CN110358719B - 一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为宿主，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS为表达载体，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌引入不同来源egtABCDE基因簇进行异源表达。实现生物合成麦角硫因。然后对egtABCDE基因簇进行优化表达，包括密码子优化、启动子优化和不同组合表达，同时优化培养基及添加的甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸，经过优化表达和优化培养条件，实现了高效生物合成麦角硫因。本发明为微生物系统高效发酵制备麦角硫因奠定了基础，适合于工业化生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
麦角硫因是一种稀有的天然手性组氨酸衍生类硫醇化合物，具有独特的生物学功能和药理活性。它不仅具很强的有抗氧化活性：可以清除经自由基、过氧亚硝基、次氯酸、鳌合二价金属离子、激活抗氧化物酶、抑制超氧化物歧化酶等，而且也具有抗炎作用和保护细胞作用，在医药、食品、保健品和化妆品及生物技术等领域具有广泛的应用前景和市场前景。
麦角硫因在1909年首次从麦角菌中分离得到，在放线菌、蓝细菌和裂殖酵母、部分蕈菌、链霉菌、分枝杆菌等微生物中也能合成，而其他细菌物种如：枯草芽抱杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌与链球菌等不能合成。麦角硫因也不能被动物和植物生物合成，但可被植物和动物吸收与积累，并广泛分布于哺乳动物的细胞和组织中。麦角硫因在人生理学中是至关重要的，人必须从膳食来源中获取，并在在特定组织和细胞诸如肝、肾、中枢神经系统和红细胞中积累。目前可通过化学合成法、提取法以及生物发酵合成法生产麦角硫因。化学方法合成左旋的麦角硫因十分困难，产品的安全性难以保证，合成原料昂贵，合成成本高，未达到预期的产量；提取法生产麦角硫因时也存在很多困难，如原料来源不足、原料中麦角硫因的含量仍然很低且提取成本高、有药物残留等，随着分子生物学及代谢工程等生物科学的快速发展，生物发酵合成法生产麦角硫因成为最具有潜力的生产方法。
然而，现有的报道中，通过构建基因工程菌生产麦角硫因的方法，其效果并不理想。如用来自耻垢分枝杆菌的egt基因在大肠杆菌中进行异源表达。将基因簇中的基因拆分连接到多个质粒中，再将质粒转化进大肠杆菌中，优化表达重组酶来提高麦角硫因产量，尽管如此，摇瓶产量仅有24mg/L(Osawa R,Kamide T,Satoh Y,et al.Heterologous andHigh Production of Ergothioneine in Escherichia coli[J].Journal ofAgricultural&Food Chemistry,2017,66(5):1191-1196.)。
因此，提供一种能够实现高效生物合成麦角硫因的方法，对于工业生产麦角硫因具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种发酵合成麦角硫因的工程菌株，是以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，异源表达egtABCDE基因簇，或，表达氨基酸序列如k或l所示的蛋白质，所述egtABCDE基因簇的氨基酸序列如e、f、g、h、i或j任一所示。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌W3110或大肠杆菌BL21。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌168，枯草芽孢杆菌W600或枯草芽孢杆菌W800。
在本发明的一种实施方式中，所述egtABCDE基因簇来源为Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis str.k10，Mycolicibacter icosiumassiliensis strain 8WA6，Mycobacterium colombiense CECT 3035，Mycobacterium marinum E11，Mycobacteriumsp.KMS或Mycobacteroides salmoniphilum。
在本发明的一种实施方式中，所述egtABCDE基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、a、b、c或d任一所示。编码序列k的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。编码序列l的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述工程菌株的表达载体为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS(构建方法见Yang S,Liu Q,Zhang Y,etal.Construction and Characterization of Broad-spectrum Promoters forSynthetic Biology.[J].Acs Synthetic Biology,2017,7(1):287-291.)。
本发明的第二个目的是提供一种生产麦角硫因的方法，应用了上述的工程菌株进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，将工程菌株接种至发酵培养基，在35-38℃发酵40-60h，根据需要在培养8-12h时添加甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸，添加的甲硫氨酸终浓度2-8g/L，添加的组氨酸甜菜碱终浓度10-15g/L，添加的组氨酸终浓度15-20g/L，添加的半胱氨酸终浓度15-20g/L。
所使用的发酵培养基组分为(g/L)：酵母粉2.5，蛋白胨5.0，Na2HPO4 6.78，KH2PO43.0，NaCl 0.5，NH4Cl 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2 0.015，葡萄糖40；FeCl2·6H2O0.013.5；MnCl2·4H2O，0.001；ZnCl2，0.0017；CuCl2·2H2O，0.00043。
本发明的第三个目的是提供上述的工程菌在制备麦角硫因或含麦角硫因的产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS为表达载体，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌引入不同来源egtABCDE基因簇进行异源表达。实现生物合成麦角硫因。然后对egtABCDE基因簇进行优化表达，包括密码子优化、启动子优化和不同组合表达，可分别获得一株产麦角硫因较佳的大肠杆菌与枯草芽孢杆菌重组菌，经过优化表达和优化培养条件，实现了高效生物合成麦角硫因。本发明能够使大肠杆菌重组菌在摇瓶上培养60h麦角硫因积累量高达437.6mg/L，枯草芽孢杆菌重组菌在摇瓶上培养60h麦角硫因积累量高达568.4mg/L，在工业上具有潜在而广泛的应用价值。
附图说明
图1：pEBS-egtABCDE及egtABCDE基因簇所含基因不同组合优化表达的构建示意图。
图2：异源表达不同来源egtABCDE基因簇的大肠杆菌重组菌在摇瓶上培养60h后麦角硫因积累量。
图3：异源表达不同来源egtABCDE基因簇的枯草芽孢杆菌重组菌在摇瓶上培养60h后麦角硫因积累量。
图4：egtABCDE基因簇所含基因不同组合优化表达的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌重组菌在摇瓶上培养60h后麦角硫因积累量。
具体实施方式
一、实施例涉及的核苷酸序列信息
(1)序列a信息为来源于Mycobacterium avium subsp.paratuberculosisstr.k10的egtABCDE基因簇核苷酸序列，NCBI编号：AE016958.1(322465to 327878)，序列(a)编码的氨基酸序列为序列e；
(2)SEQ ID NO.1序列信息为来源于Mycolicibacter icosiumassiliensisstrain 8WA6的egtABCDE基因簇核苷酸序列，SEQ ID NO.1编码的氨基酸序列为序列f；
(3)序列b信息为来源于Mycobacterium colombiense CECT 3035的egtABCDE基因簇核苷酸序列，NCBI编号：CP020821.1(3701114to 3706623)，序列b编码的氨基酸序列为序列g；
(4)序列c信息为来源于Mycobacterium marinum E11的egtABCDE基因簇核苷酸序列，NCBI编号：HG917972.2(6005272to 6010682)，序列c编码的氨基酸序列为序列h；
(5)序列(d)信息为来源于Mycobacterium sp.KMS的egtABCDE基因簇核苷酸序列，NCBI编号：CP000518.1(5206948to 5212322)，序列d编码的氨基酸序列为序列i；
(6)SEQ ID NO.2序列信息为Mycobacteroides salmoniphilum strain D16Q15的egtABCDE基因簇核苷酸序列，SEQ ID NO.2编码的氨基酸序列为序列j；
(7)SEQ ID NO.3序列信息为基因簇BACDE核苷酸序列，SEQ ID NO.3编码的氨基酸序列为序列k；
(8)SEQ ID NO.4序列信息为基因簇BA-PBSX-CDE核苷酸序列，SEQ ID NO.4编码的氨基酸序列为序列l。
二、表达系统的构建
分别以Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis str.k10基因组、Mycolicibacter icosiumassiliensis strain 8WA6基因组、Mycobacterium colombienseCECT 3035基因组、Mycobacterium marinum E11基因组、Mycobacterium sp.KMS基因组和Mycobacteroides salmoniphilum基因组为模板，通过PCR扩增egtABCDE基因簇DNA片段，使用的引物分别是egtABCDE(mp)-F/egtABCDE(mp)-R、egtABCDE(mi)-F/egtABCDE(mi)-R、egtABCDE(mc)-F/egtABCDE(mc)-R、egtABCDE(mm)-F/egtABCDE(mm)-R、egtABCDE(mk)-F/egtABCDE(mk)-R、egtABCDE(ms)-F/egtABCDE(ms)-R，将所得的PCR产物与pEBS(使用引物pEBS-F/pEBS-R扩增)骨架组装以产生pEBS-egtABCDE(mp)、pEBS-egtABCDE(mi)、pEBS-egtABCDE(mc)、pEBS-egtABCDE(mm)、pEBS-egtABCDE(mk)和pEBS-egtABCDE(ms)。以Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis str.k10基因组为模板，通过PCR扩增得到egtB(使用引物B(1)-F/B(1)-R扩增)、egtA(使用引物A(2)-F/A(2)-R扩增)、egtC(使用引物C(3)-F/C(3)-R扩增)、egtD(使用引物D(4)-F/D(4)-R扩增)、egtE(使用引物E(5)-F/E(5)-R扩增)基因的DNA片段，将所得的PCR产物与pEBS(使用引物pEBS-F/pEBS-R扩增)骨架组装以产生pEBS-BACDE。以pEBS-BACDE为模板，使用引物PBSX-F/PBSX-R通过PCR扩增启动子pbsx DNA片段，将所得的PCR产物与pEBS-BACDE(使用引物APBSC-F/APBSC-R扩增)骨架组装pSTOP1622以产生pEBS-BA-PBSX-CDE，如图1所示。
三、重组菌的构建
1.分别向大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌W3110，大肠杆菌BL21转入重组质粒pEBS-egtABCDE(mp)、pEBS-egtABCDE(mi)、pEBS-egtABCDE(mc)、pEBS-egtABCDE(mm)、pEBS-egtABCDE(mk)和pEBS-egtABCDE(ms)。得到大肠杆菌重组菌Mmp、Mmi、Mmc、Mmm、Mmk、Mms、Dmp、Dmi、Dmc、Dmm、Dmk、Dms、Wmp、Wmi、Wmc、Wmm、Wmk、Wms、Bmp、Bmi、Bmc、Bmm、Bmk、Bms。
2.分别向枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌W600、枯草芽孢杆菌W800转入重组质粒pEBS-egtABCDE(mp)、pEBS-egtABCDE(mi)、pEBS-egtABCDE(mc)、pEBS-egtABCDE(mm)、pEBS-egtABCDE(mk)和pEBS-egtABCDE(ms)。得到枯草芽孢杆菌重组菌168mp、168mi、168mc、168mm、168mk、168ms、600mp、600mi、600mc、600mm、600mk、600ms、800mp、800mi、800mc、800mm、800mk、800ms。
3.分别向枯草芽孢杆菌168，大肠杆菌DH5α转入重组质粒pEBS-BACDE和pEBS-BA-PBSX-CDE，得到重组菌BS-BACDE、BS-BA-PBSX-CDE、EC-BACDE、EC-BA-PBSX-CDE。
四、样品的处理及HPLC分析麦角硫因产量
取4mL发酵液，在12000r/min下离心10min，上清液用于HPLC分析麦角硫因，沉淀用等体积50％甲醇悬浮后进行超声破碎，再在12 000r/min下离心10min，收集上清液用于HPLC分析麦角硫因HPLC，麦角硫因产量为胞内和胞外麦角硫因含量之和。
HPLC分析条件:流动相由0.1％甲酸/水(A)和0.1％甲酸/乙睛(B)组成。梯度程序为在2分钟的95％B，在10分钟的40％B，在8.5分钟的95％B，在12分钟时终止。流速为0.5ml/min，进样量10μL。使用Dionex UPLC Ultimate 3000(Sunnyvale,CA)分析样品。在AtlantisHILIC硅胶柱(粒径3.01μm，直径×长度＝2.1×100mm；Waters)上分离化合物，并在264nm处检测。
五、实施例中涉及到的引物信息
引物信息如表1所示。
表1引物
实施例1 24株异源表达egtABCDE基因簇大肠杆菌重组菌的摇瓶培养及麦角硫因含量测定
分别挑取上述构建的24株异源表达egtABCDE基因簇大肠杆菌重组菌株及对照菌(转化pEBS空质粒)单克隆接种于5mL LB培养基，根据需要添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，置于200rpm 37℃培养10-12h，然后按10％的接种量转接于250mL三角摇瓶，培养基为发酵培养基，装液量为20mL，根据需有添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，然后置于220rpm37℃培养，培养10h时添加的甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸，添加的甲硫氨酸终浓度2g/L，添加的组氨酸甜菜碱终浓度10g/L，添加的组氨酸终浓度15g/L，添加的半胱氨酸终浓度15g/L，最终装液量为25mL(不足则补无菌的去离子水)。培养60h后进行样品的处理及HPLC分析麦角硫因产量。结果如图2所示，重组菌都能实现异源合成麦角硫因，其中重组菌Mmp的麦角硫因产量较高，达335.3mg/L。
实施例2 18株异源表达egtABCDE基因簇枯草芽孢杆菌重组菌的摇瓶培养及麦角硫因含量测定
分别挑取上述构建的18株异源表达egtABCDE基因簇枯草芽孢杆菌重组菌株及对照菌(转化pEBS空质粒)单克隆接种于5mL LB培养基，根据需要添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，置于200rpm 37℃培养10-12h，然后按10％的接种量转接于250mL三角摇瓶，培养基为发酵培养基，装液量为20mL，根据需有添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，然后置于220rpm 37℃培养，培养10h时添加的甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸，添加的甲硫氨酸终浓度2g/L，添加的组氨酸甜菜碱终浓度10g/L，添加的组氨酸终浓度15g/L，添加的半胱氨酸终浓度15g/L，最终装液量为25mL(不足则补无菌的去离子水)。培养60h后进行样品的处理及HPLC分析麦角硫因产量。结果如图3所示，重组菌都能实现异源合成麦角硫因，其中重组菌168mp的麦角硫因产量较高，达412.2mg/L。
实施例3 egtABCDE基因簇所含基因不同组合优化表达的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌重组菌的摇瓶培养及麦角硫因含量测定
分别挑取上述构建的egtABCDE基因簇所含基因不同组合优化表达的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌重组菌及对照菌(转化pEBS空质粒)单克隆接种于5mL LB培养基，根据需要添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，置于200rpm 37℃培养10-12h，然后按10％的接种量转接于250mL三角摇瓶，培养基为发酵培养基，装液量为20mL，根据需有添加终浓度为50μg/mL的卡那霉素，然后置于220rpm，37℃培养，培养10h时添加的甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸，添加的甲硫氨酸终浓度8g/L，添加的组氨酸甜菜碱终浓度15g/L，添加的组氨酸终浓度20g/L，添加的半胱氨酸终浓度20g/L。最终装液量为25mL(不足则补无菌的去离子水)。培养60h后进行样品的处理及HPLC分析麦角硫因产量。结果如图4所示，重组菌都能实现异源合成麦角硫因，其中重组菌BS-BA-Pbsx-CDE的麦角硫因产量较高，达568.4mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种发酵合成麦角硫因的工程菌株及其构建方法
<130> 233
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5315
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgggattcg ccgcggcgac gcaattgtcc cgcggagatg aagcttgcct gggcggcccc 60
gagctggccg gtgccgccga cgccgccgac tacatcaccc aacgttgcct cactgatgcc 120
ccgcacggcc gggtgggttt ggaggtcgag gcgcactgct tcgacccgac cgacccgcac 180
cgccggccgg gctgggcgga gatcggtgac gtgctgcagt ccctgccggc cttgccgggc 240
ggcggtgtcg tcacggtcga acccggcggc gctgtggagc tctccggccc gccgctgacc 300
gacgcacttt ccgcgatcga agcgatggtg gccgaccagg cggtgttgcg ggcggctttc 360
gccgccgccg ggctgggtct ggtgcagctg ggcgccgacc cgctgcggcc cacggagcgg 420
gtcaaccccg gcgagcgcta cgcggcgatg gagcagttct tcgccgccag ccacaccggt 480
tcggccggtg cggcgatgat gacgtcgacg gcgtcggtcc agctcaatct ggatgccggt 540
ccgcgttccg gttgggcaga ccgagtccgg ttggctcacg cgctgggccc gacgatggtc 600
gccatcgccg cgaactctcc gctgctggcc ggggagttct ccggctggct ttccacccgg 660
cagcgggtgt ggagccgact ggactcggcg cgctgcggcc ccatcctcgg ccttgacggc 720
accgaccccg tcaccgactg ggcgcggtac gcgctcaaag cgcccgtcat gctggtgcac 780
acgcccgaag cgattccggt cagccgctac gtgccgttcg ccgcctgggc cgacggacgg 840
gtgctgctcg gcgatcgccg cgccggcatt aaagatcttg attaccacct gaccacactg 900
tttcctccgg tgcgcccgcg cggatggctg gagatccgct acctcgacag cgtcgacgac 960
accctctggc cggcactggt attcaccctg gccaccctgc tcgacgaccc gctcgccgcc 1020
gacagcgctg ccgatgccgt cgcacccgtc gctaccgcct gggacgtcgc cgcccggatc 1080
ggcctggccg acccgcggct gcatgcggcc gcccggcact gcattgggct ggtcgccgac 1140
cgggccccgg catccctgcg cgacgggatc gatcggctgg ccggcatggt cgaacgcggc 1200
cgctgcccgg ccgacgatgt caccgacgag gtgacccggg ccggcaccgc ggcgatggtg 1260
acccgaatgg cgcgccgcca gtcatgacca cgtccgaaat attggcccgc aatctgaccc 1320
gggcgcggca gcgcacgctg gcgctcgtcg atttcgacga cgccgagctg caccgccagt 1380
acgacccgct gatgagcccg ctggtgtggg acctggccca tatcggtcag caggaggagc 1440
tgtggctgct gcgcgacggg gacccggcgc gcccaggcat gctgtccgcg gatgtcgagg 1500
gcctctacga cgccttcacc cacccacggg ccagccgcgt cgccctaccg ttgttggcgc 1560
ccgaacaggc ccggaagtat tgcgccaccg tgcgttccaa ggttttcgac aagctggggt 1620
ccctgccggg tgacgcaggg gatcgcacgg acggattcgt gttcggcctg gtgctcagcc 1680
atgaacacca gcacgacgag accatgctgc aggcgctgaa cctacgtgcc ggcccgccgc 1740
tgctcggtgc cggtgaccgc ctgcccgccg ggcagcccga cctggcagga acctcggtgt 1800
tggtaccggg cggtgaattc atgctgggcg tcgacgcaac cgacgagccc ttctcgctgg 1860
acaacgagcg ccccgcgcac cgcgtcgatg tggcggcgtt ccggatcggc cgggtgccgg 1920
tgaccaaccg cgaatggcgg gagttcatcg acgacggcgg ctaccggcag cctcagtggt 1980
ggagcgaacg gggttggcgc cactgcgtgc aagccgggtt gacggcgccg gagttctggg 2040
gccccgacca tcgatctcga atccggttcg gccacgtcga ggcccttccc ggcgacgagc 2100
cggtgcagca cgtcagctac ttcgaggcgc aggcctacgc gacatgggcc ggggcccggc 2160
tgcccaccga gatcgaatgg gagaaggcct gcgcctggga tccggccgcc ggcgcgcgac 2220
gccgctaccc ctggggcggc gccgacccgt cggccgaagt ggctaacctc gacggtgtgg 2280
cgctgcgacc ggcgccggtc ggggcctacc cggacggggc atcggcctat ggcgcgcaac 2340
aacttctcgg cgatgtctgg gagtggacca gttcgcccct gcaaccgtgg ccgggctttt 2400
ctccgatgat ctaccaacgc tattcggagc cgttcttcgg tggcgactac cgggtgctgc 2460
gcggcgggtc gtgggcggtt gcccgggaga tcctgcggcc gagcttccgc aactgggacc 2520
acccgtaccg gcggcagatc tttgccggcg tccgactggc ctgggacgcc tgatgtgccg 2580
acacctgggc tggctgggca agccgcggtc attggcccag ttgatgctgg agccgccgca 2640
gggcctgctg gtgcagtcct atgccccgcg ccgacagcag cacgggttgc tcaacgccga 2700
cggttggggc gcagggtttt tcgatgcctc ccagggcgac gcgccgcgac ggtggcgcag 2760
tgcggcacca ctgtggagcg atgggtcgtt cgcctcggtc gccccggtac tcgccagcca 2820
ctgcgtggtg gccgcggtgc gttcggcgac tgtcgggatg cctatcgagg ccagcgccac 2880
cgcgccgttc actgacggca gttggctgct gtcgcacaac ggcgtggtga accgtgaggt 2940
tctgaccgcc atcgatcgtg ccgaatcggt ctgtgacagt gccgtcctgg ccgcagcgat 3000
cttcgcccgc ggggtggaat cgttgggcga ggtgatcgcc gagatcggtg cggccgatcc 3060
gcaagcccgg ctgaacatat tggccgccaa cggttcccgt atgttggcga cgacctgggg 3120
agacactttg tcgatgttgc acggtgccga tggtgtggtg ctggccagtg agccctacga 3180
cgacgacccg cgctgggtgg atattccaga caagcacctg gtggaaacgc acgatggcga 3240
ggtgtacgtc acggccctgg gtgacctccg atgacggtat ctattgccaa tcacctggcc 3300
gccgacgcgg ctcgatccgc actgcgggcc gacgtccgcc acgggctggc ccagcatccg 3360
aagtctttac cgcccaagtg gttctacgac gacactggca gtgagctgtt cgaccagatc 3420
acccggctgc ccgagtacta cccgacccgc gccgaggcgc agatcctgcg cacgcactcc 3480
gccgaggtgg cggcgctgtc gggcgcggac accctggtcg aactgggcag cggcacctcg 3540
gagaagaccc ggatgctgct ggacgcactg caggacgctg ggttgttgcg ccgattcatc 3600
ccctttgacg tcgacgccgg agtgctggag acggcggggg aggcgatcgc ccgggactat 3660
cccggcgtgc aagtgcaggc cgtctgcggc gatttcgagc accacctggc gcagatcccc 3720
gacggtggca gacgactgtt cgtgtttctg ggatcgacca ttggcaacct gacgccgggc 3780
ccgcgtgcgg acttcctggc cgacctcgcc gcggtcatgc acgacggtga cggcctgctg 3840
ttgggcaccg atctggtcaa ggacaccggc aggctggtgc gcgcctacga cgacgcggcc 3900
ggggtgaccg cggcgttcaa ccgcaacgtg ctcgcggtgg tcaaccgtga gcttgatgct 3960
gacttcgacc tggacgcgtt cgcccatgtg gcgcggtgga attcggcgga gcagcgcatg 4020
gagatgtggt tgcgcgcccg cagccgtcag cacgtcacag tgggggcctt ggacctggct 4080
gtcgacttcg cggccggaga ggagatgctg accgaggtgt cctgcaaatt ccgggccgag 4140
caggtggccg gcgagctggc cgccgcggga ctgcgccgcc gacggtggtg gaccgacgcg 4200
gcaggcgatt tcggcgtgtc gctcgccatc aaatgagcct cgccgacagc tggcgcgctg 4260
cgcgcccccc ggtcgcgggg ctgcacctgg acagcgcagc ctgctcacgg cagagccatg 4320
cggcgctaga tgccgcagcc tgccatgccc gtcacgaagc cgaggtcggt ggctacgttg 4380
ccgccgaggc ggccgcaccg gtgctcgacg ccggccgggc ggccttcgcc gtattgaccg 4440
gcatggccga tgccgacgtg gtgtttacta ccggctcgcg aaatgcactg gacctcctgc 4500
tgtcccgatg gccgggcgcg cagcgcaccc tggcctgcct gcccggtgaa tacggcccga 4560
atctggcggt gatggcggtg cacgggttca gccggcgggc gctgccggtg gaccacaccg 4620
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acctgacccc ggtcggcagt caccgcggcc tggtgcagcc cttggcgcag atggcggaca 4740
tctgccgcgc gttcgatgtc ccgatggtgg tcgacgcggc gcaggcactg ggccagatcg 4800
actgcgcggt gggcgccgcc gccgtctatt cctcatcgcg caagtggctt gccgggccgc 4860
gcggtgtcgg ggcgctggca gtacggccgg ccttggcgga actggcgtcc tcgggaccgg 4920
cggccggtga cgtgaatgtg gctgcccagg taggcttctc cgtggcgctg ggggaacatc 4980
tggcggccag gccggcagcg gttcgggccg cgctggccgg cgtgggtgcc cggagccggc 5040
gggtgctggc tcggctaccc ggctggcggg tggtcgaacc gctcgacgag ccgagcgcca 5100
tcaccacctt ggccccgccg gccggcatcg atccggtggt cgtgcgggcg tggctgatcg 5160
ccgagcacgg gatcgtcacc accgcagccg gagtcgaacg cgcgccgttg gagctgaccg 5220
tgccggtgct gcggatctca ccgcacgtcg acaccaccga agcagatttg gacgtgctcg 5280
ctgcggcgtt ggccgatgcg ccgcgcggtg gataa 5315
<210> 2
<211> 5260
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 5524
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtgacgtcac cggaggcgat cgccgaccag ctggcgcgga cgcgggcgcg gacgctgcgg 60
ctggtcgact tcgacgacga cgagctgcgc cggcagtacg acccgttgat gagcccgctg 120
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tccttgacac tgaatttagc atgtgatata attaacttaa tattctaccc aagcttataa 2700
aagagcactg ttgggcgtga gtggaggcgc cggaaaaaag catcgaaaaa aaagagagga 2760
atgtacacat gtgccggcat ctgggatggc tgggggccga cgccacggtc tcctcgctga 2820
tgctcgagcc gccgttcggg ctgcgggtgc agtcctacgc gccgcgccgg cagaaacacg 2880
gcctgctcaa cgccgacggt tggggcgcag ggtttttcga cgcggaggtg ccgcgccgct 2940
ggcgcagccc ggcgccgctg tggggtgacg tgtccttcga gtccgtcgcg ccggcgctgc 3000
acagccactg cgtggtggcc gcggtgcgct cggcgacggt gggcatgccg atcgagatca 3060
gcgccaccgc accgttcacc gacggccggt ggctgctgtc gcacaacggg gtggtcgacc 3120
ggtctgtgct gccggtgacc tcgcgggctg aatccgtttg cgacagcgcg atattggcgg 3180
cagtcatctt ggagcggggc ctggacgcac tcggcgaggt gatcgtcgag atcggcgcgg 3240
ccgacccggc ggcccggctt aacatactgg ccgccaacgg ttctcggctg ctggccacgg 3300
cctgggggga caccctgtcc atcctgcgcc gcgccgacgg tgtggtggtg gccagtgaac 3360
cctacgacga cgactccgac tgggaggacg tgccggaccg ccacctggtc gatgtcacgg 3420
ccgacggtgt cacgctgaca ccgctggatc atccgaaggg attttgaaag agaggaatgt 3480
acacatgacg ctgtcgctgt ccaaccacct cgccgccgac tcggcccacc acgcgttgcg 3540
ccgcgacgtg ctcgacgggc tgcggcgtac accgaagtcg ttgccgccca agtggttcta 3600
cgattcggtg ggtagtgacc tgttcgacca gatcacccgc ctgccggaat actatccgac 3660
ccgcgccgag gccgagatcc tgcgcgcgca ggcgcccggc atcgcctcgg ccagcgaggc 3720
cgacaccctg gtcgaattgg gcagcggcac ctcggagaag acccgggtgc tgctcgacgc 3780
gctgcgcgag cggggcgcgc tgcgcaggta cgtcccgttc gacgtcgacg ccggcatcct 3840
gtcggcatcc gccgccgcca tccagcgcga atacgccggc atcgaaatcc aggccgtctg 3900
cggcgatttc gaggagcacc tgaccgagat ccccgaaggc gggcgacggc tgttcgtgtt 3960
tctgggctcg acgatcggca acctgacgcc cgggccgcgc gcgcagttcc tggccgcgct 4020
gtcggcccag atgcggcccg gcgacagcct gttgctgggc accgacctgg tcaaggacac 4080
cgagcggctg gtgcgcgcct acgacgacgc cgccggggtg acggcggcgt tcaaccgcaa 4140
cgtgctcgcg gtgataaacc gggaactgga cgcggatttc gacgtcgacg ccttcgagca 4200
cgtggcccgc tggaacgcgg acgaggaacg catcgagatg tggctgcgcg cgaccgtgcg 4260
ccagcgggtg cgggtcggtg cgctcgggct gacggtggac ttccgggcgg gtgaggagat 4320
gctcaccgag gtgtcgtgca agttccgccc ggagcgggtg agtgccgagc tggccgccgc 4380
cggattgcgt cgcacccgtt ggtggaccga cggcgcggag gacttcgggt tgtcgttggc 4440
cgtcaagtga aagagaggaa tgtacacgtg agcggcggca ccccgctggc cgacacgtgg 4500
cggtcggccc ggccgccggc ggcgggtctg cacctcgaca gcgcggcctg ttcccggcag 4560
agcttcgcgg tgatcgaggc caccgcccag cacgcccgca acgaggccga gctcggcggc 4620
tacgtggccg ccgaggcggc cgcaccggtg ctcgacgccg ggcggttcgc attcaccgcg 4680
ctgaccggca tgaccgacgc cgaggcggtg ttcaccaccg gctcgctgca cgccctggac 4740
ctgctgctgg gcagctggcc ggccgagcgc cgcaccctgg cctgcctgcc cggcgagtac 4800
ggccccaacc tggccgtgat gaccgcccac ggattcgacc gttggctgct gccgaccctg 4860
gccgacggcc gggtggcgct ggacgacgcg gcgctggccc tgcagaccga cccgccggac 4920
ctggtccacc tgaccacgat tggcagccac agcggtgtgg cgcaaccggt ttcgatgatc 4980
gcccggctct gccgggagct ggggctgccg ctggtcgtcg acgcggcgca ggcgctgggt 5040
caggtggact gcacggccgg cgccgacgtg acctactcgt cgtcgcggaa gtggatcgcg 5100
gggccgcgcg gagtcgggat gctcgcggtg cgccgggagc tgatggaaaa cctgcacccg 5160
aggctggcgg cgccggactg ggcgccgggc tccacggtgg ctcagcaact cgagttcggt 5220
gaggccaata tcgctgcgcg agtggggttt tcgctggcgc tgggcgaata cctggggtac 5280
gggccggccg ccgtctgcgc gcggctggcc gagctgggcg gcctgagccg cggcgtgctg 5340
accgacgtga ccggctgggc ggtcgtcgaa gacgccgaag agcccagtgc catcaccact 5400
ttggcgccca ccgacggcgc agacccgcgg gcggtgcggg actggttgct cgccgagcgg 5460
cggatcctga ccaccttcgt cggcgtgcag cgcgcgccgt tgcggctcac cgcgccggtg 5520
ttgcggatct cgccgcacct ggacaccacc gccgaggacc tggagacctt cgccgaagcg 5580
ctcatcgccg cgacggcggc gacctcggcc tga 5613
Claims (9)
1.一种发酵合成麦角硫因的工程菌株，其特征在于，以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，异源表达egtABCDE基因簇，或，表达氨基酸序列如k或l所示的蛋白质，所述egtABCDE基因簇的氨基酸序列如e、f、g、h、i或j任一所示；编码序列e的核苷酸如GenBank号AE016958.1第322465-327878位所示；编码序列f的核苷酸如SEQ ID NO.1所示；编码序列g的核苷酸序列如GenBank号CP020821.1第3701114–3706623位所示；编码序列h的核苷酸如GenBank号HG917972.2第6005272-6010682位所示；编码序列i的核苷酸如GenBank号CP000518.1第5206948-5212322位所示；编码序列j的核苷酸如SEQ ID NO.2所示；编码序列k的核苷酸如SEQ ID NO.3所示；编码序列l的核苷酸如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌W3110或大肠杆菌BL21。
3.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌W600或枯草芽孢杆菌W800。
4.根据权利要求1-3任一所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株的表达载体包括pEBS。
5.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，编码序列k的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
6.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，编码序列l的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
7.一种生产麦角硫因的方法，其特征在于，应用权利要求1-6任一所述的工程菌株进行发酵。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将工程菌株接种至发酵培养基，在35-38℃发酵40-60h，在培养8-12h时添加甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸，添加的甲硫氨酸终浓度2-8g/L，添加的组氨酸甜菜碱终浓度10-15g/L，添加的组氨酸终浓度15-20g/L，添加的半胱氨酸终浓度15-20g/L。
9.权利要求1-6任一所述的工程菌在制备麦角硫因或含麦角硫因的产品中的应用。
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| JP2012065591A (ja) * | 2010-09-24 | 2012-04-05 | Daicel Corp | エルゴチオナーゼ、およびエルゴチオネインの定量方法 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2012065591A (ja) * | 2010-09-24 | 2012-04-05 | Daicel Corp | エルゴチオナーゼ、およびエルゴチオネインの定量方法 |
| CN104854245A (zh) * | 2012-12-21 | 2015-08-19 | 刘平华 | 通过代谢工程生产麦角硫因 |
| CN106661585A (zh) * | 2014-04-29 | 2017-05-10 | 科纳根公司 | 微生物麦角硫因生物合成 |
| CN110317803A (zh) * | 2018-03-29 | 2019-10-11 | 陶志敏 | 麦角硫因的纳米生物学制备方法 |
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| "Heterologous and High Production of Ergothioneine in Escherichia coli";Ryo Osawa et al.;《J. Agric. Food Chem.》;20171225;第66卷;第1191-1196页 * |
| "High Production of Ergothioneine in Escherichia coli using the Sulfoxide Synthase from Methylobacterium strains";Tomoyuki Kamide et al.;《J. Agric. Food Chem.》;20200521;第68卷;第6390-6394页 * |
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