异性的生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用将底物酶A和底物酶B固定在MB上。将经洗涤的MB在含有“孵育缓冲液”(2M NaCl，10mM Tris-HCl pH 7.5)和5μM底物酶A或底物酶B的最终体积中在室温下温育1小时。在孵育之前和之后，使用分光光度计(Trinean Xpose)在A260测量温育混合物以确定固定效率。除去孵育溶液并丢弃，彻底洗涤底物酶-MB复合物以除去过量的底物酶分子。在200μL的“孵育缓冲液”中在55℃下进行一系列三次5分钟的洗涤，然后在200μL的“反应缓冲液”(15mM MgCl2,1X PCR缓冲液II)中在55℃进行两次5分钟的洗涤。
收集最终的洗涤溶液并与200nM的互补底物一起温育，以确保彻底除去未结合的底物酶链。使用官能化珠子进行质量控制测试以估计附着的底物酶-MB复合物的浓度并确保脱氧核酶组分保持催化活性。最后，将底物酶-MB在5℃下干燥储存在冰箱中。
附着方法2：将珠子储存小瓶涡旋并充分混合以确保珠子均匀分散。使用150μL缓冲液C(1.5M NaCl，10mM Tris-HCl pH 7.5)洗涤珠子三次以除去防腐剂。使用高度特异性的生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用将底物酶固定在珠子上。将经洗涤的珠子在含有“缓冲液C”(1.5M NaCl，10mM Tris-HCl pH 7.5)和150nM底物酶的50μL终体积中在室温下孵育5分钟。除去孵育溶液并丢弃，彻底洗涤底物酶珠复合物以除去过量的底物酶分子。将底物酶珠用400μL缓冲液C(1.5M NaCl，10mM Tris-HCl pH 7.5)洗涤一次，然后用400μL无核酸酶水洗涤五次，并在150μL“反应缓冲液”(45mM MgCl2,1X PCR缓冲液II)中在55℃下进行两次洗涤。最后，将底物酶珠重悬于20μL无核酸酶的水中，并在5℃下储存在冰箱中。
使用磁架清洗磁珠以保留磁珠并丢弃上清液。通过将二氧化硅珠粒溶液以10,000rpm离心3分钟来洗涤非磁性珠粒以沉淀珠粒，然后除去并弃去上清液。-渗透屏障(“T袋”)的制备
以下实施例中描述的一些测定法使用可渗透屏障(T袋)，其使用以下两种方案之一制备。实施例2-7使用T袋方法一(3A)和实施例10-20使用T袋方法二(3B)。
T袋方法1：根据图3A中描绘的图，使用以下材料手动制备一些可渗透屏障(T袋)：硝酸纤维素膜(0.45μm)、双面胶带和底物酶-MB。如图3A中所示，将四条胶带布置在一片硝酸纤维素上以形成小孔。将底物酶-MB复合物在10μL的“固定化缓冲液”中重构，并轻轻地轻弹以重新分散。将1μL等分试样的底物酶-MB复合物溶液加入到孔内并在室温下干燥2分钟。用小圆形硝酸纤维素盘(直径约7mm)覆盖孔，用剪刀修剪T袋。最后，将盘形T袋放入2mLEppendorf管内进行储存。
T袋方法2：根据图3B中所示的图，使用以下材料手动制备一些可渗透屏障(T袋)：由聚碳酸酯或聚醚砜材料(PES)制成的膜、双面胶带和底物酶珠。首先将双面胶带对折，使得粘性侧面自身向后折叠，并且非粘性衬垫暴露在外表面上。使用打孔器，将6mm直径的小孔冲压到折叠的胶带中。在从一侧移除衬垫之后，将胶带孔放置在膜条上并施加压力，然后从胶带的另一侧移除保护性衬垫。在孔内加入等分试样(0.5μL)的底物酶珠复合物，并在室温下干燥约30秒。用另一条膜覆盖孔，用剪刀将T袋修剪成圆盘。最后，将盘形T袋放入2mLEppendorf管内进行储存。
实施例2：合成人TFRC基因同源物的检测
在该实验中，图4中概述的策略用于在存在与人TFRC基因的靶标寡核苷酸同源物的情况下检测靶标并放大信号。使用附着方法1(实施例1)制备底物酶-MB，并使用T袋方法1(实施例1；图3A)制备T袋。获得的结果显示在图5A和5B中。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶A)(SEQ ID NO：1)、PB(底物酶B)(SEQID NO：2)、底物A(SEQ ID NO：13)、底物B(SEQ ID NO：14)、TFRC部分酶A1(SEQ ID NO：15)、TFRC部分酶B1(SEQ ID NO：16)和靶标TFRC寡核苷酸(SEQ ID NO：17)。序列列于序列表中。参考图4，底物酶A是PA，底物酶B是PB，当在TFRC靶标上组装时，部分酶A1和B1形成起始MNA酶(Cat C)。
每个反应含有0.2μM TFRC部分酶A1、0.2μM TFRC部分酶B1、1X PCR缓冲液II、5.6μL底物酶A-MB、含有底物酶B-MB的1T袋和125μL终体积的15mM MgCl2。反应含有终浓度为1pM、100fM、1fM和500μM的靶标TFRC寡核苷酸；或缺乏目标(无DNA控制)。将反应物在50℃下在加热块上在2mL反应管(Eppendorf)中温育15分钟(图5A)或20分钟(图5B)，通过手动倒置间歇混合。
在初始温育后，将样品从加热块转移并取出T袋并丢弃。将样品短暂离心并将管置于磁架上以分离未切割的底物酶-MB和切割的部分底物-MB片段与上清液中存在的切割的“游离”脱氧核酶1和2。将两份48μL上清液的等分试样转移到96孔板(Bio-Rad)中的不同孔中。向这些孔中的每一个中加入2μL含有等摩尔浓度的双重标记的底物A和底物B的底物混合物(分别为图5A和图5B的0.15μM和0.2μM终浓度)。使用条带盖(Bio-Rad)密封平板并短暂离心，然后实时监测荧光变化45分钟。
图5A中所示的结果说明了从1pM的Oligo AF-TFRC(双细线)、100fM的AF-TFRC(虚线)和无靶标(粗黑线)获得的信号。实时监测10分钟的垂直线相当于25分钟的总反应时间(即15分钟T袋孵育加10分钟实时监测)，并指示检测1pM和100fM靶标所需的时间。将图5B中所示的反应温育20分钟并且包含无靶标(粗黑线)、100fM的AF-TFRC(细双线)、1fM的AF-TFRC(虚线)或0.5fM的AF-TFRC(虚线)。在该实验中，实现的检测限为100fM，较低的目标浓度(1fM和500aM)不产生超过背景的信号(无靶标反应)。
这些结果与以下方案一致。在靶标寡核苷酸存在下，部分酶对齐并形成MNA酶。MNA酶在溶液中切割底物酶A-MB，将8-17脱氧核酶与MB表面分开。随后“游离”8-17脱氧核酶可以通过T袋选择性渗透膜迁移，其中它可以裂解底物酶B-MB，导致10-23脱氧核酶从MB表面分离。然后10-23脱氧核酶游离迁移出T袋渗透膜进入溶液，在那里它可以切割底物酶A-MB并继续级联。孵育一段时间后，使用磁铁将未裂解的底物酶-MB和裂解的部分底物-MB片段与裂解的“游离”脱氧核酶分开。
使用CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)测量来自德克萨斯红通道的荧光，每50秒进行采集，总共201或150个循环(分别为图5A和5B)，恒定温度为50℃。图5A和5B中的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值。图5描绘了寡核苷酸靶标的示例性滴定。在该实验中，容易检测到1pM和100fM的浓度，然而，1fM和500aM的浓度没有给出高于背景的信号(无靶标)。
实施例3：检测合成的人TFRC基因同源物和脱靶标序列分析
在该实验中，图4中概述的策略用于首先在存在与人TFRC基因同源的靶标寡核苷酸的情况下检测靶标并扩增信号，其次，用于分析脱靶标序列(分别与carbapenamse耐药细菌和沙眼衣原体同源的Bla_KPC和CTcds2_2基因)检查反应的特异性。使用附着方法1(实施例1)制备底物酶-MB，并使用T袋方法1(实施例1；图3A)制备T袋。该实验的结果如图6所示。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶A)(SEQ ID NO：1)、PB(底物酶B)(SEQID NO：2)、底物A(SEQ ID NO：13)、底物B(SEQ ID NO：14)、TFRC部分酶A1(SEQ ID NO：15)、TFRC部分酶B1(SEQ ID NO：16)、靶标TFRC寡核苷酸(SEQ ID NO：17)、脱靶标寡核苷酸KPC(SEQ ID NO：18)和脱靶标寡核苷酸AF-CTcds2_2(SEQ ID NO：19)。序列列于序列表中。参考图4，底物酶A是PA，底物酶B是PB，并且当在TFRC靶标上组装时，部分酶A1和B1形成起始MNA酶(Cat C)。
每个反应含有0.2μM TFRC部分酶A1、0.2μM TFRC部分酶B1、1X PCR缓冲液II、2.5μL底物酶A-MB、1x含有底物酶B-MB和15mM MgCl2的最终体积的T袋。反应进一步包含1pM的目标TFRC寡核苷酸或1nM的靶标寡核苷酸Bla KPC或1nM的脱靶标寡核苷酸CTcds2_2或无DNA靶标。将反应物在50℃下在加热块上的2mL反应管中温育20分钟，通过手动反转间歇混合。在初始温育后，将样品从加热块转移并取出T袋并丢弃。将样品短暂离心并将管置于磁架上以分离未切割的底物酶-MB和切割的部分底物-MB片段与切割的“游离”脱氧核酶。将两份48μl的等分试样的上清液转移至96孔板(Bio-Rad)中并将2μL的含有等摩尔浓度的底物A和底物B(0.15μM终浓度)的底物混合物加入每个孔中。将板密封并短暂离心。将平板置于CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)上，每隔5秒采集一次，在50℃的恒温下进行150个循环。实时监测来自德克萨斯红色通道的荧光。图6中的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复项的平均值。
图6中的结果显示了四个反应，包括无靶标对照(实心黑线)、含有1pM匹配的TFRC靶标的反应(细双线)、以及含有1nM脱靶标寡核苷酸Bla-KPC寡核苷酸的两个反应(点虚线)或1nM脱靶标寡核苷酸CT CDS(虚线)。
图6中呈现的结果证明T袋信号放大反应是高度特异性的，并且仅在存在由匹配的核酸序列(靶标组装易化子)形成的MNA酶的情况下触发。在当前的实验中，将高浓度的与细菌基因同源的合成寡核苷酸(Bla-KPC和Ct-Cds2)加入到设计用于检测人基因组DNA(TFRC基因)的T袋测定中。结果表明细菌寡核苷酸的添加不会触发级联反应并且导致没有高于背景信号的信号(没有靶标对照)。
实施例4：适应测定以检测不同的靶标序列
在该实验中，证明了图4中概述的策略可以容易地适应于检测任何核酸靶标。使用附着方法1制备底物酶-MB，并使用T袋方法1制备T vags，如实施例1(3A)中所述。参考图4，底物酶A是PA，底物酶B是PB，并且当在TFRC靶标上组装时，部分酶A1和B1形成起始MNA酶(Cat C)。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶A)(SEQ ID NO：1)、PB(底物酶B)(SEQID NO：2)、底物A(SEQ ID NO：13)、底物B(SEQ ID NO：14)、OXA部分酶A(SEQ ID NO：20)、OXA部分酶B(SEQ ID NO：21)和靶标OXA寡核苷酸(SEQ ID NO：22)。序列列于序列表中。
每个反应含有0.2μM OXA部分酶A、0.2μM OXA部分酶B、1X PCR缓冲液II、2.45μL底物酶A-MB、含有底物酶-MB的1×T-Bag和15mM MgCl2，终体积125μL。将反应物在50℃下在2mL反应管中在加热块上温育20分钟，通过手动反转进行间歇混合。反应含有10pM的TargetOXA Oligo或无DNA。
在初始温育后，将样品从加热块转移并从管中取出T袋并丢弃。将样品短暂离心并将管置于磁架上以分离未裂解的底物酶A-MB和裂解的部分底物-MB片段与裂解的脱氧核酶，其被释放到溶液中。将两份48μL上清液的等分试样转移至96孔板中的不同孔中，并向每个孔中加入2μL含有等摩尔浓度的底物A和底物B(0.2μM终浓度)的底物混合物。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自德克萨斯红通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行150个循环。图7中显示的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值，并且在存在OXA目标时显示强信号。由于在该实验中对实施例3中检测到TFRC的方案的唯一改变是使用具有对OXA特异性的靶标结合臂的MNA酶，与TFRC相反，这表明使用底物酶的扩增级联可以是通用的用于检测任何靶标核酸。
实施例5：在人血清存在下检测人基因组DNA中的人TFRC基因
在该实验中，图4中概述的策略用于检测靶标并在人基因组DNA中存在人TFRC基因时扩增信号。此外，它旨在确定10％人血清的存在是否会影响反应。使用附着方法1(实施例1)制备底物酶-MB，并使用T袋方法1(实施例1)制备T袋。参考图4，底物酶A是PA，底物酶B是PB，当在TFRC靶标上组装时，部分酶A1和B1形成起始MNA酶(Cat C)。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶A)(SEQ ID NO：1)、PB(底物酶B)(SEQID NO：2)、底物A(SEQ ID NO：13)、底物B(SEQ ID NO：14)、TFRC部分酶A1(SEQ ID NO：15)和TFRC部分酶B1(SEQ ID NO：16)。序列列于序列表中。
每个反应含有0.2μM TFRC部分酶A1、0.2μM TFRC部分酶B1、1X PCR缓冲液II、1μL底物酶A-MB、含有底物酶B-MB的1x T袋和15mM MgCl2，最终体积为70μL。反应还含有772ng基因组DNA，其在95℃下热变性2分钟。在不存在(图8A中的反应)或7μL人血清的存在(图8B中的反应)下进行反应，所述人血清已经在70℃下预热5分钟以使任何核糖核酸酶变性。
在初始温育后，将样品从加热块转移并从管中取出T袋并丢弃。将样品短暂离心并将管置于磁架上以将未裂解的底物酶A-MB和部分裂解的底物A-MB片段与裂解的脱氧核酶分离，将其释放到溶液中。将来自每个反应的一份48μL等份的上清液转移至96孔板(Bio-Rad)，然后与2μL含有等摩尔浓度的底物A和底物B(0.2μM终浓度)的底物混合物混合并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自德克萨斯红通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行111个循环。
图8A中显示的结果表明该方法能够检测772ng人基因组DNA中的人TFRC基因(实线)，其对应于约223,500个拷贝的基因(2×105个基因拷贝)。信号与无gDNA控制(虚线)很好地区分。含有10％血清的反应(图8B)与不存在血清时的反应相似，表明该方法耐受污染的血清。
实施例6：用三种部分酶检测人基因组DNA中的人TFRC基因
在该实验中，图4中概述的策略用于检测靶标并扩增来自人基因组DNA中存在的人TFRC基因的信号。在该实施例中，使用三种MNA酶(六种部分酶)触发反应，所述三种MNA酶组装在TFRC基因的不同区域上。使用附着方法1制备底物酶-MB，并使用T袋方法1制备T袋，如实施例1中所述。参考图4，底物酶A是PA，底物酶B是PB，并且当在TFRC靶标上组装时，部分酶A1和B1形成起始MNA酶(Cat C)。当在TFRC靶标上组装时，部分酶A2和B2形成第二起始MNA酶(Cat E)，并且部分酶A3和B3形成第三起始MNA酶(Cat F)。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶A)(SEQ ID NO：1)、PB(底物酶B)(SEQID NO：2)、底物A(SEQ ID NO：13)、底物B(SEQ ID NO：14)、TFRC部分酶A1(SEQ ID NO：15)、TFRC部分酶B1(SEQ ID NO：16)、TFRC部分酶A2(SEQ ID NO：23)、TFRC部分酶B2(SEQ ID NO：24)、TFRC部分酶A3(SEQ ID NO：25)和TFRC部分酶B3(SEQ ID NO：26)。序列列于序列表中。
反应含有0.2μM TFRC部分酶A1、0.2μM TFRC部分酶B1、0.2μM TFRC部分酶A2、0.2μM TFRC部分酶B2、0.2μM TFRC部分酶A3、0.2μM TFRC部分酶B3、1X PCR缓冲液II、1μL底物酶A-MB、含有底物酶B-MB的1×T袋和15mM MgCl2，终体积为70μL。反应也含有或缺乏人基因组DNA，其在加入反应之前已在95℃热变性2分钟。将反应物在50℃下在加热块上的2mL管中温育20分钟，通过手动反转间歇混合。
在初始温育后，将样品从加热块转移并从管中取出T袋并丢弃。将样品短暂离心并将管置于磁架上以分离未裂解的底物酶A-MB和裂解的部分底物A-MB片段与释放到溶液中的脱氧核酶。将48μL等分试样的上清液转移至96孔板(Bio-Rad)并与2μL含有等摩尔浓度的底物A和底物B(0.2μM终浓度)的底物混合物混合。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自德克萨斯红通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行120个循环。图9中呈现的结果描绘了使用T袋形式的信号放大检测人基因组DNA中的人TFRC基因。在人基因组DNA(280,000或2.8×105基因拷贝)的存在(实线)或不存在(虚线)下进行实验。
实施例7：人基因组DNA中人TFRC基因的检测
在该实验中，图4中概述的策略用于首先检测靶标并在人TFRC基因存在下扩增信号。底物酶-MB使用附着方法1制备，且T袋使用T袋方法1制备，如实施例1中所述。参考图4，当在TFRC靶标上组装时，底物酶A是PA，底物酶B是PB和部分酶A1和B1形成起始MNA酶(CatC)。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶A)(SEQ ID NO：1)、PB(底物酶B)(SEQID NO：2)、底物A(SEQ ID NO：13)、底物B(SEQ ID NO：14)、TFRC部分酶A1(SEQ ID NO：15)和TFRC部分酶B1(SEQ ID NO：16)。序列列于序列表中。
每个反应含有0.2μM TFRC部分酶A1、0.2μM TFRC部分酶B1、1X PCR缓冲液II、2.5μL底物酶A-MB、含底物酶B-MB的1x T袋，和15mM MgCl2，终体积为125μL。反应缺乏基因组DNA或含有965ng或579ng人基因组DNA，其已在95℃热变性2分钟。将反应物在50℃下在加热块上的2mL反应管中温育20分钟，通过手动反转间歇混合。在存在965ng(实线)、579ng(虚线)或缺乏(虚线)人基因组DNA的情况下进行实验。
在初始温育后，将样品从加热块转移并从管中取出T袋并丢弃。将样品短暂离心并将管置于磁架上以将未切割的底物酶A-MB和切割的部分底物A-MB片段与释放到溶液中的脱氧核酶分离。将两份48μL等份的上清液转移至96孔板(Bio-Rad)中的不同孔中，并与2μL含有等摩尔浓度的底物A和底物B(0.2μM终浓度)的底物混合。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自德克萨斯红通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行150个循环。结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复项的平均值。图10描绘了使用T袋形式的信号放大对人基因组DNA的这种示例性滴定。在该实验中，在背景信号(无靶标)之上检测到270,000和168,000拷贝的TFRC基因的浓度。
实施例8：通过组合8-17和10-23催化核酸改善稳定性
在该实验中，比较了两种示例性底物酶的长期稳定性。底物酶A由8-17催化核酸组分和10-23催化核酸底物组分组成。催化酶C由10-23催化核酸组分和10-23催化核酸底物组分组成。获得的结果如图11所示。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶A)(SEQ ID NO：1)、PA(底物酶C)(SEQID NO：3)、TFRC部分酶A1(SEQ ID NO：15)、TFRC部分酶B1(SEQ ID NO：16)、靶标TFRC寡核苷酸(SEQ ID NO：17)、靶标TFRC寡核苷酸4(SEQ ID NO：27)和脱氧核酶A(SEQ ID NO：28)。序列列于序列表中。
底物酶C由10-23催化核酸组分和10-23催化核酸底物组分组成，底物组分含有内部荧光素和两个内部ZEN Quencher部分。反应A、B、C和D在20μL最终反应体积中含有0.2μMTFRC部分酶A1、0.2μM TFRC部分酶B1、0.2μM底物酶C、1X PCR缓冲液II和25mM MgCl2。所有反应均在52℃下在CFX96热循环仪中一式两份进行，并且在FAM通道中测量荧光，每5秒进行一次采集(扫描模式：仅SYBR/FAM)，反应A和B共201个循环，反应C和D共200循环。反应A和C不含靶标TFRC寡核苷酸。反应B含有1581pg(5nM)靶标TFRC寡核苷4，反应D含有512μg(2nM)靶标TFRC寡核苷酸。
底物酶A由8-17催化核酸组分和10-23催化核酸底物组分组成，底物组分含有内部荧光素和两个内部ZEN Quencher部分。反应E、F、G和H在20μl最终反应体积中含有0.2μM底物酶A、1X PCR缓冲液II和25mM MgCl2。所有反应均在50℃下在CFX96热循环仪中一式两份进行，并且在FAM通道中测量荧光信号，每5秒进行采集(扫描模式：所有通道)，总共201个循环。反应E和G不含任何起始脱氧核酶，反应F和H各自含有503μg(2.5nM)起始脱氧核酶。
反应A和B的结果显示在图11A中，并说明了通过10-23MNA酶对底物酶C的底物组分的靶标依赖性切割，其中在重构底物酶C寡核苷酸后立即进行温育。反应B中的裂解事件导致内部荧光团和猝灭剂的物理分离，并显示荧光随时间的增加。反应A中没有裂解事件导致荧光随时间的增加最小。图11B中显示的结果说明了底物酶C的底物组分在-20℃下储存43天后的靶标依赖性切割。反应C和D显示FAM信号随时间的增加，表明底物酶C在储存期间自切割和/或降解。图11中显示的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值。
反应E和F的结果显示在图11C中，并说明了底物酶A的底物组分被10-23脱氧核酶切割，并且在重构底物酶A寡核苷酸后立即进行孵育。反应F中的裂解事件导致内部荧光团和猝灭剂的物理分离，并显示FAM信号随时间的增加。反应E中没有切割事件，结果表明FAM信号随时间的增加最小。图11D中显示的结果说明在底物酶A在-20℃下储存超过5个月后，通过脱氧核酶切割底物酶A的底物组分。反应G和H分别显示与反应E和F相当的信号。这表明底物酶A在储存期间没有降解或自切割。改善的稳定性归因于含有8-17和10-23个催化核酸组分的设计。图11中显示的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值。
实施例9：将底物酶固定在平面微阵列载玻片上
以下示例突出显示了当底物酶系在平面(固定)表面上时遇到的一些问题，但当底物酶系在移动的三维表面(包括但不限于磁珠)时不明显。在该实验中，在固定到载玻片上后监测底物酶活性。将固定的底物酶(反应B)的活性与未束缚的(游离的)脱氧核酶(反应A)进行比较，得到的结果显示在图12中。
对该实验特异的寡核苷酸包括：底物酶D(SEQ ID NO：4)、底物C(SEQ ID NO：29)和脱氧核酶B(SEQ ID NO：30)。序列列于序列表中。
使用空白醛载玻片进行对照反应(反应A)，所述空白醛载玻片描述于Stralis-Pavese等(2011),Nat Protoc.2011；6(5):609–24。测试反应(反应B)在已用底物酶D官能化的VSS-25Vantage甲硅烷基化醛载玻片上进行，也使用Stralis-Pavese等(2011)NatureProtocols,6(5),609–624中描述的方法。每个反应在25μL终体积中含有0.4μM底物C、0.02％吐温-20、25mM MgCl2和1X PCR缓冲液II。反应A含有50nM的脱氧核酶D，其与底物酶D的催化核酸组分同源。所有反应都发生在置于载玻片顶部的Hybriwell粘合剂室(GraceBio-Labs，611204)内。将载玻片在设定为54℃的加热块上孵育。使用具有以下设置的Leica荧光显微镜在孵育30分钟之前和之后测量荧光；GFP2发射，PMT增益设定为3.5，曝光时间为59.7秒。使用Image J分析软件处理图像，其中分离8位绿色通道并测量RGB值。图像显示在图12A和图12B中。在图12C中绘制了相对RGB值，其中从“孵化后”RGB值中减去“孵化前”RGB值。
图12A中显示的结果说明在对照脱氧核酶和底物在54℃温育之前观察到最小荧光，并且在孵育30分钟后产生强荧光。图12B中显示的结果说明在孵育30分钟后，对于含有固定化的底物酶D的载玻片观察到的荧光没有显著增加。固定化的底物酶可能由于一些原因而不能水解底物，包括没有足够的底物酶拴系到平面表面和/或底物酶在固定到平面玻璃表面后不再具有催化活性。
实施例10：使用Nicking核酸内切酶显示第一步起始
在该实验中，图13B中概述的策略用于在存在与沙眼衣原体ompA基因同源的合成寡核苷酸靶标的情况下检测靶标并扩增信号。在该实施例中，使用切口核酸内切酶Nt.BstNBI作为MNA酶的替代生化触发剂触发反应。设计底物酶以包括与目标靶标互补的靶标特异性序列，并且还包含切口核酸内切酶的切口位点。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶E)(SEQ ID NO：5)、底物D(SEQ ID NO：31)和靶标ompA寡核苷酸1(SEQ ID NO：32)。序列列在序列表中。如实施例1的附着方法2中所述，将底物酶E连接到磁珠(底物酶E-MB)上。
所有反应均含有15μL最终体积的1X NEB缓冲液3.1、5mM MgCl2和0.5μL底物酶E-MB。反应A含有4单位Nt.BstNBI和2nM靶标ompA寡核苷酸1。反应B含有2nM靶标ompA寡核苷酸1且缺乏Nt.BstNBI。反应C含有4单位的Nt.BstNBI并缺乏靶标ompA寡核苷酸1。将反应在55℃下在加热块上的2mL管中温育20分钟。在初始温育后，将样品从加热块转移并将样品短暂离心。将48μL等份的反应溶液转移至96孔板(Bio-Rad)并与2μL含有0.2μM(终浓度)底物D的底物混合物混合。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自FAM通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行150个循环。
图14中显示的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值。在存在ompA靶标和Nt.BstNBI的情况下，FAM通道中的强信号是明显的。在没有Nt.BstNBI和/或ompA靶标的情况下没有检测到信号。这表明Nt.BstNBI的双链限制酶识别位点在靶标与底物酶结合后成功产生，允许Nt.BstNBI催化底物酶链的切割，从而从珠子释放活性8-17脱氧核酶。没有ompA靶标或Nt.BstNBI时没有信号产生。证实两者都是DNA诱导的脱氧核酶释放所必需的。由于切割内切核酸酶不切割靶标链，因此它仍然可以再循环并与其他底物酶杂交，导致脱氧核酶的进一步释放。这可以提供用于增强信号生成和增加目标检测灵敏度的机制。结果表明，涉及使用酶进行表面结合的脱氧核酶释放的扩增级联可以使用一系列不同的生物化学触发剂启动，包括MNA酶和限制酶如切口核酸内切酶。
实施例11：脱氧核酶-底物酶、MB和聚碳酸酯膜的空间限制和扩散
在该实验中，使用图15中概述的策略来证明底物酶珠通过具有不同孔径的半透膜扩散或保留的能力之间的关系。其次，该策略用于证明游离脱氧核酶通过膜扩散到T袋中然后切割底物酶内的底物区域以释放表面结合的脱氧核酶的能力。此外，它还旨在确定释放的脱氧核酶是否可以扩散出T袋并切割荧光底物以产生信号。如实施例1的附着方法2中所述，将PB(底物酶F)连接到磁珠(底物酶F-MB)上。根据图3B中所示的图，使用聚碳酸酯膜手工制备用于构造T袋的可渗透屏障。使用具有各种珠直径(2.8μm，6μm和8μm)和两种不同膜孔径(0.8μm和2.0μm)的MB进行反应。
对该实验特异的寡核苷酸包括：底物酶F(SEQ ID NO：6)、底物E(SEQ ID NO：33)和起始脱氧核酶A(SEQ ID NO：28)。序列列在序列表中。
反应在60μl终体积中含有1X PCR缓冲液II、45mM MgCl2。反应含有1×T袋，其由含有底物酶F-MB的聚碳酸酯材料(0.8μm或2μm)制成。反应含有或缺少2nM脱氧核酶A。反应物在加热块上在2mL管中于50℃温育20分钟。在初始温育后，将样品从加热块转移并将样品短暂离心。将48μL等份的反应溶液转移至96孔板(Bio-Rad)并与2μL底物E(0.2μM终浓度)混合。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自德克萨斯红通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行150个循环。
图16A-F中所示的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值，并且在不存在起始脱氧核酶的情况下显示可忽略的信号。这表明当磁珠的直径大于膜的孔径时，底物酶不能通过T袋膜扩散，同时拴在磁珠上。由于在起始脱氧核酶A存在下观察到强信号，这表明起始脱氧核酶可以扩散到T袋中，切割底物酶-MB，并释放表面结合的脱氧核酶B。这进一步表明释放的脱氧核酶B能够扩散出T袋，并且当与上清液一起转移到新管中时，释放的脱氧核酶B可以切割荧光标记的底物分子E。对于各种磁珠尺寸(2.8μm、6μm和8μm)和各种孔径(0.8μm和2.0μm)。
实施例12：PES膜可以增强底物酶和脱氧核酶活性
下面的实施例强调了凭经验测试使用不同膜材料构建T袋的重要性，以确定材料本身是否会影响反应成分的催化活性。此外，该实施例表明一些膜材料如聚醚砜(PES)的存在可以增强脱氧核酶的催化活性。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶G)(SEQ ID NO：7)、底物F(SEQ ID NO：34)和脱氧核酶C(SEQ ID NO：35)。序列列于序列表中。在该实施例中，PA(底物酶G)如实施例1的附着方法2中所述附着于磁珠(底物酶G-MB)。
反应包含1X PCR缓冲液II、1μL底物酶G-MB、45mM MgCl2、终体积为60μL，缺少或含有2nM脱氧核酶C。反应含有或缺少2×3mm的PES膜圆盘，并且在加热块上在2mL管中于50℃温育20分钟。在初始温育后，将样品从加热块转移并将样品短暂离心。使用磁架保留磁珠(未切割的底物酶G-MB和裂解的底物酶G-MB的MB-部分底物部分)，将45μL反应溶液的等分试样转移至96孔板(Bio-Rad)并与5μL底物F(0.2μM终浓度)混合。丢弃PES膜。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自德克萨斯红通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行150个循环。所有反应均一式两份进行，结果如图17所示。
在该实验中，将PES膜添加到脱氧核酶切割底物酶-MB的反应中似乎增强脱氧核酶活性。与缺乏膜的反应相比，观察到含有PES膜的反应的荧光随时间的快速增加。这表明荧光底物在从磁珠表面释放后通过脱氧核酶更快地裂解。
实施例13：替代T袋膜材料的演示
在该实验中，使用图15中概述的策略来确定使用聚醚砜(PES)作为用于构造T袋的替代半透膜材料的T袋概念的一般性。此外，目的是使用PES膜确定底物酶-MB容纳、脱氧核酶扩散和表面结合脱氧核酶的释放是否可能。如实施例1的附着方法2中所述，将PB(底物酶F)连接到磁珠(底物酶F-MB)上。根据图3B中描绘的图使用PES膜手动制备T袋，并使用各种膜孔径(0.65μm、0.8μm和1.2μm)进行反应。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PB(底物酶F)(SEQ ID NO：6)、底物E(SEQ ID NO：33)和脱氧核酶A(SEQ ID NO：28)。序列列于序列表中。
反应在60μl终体积中含有1X PCR缓冲液II、45mM MgCl2。反应包含由含有0.6μL底物酶F-MB的PES材料(0.65μm、0.8μm或1.2μm)制成的1×T袋。反应含有或缺少2nM脱氧核酶A。反应物在加热块上在2mL管中于50℃温育20分钟。在初始温育后，将样品从加热块转移并将样品短暂离心。将48μL等份的反应溶液转移至96孔板(Bio-Rad)并与2μL底物E(0.2μM终浓度)混合。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自德克萨斯红通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行150个循环。
图18A-C中显示的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值，并且在不存在起始脱氧核酶A的情况下显示可忽略的信号。这表明底物酶不能通过PES膜扩散，同时拴系到磁珠(Dynabeads M270 2.8μm)。在起始脱氧核酶A存在时存在强信号，表明起始脱氧核酶可以扩散到由PES膜制成的T袋中，然后切割底物酶并释放表面结合的脱氧核酶。它还表明释放的脱氧核酶能够扩散出PES T袋并切割荧光标记的底物分子。对于具有不同孔径(0.65μm、0.8μm和1.2μm)的膜，观察到类似的结果，表明孔径不是关键的，只要它小于底物酶-MB的直径即可。图18中显示的结果说明可替代的膜，例如PES，可用于将底物酶-MB与其他反应组分进行包封和物理分离。
实施例14：检测沙眼衣原体ompA基因同源物和脱靶标序列分析
在该实验中，图4中概述的策略用于在存在与沙眼衣原体ompA基因同源的合成寡核苷酸靶标的情况下检测靶标并扩增信号，证明该策略可以容易地适应于检测任何核酸靶标。第二个目的是分析脱靶标序列(与人基因同源的PPIA和p273基因)以检查反应的特异性。如实施例1的附着方法2中所述，将PA(底物酶H)和PB(底物酶I)连接到磁珠(底物酶H-MB和底物酶I-MB)上。根据图3B中所示的图，使用聚碳酸酯膜(0.8μm)手动制备T袋。获得的结果显示在图19中。参考图4，底物酶H是PA，底物酶I是PB，ompA部分酶A1和B1在ompA靶标上组装时形成起始MNA酶(Cat C)。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶H)(SEQ ID NO：8)、PB(底物酶I)(SEQID NO：9)、底物G(SEQ ID NO：36)、底物H(SEQ ID NO：37)、ompA部分酶Al(SEQ ID NO：38)、ompA部分酶B1(SEQ ID NO：39)、靶标ompA寡核苷酸2(SEQ ID NO：40)、脱靶标寡核苷酸p273(SEQ ID NO：41)和脱靶标寡核苷酸PPIA(SEQ ID NO：42)。序列列于序列表中。
反应含有5nM ompA部分酶A1、5nM ompA部分酶B1、1X PCR缓冲液II、0.5μL底物酶H-MB、含有0.5μL底物酶I-MB 1×T袋和45mM MgCl2，终体积为70μL。T袋由0.8μm孔径的聚碳酸酯膜制成。反应包含最终浓度为100fM、10fM和1fM的靶标ompA寡核苷酸2，或1nM的脱靶标寡核苷酸p273，或1nM脱靶标寡核苷酸PPIA，或缺乏靶标(无DNA对照)。将反应在50℃下在加热块上的2mL管中温育20分钟。在初始温育后，将样品从加热块转移并从管中取出T袋并丢弃。将样品短暂离心并将管置于磁架上以分离未切割的底物酶H-MB，并将裂解的部分底物H-MB片段与释放到溶液中的脱氧核酶切割。将48μL等份的上清液转移至96孔板(Bio-Rad)并与2μL含有等摩尔浓度的底物G和底物H(0.2μM终浓度)的底物混合物混合。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自FAM通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行150个循环。
图19中显示的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值，并描绘了寡核苷酸靶标的示例性滴定。图19中的结果说明了从含有100fM靶标ompA寡核苷酸2(黑线)、10fM靶标ompA寡核苷酸2(断点黑线)、1fM靶标ompA寡核苷酸2(小的黑色虚线)、1nMPPIA脱靶标(灰色虚线)、1nM p273脱靶标(灰色虚线)、约200,000份人基因组DNA(灰色实线)和无DNA(灰色双线)的反应获得的信号。图19中所示的五分钟实时监测相当于25分钟的总反应时间(即20分钟T袋孵育加上5分钟荧光底物裂解的实时监测)，并且表明检测100fM、10fM和1fM的ompA靶标所需的时间。在该实验中，该方案能够检测测试的最低浓度，即1mpM的ompA靶标。样品中ompA的总浓度相当于该基因的约4,200个拷贝(4.2×103个基因拷贝)。此外，添加高浓度的脱靶标控制(PPIA，p273和Hu gDNA)不会产生高于无靶标对照(无DNA)的信号，表明T袋信号放大反应具有高度特异性，并且仅在存在与匹配的靶标核酸序列(在该实施例中为ompA寡核苷酸2)形成的MNA酶的情况下触发。
这些结果与以下方案一致。在靶标寡核苷酸存在下，部分酶排列并形成活性起始MNA酶。MNA酶在溶液中切割底物酶H-MB，将8-17脱氧核酶与MB表面分开。随后“游离”8-17脱氧核酶可以通过T袋选择性渗透膜迁移，然后它可以裂解底物酶I-MB，从而导致10-23脱氧核酶从MB表面分离。然后10-23脱氧核酶自由迁移出T袋渗透膜进入溶液，在那里它可以裂解底物酶H-MB并继续级联。孵育一段时间后，磁铁可以将未切割的底物酶-MB和切割的部分底物-MB片段与切割的“游离”脱氧核酶分开。游离脱氧核酶(10：23和8:17)可以转移到含有荧光底物的第二反应室中，游离脱氧核酶可以切割底物并产生荧光信号。
实施例15：沙眼衣原体总核酸(TNA)样品中沙眼衣原体ompA基因的检测
在该实验中，图4中概述的策略用于检测靶标并扩增来自衣原体总核酸样品(TNA)中存在的沙眼衣原体ompA基因的信号，其使用实施例1中描述的培养和提取方法获得。如实施例1的附着方法2中所述，将底物酶H和底物酶I连接到磁珠(底物酶H-MB和底物酶I-MB)上。根据图3B中所示的图，使用聚碳酸酯膜(0.8μm)手动制备T袋。获得的结果显示在图20中。参考图4，底物酶H是PA，底物酶I是PB，ompA部分酶A1和B1在ompA靶标上组装时形成起始MNA酶Cat C。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶H)(SEQ ID NO：8)、PB(底物酶I)(SEQID NO：9)、底物G(SEQ ID NO：36)、底物H(SEQ ID NO：37)、ompA部分酶Al(SEQ ID NO：38)、ompA部分酶B1(SEQ ID NO：39)和靶标ompA寡核苷酸2(SEQ ID NO：40)。序列列于序列表中。
反应含有5nM ompA部分酶A1、5nM ompA部分酶B1、1X PCR缓冲液II、0.5μL底物酶H-MB、含有0.5μL底物酶I-MB的1×T袋和25mM MgCl2，终体积为70μL。T袋由0.8μm孔径的聚碳酸酯膜制成。反应缺乏DNA(无DNA对照)、或含有2fM靶标ompA寡核苷酸，或含有沙眼衣原体TNA，其是TNA在加入反应前在95℃热变性2分钟。将反应在50℃下在加热块上的2mL管中温育20分钟。
在初始温育后，将样品从加热块转移并从管中取出T袋并丢弃。将样品短暂离心并将管置于磁架上以分离未切割的底物酶H-MB，并将裂解的部分底物H-MB片段与释放到溶液中的脱氧核酶切割。将48μL等份的上清液转移至96孔板(Bio-Rad)并与2μL含有等摩尔浓度的底物G和底物H(0.2μM终浓度)的底物混合物混合。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自FAM通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行150个循环。
图20中显示的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值，并证明该方法能够检测来自沙眼衣原体总核酸(TNA)样品的沙眼衣原体ompA基因(实心黑线)。样品中ompA的总浓度对应于约3,500,000份拷贝的基因(3.5×106份基因拷贝)。该信号与无DNA对照(灰色实线)很好地区分，并产生类似于含有2fM合成靶标ompA寡核苷酸(黑色虚线)的反应的信号。
实施例16：在15分钟内快速检测ompA基因同源物
在该实验中，图4中概述的策略用于在存在与沙眼衣原体ompA基因同源的合成寡核苷酸靶标的情况下检测靶标并扩增信号。在此，将样品与T袋一起孵育仅12分钟，证明了核酸靶标的快速检测。如实施例1的附着方法2中所述，将PA(底物酶H)和PB(底物酶I)连接到磁珠(底物酶H-MB和底物酶I-MB)上。根据图3B中描绘的图，使用聚碳酸酯膜(0.8μm)手动制备T袋。获得的结果显示在图21中。参考图4，底物酶H是PA，底物酶I是PB，ompA部分酶Al和B1在ompA靶标上组装时形成起始MNA酶(Cat C)。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶H)(SEQ ID NO：8)、(PB)底物酶I(SEQID NO：9)、底物H(SEQ ID NO：37)、ompA部分酶A1(SEQ ID NO：38)、ompA部分酶Bl(SEQ IDNO：39)和目标ompA寡核苷酸2(SEQ ID NO：40)。序列列于序列表中。
反应含有5nM ompA部分酶A1、5nM ompA部分酶B1、1X PCR缓冲液II、0.5μl底物酶H-MB、含0.5μl的底物酶I-MB的1×T袋和25mM MgCl2，终体积为60μl。T袋由0.8μm孔径的聚碳酸酯膜制成。反应缺乏DNA(无DNA对照)，或含有500pM或2pM的靶标ompA寡核苷酸。将反应在50℃下在加热块上的2mL管中温育12分钟。
在初始温育后，将样品从加热块转移并从管中取出T袋并丢弃。将样品短暂离心并将管置于磁架上以分离未切割的底物酶H-MB，并将裂解的部分底物H-MB片段与释放到溶液中的脱氧核酶切割。将46μL等份的上清液转移至96孔板(Bio-Rad)并与4μL底物H(0.2μM终浓度)混合。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自FAM通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行150个循环。
图21中显示的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值，并证明该方法能够在较少的情况下检测500pM(灰线)和1pM(黑线)的合成靶标ompA寡核苷酸。总反应时间超过15分钟。图21中所示的三分钟实时监测是总反应时间为15分钟(即12分钟T袋孵育加上3分钟实时监测)的反应的最后阶段，并指示检测500pM和1pM的合成靶标ompA寡核苷酸。信号与无DNA对照(黑色虚线)完全不同。
实施例17：使用结合了脱氧核酶和部分酶的底物酶的交叉催化级联
在该实验中，图22中概述的策略用于在存在与沙眼衣原体ompA基因同源的合成寡核苷酸靶标的情况下检测靶标并扩增信号。在该实验中，如实施例1的附着方法2中所述，将底物酶J(PA)和底物酶K1(PB)连接到磁珠(底物酶J-MB和底物酶K1-MB)上。根据图3B中描绘的图，使用聚碳酸酯膜(0.8μm)手动制备T袋。起始MNA酶C(Cat C)包含ompA部分酶A1和B1(相当于图22中的C1和C2)和靶标ompA。获得的结果显示在图24中。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶J)(SEQ ID NO：10)、PB(底物酶K1)(SEQID NO：11)、PC(底物酶K2)(SEQ ID NO：12)、底物E(SEQ ID NO：33)、ompA部分酶A1(SEQ IDNO：38)、ompA部分酶B1(SEQ ID NO：39)、靶标ompA寡核苷酸2(SEQ ID NO：40)和AF-B3(反馈组装易化子)(SEQ ID NO：43)。序列列于序列表中。
反应含有50nM ompA部分酶Al、50nM ompA部分酶B1、1X PCR Buffer II、45mMMgCl2、2nM底物酶K2、2nM反馈组装易化子、0.6μL PA(底物酶J-MB)、含有0.6μL PB(底物酶K1-MB)的1×T袋，终体积为60μL。反应缺乏DNA(无DNA对照)、或含有2nM、200pM、50pM、10pM或1pM的靶标ompA寡核苷酸。将反应在50℃下在加热块上的2mL管中温育20分钟。
在初始温育后，将样品从加热块转移并从管中取出T袋并丢弃。将样品短暂离心并将管置于磁架上以分离未裂解的底物酶J-MB，裂解的部分底物J-MB片段和未裂解的底物酶K1-MB，从脱氧核酶和部分酶中释放到溶液中。将48μL等份的上清液转移至96孔板(Bio-Rad)并与2μL底物E(0.2μM终浓度)混合。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自德克萨斯红色通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行150个循环。
图24中显示的结果是重复的平均值，其通过使用Microsoft Excel(版本14)在5分钟时从荧光中减去0分钟处的荧光而绘制。结果表明该方法能够检测2nM、200pM、50pM、10pM和1pM的合成靶标ompA寡核苷酸。信号与无DNA对照有很好的区别。这些结果与以下方案一致。在靶标寡核苷酸存在下，部分酶排列并形成活性起始MNA酶。MNA酶在溶液中切割底物酶J-MB，将8-17脱氧核酶与MB表面分开。随后“游离”8-17脱氧核酶可以通过T袋选择性渗透膜迁移，其中它可以切割PB(底物酶K1-MB)内的Sub B，导致部分酶K1(Cat B1)从MB表面分离。然后，Cat B1可以自由地从T袋渗透膜迁移到溶液中，在那里它可以与游离的部分酶K1(CatB2)和反馈组装易化子(AF-B3)杂交，形成活性反馈MNA酶(Cat B)，它可以在PA(底物酶J-MB)内切割Sub A，从而继续反馈级联。孵育一段时间后，使用磁铁将未切割的底物酶-MB和切割的部分底物-MB片段与切割的“游离”脱氧核酶和部分酶分离。将游离脱氧核酶(Cat A)和部分酶(Cat B)转移到含有荧光底物的第二反应室中，其中游离脱氧核酶可裂解产生荧光信号。
实施例18：使用完全由8-17个组分组成的底物酶的交叉催化级联
该实验证明，完全由8-17个催化核酸组分组成的底物酶可用于使用底物酶和选择性渗透屏障执行交叉催化信号放大级联。图4中概述的策略通过使用起始Cat C(其为8-17脱氧核酶D)进行修饰，其中PA(底物酶L)和PB(底物酶M)包含通过可以交叉催化方式切割的底物序列连接的8:17脱氧核酶。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶L)(SEQ ID NO：44)、PB(底物酶M)(SEQID NO：45)、底物E(SEQ ID NO：33)和脱氧核酶D(SEQ ID NO：46)。序列列在序列表中。如实施例1的附着方法2中所述，将底物酶L和底物酶M连接到磁珠(底物酶L-MB和底物酶M-MB)上。根据图3B中所示的图，使用聚碳酸酯膜(0.8μm)手动制备T袋。获得的结果显示在图25中。
反应含有1×PCR缓冲液II、1.5倍浓度的底物酶L-MB、含有1.5倍浓度的底物酶M-MB的1×T袋和45mM MgCl2，终体积为60μL。反应缺乏起始DNA(无脱氧核酶对照)、或含有2nM、200pM或20pM的起始脱氧核酶(脱氧核酶D)。将反应在48℃下在加热块上的2mL管中温育60分钟。
在初始温育后，将样品从加热块转移并从管中取出T袋并丢弃。将样品短暂离心并将管置于磁架上以分离未切割的底物酶L-MB和切割的部分底物L-MB片段与释放到溶液中的脱氧核酶。将48μL等分试样的上清液转移到96孔板(Bio-Rad)中并与2μL底物E(0.2μM终浓度)混合。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自德克萨斯红通道的荧光，每隔10秒进行采集，在48℃的恒定温度下进行150个循环。
图25中显示的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值，并证明该方法能够检测2nM(实心黑线)、200pM(黑色断线)和20pM(黑色点状虚线)启动脱氧核酶。信号与无脱氧核酶对照(灰线)完全不同。
实施例19：替代珠子材料的示范
在该实验中，使用图15中概述的策略来确定使用二氧化硅珠(1μm孔径)作为用于构造T袋的替代珠材料的T袋概念的一般性。此外，目的是使用二氧化硅珠作为磁珠的替代物来确定底物酶包含、脱氧核酶扩散和表面结合的脱氧核酶的释放是否可能。如实施例1的附着方法2中所述，将PB(底物酶F)连接到1μm二氧化硅珠(底物酶F-Beads)上，然而，使用离心而不是磁架进行洗涤程序。每个洗涤步骤需要以10,000rpm离心二氧化硅珠粒溶液3分钟以沉淀珠粒，然后除去并弃去上清液。根据图3B中所示的图，使用聚碳酸酯膜(0.8μm孔径)或PES膜(0.8μm孔径)手动制备T袋。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PB(底物酶F)(SEQ ID NO：6)，底物E(SEQ ID NO：33)和脱氧核酶A(SEQ ID NO：28)。序列列于序列表中。
反应在60μl终体积中含有1X PCR缓冲液II、45mM MgCl2。反应包含由含有0.6μL底物酶F-SB的聚碳酸酯材料(0.8μm)或PES材料(0.8μm)制成的1×T袋。反应含有或缺少2nM脱氧核酶A。反应物在加热块上在2mL管中于50℃温育20分钟。在初始温育后，将样品从加热块转移并将样品短暂离心。将48μL等份的反应溶液转移至96孔板(Bio-Rad)并与2μL底物E(0.2μM终浓度)混合。将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自德克萨斯红通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行150个循环。
图26A和B中显示的结果是使用Microsoft Excel(版本14)绘制的重复的平均值，并且在没有起始脱氧核酶A的情况下显示可忽略的信号。这表明底物酶不能通过膜扩散而拴在二氧化硅上珠子(1μm直径)。在起始脱氧核酶A存在时存在强信号，表明起始脱氧核酶可以扩散到由聚碳酸酯或PES膜制成的T袋中，然后切割底物酶-SB并释放表面结合的脱氧核酶。它还表明释放的脱氧核酶能够扩散出T袋并切割荧光标记的底物分子。对于由不同材料(PES和聚碳酸酯)制成的膜，观察到类似的结果。结果表明，珠粒材料和膜材料可以由各种材料组成，只要珠粒大于膜孔的直径即可。图26中所示的结果说明了可替代的珠粒材料如二氧化硅可用于将底物酶与其它反应组分进行包封和物理分离。
实施例20：使用底物酶和具有终点检测的部分酶的交叉催化级联
在该实验中，图27中概述的策略用于在存在与沙眼衣原体ompA基因同源的合成寡核苷酸靶标的情况下检测靶标并扩增信号。在该实验中，PA(底物酶J)、PB(底物酶Kl)和PC(底物酶K2)如实施例1的附着方法2中所述附着于磁珠(底物酶J-MB，底物酶Kl-MB和底物酶K2-MB)。根据图3B中所示的图，使用聚碳酸酯膜(0.8μm)手动制备T袋。起始MNA酶C(Cat C)包含ompA部分酶A1和B1(相当于图27中的C1和C2)和靶标ompA。获得的结果显示在图28中。
对该实验特异的寡核苷酸包括：PA(底物酶J)(SEQ ID NO：10)、PB(底物酶K1)(SEQID NO：11)、PC(底物酶K2)(SEQ ID NO：12)、底物E(SEQ ID NO：33)、ompA部分酶A1(SEQ IDNO：38)、ompA部分酶B1(SEQ ID NO：39)、靶标ompA寡核苷酸2(SEQ ID NO：40)和AF-B3(反馈组装易化子)(SEQ ID NO：43)。序列列于序列表中。
T袋反应含有50nM ompA部分酶A1、50nM ompA部分酶B1、1X PCR缓冲液II、45mMMgCl2、2nM反馈组装易化子(AF-B3)、0.6μL PA(底物酶J-MB)、0.6μl PC(底物酶K2-MB)和含有0.6μL PB(底物酶K1-MB)的1×T袋，终体积为60μL。MNA酶对照反应含有50nM ompA部分酶A1、50nM ompA部分酶B1、1X PCR缓冲液II和45mM MgCl2，终体积为60mM。反应缺乏DNA(无DNA对照)、或含有500pM、200pM、100pM或50pM的靶标ompA寡核苷酸。将反应在50℃下在加热块上的2mL管中温育20分钟。
孵育后，将样品从加热块中取出并短暂离心。将等分试样(40μL)的溶液转移到96孔板(Bio-Rad)中，将板密封并短暂离心。在CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)中测量来自德克萨斯红色通道的荧光，每50秒进行采集，在50℃的恒定温度下进行5个循环。
图27中的结果表示为通过从每个样品反应的荧光中减去来自无靶标对照(NTC)反应的荧光而计算的归一化荧光值。使用Microsoft Excel(版本14)使用从重复反应计算的平均值和标准偏差绘制结果，每次反应测量五次。结果表明，图27中描绘的T袋方法能够检测500pM、200pM、100pM和50pM的合成靶标ompA寡核苷酸。信号与无目标控制很好地区分开来。使用MNA酶对照反应检测相同的目标浓度与没有目标对照的区别不大，表明图27中描绘的策略提供增强的信号放大。这些结果与以下方案一致。在靶标寡核苷酸存在下，部分酶对齐并形成活性起始MNA酶(Cat C)。Cat C在PA内切割Sub A，将Cat A与MB的表面分开。随后，Cat A可以通过T袋选择性渗透膜迁移，其中它可以切割PB内的Sub B，导致Cat B1与MB表面分离。然后，Cat Bl可以自由地从T袋渗透膜迁移到溶液中，在那里它可以与Cat B2和反馈组装易化子(AF-B3)杂交形成活性反馈MNA酶(Cat B)，其可以切割PA内的Sub A以继续反馈放大。结果还表明，除了启动反馈扩增外，Cat B和Cat C还可以同时切割Sub A-FQ以产生荧光，从而实时指示靶标的存在。
通过交叉引用并入
本申请要求2017年4月11日提交的澳大利亚临时申请号2017901321的优先权，其全部内容通过交叉引用并入本文。
Claims (59)
1.一种用于确定样品中存在靶标的方法，所述方法包括：
-提供反应混合物，所述反应混合物包含：
多核苷酸A群(PA)和多核苷酸B群(PB)，其中
每个PA多核苷酸包含催化核酸A和催化核酸底物A，
每个PB多核苷酸包含催化核酸B和催化核酸底物B，
所述催化核酸A能够催化性修饰所述催化核酸底物B，且
所述催化核酸B能够催化性修饰所述催化核酸底物A；
选择性可渗透屏障，其能够将所述PA与所述PB物理分离，其中所述PA和PB不能渗透所述选择性可渗透屏障，并且所述PA和/或PB在所述反应混合物中是可移动的；和
(iii)两种寡核苷酸，其各自能够与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A特异性杂交，并且至少一种寡核苷酸能够与靶标特异性杂交，从而形成能够切割所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A的催化核酸C；或者
(iv)催化酶D，其能够切割通过靶标与所述PA的杂交形成的核酸双链体的一条或多条链；
-接触：
(i)使所述PA、所述PB及所述寡核苷酸与所述样品接触，并使用所述选择性可渗透屏障将所述PA与所述PB分离，其中：
如果所述靶标存在于所述样品中，则所述两种寡核苷酸中的每一种与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A杂交，并且至少一种进一步与靶标杂交，从而形成切割所述PA多核苷酸的所述催化核酸C，从而释放所述PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；或者
(ii)使所述PA、所述PB及所述催化酶D与所述样品接触，并使用所述选择性可渗透屏障将所述PA与所述PB分离，其中：
如果所述靶标存在于所述样品中，则所述靶标与PA多核苷酸杂交形成包含所述催化酶D的识别和切割位点的所述核酸双链体，
所述催化酶D的所述切割位点不在所述催化核酸A内，并且
所述催化酶D在所述切割位点处结合并切割所述核酸双链体，释放所述PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
-其中：
释放的催化核酸A移动通过所述可渗透屏障，与PB多核苷酸的所述催化核酸底物B杂交，并切割所述PB多核苷酸，从而释放所述PB多核苷酸的所述催化核酸B，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
释放的催化核酸B移动通过所述可渗透屏障，与第二PA多核苷酸的所述催化核酸底物A杂交，并切割所述第二PA多核苷酸，从而释放所述第二PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
并且
检测到任何所述PA和/或PB多核苷酸的切割表明样品中存在靶标。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述催化核酸A不能催化性修饰催化核酸底物A，和/或
所述第二多核苷酸的所述催化核酸B不能催化性修饰所述催化核酸底物B。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述催化核酸C不能切割所述PB多核苷酸的所述催化核酸底物B。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在所述反应混合物多核苷酸中可移动的所述PA和/或PB的任一个包含：
附着的组分，和/或，
提供二级结构的自身互补区域，和/或
带电部分；
其防止所述多核苷酸渗透穿过所述选择性可渗透屏障。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述附着的组分是：
与配体杂交的适体，或
珠子(例如磁珠)，或
微粒，或
纳米粒子，或
带电部分。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中：
所述催化核酸底物A的所述切割从所述PA多核苷酸的所述催化核酸A释放所述附着的组分或所述自身互补区域，所述催化核酸A因此能够移动通过所述可渗透屏障，和/或
所述催化核酸底物B的所述切割从所述PB多核苷酸的所述催化核酸B释放所述附着的组分或所述自身互补区域，所述催化核酸B因此能够移动通过所述可渗透屏障。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述催化核酸A和/或所述催化核酸B是脱氧核酶或核酶。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中：
所述催化核酸A和/或所述催化核酸B选自由8-17脱氧核酶、10-23脱氧核酶、9-86脱氧核酶、12-91脱氧核酶、GR-5脱氧核酶、17E脱氧核酶、RFD-EC1脱氧核酶、F-8脱氧核酶、39-E脱氧核酶、E2脱氧核酶、Mg5脱氧核酶、A43脱氧核酶、DAB22脱氧核酶、PS2.M脱氧核酶、锤头状核酶、L-组氨酸依赖性脱氧核酶和HRP脱氧核酶组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中：
所述催化核酸A和所述催化核酸B各自是不同种类的脱氧核酶。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中：
(i)所述催化核酸A是10-23脱氧核酶，且所述催化核酸B是8-17脱氧核酶；和
所述催化核酸底物A是8-17脱氧核酶的底物，且所述催化核酸底物B是10-23脱氧核酶的底物；或者
(ii)所述催化核酸A是8-17脱氧核酶，且所述催化核酸B是10-23脱氧核酶；和
所述催化核酸底物A是10-23脱氧核酶的底物，且所述催化核酸底物B是8-17脱氧核酶的底物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中：
提供所述两种寡核苷酸，每种寡核苷酸能够与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A特异性地杂交，并且至少一种能够与所述靶标特异性杂交，从而形成能够切割所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A的所述催化核酸C；
所述靶标包括蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒，或其任何衍生物、部分或组合，或由以上组成；
所述催化核酸C包含能够与所述靶标结合的适体部分；
所述方法进一步包括使所述样品与抑制剂接触，所述抑制剂与所述适体杂交，从而使催化核酸C失活；
所述抑制剂对所述适体部分的结合亲和力低于所述靶标对所述适体部分的结合亲和力；并且
当存在于所述样品中时，所述靶标与所述适体结合，取代所述抑制剂并使所述催化核酸C具有活性，从而促进所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A的切割。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中：
所述催化核酸C是多组分核酸酶(MNA酶)，
并且
所述两种寡核苷酸是只有在所述靶标存在下能够自组装以形成所述MNA酶的两种部分酶寡核苷酸。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中：
所述催化核酸C是多组分核酸酶(MNA酶)，
所述两种寡核苷酸是只有在所述靶标存在下能够自组装以形成所述MNA酶的两种部分酶寡核苷酸，
所述靶标包含多核苷酸或由多核苷酸组成；并且
所述两种部分酶寡核苷酸各自在所述自组装期间与所述多核苷酸杂交以形成所述MNA酶。
14.根据权利要求12所述的方法，其中：
所述靶标包括蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒、或其任何衍生物、部分或组合，或由以上组成；
所述两种部分酶寡核苷酸中的至少一种包含能够与所述靶标特异性杂交的DNA、RNA或肽适体部分；
所述方法进一步包括使所述样品与MNA酶组装易化子寡核苷酸接触，所述组装易化子寡核苷酸促进所述两种部分酶寡核苷酸自组装成MNA酶，以及与抑制剂分子接触，所述抑制剂分子与适体杂交，使得所述MNA酶催化性失活；
所述抑制剂对所述适体部分的结合亲和力低于所述靶标对所述适体部分的结合亲和力；并且
所述靶标与所述适体部分杂交，除去所述抑制剂并使所述MNA酶具有催化性活性。
15.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中：
所述靶标是多核苷酸，
所述催化酶D是内切核酸酶或外切核酸酶。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中
所述催化核酸A从所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A的释放和/或所述催化核酸B从所述PB多核苷酸的所述催化核酸底物B的释放将荧光团与猝灭剂分离，从而提供信号以便于检测所述靶标。
17.根据权利要求1至16中任一项的方法，其中所述检测包括
从所述反应混合物中分离所述释放的催化核酸A和/或所述释放的催化核酸B；
在适合于通过所述催化核酸切割所述催化核酸底物的条件下，将所分离的催化核酸应用于包含催化核酸底物A和/或催化核酸底物B的第二反应混合物；和
检测通过所述催化核酸对所述催化核酸底物的切割。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述检测包括实时定量所述释放的催化核酸A和/或所述释放的催化核酸B。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，包括：
少于5个、少于6个、少于7个、少于8个、少于9个、少于10个、少于15个或少于20个的所述PA多核苷酸的切割，和/或
少于5个、少于6个、少于7个、少于8个、少于9个、少于10个、少于15个或少于20个的所述PB多核苷酸的切割，
以便于检测靶标。
20.一种用于确定样品中靶标的存在的方法，所述方法包括：
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：
(i)多核苷酸A群(PA)、多核苷酸B群(PB)和多核苷酸C群(PC)，
其中
每个PA多核苷酸包含催化核酸A和催化核酸底物A，
每个PB多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B1和催化核酸底物B，
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2，
其中：
所述部分酶寡核苷酸B1的底物臂能够与所述催化核酸底物A杂交，
所述部分酶寡核苷酸B2的底物臂能够与所述催化核酸底物A杂交，并且
所述催化核酸A能够催化性修饰所述催化核酸底物B；
(ii)组装易化子寡核苷酸，其能够与部分酶寡核苷酸B1的传感器臂和部分酶寡核苷酸B2的传感器臂杂交；
(iii)能够将所述PA与所述PB物理分离的选择性可渗透屏障，其中所述PA和所述PB不能渗透所述选择性可渗透屏障，所述PA、PB和PC在所述反应混合物中可移动；以及下列之一：
(iv)两个部分酶寡核苷酸C1和C2各自能够与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A特异性杂交，并且至少一个能够与所述靶标特异性杂交，从而形成能够切割所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A的催化核酸C；
或者
(v)能够切割通过所述靶标与所述PA杂交形成的核酸双链体的一条或多条链的催化酶D；
和
(b)接触：
(i)使所述部分酶寡核苷酸C1和C2与所述样品接触，并使用所述选择性可渗透屏障将所述PB与所述PA分离，其中：
如果所述靶标存在于所述样品中，则所述部分酶寡核苷酸C1和C2的每一种的底物臂与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A杂交，并且所述部分酶寡核苷酸C1和C2中的至少一种与所述靶标杂交形成所述催化核酸C，所述催化核酸C切割所述PA多核苷酸，从而释放所述PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
或者
(ii)使所述催化酶D与所述样品接触，并使用所述选择性可渗透屏障将所述PB与所述PA分离，其中：
如果所述靶标存在于所述样品中，则所述靶标与PA多核苷酸杂交形成包含所述催化酶D的识别和切割位点的核酸双链体，
所述催化酶D的切割位点不在所述催化核酸A内，并且
所述催化酶D在所述切割位点处结合并切割所述核酸双链体，释放所述PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
其中：
所述释放的催化核酸A移动通过所述可渗透屏障，与PB多核苷酸的所述催化核酸底物B杂交，并切割所述PB多核苷酸，从而释放所述PB多核苷酸的所述部分酶寡核苷酸B1，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
所述释放的部分酶寡核苷酸B1移动通过所述可渗透屏障，部分酶寡核苷酸B1和B2的每一种的传感器臂与所述组装易化子寡核苷酸杂交，并且部分酶寡核苷酸B1和B2的每一种的底物臂与第二PA多核苷酸的所述催化核酸底物A杂交，从而形成催化核酸B，所述催化核酸B切割所述第二PA多核苷酸，从而释放所述第二PA多核苷酸的所述催化核酸A，其因此能够移动通过所述可渗透屏障；
和
检测到任何所述PA和/或PB多核苷酸的切割表明所述样品中存在所述靶标。
21.根据权利要求20所述的方法，其中：
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2和能被催化核酸A切割的催化核酸底物B，
释放的催化核酸A切割所述PC多核苷酸，从而释放所述PC多核苷酸的所述部分酶寡核苷酸B2，和
检测到任何PC多核苷酸的切割表明所述样品中存在所述靶标。
22.根据权利要求20所述的方法，其中
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2和催化核酸底物A，和
如果所述靶标存在于所述样品中，则所述部分酶寡核苷酸C1和C2的每一种的底物臂与所述PC多核苷酸的所述催化核酸底物A杂交，并且所述部分酶寡核苷酸C1和C2的至少一种与所述靶标杂交形成所述催化核酸C，所述催化核酸C切割所述PC多核苷酸，从而释放所述PC多核苷酸的所述部分酶寡核苷酸B2。
23.根据权利要求20所述的方法，其中如果所述靶标存在于所述样品中，则所述靶标与PC多核苷酸杂交以形成所述核酸双链体，其包含所述催化酶D的识别和切割位点，
所述催化酶D的所述切割位点不在所述PC多核苷酸的所述催化核酸A内，以及
所述催化酶D在所述切割位点结合并切割所述核酸双链体，从而释放所述PC多核苷酸的所述部分酶寡核苷酸B2。
24.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中在所述反应混合物中可移动的所述PA、PB和/或PC多核苷酸的任一个包含：
附着的组分和/或，
提供二级结构的自我互补区域，和/或
带电部分；
其防止所述多核苷酸渗透穿过所述选择性可渗透屏障。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述附着的组分是：
与配体杂交的适体，或
珠子(例如磁珠)或微粒，
或纳米粒子，或带电部分。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中：
所述催化核酸底物A的切割从所述PA多核苷酸的所述催化核酸A释放所述附着的组分或所述自身互补区域，所述催化核酸A因此能够移动通过所述可渗透屏障，
和/或所述催化核酸底物B的切割从所述PB多核苷酸释放所述附着的组分或所述自身互补区域，所述PB多核苷酸因此能够移动通过所述可渗透屏障。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中：
所述催化核酸C是多组分核酸酶(MNA酶)，
和
所述两种寡核苷酸是两种部分酶寡核苷酸，其只有在所述靶标存在下能够自组装形成所述MNA酶。
28.根据权利要求27所述的方法，其中：
所述靶标包括蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒，或其任何衍生物、部分或组合，或由以上组成；
所述两种部分酶寡核苷酸中的至少一种包含能够与所述靶标特异性杂交的DNA、RNA或肽适体部分；
所述方法进一步包括使所述样品与MNA酶组装易化子寡核苷酸接触，促进所述两种部分酶寡核苷酸自组装成MNA酶，和与抑制剂分子接触，所述抑制剂分子与所述适体杂交，使所述MNA酶催化性失活；
所述抑制剂对所述适体部分的结合亲和力低于所述靶标对所述适体部分的结合亲和力；并且
所述靶标与所述适体部分杂交，除去所述抑制剂并使所述MNA酶具有催化性活性。
29.根据权利要求27所述的方法，其中：
所述靶标包含多核苷酸或由多核苷酸组成；以及
所述两个部分酶寡核苷酸各自在所述自组装期间与所述多核苷酸杂交以形成所述MNA酶。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中：
所述反应混合物还包含在所述反应混合物中可移动的所述催化核酸底物A的群，所述群的每个催化核酸底物A包含荧光团分子和猝灭剂分子；并且
所述催化核酸B和/或所述催化核酸C切割所述催化核酸底物A的群的成员，将所述荧光团与所述猝灭剂分离，从而提供便于检测所述靶标的信号。
31.一种用于检测样品中靶标的组合物，所述组合物包含：
多核苷酸A群(PA)和多核苷酸B群(PB)，其中
每个PA多核苷酸包含催化核酸A和催化核酸底物A，
每个PB多核苷酸包含催化核酸B和催化核酸底物B，
所述催化核酸A能够催化性修饰所述催化核酸底物B，且
所述催化核酸B能够催化性修饰所述催化核酸底物A，
能够将所述PA与所述PB分离的选择性可渗透屏障。
32.一种组合物，其包含：
(i)多核苷酸A群(PA)，多核苷酸B群(PB)和多核苷酸C群(PC)，其中
每个PA多核苷酸包含催化核酸A和催化核酸底物A，
每个PB多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B1和催化核酸底物B，
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2，
其中：
所述部分酶寡核苷酸B1的底物臂能够与所述催化核酸底物A杂交，
所述部分酶寡核苷酸B2的底物臂能够与所述催化核酸底物A杂交，并且
所述催化核酸A能够催化性修饰所述催化核酸底物B；
(ii)组装易化子寡核苷酸，其能够与部分酶寡核苷酸B1的传感器臂和部分酶寡核苷酸B2的传感器臂杂交；
(iii)能够将所述PA与所述PB物理分离的选择性可渗透屏障，其中所述PA和PB不能渗透所述选择性可渗透屏障，
其中，所述部分酶寡核苷酸B1底物臂和所述部分酶寡核苷酸B2底物臂与所述催化核酸底物A的杂交，以及所述部分酶寡核苷酸B1传感器臂和所述部分酶寡核苷酸B2传感器臂与所述组装易化子的杂交，形成催化核酸B，其能够切割所述催化核酸底物A。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中：
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2和能够被催化核酸A切割的所述催化核酸底物B；或者
每个PC多核苷酸包含部分酶寡核苷酸B2和所述催化核酸底物A。
34.根据权利要求31所述的组合物，其中所述PA和/或PB中的任一种包含：
附着的组分和/或，
提供二级结构的自我互补区域，和/或
带电部分；
其防止多核苷酸渗透穿过所述选择性可渗透屏障。
35.根据权利要求32或权利要求33所述的组合物，其中任何所述PC包含：
附着的组分和/或，
提供二级结构的自我互补区域，和/或
带电部分；
其防止所述多核苷酸渗透穿过所述选择性可渗透屏障。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的组合物，其中所述附着的组分是：
与配体杂交的适体，或
珠子(例如磁珠)，或
微粒，或
纳米粒子，或
带电部分。
37.根据权利要求31-36中任一项所述的组合物，其中：
所述催化核酸A不能催化性修饰催化核酸底物A，和/或
所述第二多核苷酸的所述催化核酸B不能催化性修饰所述催化核酸底物B。
38.根据权利要求31-37中任一项所述的组合物，其进一步包含两种寡核苷酸，每种寡核苷酸能够与PA多核苷酸的所述催化核酸底物A特异性杂交，并且至少一种寡核苷酸能够与所述靶标特异性杂交，从而形成催化核酸C，其能够切割所述PA多核苷酸的所述催化核酸底物A。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中：
所述催化核酸C是多组分核酸酶(MNA酶)，和
所述两种寡核苷酸是两种部分酶寡核苷酸，其只有在所述靶标存在下能够自组装形成所述MNA酶。
40.根据权利要求31至36中任一项所述的组合物，还包含：
催化酶D，其能够裂解通过所述靶标与所述PA杂交形成的核酸双链体的一条或多条链；
其中：
所述PA多核苷酸的至少一部分与所述靶标共享序列互补性，使其能够与所述靶标杂交以形成包含所述催化酶D的识别和切割位点的核酸双链体，和
所述催化酶D的所述切割位点不在所述PA多核苷酸的所述催化核酸A内。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中：
所述靶标是多核苷酸，
所述催化酶D是内切核酸酶或外切核酸酶。
42.根据权利要求38所述的组合物，其中所述靶标包含蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒，或其任何衍生物、部分或组合，或由以上组成；
所述催化核酸C包含能够与所述靶标结合的适体部分；
所述组合物还包含与所述适体杂交的抑制剂；并且
所述抑制剂对所述适体部分的结合亲和力低于所述靶标对所述适体部分的结合亲和力；
能够将所述PA与所述PB分离的选择性可渗透屏障。
43.根据权利要求38或39所述的组合物，其中：
所述靶标包含多核苷酸或由多核苷酸组成；和
只有在所述靶标存在下才能自组装形成所述MNA酶的所述两种部分酶寡核苷酸能够各自与所述靶标的多核苷酸和所述PA多核苷酸的所述催化核酸A底物杂交，从而自组装形成所述MNA酶。
44.根据权利要求39所述的组合物，其中：
所述靶标包括蛋白质、分析物、糖蛋白、脂质、脂蛋白、细胞、病毒、细菌、古细菌、真菌、抗体、代谢物、病原体、毒素、污染物、毒物、小分子、聚合物、金属离子、金属盐、朊病毒，或其任何衍生物、部分或组合，或由以上组成；
只有在所述靶标存在下能够自组装以形成所述MNA酶的所述两种部分酶寡核苷酸中的至少一种包含能够与所述靶标特异性杂交的DNA、RNA或肽适体部分；
所述组合物还包含MNA酶组装易化子寡核苷酸，只有在所述靶标存在下能够自组装以形成所述MNA酶的所述两种部分酶寡核苷酸可以各自杂交至所述MNA酶组装易化子寡核苷酸，促进所述MNA酶的自组装；
所述组合物还包含抑制剂分子，其可以与所述适体杂交，从而使所述MNA酶催化性失活；
所述抑制剂对所述适体部分的结合亲和力低于所述靶标对所述适体部分的结合亲和力；并且
所述靶标可以与所述适体部分杂交以除去所述抑制剂并使所述MNA酶具有催化性活性。
45.根据权利要求31-44中任一项所述的组合物，其进一步包含通过由所述催化核酸C和/或由所述催化核酸B切割所述PA多核苷酸而释放的催化核酸A。
46.根据权利要求31-45中任一项所述的组合物，其进一步包含通过由所述催化核酸A切割所述PB多核苷酸而释放的催化核酸B。
47.根据权利要求31-46中任一项所述的组合物，其中：
所述催化核酸A和/或所述催化核酸B是脱氧核酶或核酶。
48.根据权利要求31-47中任一项所述的组合物，其中：
所述催化核酸A和/或所述催化核酸B选自由8-17脱氧核酶、10-23脱氧核酶、9-86脱氧核酶、12-91脱氧核酶、GR-5脱氧核酶、17E脱氧核酶、RFD-EC1脱氧核酶、F-8脱氧核酶、39-E脱氧核酶、E2脱氧核酶、Mg5脱氧核酶、A43脱氧核酶、DAB22脱氧核酶、PS2.M脱氧核酶、锤头状核酶、L-组氨酸依赖性脱氧核酶和HRP脱氧核酶组成的组。
49.根据权利要求31-48中任一项所述的组合物，其中：
所述催化核酸A和所述催化核酸B各自是不同种类的脱氧核酶。
50.根据权利要求31-49中任一项所述的组合物，其中：
(i)所述催化核酸A是10-23脱氧核酶，所述催化核酸B是8-17脱氧核酶；和
所述催化核酸底物A是8-17脱氧核酶底物，所述催化核酸底物B是10-23脱氧核酶底物；或者
(ii)所述催化核酸A是8-17脱氧核酶，所述催化核酸B是10-23脱氧核酶；和
所述催化核酸底物A是10-23脱氧核酶底物，所述催化核酸底物B是8-17脱氧核酶底物。
51.根据权利要求31-50中任一项所述的组合物，其中所述PA和/或PB和/或PC在所述组合物中是可移动的。
52.根据权利要求31-51中任一项所述的组合物，其中所述PA多核苷酸和/或PB多核苷酸和/或所述PC多核苷酸各自包含荧光团和猝灭剂。
53.根据权利要求31-52中任一项所述的组合物，其进一步包含在所述组合物中可移动的所述催化核酸底物A的群，所述群的每个催化核酸底物A包含荧光团分子和猝灭剂分子，其中所述催化核酸B能够切割所述催化核酸底物A的群的成员，将所述荧光团与所述猝灭剂分离，从而提供便于检测所述靶标的信号。
54.根据权利要求38或39所述的组合物，其进一步包含在所述组合物中可移动的所述催化核酸底物A的群，所述群的每个催化核酸底物A包含荧光团分子和猝灭剂分子，其中所述催化核酸C能够切割所述催化核酸底物A的群的成员，将所述荧光团与所述猝灭剂分离，从而提供便于检测所述靶标的信号。
55.一种多核苷酸，其包含：
-催化核酸或其组分；
-催化核酸底物；
-以及以下的任何一个或多个：
(i)附着的组分，
(ii)提供二级结构的自我互补区域，
(iii)带电部分，
其能够防止所述多核苷酸渗透穿过选择性渗透屏障；
其中所述催化核酸不能催化性修饰所述催化核酸底物。
56.根据权利要求55所述的多核苷酸，其中所述附着的组分是：
与配体杂交的适体，或
珠子(例如磁珠)，或
微粒，或
纳米粒子，或
带电部分。
57.根据权利要求55或56所述的多核苷酸，其中所述催化核酸是脱氧核酶或核酶。
58.根据权利要求57所述的多核苷酸，其中所述脱氧核酶是10-23脱氧核酶或8-17脱氧核酶。
59.根据权利要求55或56所述的多核苷酸，其中所述其组分是MNA酶的部分酶寡核苷酸组分。
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