CN110382547A

CN110382547A - 抗凝血因子viii抗体及其用途

Info

Publication number: CN110382547A
Application number: CN201780077828.9A
Authority: CN
Inventors: 尹在承; 白光熙; 卞泰镐; 朴贞洙; 金智泰; 吴汉圭; 李宗玟
Original assignee: Expect Exhibition Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Expect Exhibition Bioisystech Co Ltd
Priority date: 2016-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2019-10-25
Anticipated expiration: 2037-12-14
Also published as: KR20180068884A; US20200277401A1; US11155635B2; KR101989779B1; CN110382547B

Abstract

本发明涉及特异性结合凝血因子VIII的抗体或其抗原结合片段，及其用途。更具体地，本发明涉及：特异性结合凝血因子VIII的抗体(其包括重链CDR和轻链CDR的特定序列)，或其抗原结合片段；一种柱子，其中该抗体或该其抗原结合片段(作为配体)与柱子固定相偶联用于分离或纯化重组凝血因子VIII；和使用该柱子纯化重组凝血因子VIII的方法。

Description

抗凝血因子VIII抗体及其用途

技术领域

本发明涉及特异性结合凝血因子VIII的抗体或其抗原结合片段，且涉及其用途。更具体地，本发明涉及特异性结合凝血因子VIII的抗体或其抗原结合片段(该抗体或其抗原结合片段包括重链CDR和轻链CDR，每个CDR均具有特定序列)，一种用于纯化重组凝血因子VIII的柱子(该柱子偶联(coupled)有该抗体或其抗原结合片段)，和使用该柱子分离或纯化重组凝血因子VIII的方法。

技术背景

使用通过各种构成组分(例如凝血因子I(纤维蛋白原)以及凝血因子II、III、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII和XIII(凝血因子的罗马数字并不指示顺序反应的顺序))的凝血级联形成稳定的(交联的)纤维蛋白的过程进行凝血(血液凝结)。当这些凝血因子中的即使一种缺乏时，由于不利的凝血，出血将会出现在人体内。由于此类血凝障碍，临床上可观察到的症状包括由于关节内溢血的关节畸形，由于肌肉内溢血的水肿，和颅内溢血。过量溢血(出血)可导致威胁生命的症状。

血友病(其是代表性血凝障碍)是遗传性X连锁隐性障碍且是由突变引起的罕见病。血友病分类为A型血友病(其是由凝血因子VIII(FVII)的缺乏引起的)和B型血友病(其是由凝血因子IX(FIX)的缺乏引起的)。此外，血友病可分类为轻度、中度和重度血友病，其取决于相关凝血因子的缺乏程度。据估计A型血友病在5,000个男性出生人口中出现约1个，且B型血友病在20,000个男性出生人口中出现约1个，且全世界有至少400,000名血友病患者。已经使用了用于外部施用用于血友病的按需和预防性治疗的缺乏的凝血因子的方法。缺乏的凝血因子的替代疗法可以延长血友病患者的预期寿命。

半个世纪以来，凝血因子VIII已从正常人的血浆中进行浓缩，分离和纯化，并已用于治疗A型血友病。然而，在20世纪80年代早期开始出现由施用血浆衍生的药物引起的出血性病毒(例如HIV和肝炎病毒(B和C型))感染的风险。出于此原因，自1988年以来，重组凝血因子VIII的使用(其消除出血性病毒感染的风险)已逐渐增加。

重组凝血因子VIII的分离和纯化通过一系列色谱分析步骤(如分离和纯化蛋白治疗剂的常规过程)进行。色谱分析法是使用两种互不相容的相分离靶物质的方法，例如，通过使其中该待分离的靶物质与各种物质一起溶解的流动相与另一相(即固定相)接触。在流动相流经填充有固定相的柱子时，样品混合物(其溶解在流动相)经受一系列与该固定相的相互作用。此类相互作用的行为取决于该样品混合物的成分(溶质)的物理或化学特性。每种组成成分的特性的差异引起与固定相相互作用强度的差异，并因此在流经填充有固定相的柱子的移动相的组合物的影响下导致每种溶质迁移速率的差异。取决于流动相的组成和流速进行分离的每种溶质以与固定相互相作用的强度相反的顺序洗脱。最微弱地保留在固定相的溶质首先从该柱子中洗脱，且最强力地保留在固定相的溶质最后洗脱。在洗脱样品组分期间，当由于一个组分(溶质)的洗脱时间与另一组分(溶质)的洗脱时间相似而分离组分是不利的时，可通过改变色谱分析条件(固定相和/或移动相)使得组分之间洗脱时间的差异足够长以便根据需要分离组分。因此，需要满足用于分离每种特定成分的最佳条件的固定相，且不断尽力设计它们。上述固定相通常由支撑物或基质(其与包含官能团(即连接基团)的配体附接)组成。色谱分析法可表征为各种类型的色谱分析法，每种色谱分析法基于所用的固定和流动相中样品组分的相互作用原理。此类色谱分析法的实例包括离子交换色谱分析法、亲水性相互作用色谱分析法和亲和色谱分析法。

其中，根据锁和钥匙识别原理，亲和色谱分析法基于靶生物分子和生物特异性配体之间的特异性相互作用。因此，靶标和配体由亲和对组成，例如抗原/抗体、酶/底物和配体/受体。蛋白A、蛋白G等是众所周知的用于基于蛋白的亲和色谱分析法(其是广泛用于分离和纯化蛋白的方法)的配体。众所周知的是蛋白A色谱分析法特别为单克隆抗体提供显著的特异性，且因此能够用于获得具有高纯度的单克隆抗体。

在这些技术背景下，本申请的发明人已开发了特异性结合凝血因子VIII的新型抗体，且已经发现通过将该抗体应用于重组凝血因子VIII的纯化，可以以高纯度纯化重组凝血因子VIII。基于此发现，本发明已经完成。

发明内容

技术问题

因此，鉴于上述问题，已进行了本发明，且本发明的一个目的是提供特异性结合凝血因子VIII的新型抗体或其抗原结合片段。

本发明的另一目的是提供编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，包含该多核苷酸的重组表达载体，包含该重组表达载体的宿主细胞和产生该抗体的方法。

本发明的另一目的是提供用于纯化重组凝血因子VIII的柱子(其中该柱子结合有该抗体或其抗原结合片段)，和使用该柱子分离或纯化重组凝血因子VIII的方法。

技术方案

依照本发明，上述目的和其他目的可通过提供特异性结合凝血因子VIII的抗体或其抗原结合片段完成，该抗体或其抗原结合片段包含：选自由SEQID NO:1至3组成的组的重链CDR；和选自由SEQ ID NOS:4至6组成的组的轻链CDR。

依照本发明的另一方面，提供了一种多核苷酸，其编码该抗体或其抗原结合片段。

依照本发明的另一方面，提供了一种重组表达载体，其包含该核苷酸。

依照本发明的另一方面，提供了一种宿主细胞，其用该重组表达载体转化。

依照本发明的另一方面，提供了一种生成抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括：培养该重组宿主细胞以生成抗体或其抗原结合片段和回收该产生的抗体或其抗原结合片段，随后分离和纯化。

依照本发明的另一方面，提供了用于分离或纯化重组凝血因子VIII的柱子，其中该柱子的固定相偶联有该抗体或其抗原结合片段。

依照本发明的另一方面，提供了一种纯化重组凝血因子VIII的方法，该方法包括在该柱子上装载含有重组凝血因子VIII的样品。

本发明的其他技术特征和实施方案将会在下列的本发明详述和权利要求书中更清楚的描述。

附图简述

从下列结合附图的详述中将会更清楚地理解本发明的上述目的和其他目的、特征和其他优势，其中：

图1显示通过基于等电点分离经纯化的抗体蛋白鉴定抗体的等电点的结果；

图2显示通过免疫印迹鉴定该经纯化的抗体蛋白的免疫学特征的结果；和

图3显示鉴定经纯化的抗FVIII抗体蛋白是否通过抗原-抗体相互作用特异性结合抗原性重组凝血因子FVIII的结果。

最佳实施方式

在一个方面中，本发明涉及特异性结合凝血因子VIII的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：选自由SEQ ID NO:1至3组成的组的重链CDR；和选自由SEQID NO:4至6组成的组的轻链CDR。

如本文所用的术语“抗体”意指包含特异性识别抗原并因此与特异性抗原免疫反应的免疫球蛋白分子的蛋白分子，且包含特异性结合凝血因子VIII的整个抗体以及该抗体分子的抗原结合片段。

整个抗体由两个全长轻链和两个全长重链组成，其中每个轻链通过二硫键与重链连接。在哺乳动物中，存在五种抗体同种型(称之为IgA、IgD、IgE、IgM和IgG)，且IgG进一步分类为四种抗体亚型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

如本文所用的术语“抗体片段”是指维持抗原结合能力的最小片段，且包含Fab、F(ab')、F(ab')₂和Fv。Fab包含重链和轻链中的每一种的可变区，轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)，每种恒定域具有抗原结合位点。Fab'与Fab的不同在于它进一步在重链的CH1域的C末端处包含至少一个半胱氨酸。F(ab')₂包含两个Fab'分子，该F(ab')₂在铰链区中的半胱氨酸残基之间具有二硫键。包含重链和轻链中的每一种的可变区的Fv(可变片段)是对亲本免疫球蛋白具有原始的特异性的最小抗体片段。二硫化稳定的Fv(dsFv)通过经由二硫键使轻链的可变区与重链的可变区结合形成。单链Fv(scFV)是其中重链和轻链的各自的可变区经由肽接头共价连接的Fv。这些抗体片段可通过用蛋白酶(例如，提供Fab或F(ab')₂的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)处理整个抗体获得，且优选使用基因重组技术构建。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体是FV(例如scFV)或完整抗体类型。此外，重链恒定区可选自γ、μ、α、δ和ε同种型。轻链恒定区可以是κ或λ型。

如本文所用的术语“重链”可解释成包含包含可变区域VH和三个恒定区域CH1、CH2和CH3的全长重链及其片段，该可变区域VH包含具有足以给予对抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。另外，如本文所用的术语“轻链”可解释成包含包含可变区域VL和恒定区域CL的全长轻链及其片段，该可变区域VL包含具有足以给予对抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。

通常，免疫球蛋白具有基本结构单元，该基本结构单元包含两个重链和两个轻链。每个重链包含一个可变区和三个恒定域，而每个轻链包含一个可变区和一个恒定域。重链和轻链中的每一个的可变区包含三个互补决定区(称之为“CDR”)和四个框架。CDR起到结合抗体的表位的作用。每个链上的CDR起始于N末端，且以CDR1、CDR2和CDR3的顺序排列。这些CDR通过它们所位于的链彼此区分。

根据本发明的抗体(例如)包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3，该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3。

此外，根据本发明的抗体可包括：选自由SEQ ID NO:7至10组成的组的重链可变区框架区(FR)；和选自由SEQ ID NO:11至14组成的组的轻链可变区框架区(FR)。

此外，根据本发明的抗体可包括SEQ ID NO:15的重链可变区和SEQ ID NO:16的轻链可变区，且可包括SEQ ID NO:17的重链和SEQ ID NO:18的轻链。

根据本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、整个抗体和抗体片段。此外，嵌合抗体(例如人源化小鼠抗体)，二价或双特异性分子(例如双特异性抗体)，双链抗体(diabody)，三链抗体(triabody)和四链抗体(tetrabody)属于本发明使用的抗体的范围。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指具有统一分子组成(其从基本上相同的抗体群中获得且对单个表位表现出结合特异性和亲和力)的抗体分子。

“人源化”型非人(例如鼠)抗体是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者高可变区的残基由来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供者抗体)(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高可变区的残基取代。

如本文所用的术语“人抗体”是指完全由人免疫球蛋白的所有组分(包括CDR、框架区等)的氨基酸序列组成的分子。人抗体在治疗人类疾病中具有至少三种潜在益处。首先，人抗体进一步优选与人免疫系统相互作用以通过(例如)补体依赖的细胞毒性(CDC)或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)介导更有效地破坏靶细胞。另一益处是，当人抗体施用至人体时，人免疫系统并不将人抗体识别为外源分子，使得由免疫复合物的形成(其在嵌合抗体或人源化抗体中出现)导致的不良反应可降低至最小第三，此类免疫复合物的形成可引起施用至人体的嵌合或人源化抗体制剂的缩短的半衰期，但是，人抗体的半衰期与那些天然衍生自人循环系统中的抗体相似，甚至当其以更低的量或以更低的频率施用时。

当根据本发明的抗体包括恒定域时，它可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合体或杂合体。

如本文所用的术语“组合体”意指编码单链免疫球蛋白Fc的具有相同来源的多肽片段与具有不同来源的单链多肽连接以便产生二聚体或多聚体。此类二聚体或多聚体可产自两种或多种选自由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的恒定域组成的组的恒定域。

如本文所用的术语“杂合体”意指编码两种或多种重链恒定域的具有不同来源的序列存在于单链免疫球蛋白重链恒定域。例如，域杂合体可由一至四种选自由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH1、CH2、CH3和CH4组成的组的域组成。此外，杂合体的组合体可从IgG亚型的重链恒定域形成，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。杂合体的组合体如以上定义的。

本发明的抗体或抗体片段可包括本文提及的抗凝血因子VIII抗体的序列以及其生物等同物，只要它满足特异性识别凝血因子VIII的标准。例如，可对该抗体的氨基酸序列进行另外的改变以便进一步提高该抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。此类修饰包括(例如)该抗体的氨基酸残基的缺失、插入和/或替代。此类氨基酸变化基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其亲水性(hydropathicity)、亲水性(hydrophilicity)、电荷和大小。通过分析氨基酸侧链的大小、形状和类型可以看到，所有精氨酸、赖氨酸和赖氨酸分类为碱性带正电荷残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸分类为相似且小的氨基酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸分类为具有芳香族侧链的氨基酸。因此，基于这些考虑，认为精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；和苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是生物学上功能等同物。

在引入突变中，可以考虑氨基酸的亲水指数。每种氨基酸根据其亲水性和电荷给出亲水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

氨基酸的亲水指数在给予蛋白的相互作用的生物学功能中是非常重要的。众所周知的是，需要用具有相似亲水指数的氨基酸替代，以便保持相似的生物学活性。当参照亲和指数引入突变时，替代是在具有亲水指数差异在±2内，更优选在±1内，且甚至更优选在0.5内的氨基酸之间进行的。

同时，还众所周知的是，具有相似亲合性值的氨基酸之间的替代形成具有等同的生物学活性的蛋白。如美国专利号4,554,101中所公开的，给出了针对各自氨基酸残基的下列亲合性值：精氨酸(+柱子3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。

蛋白中的氨基酸交换(其并不完全改变分子的活性)是本领域已知的(H.Neurath和R.L.Hill(Eds),“The Proteins”,美国学术出版社,纽约,1979)。最常见的交换是氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly之间的交换。

当考虑到具有生物学上等同活性的变化，根据本发明的抗体或编码该抗体的核苷酸分子解释成包括具有与序列号中陈述的序列基本上同一性的序列。术语“基本上同一性”意指具有至少61％的同源性，更优选70％的同源性的序列，甚至更优选80％的同源性，且最优选90％的同源性的序列，当本发明的序列与任何其他序列比对以便尽可能多地彼此对应，且使用本领域中常规使用的算法分析所比对的序列时。NCBI基本局部比对检索工具(BLAST)可从NCBI等进入，且可与互联网上的序列分析程序(诸如BLASTP、BLASM、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX)连同使用。BLAST可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得。使用此程序比较序列同源性的方法可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html找到。

在另一方面中，本发明涉及编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

通过分离编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，抗体或其抗原结合片段可重组产生。该多核苷酸经分离且插入至可复制载体中用于进一步克隆(扩增DNA)或进一步表达。基于此，在另一方面中，本发明涉及包括该多核苷酸的载体。

术语“核苷酸”旨在包含DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子二者，且核苷酸(其是基本组成单元)包括天然衍生的核苷酸以及类似物，其中糖或碱基部分是经修饰的。编码本发明的重和轻链可变区的多核苷酸的序列可以是变化的。此类变化包括核苷酸的添加、缺失或非保守性或保守性替代。

在一个实施方案中，本发明可以是编码SEQ ID NO:20的重链可变区的多核苷酸或编码SEQ ID NO:21的轻链可变区的多核苷酸。在另一实施方案中，本发明可以是编码SEQID NO:22的重链的多核苷酸或编码SEQ ID NO:23的轻链的多核苷酸。

本发明解释成包括与该核苷酸序列具有基本上同一性的核苷酸序列。具有基本上同一性的核苷酸序列意指具有至少80％同源性，更优选至少90％同源性，且最优选至少95％同源性的核苷酸序列，当将本发明的序列与任何其他序列比对以便尽可能多地彼此对应，且使用本领域常规使用的算法分析所比对的序列时。

编码该抗体的DNA可使用常规规程(例如，使用能够特异性结合编码该抗体的重和轻链的DNA的寡核苷酸探针)容易地分离或合。各种载体是可获得的。载体组成通常包括但不限于一种或多种下列组成：1)信号序列(信号肽)，2)复制起始点，3)一种或多种标记基因，4)增强子元件，和5)启动子和转录终止序列。

如本文所用的，术语“载体”是指一种在宿主细胞中表达靶基因的方式且包含质粒载体和粘粒载体，以及病毒载体，诸如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体(AAV)。该载体中编码该抗体的多核苷酸可操作地连接启动子。

术语“可操作地连接”意指表达调控序列(例如，启动子、信号序列或转录调节因子结合位点的排列)的多核苷酸和另一多核苷酸序列之间的功能连接，且受该多核苷酸序列的转录和/或翻译调控。

当原核细胞用作宿主时，该载体通常包括能够引导转录的强效启动子(诸如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子，或T7启动子)、用于起始翻译的核糖体结合位点，和转录/翻译终止序列。此外，例如，当真核细胞用作宿主时，该载体包括衍生自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子和人肌肉肌酸启动子)，或衍生自动物病毒的启动子，诸如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV tk启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV LTR启动子、莫洛尼启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子和劳斯氏肉瘤病毒，且通常具有多腺苷酸化序列作为转录终止序列。

任选地，该载体可与另一序列融合以便促进由其表达的抗体的纯化。待融合的序列包括(例如)谷胱甘肽S转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)、6x His(hexa组氨酸；Qiagen，USA)等。

该载体包括本领域中常用作可选择标记的耐抗生素基因，且其实例包括抵抗氨苄青霉素(ampicillin)、庆大霉素(gentamycin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、链霉素(streptomycin)、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)、新霉素(neomycin)和四环素(tetracycline)。

在另一方面中，本发明涉及用上述载体转化的细胞。用于产生本发明的抗体的细胞可以是原核生物、酵母或高等的真核细胞，但不限于此。

可使用原核宿主细胞，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏芸金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))、链霉菌属(Streptomyces spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)(例如恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)(例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus))。

对动物细胞的兴趣是最大的，且有用的宿主细胞系的实例包括但不限于COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S或HT1080。

在另一方面中，本发明涉及用于产生该抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：培养该重组宿主细胞以生成抗体或其抗原结合片段和回收该抗体或其抗原结合片段，随后分离和纯化。

该细胞可在各种培养基中培养。任何可商购的培养基可用作培养基而无限制。可以以适当的浓度包括本领域技术人员熟知的所有其他必须补充物。培养条件(诸如温度和pH)通常与选择用于表达的宿主细胞一起使用，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。

该抗体或其抗原结合片段的回收可(例如)通过去除杂质的离心或超滤或使用(例如)亲和色谱分析法纯化所得产物来进行。可使用其它另外的纯化技术(诸如阴离子或阳离子交换色谱分析法、疏水性相互作用色谱分析法和羟磷灰石(HA)色谱分析法)。

在另一方面中，本发明涉及用于分离或纯化重组凝血因子VIII的柱子，其中该抗体或其抗原结合片段结合该柱子。

“分离和纯化”是指一系列用于从存在于复杂混合物中的杂质中区分某种蛋白(例如凝血因子VIII)并去除其他杂质以提高纯度或质量的方法/过程。从存在于样品中的杂质中检测特异性结合该抗体的凝血因子VIII，这取决于与该柱子附接的抗凝血因子VIII抗体。该杂质可(例如)包括宿主细胞蛋白、宿主细胞残留物、细胞裂解物和蛋白、DNA、内毒素和用于细胞生长的培养因子。

如本文所用的术语“柱子”是指填充有用于使用靶蛋白的理化性质从复杂混合物中分离、检测或纯化靶蛋白(诸如重组凝血因子VIII)的色谱分析程序的固定相的设备。具体地，该靶蛋白可通过产生填充有固定相的柱子选择性地从混合物或杂质中分离，这取决于靶材料的亲合性或疏水性的程度、分子的势能、结合特定物质的可能性等。

该柱子可填充有对凝血因子VIII具有亲和力的固定相材料，且该固定相材料可以是(例如)树脂或琼脂糖珠子。如本发明的一个实施方案中所述的，产生一种柱子用于分离或纯化重组凝血因子VIII，该柱子填充有固定相，在该固定相中抗凝血因子VIII抗体(作为配体)连接琼脂糖凝胶(其是交联的琼脂糖珠子的形式的树脂)。

在另一方面中，本发明涉及纯化凝血因子VIII的方法，该方法包括允许含有重组凝血因子VIII的样品与连接该柱子的固定相的配体相互作用。

待装载至该柱子中的样品可以是(例如)细胞培养液体或发酵液，且当将该样品装载至该柱子中且纯化过程进行时，可去除除靶蛋白外的宿主细胞蛋白和宿主细胞残留物(例如，细胞裂解物和蛋白、DNA和内毒素)。

含有在样品中的重组凝血因子VIII通过抗原-抗体反应结合与柱子固定相连接的抗凝血因子VIII抗体。然后，结合凝血因子VIII抗体的重组凝血因子VIII可通过分离洗脱程序分离。洗脱液的组成和洗脱条件可设定成本领域技术人员可实施的条件，且可与合适的缓冲液或液体组合以提供流动相。

这允许分离和纯化基本上纯的重组凝血因子VIII。“基本上纯的”意指基本上去除除重组凝血因子VIII外的所有材料，有利的是约80％或更多，例如约95％或更多，即95至100％，例如，约98％或更多，即98至100％，优选的是约99％或更多，即99至100％，基于污染物的总量。可以基于应用到柱子上的样品中的重组凝血因子VIII的浓度和使用的其他条件来确定可能的纯度。

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对本领域技术人员显而易见的是提供这些实施例仅用于说明本发明且不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：杂交瘤的产生

通过从细胞培养溶液中分离并纯化来制备待用于接种疫苗(免疫)的重组凝血因子VIII蛋白以便产生重组凝血因子VIII蛋白(SEQ ID NO:19)的单克隆抗体。Balb/c小鼠用于免疫。

重组凝血因子VIII蛋白和抗原佐剂(弗氏完全佐剂)以等同量完全混合，且所得的混合物经腹腔内注射到该Balb/c小鼠中。25天后，重组凝血因子VIII蛋白和该抗原佐剂以等同量混合，该所得混合物进一步注射到该小鼠中，从该小鼠中收集血清，且进行另外的注射直至重组凝血因子VIII蛋白显示出极好的阳性反应。

在最后接种疫苗(免疫)后的第三天，从该小鼠中收集血清，且通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)鉴定血清中是否生成抗体。然后，打开每只小鼠的腹腔，取出并粉碎脾脏。根据已知方法(Galfre G.等人,Nature 266,550-552(1977)将粉碎的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。制备等同于1/5脾细胞的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞并与PEG1500混合，随后诱导融合反应。融合反应后，在含有HAT的选择性培养基中悬浮该细胞，并转移至96孔板以抑制位融合的细胞的生长。当融合的细胞充分生长时，同时用含有HAT的选择性培养基取代，通过对凝血因子VIII蛋白特异的ELISA进行分析，将显示阳性反应的细胞转移至新的平板，且然后在此进行培养。当细胞计数足够时，通过有限稀释进行单克隆产物细胞系选择。使用形成菌落的孔的培养液，通过ELISA选择33个显示阳性反应的克隆。在使用Biacore鉴定所选克隆的培养溶液对抗原的结合能力后，选择了两个克隆(3F6-2-5和5F4-9-1)，这两个克隆被认为是最适合用作纯化重组凝血因子VIII蛋白的抗体)。选择3F6-2-5(在该两个克隆中，其对抗原具有更好的的结合能力)作为针对重组凝血因子VIII蛋白的生成抗体的杂交瘤克隆。由该3F6-2-5克隆产生的抗体的同种型的分析结果显示重链是IgG1，且轻链是属于κ组的抗体。

实施例2：抗体基因获得

通过从产生针对FVIII的抗体的小鼠杂交瘤细胞(3F6-2-5)中提取RNA获得针对重组凝血因子VIII蛋白(FVIII)的抗体的重和轻链基因，随后进行RT-PCR。

为了获得重链基因，从3F6-2-5杂交瘤细胞中提取RNA并对其进行5’RACE。制备针对3’恒定区的GSP1(基因特异性引物)、GSP2和巢式引物，进行RACE PCR，所得PCR产物克隆至T载体中，且然后对该核苷酸序列分析。结果，鉴定5’区的包括信号序列的核苷酸序列。根据所鉴定的核苷酸序列产生引物且通过RT-PCR获得重链基因。

GSP1：5’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGT(SEQ ID NO:24)

GSP2：5’-CCTTGGCCCCAGAAGTGGTAA(SEQ ID NO:25)

巢式：5’-TAAATGCCAGTGTCTTCAGC(SEQ ID NO:26)

在鉴定该核苷酸序列后，构建引物以便包括5'-Nhe I和3'-Xho I限制性内切酶识别序列，以便将重链基因克隆至胚芽(Pangen)表达载体(pPGIX)中，且然后扩增插入至T载体中的重链基因。用Nhe I和Xho I限制性内切酶处理该PCR产物和表达载体，产生pPGIX-抗FVIII-HC，鉴定插入的重链基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:22)。

通过从3F6-2-5杂交瘤细胞中提取RNA并使用11种类型的5'引物和针对基于已知信号序列产生的3'恒定区的引物(MKCIII)进行RT-PCR获得轻链基因。

RT-PCR的结果在使用MKV7引物和3'-MKCIII引物的PCR产物中鉴定出包括轻链可变区和恒定区的700bp条带。将所获得的PCR产物克隆至T载体中，且然后鉴定该核苷酸序列。

MKV1：5’-GCT AGC GCC ACC ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTG(SEQID NO:27)

MKV2：5’-GCT AGC GCC ACC ATG GAG WCA GAC ACA CTC CTG YTA TGG GTG(SEQID NO:28)

MKV3：5’-GCT AGC GCC ACC ATG AGT GTG CTC ACT CAG GTC CTG GSG TTG(SEQID NO:29)

MKV4：5’-GCT AGC GCC ACC ATG AGG RCC CCT GCT CAG WTT YTT GGM WTC(SEQID NO:30)

MKV5：5’-GCT AGC GCC ACC ATG GAT TTW CAG GTG CAG ATT WTC AGC TTC(SEQID NO:31)

MKV6：5’-GCT AGC GCC ACC ATG AGG TKC YYT GYT SAG YTY CTG RGG(SEQ IDNO:32)

MKV7：5’-GCT AGC GCC ACC ATG GGC WTC AAG ATG GAG TCA CAK WYY CWG G(SEQID NO:33)

MKV8：5’-GCT AGC GCC ACC ATG TGG GGA YCT KTT TYC MMT TTT TCA ATT G(SEQID NO:34)

MKV9：5’-GCT AGC GCC ACC ATG GTR TCC WCA SCT CAG TTC CTT G(SEQ ID NO:35)

MKV10：5’-GCT AGC GCC ACC ATG TAT ATA TGT TTG TTG TCT ATT TCT(SEQ IDNO:36)

MKV11：5’-GCT AGC GCC ACC ATG GAA GCC CCA GCT CAG CTT CTC TTC C(SEQ IDNO:37)

MKCIII：5’-CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GCT C(SEQ ID NO:38)

在鉴定该核苷酸序列后，制备引物以便包括5'-Nhe I和3'-Xho I限制性内切酶识别序列，以便将轻链基因克隆至胚芽氏(Pangen’s)表达载体(pPGIX)，且然后使用PCR扩增插入至T载体的轻链基因。用Nhe I和Xho I限制性内切酶处理该PCR产物和表达载体，且然后进行连接以产生pPGIX-抗FVIII-LC，且然后鉴定插入的轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:23)。将插入至表达质粒中的重和轻链基因(pPGIX-抗FVIII-HC和pPGIX-抗FVIII-LC)转移至胚芽氏表达载体(pPGX)，且用于转染以便开发具有较高表达效率的细胞系。用Nhe I和Xho I限制性内切酶处理pPGX-抗FVIII-HC和pPGX-抗FVIII-LC质粒DNA，且然后与用相同限制性内切酶处理的pPGX连接，以分别构建pPGX-抗FVIII-HC和pPGX-抗FVIII-LC质粒DNA。

实施例3：CHO细胞表达

在24个孔中进行该表达质粒转染CHO DG44宿主细胞系，且同时通过电转转染pPGX-抗FVIII-HC、pPGX-抗FVIII-LC和pDCH1P(dhfr)。当该细胞在37℃，5％CO₂培养箱中进行培养后完全生长后，在选择性培养基中培养该细胞以便仅使经转化的细胞生长。大约两周后，当该细胞充分生长时，去除部分培养上清液，且通过ELISA分析选择表达抗FVIII抗体的细胞组。为了选择具有高表达效率的细胞系，通过选择5种细胞系(ADBA1001、ADBA1003、ADBA1011、ADBA1013、ADBA1014)(其基于ELISA分析的结果)进行单一细胞选择。将细胞以1个细胞/孔的密度接种于96孔板的培养基中，且对约4周后形成的菌落分析以选择具有高表达效率的细胞系，且培养该细胞系。当获得足够数目的细胞时，通过ELISA比较分析单克隆细胞系的表达效率。选择了六种具有高生产效率的单克隆细胞系(ADBA1003-22、ADBA1011-19、ADBA1013-14、ADBA1013-27、ADBA1014-11、ADBA1014-69)作为候选细胞系。

鉴定了六种具有高抗体生产力的单克隆细胞系，以在90天的长期传代培养期间稳定表达抗体蛋白。其间，选择具有最高抗体生产力的ADBA1013-14细胞系作为最终的细胞系。鉴定出由其产生的抗体具有表1所示的序列。

表1

实施例4：抗体纯化

使用ADABA1013-14细胞系的培养液分离和纯化抗体蛋白。使用填充有蛋白A树脂的柱子进行亲和色谱分析法。将柱子安装于AKTA纯净系统中(GE healthcare)，并用20mM磷酸钠和150mM氯化钠(pH 7.4)的平衡缓冲液平衡，且将培养液装载于其上。然后，洗涤该柱子且仅用20mM柠檬酸钠(pH 3.5)作为洗脱缓冲液洗脱抗体蛋白。对于洗脱的蛋白级分的病毒灭活，用1N HCl将该洗出液的pH降低至3.5，和该洗出液在室温反应180分钟。

病毒灭活后，用四倍的注射用水的体积稀释该洗出液，并对该洗出液进行Q琼脂糖凝胶柱子色谱分析。将柱子安装于AKTA纯净系统中(GE healthcare)，用4mM柠檬酸和10mM磷酸钠的平衡缓冲液平衡，且将样品装载于其上。在样品装载期间收集流穿物(流出物)，通过0.22μm PES膜过滤，并对其进行纳滤。

实施例5：纯化的抗体的表征

1.N-糖基化位点测定

使用肽图分析鉴定该纯化的抗体蛋白的N-糖基化位点。

使用三氯乙酸沉淀方法对该纯化的抗体蛋白进行脱盐和浓缩。通过用胰蛋白酶和胰蛋白酶/PNGase F处理，随后用DTT和碘乙酰胺处理对所获得样品进行还原和烷基化。使用用PNGase F处理前和处理后的样品通过LC-MS/MS肽测序分析的糖基化的天冬酰胺氨基酸位点分析结果显示糖与重链的第288位精氨酸结合。

2.等电点(pI)的鉴定(等电聚焦)

根据等电点(pI)分离纯化的抗体蛋白以测定该抗体的等电点。

将20μg的IEF标记物(pI 3-10)和该纯化的抗体蛋白装载至 pH 3-7IEF凝胶上，且分别以100V、200V和500V的电压进行电泳1小时、1小时和30分钟。将该凝胶在12％TCA(三氯乙酸)中固定30分钟，用超纯水洗涤三次10分钟，并处理直至用GelCode蓝染色试剂染色充分。染色完成后，用超纯水洗涤该抗体，用肉眼鉴定pI条带，且使用Gel DocXR+成像器分析pI值。

使用Gel Doc XR+成像器分析IEF条带的pI。结果，发现该纯化的抗体蛋白的pI为6.2至6.8(图1)。

3.完整分子量测定

通过测定该纯化的抗体蛋白的分子量鉴定该蛋白的一维结构。

将稀释至1mg/mL的该纯化的抗体蛋白用1M DTT溶液处理，终浓度为20mM，并在室温反应40分钟，且使用LC-MS测定重链/轻链的分子量。

将在HPLC期间分离的肽与Q-TOF MS的ESI源相连，以测定肽离子的质量值。分子量使用数据分析软件进行测定，并通过使用最大熵法的去卷积进行分析。

发现该纯化的抗体蛋白的天然形式的分子量为147,859至148,394Da。这比理论抗体蛋白的分子量(不包括糖的分子量)高约3,000Da，其认为是与两条重链结合的糖的分子量的平均值。轻链的分子量经测定为24,323Da(±2Da)，其与理论抗体蛋白的轻链分子量完全相同。重链的主要分子量经检测为49,715Da。这相较于理论重链的分子量，增加了1,300Da，其认为是由于与重链的Asn 288结合的糖的分子量。

4.免疫印迹

分析通过抗原-抗体反应的该纯化的抗体蛋白的免疫学特性。

将该纯化的抗体蛋白稀释至1mg/mL，制备1、3和5μg的该稀释液，且将PBS添加至此，最终体积为10μL。在2.5μL的5X非还原的样品缓冲液与2.5μL的5X还原的样品缓冲液混合后，在还原条件下通过在95℃或更高煮沸10分钟并在冰上冷却5分钟制备该样品。将该制备的样品上样于10％SDS-PAGE凝胶上，且然后对其进行电泳，在80V 30分钟和在100V 1小时30分钟。在跑完电泳后，将细胞转移至硝酸纤维素膜并用5％脱脂牛奶封闭1小时。封闭后，将稀释至1:1,000的山羊抗小鼠IgG，AP缀合物在室温处理2小时，且然后用1X TBST洗涤10分钟三次。洗涤后，用NBT/BCIP处理该膜用于蛋白质检测以诱导显色。在观察到充分显色后，通过用流水洗涤来终止该反应。

作为免疫印迹的结果，在还原条件下，轻链经检测在约25kDa处且重链经检测在约50kDa处，且在非还原条件下，该抗体蛋白经检测在约150kDa处(图2)。因此，鉴定出该纯化的抗体蛋白(小鼠IgG)特异性结合抗小鼠IgG抗体。

5.特异性结合FVIII的鉴定

通过抗原-抗体反应鉴定该纯化的抗FVIII抗体蛋白是否特异性结合抗原(重组凝血因子FVIII)。

制备稀释至0.02mg/mL的200和400ng的重组凝血因子FVIII，且将PBS添加至此以实现最终体积为20μL。将所得的混合物与5μL的5X还原的样品缓冲液混合，在95℃或更高的温度煮沸10分钟并在冰上冷却5分钟以制备样品。将所制备的样品上样于7.5％凝胶中，且然后对其进行电泳，在80V 30分钟和在100V 1小时30分钟。在跑完电泳后，将该细胞转移至硝酸纤维素膜并用5％脱脂牛奶封闭1小时。封闭后，将稀释至1:1,000的该纯化的抗体蛋白(小鼠IgG)在4℃过夜处理，且然后用1X TBST洗涤10分钟三次。洗涤后，稀释至1:5,000的第二抗体(山羊抗小鼠IgG，AP缀合物)在室温反应2小时，且然后用1X TBST洗涤三次10分钟。用NBT/BCIP处理该膜以诱导显色用于蛋白检测。在观察到充分显色后，通过用流水洗涤来终止该反应。

作为免疫印迹的结果，如附图中所示，在对应于凝血因子FVIII的重链的90kDa附近检测到条带，其意味着该纯化的抗体蛋白特异性结合凝血因子FVIII(图3)。

6.抗体结合亲和力(SPR)

通过SPR(表面等离子体共振)方法测量该纯化的抗体蛋白和重组凝血因子FVIII蛋白之间的通过抗原-抗体反应的动力学亲和力(Ka、Kd、KD)。

将CM5芯片安装于Biacore T200仪器上，且将作为配体的重组凝血因子FVIII蛋白在10mM乙酸钠缓冲液中(pH 5.0)稀释并注射进样品通道中达10分钟用于固定化。通过用缓冲液稀释来制备浓度为2μM的该纯化的抗体蛋白(作为分析物)，且然后连续稀释至十种浓度(0.0039、0.0078、0.015、0.031、0.062、0.125、0.25、0.5、1、2μM)。结合和解离时间分别设定为3分钟和4分钟，并测量结合和解离。

BIA评价分析软件用于分析该纯化的抗体蛋白和重组凝血因子FVIII蛋白的动力学亲和力。通过将10中浓度的结合/解离数据应用于1:1动力学结合模型计算结合力、解离力和解离常数如下。

作为SPR测试的结果，该纯化的抗体蛋白对重组凝血因子FVIII蛋白的KD值经分析和测定为5.53E^-08M。

表2

实施例6：用于抗原纯化的柱子的产生

使用该纯化的抗体制备Mab凝胶以产生用于纯化重组凝血因子FVIII蛋白作为血友病药物的柱子。

用偶联缓冲溶液(碳酸氢钠、磷酸钠，pH 8.3)交换该纯化的抗体，用于与CNBr活化的琼脂糖凝胶4B树脂偶联。

将该CNBr活化的琼脂糖凝胶4B树脂通过用1N HCl膨胀来转化成浆液，与用偶联缓冲液交换的抗体混合，并在室温反应2小时。在用具有低pH的洗涤溶液和具有高pH的洗涤溶液交替洗涤树脂之后，完成Mab凝胶的制备。

实施例7：抗原-抗体结合的鉴定

为了鉴定所制备的Mab凝胶与重组凝血因子FVIII蛋白的结合能力，使用重组凝血因子FVIII蛋白的培养溶液进行性能测试。在用平衡缓冲液平衡Mab凝胶填充的柱子后，装载含有5000IU的重组FVIII蛋白的培养液。用洗涤缓冲液去除非特异性结合蛋白，且然后洗脱蛋白。

通过生色测定法定量分析重组FVIII培养液、洗脱液和流穿物。作为该分析的结果，确定了大约85％的重组FVIII蛋白结合Mab凝胶，且然后经洗脱。

因此，发现用于纯化(使用所产生的抗体)的Mab凝胶能够结合重组凝血因子FVIII蛋白，并因此适用于产生用于纯化的抗体树脂，以便商业化生产重组凝血因子FVIII蛋白。

实施例8：使用用于纯化的Mab凝胶纯化重组凝血因子FVIII

50L培养液进行免疫亲和色谱分析法以便鉴定所产生的用于纯化的Mab凝胶是否适合作为用于纯化的树脂，以便商业化生产重组凝血因子FVIII。

填充有用于纯化的Mab凝胶(约1,000mL)的柱子(直径：11.6cm，高度：9.5cm)用于纯化。将该柱子安装于AKTA纯净系统(GE healthcare)中，并平衡。当该柱子稳定时，仅装载一半的培养液，针对3个CV洗涤，针对7至9个CV洗脱。将剩余培养基以相同方式装载于该柱子上，进行免疫亲和色谱分析法，并回收洗脱的重组凝血因子FVIII。所回收的重组凝血因子FVIII通过0.22μmPES膜过滤，且然后保存在4℃。

使用纯化前和纯化后样品进行生色测定以便测定免疫亲和色谱分析法的纯化产率。活性分析结果显示50L的培养液中含有的重组凝血因子FVIII为3.95MIU且该纯化的蛋白为3.25MIU，且因此发现纯化产率为82.3％。

因此，认为使用所产生的抗体产生的用于纯化的Mab凝胶能够在商业生产规模上结合重组凝血因子FVIII蛋白，且因此适合用作用于纯化的抗体树脂，以便商业化生产重组凝血因子FVIII蛋白。

【工业实用性】

由于根据本发明的特异性结合凝血因子FVIII的抗体或其抗原结合片段表现出优良的亲和力和对凝血因子FVIII的结合能力，所以通过提供用于分离或纯化重组凝血因子FVIII的柱子(该柱子偶联有该抗体或其抗原结合片段)或使用该柱子纯化重组凝血因子FVIII的方法来纯化高纯度的重组凝血因子FVIII和生产稳定的具有提高质量的凝血因子FVIII是可能的。

尽管已经参考具体配置文件描述了本发明，但是本领域技术人员将会理解，出于说明性目的提供此说明书作为优选的实施方案，且不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围时是由提交的附随的权利要求书和其等同物定义的。

序列表文本文件

附上电子文件。

<110> 盼展生物技术有限公司

<120> 抗凝血因子VIII抗体及其用途

<130> PP-B1993

<150> KR 10-2016-0170646

<151> 2016-12-14

<160> 38

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Trp Met Asp

1 5 10

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR2

<400> 2

Glu Ile Arg Ser Lys Ala Lys Asn His Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR3

<400> 3

Tyr His Phe

1

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR1

<400> 4

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ile Asn Gln Glu Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR2

<400> 5

Phe Gly Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR3

<400> 6

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH FR1

<400> 7

Glu Val Lys Ile Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH FR2

<400> 8

Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH FR3

<400> 9

Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

1 5 10 15

Lys Ser Arg Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr

20 25 30

Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Asn

35

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH FR4

<400> 10

Trp Gly Pro Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL FR1

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys

20

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL FR2

<400> 12

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 13

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL FR3

<400> 13

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL FR4

<400> 14

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg Ala

1 5 10

<210> 15

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 15

Glu Val Lys Ile Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Lys Asn His Ala Thr Asn Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Asn Tyr His Phe Trp Gly Pro Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 16

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Ile Asn Gln Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Asp Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met

100 105 110

Lys Arg Ala

115

<210> 17

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链

<400> 17

Glu Val Lys Ile Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Lys Asn His Ala Thr Asn Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Asn Tyr His Phe Trp Gly Pro Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly

115 120 125

Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu

145 150 155 160

Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr

165 170 175

Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu

180 185 190

Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr

210 215 220

Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

225 230 235 240

Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp

245 250 255

Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp

260 265 270

Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

275 280 285

Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp

290 295 300

Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro

305 310 315 320

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala

325 330 335

Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp

340 345 350

Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile

355 360 365

Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn

370 375 380

Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys

385 390 395 400

Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys

405 410 415

Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu

420 425 430

Ser His Ser Pro Gly Lys

435

<210> 18

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链

<400> 18

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Ile Asn Gln Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Asp Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met

100 105 110

Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu

145 150 155 160

Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr

180 185 190

Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr

195 200 205

Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215 220

<210> 19

<211> 1438

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组血液凝血因子VIII

<400> 19

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

1 5 10 15

Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

20 25 30

Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys

35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

50 55 60

Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val

65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val

85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala

100 105 110

Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val

115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn

130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser

145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu

180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu

260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile

275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly

290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met

305 310 315 320

Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe

355 360 365

Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His

370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu

385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro

405 410 415

Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr

420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile

435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile

450 455 460

Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile

465 470 475 480

Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys

485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys

500 505 510

Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys

515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

530 535 540

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

545 550 555 560

Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe

565 570 575

Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln

580 585 590

Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe

595 600 605

Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser

610 615 620

Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu

625 630 635 640

Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr

645 650 655

Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro

660 665 670

Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp

675 680 685

Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala

690 695 700

Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

705 710 715 720

Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

725 730 735

Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His

740 745 750

Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile

755 760 765

Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp

770 775 780

Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys

785 790 795 800

Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly

805 810 815

Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser

820 825 830

Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser

835 840 845

Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu

850 855 860

Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr

865 870 875 880

Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile

885 890 895

Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe

900 905 910

Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His

915 920 925

Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe

930 935 940

Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro

945 950 955 960

Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln

965 970 975

Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr

980 985 990

Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro

995 1000 1005

Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe

1010 1015 1020

His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met

1025 1030 1035 1040

Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn

1045 1050 1055

Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg

1060 1065 1070

Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val

1075 1080 1085

Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val

1090 1095 1100

Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe

1105 1110 1115 1120

Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly

1125 1130 1135

His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp

1140 1145 1150

Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp

1155 1160 1165

Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro

1170 1175 1180

Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser

1185 1190 1195 1200

Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys

1205 1210 1215

Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe

1220 1225 1230

Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro

1235 1240 1245

Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile

1250 1255 1260

Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys

1265 1270 1275 1280

Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile

1285 1290 1295

Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser

1300 1305 1310

Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln

1315 1320 1325

Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met

1330 1335 1340

Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser

1345 1350 1355 1360

Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln

1365 1370 1375

Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn

1380 1385 1390

Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu

1395 1400 1405

Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala

1410 1415 1420

Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

1425 1430 1435

<210> 20

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH coding nucleotide

<400> 20

atgtacttgg gactgaacta tgtattcata gtttttctct taaatggtgt ccagagtgaa 60

gtgaagattg aggagtctgg aggaggcttg gtgcagcctg gaggatccat gaaactctct 120

tgtgctgcct ctggattcac ttttagtgac gcctggatgg actgggtccg ccagtctcca 180

gagaagggtc ttgagtgggt tgctgaaatt agaagcaaag ctaaaaatca tgcaacaaac 240

tatgctgagt ctgtgaaagg gaggttcacc atctcaagag atgattccaa aagtcgtgtc 300

tacctgcaaa tgaacacctt aagagctgaa gacactggca tttattactg taccaattac 360

cacttctggg gcccaggcac cactctcaca gtctcctca 399

<210> 21

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL编码的核苷酸

<400> 21

atgggcatca agatggagtc acattttcag gtcctcatgt ttcttctgct ctgggtatct 60

ggtgcctgtg cagacattgt gatgacacag tctccatcct ccctggctat gtcagtagga 120

cagaaggtca ctatgagctg caagtccagt cagagtcttt taaatagtat caatcaagag 180

aactatttgg cctggtacca gcagaaacca ggacagtctc ctaaacttct gatatacttt 240

ggatccacta gggaatctgg ggtccctgat cgcttcatag gcagtggatc tgggacagat 300

ttctctctta ccattagtga cgtgcaggct gaagacctgg cagattactt ctgtcagcaa 360

cattatagta ctccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tagaaatgaa acgggct 417

<210> 22

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链编码的核苷酸

<400> 22

atgtacttgg gactgaacta tgtattcata gtttttctct taaatggtgt ccagagtgaa 60

gtgaagattg aggagtctgg aggaggcttg gtgcagcctg gaggatccat gaaactctct 120

tgtgctgcct ctggattcac ttttagtgac gcctggatgg actgggtccg ccagtctcca 180

gagaagggtc ttgagtgggt tgctgaaatt agaagcaaag ctaaaaatca tgcaacaaac 240

tatgctgagt ctgtgaaagg gaggttcacc atctcaagag atgattccaa aagtcgtgtc 300

tacctgcaaa tgaacacctt aagagctgaa gacactggca tttattactg taccaattac 360

cacttctggg gcccaggcac cactctcaca gtctcctcag ccaaaacgac acccccatct 420

gtctatccac tggcccctgg atctgctgcc caaactaact ccatggtgac cctgggatgc 480

ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtg acagtgacct ggaactctgg atccctgtcc 540

agcggtgtgc acaccttccc agctgtcctg cagtctgacc tctacactct gagcagctca 600

gtgactgtcc cctccagcac ctggcccagc gagaccgtca cctgcaacgt tgcccacccg 660

gccagcagca ccaaggtgga caagaaaatt gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc 720

atatgtacag tcccagaagt atcatctgtc ttcatcttcc ccccaaagcc caaggatgtg 780

ctcaccatta ctctgactcc taaggtcacg tgtgttgtgg tagacatcag caaggatgat 840

cccgaggtcc agttcagctg gtttgtagat gatgtggagg tgcacacagc tcagacgcaa 900

ccccgggagg agcagttcaa cagcactttc cgctcagtca gtgaacttcc catcatgcac 960

caggactggc tcaatggcaa ggagttcaaa tgcagggtca acagtgcagc tttccctgcc 1020

cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc 1080

attccacctc ccaaggagca gatggccaag gataaagtca gtctgacctg catgataaca 1140

gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac 1200

tacaagaaca ctcagcccat catggacaca gatggctctt acttcgtcta cagcaagctc 1260

aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga aatactttca cctgctctgt gttacatgag 1320

ggcctgcaca accaccatac tgagaagagc ctctcccact ctcctggtaa atga 1374

<210> 23

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链编码的核苷酸

<400> 23

atgggcatca agatggagtc acattttcag gtcctcatgt ttcttctgct ctgggtatct 60

ggtgcctgtg cagacattgt gatgacacag tctccatcct ccctggctat gtcagtagga 120

cagaaggtca ctatgagctg caagtccagt cagagtcttt taaatagtat caatcaagag 180

aactatttgg cctggtacca gcagaaacca ggacagtctc ctaaacttct gatatacttt 240

ggatccacta gggaatctgg ggtccctgat cgcttcatag gcagtggatc tgggacagat 300

ttctctctta ccattagtga cgtgcaggct gaagacctgg cagattactt ctgtcagcaa 360

cattatagta ctccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tagaaatgaa acgggctgat 420

gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc 480

tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt 540

gatggcagtg aacggcaaaa tggcgtcctg aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac 600

agcacctaca gcatgagcag caccctcacg ttgaccaagg acgagtatga acgacataac 660

agctatacct gtgaggccac tcacaagaca tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac 720

aggaatgagt gttag 735

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GSP1引物

<400> 24

tgaggagacg gtgaccgtgg t 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GSP2引物

<400> 25

ccttggcccc agaagtggta a 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nested引物

<400> 26

taaatgccag tgtcttcagc 20

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKV1引物

<400> 27

gctagcgcca ccatgaagtt gcctgttagg ctgttggtgc tg 42

<210> 28

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKV2引物

<400> 28

gctagcgcca ccatggagwc agacacactc ctgytatggg tg 42

<210> 29

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKV3引物

<400> 29

gctagcgcca ccatgagtgt gctcactcag gtcctggsgt tg 42

<210> 30

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKV4引物

<400> 30

gctagcgcca ccatgaggrc ccctgctcag wttyttggmw tc 42

<210> 31

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKV5引物

<400> 31

gctagcgcca ccatggattt wcaggtgcag attwtcagct tc 42

<210> 32

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKV6引物

<400> 32

gctagcgcca ccatgaggtk cyytgytsag ytyctgrgg 39

<210> 33

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKV7引物

<400> 33

gctagcgcca ccatgggcwt caagatggag tcacakwyyc wgg 43

<210> 34

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKV8引物

<400> 34

gctagcgcca ccatgtgggg ayctktttyc mmtttttcaa ttg 43

<210> 35

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKV9引物

<400> 35

gctagcgcca ccatggtrtc cwcasctcag ttccttg 37

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKV10引物

<400> 36

gctagcgcca ccatgtatat atgtttgttg tctatttct 39

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKV11引物

<400> 37

gctagcgcca ccatggaagc cccagctcag cttctcttcc 40

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKCIII引物

<400> 38

ctaacactca ttcctgttga agctc 25

Claims

1.一种特异性结合凝血因子VIII的抗体，或其抗原结合片段，其包含：

选自由SEQ ID NO:1至3组成的组的重链CDR；和

选自由SEQ ID NO:4至6组成的组的轻链CDR。

2.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变区，其包括SEQ ID NO:1的CDR1、SEQ ID NO:2的CDR2和SEQ ID NO:3的CDR3；和

轻链可变区，其包括SEQ ID NO:4的CDR1、SEQ ID NO:5的CDR2和SEQ ID NO:6的CDR3。

3.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含：

选自由SEQ ID NO:7至10组成的组的重链可变区框架区(FR)；和

选自由SEQ ID NO:11至14组成的组的轻链可变区框架区(FR)。

4.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:15的重链可变区和SEQ ID NO:16的轻链可变区。

5.根据权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:17的重链和SEQ ID NO:18的轻链。

6.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至5任一项的抗体或其抗原结合片段。

7.一种表达载体，其包含根据权利要求6的多核苷酸。

8.一种重组宿主细胞，其用根据权利要求7的表达载体转化。

9.一种生成抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括：

培养根据权利要求8的重组宿主细胞以生成抗体或其抗原结合片段；并

回收该产生的抗体或其抗原结合片段，随后分离和纯化。

10.用于分离或纯化重组凝血因子VIII的柱子，

其中所述柱子的固定相偶联有根据权利要求1至5任一项的抗体或其抗原结合片段，其作为配体用于分离或纯化重组凝血因子VIII。

11.一种分离或纯化重组凝血因子VIII的方法，该方法包括在根据权利要求10的柱子上装载含有重组凝血因子VIII的样品。