CN110437341A

CN110437341A - 一种具有红色荧光活性的检测蛋白及其应用

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Publication number: CN110437341A
Application number: CN201910766160.XA
Authority: CN
Inventors: 朱传刚; 沈元曦; 纪荣毅; 柴瑞; 林矫矫; 洪炀; 马以桐
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date: 2019-08-19
Filing date: 2019-08-19
Publication date: 2019-11-12
Anticipated expiration: 2039-08-19
Also published as: CN110437341B

Abstract

本发明提供一种具有红色荧光活性的检测蛋白及其应用，其特征在于所述检测蛋白包括链球菌蛋白G（SPG）片段和荧光蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为SPG的C3区段，所述荧光蛋白为优化后的红色荧光蛋白，所述检测蛋白具有荧光活性和与不同物种抗体结合的双重活性。本发明公开的检测蛋白，其可以广谱结合包括人及多种动物总IgG及不同亚类的IgG，与现有技术中的免疫球蛋白结合分子相比，它结合力也比现有的免疫球蛋白结合分子高。

Description

一种具有红色荧光活性的检测蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种具有红色荧光活性的检测蛋白及其应用。

背景技术

各种传染性疾病大范围的流行传播，对我国的国家安全和人口健康造成严重威胁。发展灵敏、准确的病原分析方法和检测技术对于相关疾病的快速诊断和及时治疗、生物恐怖和突发性公共卫生事件的有效防范和快速处置具有重要意义。经典的微生物分离鉴定麻烦费时，难以应用于致病微生物的现场快速检测；基于病原核酸的检测方法大多具有较高的检测灵敏度，但需要复杂的核酸抽提过程，而且容易出现假阳性；免疫学方法因基于抗体对病原的特异性识别作用而具有较好的特异性，同时操作简单，因此，广泛应用于临床和基础研究的各个领域。常规的免疫分析方法虽然能够实现快速检测，但由于该方法通常通过肉眼识别纳米金聚集显色，其灵敏度较低。针对于此，我们亟需开发一种快速、高灵敏的免疫检测方法。

链球菌蛋白G（SPG）是能与人及多种动物的抗体IgG结合的一种链球菌细胞壁蛋白，最早由Kronvall在1973年报道。A、C、G群链球菌的细胞壁及培养上清液中均含有该蛋白，SPG与葡萄球菌蛋白A（SPA）的特性明显不同。在1984年，Bjorck等人将这种蛋白统称为链球菌蛋白G，并对其进行了分离和纯化。目前，虽然SPA由于具有与抗体Fc端结合的特性，较为广泛的应用于免疫学实验中。然而，SPG与SPA相比，SPG与IgG的结合力更强，结合谱也更广（曹之舫，1989）。

SPG从N段开始，有三个同源结构区域A1、A2、A3，每个同源结构都由24个氨基酸组成，同时这三个同源结构被51个氨基酸组成的同源区域B1、B2隔开，接着是一个间隔的区域S，随后是55个氨基酸组成的同源结构区C1、C2、C3，它们之间又被D1和D2区所隔开，C3区之后为亲水区域W，最后为M区（Sjobring，1991）。有研究表明，SPG的三个同源的氨基酸序列C1、C2和C3区域与抗体IgG Fc端的结合相关，并且C1和C2区只有2个氨基酸序列不同，C1和C3区有6个氨基酸序列不同，并且C3区与抗体IgG的结合能力相当于C1区的7倍（Kobatake，1990）。而SPG的A、B区则具有与抗体Fab段结合以及与血清白蛋白结合的活性，被认为会起到干扰抗体与抗原的作用以及带来非特异性反应的问题。

红色荧光蛋白(Red fluorescent protein，RFP)是香菇珊瑚中分离的一种生物发光蛋白，它是一个由约248个氨基酸组成的蛋白质，RFP发射的荧光强度比最好的绿色荧光蛋白（GFP）突变体更高。具有较强的穿透力，且持续时间长的特点。DsRed2是源于野生型DsRed的一种人工突变基因，该突变基因的表达产物RFP2，蛋白结构与绿色荧光蛋白（GFP）相似。在自然光下就可以发射出红色荧光，是极具潜力的新的可视性报告基因。

红色荧光蛋白等标记抗体或G蛋白等活性物质的方法，涉及到化学偶联，偶联后提纯，透析，浓缩等繁琐步骤；而且由于本身生物大分子的特点，偶联的结合位点多样，不仅可能造成生物大分子的失活，而且影响稳定性。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏的免疫检测产品及方法，实现高效、高密度的免疫检测。

为了实现上述技术方案，本发明提供一种能高效的结合IgG的工具蛋白，将SPG基因的IgG结合片段进行重构，只保留蛋白G能与抗体IgG的Fc端特异性相结合的C3区，并连接RFP，制备的重组蛋白具有荧光活性和与不同物种抗体结合的双重活性。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有红色荧光活性的检测蛋白，包括链球菌蛋白G（SPG）片段和荧光蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为SPG的C3区段，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白；

优选的，其中SPG的C3区段的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。

其中优化后的红色荧光蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID NO.8所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

融合后的C3-RFP的核苷酸序列为如SEQ ID NO.10所示；氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示。

优选的，一种具有红色荧光活性的检测蛋白，所述检测蛋白的核苷酸序列为SEQID NO.5所示。

本发明同时提供一种具有红色荧光活性的检测蛋白的构建方法，所述方法为：

（1）根据C3片段的基因序列，从含有C3片段的菌液中PCR扩增出C3序列；

（2）通过PCR从含有RFP序列的菌液中扩增出RFP序列；

（3）先将扩增出的RFP序列双酶切后，连接到表达载体上，经鉴定后再将C3片段双酶切后连接上去，构建重组蛋白的原核表达质粒；

（4）将共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白；

（5）经破碎、纯化后制得融合蛋白C3-RFP

其中，步骤（1）中使用的引物对如SEQ ID NO.1、2所示；

步骤（2）中使用的引物对如SEQ ID NO.3、4所示；

上述方法中，融合蛋白基因的表达、纯化可采用本领域常规用于蛋白表达纯化的方法，例如将融合蛋白基因克隆入表达载体，将表达载体和/或共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白，经破碎、纯化后得到融合蛋白。其中，本发明对表达载体、共表达载体、表达宿主的种类和类别不作限定，可选用本领域常规用于遗传修饰的载体和宿主，具体的，表达载体可为pET-28、pET-32、pET-15或pET-11的等，共表达载体可为pCDFDuet-1等；表达宿主可选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。

本发明中，克隆可通过例如链式酶聚合反应(PCR)完成。

本发明同时提供一种用于免疫分析的产品，所述产品包括本发明所述的融合蛋白C3-RFP。

其中，产品的形式可为探针(传感器)、试纸条、芯片、试剂盒等，在使用时，将本发明所述的融合蛋白C3-RFP与其它现有的商业试剂(如酶标抗体、荧光标记抗体、显色剂、底物等)混合，可用于各种形式的免疫分析，例如抗体检测、抗体筛选、抗原检测、病原检测、蛋白检测、蛋白相互作用筛查、高通量靶标蛋白检测、蛋白-核酸相互作用分析、药物筛选等。

产品以试纸条的形式存在时，可将本发明复合物置于检测线，用于捕获目标分子，采用金标纳米粒子等进行检测；进一步的，当复合物融合不同的功能配体时，可实现多种目标分子的同时检测。

本发明中，免疫分析可为间接免疫、夹心免疫等方式，可用于各种形式的免疫分析，例如抗体检测、抗体筛选、抗原检测、病原检测、蛋白检测、蛋白相互作用筛查、高通量靶标蛋白检测、蛋白-核酸相互作用分析、药物筛选等。

有益效果

(1)本发明采用分子生物学的方法，重新构建了一个自然界不存在的新型双功能分子，重组的G蛋白与红色荧光蛋白C3-RFP，构建时不仅设计了连接片段保证两种活性不相互干扰，而且进行了密码子优化及纯化标签。该蛋白由于是通过原核表达获得，产量高，可以通过纯化标签进行亲和层析，纯度得到了保证。提纯的蛋白经过检测，具有与多物种IgG的结合活性，同时具有红色荧光活性。在应用到试纸条等检测中时，显示了该发明蛋白具有的高灵敏性。

(2) 本发明将SPG基因的IgG结合片段进行重构，只保留蛋白G能与抗体IgG的Fc端特异性相结合的C3区，并连接RFP，制备的重组蛋白具有荧光活性与与不同物种抗体结合的双重活性。

(3)本发明基于融合蛋白C3-RFP可高效、高密度的捕获目标分子，达到快速、高灵敏的检测。

(4)本发明的融合蛋白C3-RFP制备过程简单、易行，可适用于不同的免疫检测模式，如可用于间接ELISA、夹心ELISA等，尤其适用于液相中的免疫分析，仅仅是替换原有检测方法中的一种试剂，不改变原有操作步骤，不需要额外的设备和仪器。

附图说明

图1 SPG的结构示意图。

图2 对重组蛋白的原核表达质粒pET-28a（+）-C3-RFP，进行PCR鉴定（A）和双酶切鉴定（B），其中，

A：M：DNA标志物；1：质粒pET-28a（+）-C3-RFP经PCR，得到的C3序列，大小为165bp；2：质粒pET-28a（+）-C3-RFP经PCR，得到的RFP序列，大小为687bp；3：质粒pET-28a（+）-C3-RFP经PCR，得到的C3-RFP序列，大小为852bp

B：M：DNA标志物；1：质粒pET-28a（+）-C3-RFP经双酶切得到的C3-RFP序列，大小为852bp；2：质粒pET-28a（+）-C3-RFP经双酶切得到的RFP序列，大小为687bp。

图3 pET-28a（+）-C3-RFP表达蛋白的SDS-PAGE分析，其中，图A .SDS-PAGE分析pET-28a（+）-C3-RFP时相表达情况；图B .SDS-PAGE分析pET-28a（+）-C3-RFP蛋白纯化情况

A：M：蛋白标志物；0h：无IPTG诱导；1h-8h：IPTG诱导1h，2h，4h，6h，8h；

B：M：蛋白标志物；1：超声破碎沉淀物；2：超声破碎上清液；3：上样后；4：BindingBuffer；5：Wash Buffer；6：Strip Buffer。

图4 pET-28a（+）-C3-RFP表达情况诱导表达后的荧光活性观察，其中，0h：无IPTG诱导；1h-8h：IPTG诱导1h，2h，4h，6h，8h

图5 Western-blot分析pET-28a（+）-C3-RFP与IgG结合活力，其中，

A：M：蛋白标志物；1：重组蛋白与羊的结合活性；2：重组蛋白与驴的结合活性；3：重组蛋白与鼠的结合活性；4：重组蛋白与兔的结合活性

B：M：蛋白标志物；1：重组蛋白与His抗体的结合活性

图6 Elisa法分析pET-28a（+）-C3-RFP与多物种的IgG的亲和常数，其中，图A：Elisa法分析pET-28a（+）-C3-RFP与兔的IgG的亲和常数；图B：Elisa法分析pET-28a（+）-C3-RFP与驴的IgG的亲和常数；图C：Elisa法分析pET-28a（+）-C3-RFP与鼠的IgG的亲和常数；图D：Elisa法分析pET-28a（+）-C3-RFP与羊的IgG的亲和常数。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1重组蛋白G的构建

1.1 生物材料

大肠埃希氏杆菌BL21购自南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒pET-28a(+)为实验室保存，含有C3片段的菌液[1]、含有RFP序列的菌液[2]为实验室保存。

[1]许瑞,赵登云,洪炀,陆珂,李浩,林矫矫,冯金涛,徐玉梅,朱传刚.链球菌蛋白G的结构域重构、表达及鉴定[J].中国动物传染病学报,2015,23(05):46-52.

[2]康泽然. 单体红色荧光蛋白基因DsRed2的克隆、原核表达特性及其生物信息分析[D].延边大学,2016.

1.2 重组蛋白G基因序列的构建和合成

根据C3片段的基因序列，设计引物如表1所示，从含有C3片段的菌液中P出C3序列。同时，通过PCR从含有RFP序列的菌液中扩增出RFP序列先将扩增出的RFP序列双酶切后连接到pET-28a(+)上，经鉴定后再将C3片段经双酶切后连接上去，构建重组蛋白的原核表达质粒pET-28a（+）-C3-RFP。（C3片段PCR对应上下游引物：SEQ ID NO.1、2；RFP PCR对应上下游引物：SEQ ID NO.3、4；全片段PCR对应上下游引物：SEQ ID NO.1、4；C3片段双酶切：BamH1、EcoR1；RFP片段双酶切：EcoR1、Xhol1；全片段双酶切：BamH1、Xhol1）

表1 引物序列

注：划线部分为酶切位点

1.3 重组质粒鉴定

对合成后的基因序列进行PCR反应，反应体系如下：

将各组分混匀后，短暂离心置于PCR仪中进行反应，反应参数如下：

对PCR产物进行电泳鉴定；同时，对产物进行BamH1和Xho1双酶切鉴定（图2），电泳结果显示：目的基因全片段大小约为852bp；C3片段大小约为165bp，RFP片段大小约为687bp，与预测相同。同时对PCR产物进行测序鉴定，序列如序列表SEQ ID NO.5所示，测序鉴定结果显示与设计的序列一致。（C3片段对应上下游引物：SEQ ID NO.1、2；RFP对应上下游引物：SEQID NO.3、4；全片段对应上下游引物：SEQ ID NO.1、4）

实施例2重组蛋白G的表达和纯化

2.1 重组质粒的表达

时相

（1）将鉴定结果正确的pET-28a（+）-C3-RFP重组质粒分别转入BL21（DE3），并接种于5ml含Kan+的LB液体培养基中，置于37℃震荡培养箱中，250rpm震荡培养。

（2）（2）当生长至对数期（OD600约为0.6时），加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达。在诱导表达前、诱导表达后1h、2h、4h、6h、8h分别取0.5ml菌液，应用SDS-PAGE电泳分析最佳诱导时间。（图3A）

大量表达：

（1）将鉴定结果正确的pET-28a（+）-C3-RFP重组质粒分别转入BL21（DE3），并接种于150ml含Kan+的LB液体培养基中，置于37℃震荡培养箱中，250rpm震荡培养。

（2）当生长至对数期（OD600约为0.6时），加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达。将诱导8h后的菌液12000rpm离心20min弃上清，沉淀用20ml 1×PBS重悬，反复冻融三次后，冰浴超声破碎20min（超2s隔9s）后12000rpm离心15min，收集沉淀和上清。

（4）将离心后的沉淀用5ml 8mol 尿素重悬，重复上述离心步骤，收集上清。

（5）将超声后上清、沉淀重悬后上清，分别加入等体积蛋白电泳缓冲液，用SDS-PAGE电泳分析表达产物的可溶性。

2.2重组蛋白的纯化

使用Ni-NTA Hisbind Resin试剂盒（序列号：70666-3）对重组蛋白进行纯化，根据产品说明书进行操作，简易操作步骤如下：

（1）取5ml树脂加入新空柱中静置平衡，当液面降到树脂表面时，依次加入15ml ddH₂O，25ml 1×Charge Buffer，15ml 1×Binding Buffer溶液洗涤。

（2）当液面降到树脂表面时，加入超声破碎后的上清溶液，并重复上样3次，收集过柱后的溶液。

（3）依次加入50ml 1×Binding Buffer和30ml 1×Wash Buffer洗涤，分别收集过柱后的溶液。

（4）加入20ml 1×Stripe Buffer洗去Ni离子，收集过柱后的溶液。

（5）加入适量1×Stripe Buffer，保存树脂。

（6）将上述收集的溶液进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白纯化情况。

SDS-PAGE分析显示（图3），重组质粒pET-28a（+）-C3-RFP在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达，且1mmol/L IPTG诱导后1-6h表达量随着时间的增长而增加，诱导8h后表达量达到最高并趋于稳定。同时，SDS-PAGE分析显示，重组质粒pET-28a（+）-C3-RFP表达的蛋白在超声上清和沉淀中都有所表达，沉淀中的蛋白含量高于上清中的蛋白含量，表示该蛋白具有一定的水溶性，包涵体也同时存在。

实施例3 C3-RFP重组蛋白活性鉴定

3.1 荧光活性的观察

将上述时相中收集到的菌液，10000rpm离心5min，弃上清，加入200ul ddH₂O重悬菌体，重悬后，吸取10ul于干净载玻片上，盖上盖玻片，于荧光电子显微镜下用RFP激发光激发，观察菌体有无红色荧光。荧光电子显微镜观察显示（图4），重组质粒pET-28a（+）-C3-RFP在大肠杆菌BL21（DE3）中成功诱导表达后1-8h荧光随着时间的增长而增加，诱导8h后荧光达到最高并趋于稳定。

3.2 Western blotting检测重组蛋白与IgG的结合活性

（1）将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，之后将蛋白转移至NC膜上，130mA，75min。

（2）将NC膜浸泡于PBST稀释的5%脱脂奶粉中，室温封闭2h。

（3）将封闭后的NC膜用PBST洗涤三次，每次5min。

（4）将NC膜用HRP标记的山羊抗小鼠IgG，兔抗山羊IgG，小鼠抗兔IgG，驴抗山羊IgG，（用PBST 1:2000稀释）作为抗体，室温孵育1h。

（5）将孵育后的NC膜用PBST洗涤三次，每次10min。

（6）将NC膜用DAB双组份显色液试剂盒进行显色，显色后用流水冲洗，终止反应。

结果显示重组蛋白具有与驴，山羊，鼠，兔等IgG的结合能力（图5）

3.3 ELISA法测定重组蛋白与不同物种IgG亲和常数

（1）用BCA法测定重组蛋白的浓度，并用商品化的标准蛋白G（SPG）作为对照。

（2）用包被液将蛋白从10μg/ml开始进行倍比稀释，共进行8个稀释度，以100μl每孔包被于96孔板上，每个浓度设置3个重复，4℃包被过夜。

（3）将96孔板用PBST洗涤三次，200μl每孔，每次5min。

（4）加入用PBST稀释的5%脱脂奶粉的溶液，150μl每孔，37℃封闭2h。

（5）将96孔板用PBST洗涤三次，200μl每孔，每次5min。

（6）将HRP标记的山羊抗鼠、兔抗山羊、鼠抗兔、驴抗山羊这四种二抗，分别用PBST按1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1：8000进行倍比稀释，100μl每孔，37℃孵育2h。

（7）将96孔板用PBST洗涤三次，200μl每孔，每次5min。

（8）加入TMB进行显色，100μl每孔，室温反应15min。

（9）加入2mol/L H₂SO₄终止反应，30μl每孔，读取OD450值。

测得数据如表2所示，亲和曲线如图6所示。

表2 ELISA法测定重组蛋白与不同物种IgG亲和常数

K	C3-RFP
		兔	1.9*10<sup>5</sup>
驴	4.1*10<sup>5</sup>
		鼠	1.7*10<sup>5</sup>
羊	5.4*10<sup>5</sup>

结果显示本实验将SPG基因与红色荧光蛋白(RFP)基因片段进行重构。保留SPG中能与抗体IgG的Fc端特异性相结合的C3区，然后连接RFP基因片段，构建rSPG-RFP重组蛋白的原核表达质粒构建的原核表达质粒成功表达了重组蛋白rSPG-RFP。该重组蛋白同时具有SPG与不同物种IgG结合的能力以及RFP发射荧光的功能，是一种新型的双功能重组蛋白。

重组蛋白的荧光活性在细菌中已经逐步出现。一般认为蛋白的正确折叠是产生荧光的基础。细菌表达重组蛋白的初期，SDS-PAGE时相分析已经出现重组蛋白，但对应的荧光信号并不强，这可能是由于蛋白的折叠需要一个过程。通过分析重组蛋白的荧光特性，重组蛋白在表达4h时开始出现较强荧光，在8h荧光强度增强数倍，检测其在532nm激发光下，582nm反射光下荧光强度，与RFP没有明显差别，提示重组蛋白rSPG-RFP折叠正确，两段基因重组表达不影响其功能。

应当理解，虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明内容作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之进行一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120>一种具有红色荧光活性的检测蛋白及其应用

<160> 11

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<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> C区上游引物

<400>CGCGGATCCACCTACAAAC

<210>2

<211> 16

<212> DNA

<213> C区下游引物

<400>CCGGAATTCGCTACCG

<210>3

<211> 25

<212> DNA

<213> RFP区上游引物

<400>CCCGGAATTCGCCTCCTCCGAGAAC

<210>4

<211> 18

<212> DNA

<213> RFP区下游引物

<400>GGCCTCGAGCAGGAACAG

<210>5

<211> 891

<212> DNA

<213> 重组蛋白C3-RFP的核苷酸序列

<400>CGCGGATCCACCTACAAACTGGTGATCAACGGCAAAACTTTAAAAGGTGAGACCACCACAAAAGCAGTGGATGCCGAGACCGCACAGAAGGCCTTCAAGCAGTATGCCAACGACAATGGCGTGGATGGCGTGTGGACCTATGACGATGCCACCAAAACCTTCCGCGTGACAGAGGGCGGTGGTGGTAGTGGTGGTGGCGGTAGCGAATTCGCCTCCTCCGAGAACGTCATCACCGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCACCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCCACAACACCGTGAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGTGTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGCGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCTGCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCATCGGCGTGAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCCGCGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGACCCACAAGGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATCTACATGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCTACTACTACGTGGACGCCAAGCTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGCGCACCGAGGGCCGCCACCACCTGTTCCTGTAGCTCGAG

<210>6

<211> 165

<212> DNA

<213> SPG的C3片段的核苷酸序列

<400>ACTTACAAACTTGTTATTAATGGTAAAACGCTGAAGGGTGAAACCACCACCAAAGCGGTGGATGCCGAAACCGCGCAGAAGGCCTTTAAGCAGTACGCCAACGACAATGGCGT GGATGGTGTTTGGACCTACGACGACGCGACCAAAACCTTTCGTGTTACCGAA

<210>7

<211> 55

<212> protein

<213> SPG的C3片段的氨基酸序列

<400>TYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAQKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFRVTE

<210>8

<211> 678

<212>DNA

<213>RFP优化后核苷酸序列：

<400>GAA TTC GCC TCC TCC GAG AAC GTC ATC ACC GAG TTC ATG CGC TTC AAA GTGCGC ATG GAA GGC ACC GTG AAT GGC CAC GAG TTC GAG ATT GAA GGC GAA GGT GAA GGCCGC CCA TAC GAA GGC CAC AAC ACC GTG AAG CTG AAG GTG ACC AAA GGC GGT CCA CTGCCG TTC GCG TGG GAT ATT CTG AGC CCG CAG TTC CAG TAC GGC AGC AAG GTG TAC GTTAAG CAT CCG GCG GAC ATC CCG GAT TAC AAG AAG CTG AGC TTC CCG GAA GGC TTC AAATGG GAG CGC GTG ATG AAC TTC GAG GAC GGC GGC GTT GCC ACG GTT ACC CAA GAT AGTAGT CTG CAA GAT GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GGC GTG AAC TTC CCGAGC GAT GGC CCA GTG ATG CAG AAA AAG ACC ATG GGC TGG GAA GCG AGC ACC GAA CGTCTG TAC CCG CGC GAT GGT GTT CTG AAA GGC GAA ACG CAC AAG GCG CTG AAA CTG AAAGAC GGC GGC CAC TAC CTC GTG GAG TTC AAG AGC ATC TAC ATG GCC AAA AAG CCG GTGCAA CTG CCG GGC TAT TAC TAC GTG GAC GCC AAG CTG GAC ATC ACC AGC CAT AAC GAGGAC TAC ACG ATC GTG GAG CAG TAC GAA CGC ACC GAA GGT CGC CAC CAC CTG TTC CTG

<210>9

<211>226

<212>PROTEIN

<213>RFP氨基酸序列

<400>EFASSENVITEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVATVTQDSSLQDGCFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAKKPVQLPGYYYVDAKLDITSHNEDYTIVEQYERTEGRHHLFL

<210>10

<211> 888

<212> DNA

<213> C3-RFP核苷酸序列

<400>GGA TCC ACC TAC AAA CTG GTG ATC AAC GGC AAA ACT TTA AAA GGT GAG ACCACC ACA AAA GCA GTG GAT GCC GAG ACC GCA CAG AAG GCC TTC AAG CAG TAT GCC AACGAC AAT GGC GTG GAT GGC GTG TGG ACC TAT GAC GAT GCC ACC AAA ACC TTC CGC GTGACA GAG GGC GGT GGT GGT AGT GGT GGT GGC GGT AGC GAA TTC GCC TCC TCC GAG AACGTC ATC ACC GAG TTC ATG CGC TTC AAA GTG CGC ATG GAA GGC ACC GTG AAT GGC CACGAG TTC GAG ATT GAA GGC GAA GGT GAA GGC CGC CCA TAC GAA GGC CAC AAC ACC GTGAAG CTG AAG GTG ACC AAA GGC GGT CCA CTG CCG TTC GCG TGG GAT ATT CTG AGC CCGCAG TTC CAG TAC GGC AGC AAG GTG TAC GTT AAG CAT CCG GCG GAC ATC CCG GAT TACAAG AAG CTG AGC TTC CCG GAA GGC TTC AAA TGG GAG CGC GTG ATG AAC TTC GAG GACGGC GGC GTT GCC ACG GTT ACC CAA GAT AGT AGT CTG CAA GAT GGC TGC TTC ATC TACAAG GTG AAG TTC ATC GGC GTG AAC TTC CCG AGC GAT GGC CCA GTG ATG CAG AAA AAGACC ATG GGC TGG GAA GCG AGC ACC GAA CGT CTG TAC CCG CGC GAT GGT GTT CTG AAAGGC GAA ACG CAC AAG GCG CTG AAA CTG AAA GAC GGC GGC CAC TAC CTC GTG GAG TTCAAG AGC ATC TAC ATG GCC AAA AAG CCG GTG CAA CTG CCG GGC TAT TAC TAC GTG GACGCC AAG CTG GAC ATC ACC AGC CAT AAC GAG GAC TAC ACG ATC GTG GAG CAG TAC GAACGC ACC GAA GGT CGC CAC CAC CTG TTC CTG TAG CTC GAG

<210>11

<211> 295

<212> protein

<213>C3-RFP氨基酸序列：

<400>GSTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAQKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFRVTEGGGGSGGGGSEFASSENVITEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKVYVKHPADIPDYKKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVATVTQDSSLQDGCFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAKKPVQLPGYYYVDAKLDITSHNEDYTIVEQYERTEGRHHLFLLE

Claims

1.一种具有红色荧光活性的检测蛋白，其特征在于所述检测蛋白包括链球菌蛋白G（SPG）片段和荧光蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为SPG的C3区段，所述荧光蛋白为优化后的红色荧光蛋白，所述检测蛋白具有荧光活性和与不同物种抗体结合的双重活性。

2.如权利要求1所述的一种具有红色荧光活性的检测蛋白，其中SPG的C3区段的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；其中优化后的红色荧光蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID NO.8所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

3.如权利要求1所述的一种具有红色荧光活性的检测蛋白，所述检测蛋白C3-RFP的核苷酸序列为如SEQ ID NO.10所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.一种制备具有红色荧光活性的检测蛋白的构建方法，所述方法为：

根据C3片段的基因序列，从含有C3片段的菌液中PCR扩增出C3序列；

通过PCR从含有RFP序列的菌液中扩增出RFP序列；

先将扩增出的RFP序列双酶切后，连接到表达载体上，经鉴定后再将C3片段双酶切后连接上去，构建重组蛋白的原核表达质粒；

将共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白；

经破碎、纯化后制得融合蛋白C3-RFP

其中，步骤（1）中使用的引物对如SEQ ID NO.1、2所示；

步骤（2）中使用的引物对如SEQ ID NO.3、4所示。

5.如权利要求4所述的构建方法，其中所述的检测蛋白C3-RFP的核苷酸序列为如SEQID NO.10所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

6.如权利要求1所述的具有红色荧光活性的检测蛋白在抗体的体外免疫学检测中的应用。

7.如权利要求1所述的具有红色荧光活性的检测蛋白在纯化抗体中的应用。

8.如权利要求1所述的具有红色荧光活性的检测蛋白制备免疫分析产品的应用，所述应用为探针(传感器)、试纸条、芯片、试剂盒等，在使用时，将权利要求1所述的融合蛋白C3-RFP与其它现有的商业试剂(如酶标抗体、荧光标记抗体、显色剂、底物等)混合。