CN110272911A

CN110272911A - AOX1a基因在提高植物耐旱性方面的应用

Info

Publication number: CN110272911A
Application number: CN201910603825.5A
Authority: CN
Inventors: 林宏辉; 张大伟; 乔康; 邓星光
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-07-05
Filing date: 2019-07-05
Publication date: 2019-09-24

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，公开了AOX1a基因在提高植物耐旱性方面的应用。将所述AOX1a基因应用于提高植物的耐旱性，所述AOX1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述植物为番茄。AOX1a基因参与乙烯诱导的耐旱性，且能够提高植物的干旱耐受力。本发明提供了一种新的提高植物耐旱性的基因AOX1a，对于转基因工程具有很好的应用前景。

Description

AOX1a基因在提高植物耐旱性方面的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种AOX1a基因在提高植物耐旱性方面的应用。

背景技术

农业生产是社会经济和物质生产的基础和重要组成部分，其中植物生产在农业生产中又占有重要的基础地位。植物生长过程中可能会受到多种胁迫，从而影响其产量。现在全球干旱化趋势严重，干旱胁迫成为导致农作物减产的主要胁迫之一。现有的野生型植物对于环境胁迫，特别是干旱胁迫条件下，表现出较低的耐受性。

干旱胁迫是影响植物生长发育、产量和品质的主要非生物胁迫因子之一。然而，植物抗旱性是由多基因控制的数量性状，单基因的转化并不能显著提高作物的抗性，这也严重限制了高产高抗性作物的发展。干旱胁迫会引起大量基因产物的变化，对调控这些基因的转录因子及不同信号途径交叉对话的深入了解将有助于作物综合性状的改良。在作物改良过程中，如何利用现有的成果创造出生长正常、产量不受影响、具有较强胁迫耐受性的转基因植物，如何将转入的外源基因对作物自身机制的干扰降到最低，并在恰当时间激活胁迫诱导基因的表达，如何使胁迫诱导基因产生于理想的细胞组织位置并具有合适的表达量等，都是我们在创造转基因植物时需要考虑的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是从基因水平提高植物的耐旱性，提供一种AOX1a基因在提高植物耐旱性方面的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是提供一种AOX1a基因在提高植物耐旱性方面的应用，将所述AOX1a基因应用于提高植物的耐旱性，所述AOX1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述植物为番茄。

进一步地，所述用途包括培育具有抗旱性增强目的性状的番茄植株。

本发明还提供一种提高植物耐旱性的方法，包括通过转基因技术，将AOX1a基因在植物体内进行过表达，所述AOX1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述植物为番茄。

进一步地，所述方法包括以下步骤：AOX1a过量表达载体的构建；农杆菌介导的番茄的遗传转化；转基因植株鉴定。

进一步地，所述方法还包括以下步骤：对所述的转基因植株进行干旱胁迫处理，观察植株抗旱表型进行筛选。

本发明的有益效果在于，通过将AOX1a基因应用于提高植物耐旱性，解决了现有的野生型植物对于环境胁迫，特别是干旱胁迫条件下，表现出较低的耐受性的问题。改良后的番茄植株生长正常、产量不受影响、具有较强胁迫耐受性。

附图说明

图1是本发明实施例的实验技术路线图；

图2是AOX基因的各亚型(AOX1a、AOX1b、AOX2)的序列对比图；

图3是AOX1a过量表达载体及AOX-RNAi沉默载体构建示意图；

图4是pMD19-T中间载体酶切鉴定和PBI121表达载体连接与酶切鉴定；

图5是利用qRT-PCR的方法分析野生型番茄和AOX1a过表达植株的AOX1a基因表达量；

图6是利用qRT-PCR的方法分析野生型番茄和RNAi植株的AOX1a基因表达量；

图7是干旱胁迫第14天ACC预处理后的番茄植株的表型的照片；

图8是对野生型和转基因番茄植株的相对含水量测定；

图9是对野生型和转基因番茄植株的电导率缺失率测定；

图10是对野生型和转基因番茄植株的过氧化氢含量测定；

图11是对干旱胁迫应答途径的标记基因P5CS1的表达水平变化进行QT-PCR分析；

图12是对干旱胁迫应答途径的标记基因NCED3的变化进行QT-PCR分析；

图13是对干旱胁迫应答途径的标记基因RD29A的表达水平变化进行QT-PCR分析；

图14是本发明实施例对干旱胁迫应答途径的标记基因RD29B的表达水平变化进行QT-PCR分析；

图15是荧光定量PCR引物列表。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例提供一种提高植物耐旱性的基因AOX1a(Alternative oxidase1a)，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述核苷酸序列为CDS序列，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。将AOX1a基因应用于培育具有抗旱性增强目的性状的转基因植物，改良后的番茄植株生长正常、产量不受影响、具有较强胁迫耐受性。

本发明实施例的实验技术路线如图1所示，包括以下步骤：

1目的基因的克隆

1.1番茄总RNA的提取

①取1g番茄叶片置于已灭菌的研钵中，加入适量的液氮快速研磨；

②将研磨后的材料转入1.5mL离心管中，加入500μL苯酚、氯仿、异戊醇的混合液(苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1)、500μL RNA提取液[20mM Tris-HCl(pH 8.0)，1％(W/V)SDS，200mM NaCl，5mM EDTA]及2v％β-巯基乙醇，最后再向离心管中加入200μL无水乙醇；在旋涡振荡器上混匀30s左右使蛋白质充分变性；

③4℃，12000rpm，离心10min；

④取上清，加入1/2体积的8M LiCl，-20℃沉淀30min；

⑤4℃，12000rpm，离心10min，收集沉淀；

⑥沉淀用70v％乙醇清洗1～2次，真空干燥；

⑦加入50μL ddH₂O保存于-20℃冰箱中，备用。

1.2反转录合成cDNA

所有RNA在反转录以前用Dnase I进行酶切消化除去DNA。然后采用SuperScriptIIIReverse Transcriptase(Invitrogen)在20μL体系中进行反转录，合成第一链cDNA。具体步骤如下：

①向0.5mL EP管中加入4μL RNA，1μL Oligdt，1μL dNTP，补水至14μL，短暂离心混匀后，65℃水浴5～10min；取出置冰上冷却；

②加入4μL 5×buffer，1μL DTT，0.5μL Rnaseout，混匀，37℃水浴2min；

③加入0.5μL M-MLV，37℃水浴1h；

④70℃水浴15min，终止反应。

1.3 AOX基因片段的扩增

为了构建AOX1a超表达载体，参照NCBI上AOX1a基因(accession numberAY034148)的序列设计引物，扩增其全部开放阅读框(Open reading frame,ORF)。具体引物序列如下：

AOX1a基因扩增引物：

AOX1a-F:5'-TATTTGCCTTCTTCCTCAAGTTTC-3'

AOX1a-R:5'-AAAAAGGAACAAAATAGTGACGGAC-3'

含BamHI和ECoRI酶切位点的AOX1a基因扩增引物：

AOX1a-F:5'-CGCGGATCCTATTTGCCTTCTTCCTCAAGTTTC-3'(BamHI)

AOX1a-R:5'-CCGGAATTCAAAAAGGAACAAAATAGTGACGGAC-3'(ECoRI)

PCR扩增利用TAKARA Primer STAR HS高保真酶进行。PCR扩增体系：共50μL，其中5μL 10×rTaq DNA buffer，3μL MgCl₂(2.5mmol·L-1)，模板为2μL，上下游引物各2μL，1μLrTaq DNA聚合酶(2.5U/μL)及2μL的dNTP(2.5mmol·L^-1)，再加ddH₂O至50μL。

反应程序为：95℃预变性3min，接下来反应30个循环(94℃，1min；54℃，30s；72℃，50s)，最后72℃延伸10min。

为了构建AOX沉默载体，本实验先对AOX基因各亚型(AOX1a，AOX1b和AOX2)序列进行比对，取同源序列设计引物(图2)，具体如下：

正向片段：

AOX-UF：5'-TGTATTTTTTCAGAGGAGATATGGT-3'

AOX-UR：5'-ATTATTAGTCGCTTAGTGATACCCA-3'

反向片段：

AOX-DF：5'-AGAGCAATGATGTTAGAGACAGTGG-3'

AOX-DR：5'-GCTTAGTGATACCCAAGTGGTGCTG-3'

引入酶切位点的引物：

正向片段：

AOX-UF：5'-CCCCCGGGGGTGTATTTTTTCAGAGGAGATATGGT-3'(SmaI)

AOX-UR：5'-CGCGGATCCATTATTAGTCGCTTAGTGATACCCA-3'(BamHI)

反向片段：

AOX-DF：5'-CCCCCGGGGGAGAGCAATGATGTTAGAGACAGTGG-3'(SmaI)

AOX-DR：5'-CCGGAATTC GCTTAGTGATACCCAAGTGGTGCTG-3'(EcoRI)

PCR扩增体系同前文所述，退火温度分别为：正向片段53℃；反向片段54℃。

2载体构建(如图3所示)

2.1 PCR产物纯化回收

使用PCR产物纯化试剂盒(上海生工公司)回收并纯化扩增产物。

具体纯化步骤如下：

①将切下的凝胶称重，加入等体积的B2溶胶液，50℃水浴8min。水浴过程中上下颠倒混匀，使胶完全溶解为止。

②将溶解液转入纯化柱子中，9 000rpm离心l min，弃去甩出液。

③加入500μL漂洗液，室温放置3min，然后9000rpm离心l min，弃去甩出液。

④重复一次步骤③。

⑤室温下12000rpm离心2min，将柱中的残留液体甩干。

⑥加入30～50μL ddH2O，室温放置5min，然后12000rpm离心2min，收集甩出液。

2.2与pMD19-T载体连接

按照pMD19-T载体说明书进行。在0.5mL PCR管中依次加入以下成分，然后于14℃恒温水浴锅中连接过夜。具体如下：

纯化的DNA片段(2μg/μL)4.5μL

Solution I 5μL

pMD19-T vector 0.5μL

总体积10μL。连接pMD19-T载体是将其作为中间载体，后续连接到表达载体上进行操作。具体如下：

将pMD19-T载体用BamHI/EcoRI双酶切，回收大片段。同时对鉴定成功的AOX1a的PCR片段用BamHI/EcoRI双酶切后，用T4连接酶与回收的pMD19-T载体大片段进行连接反应，即为AOX1a中间载体。另外，用BamHI/SmaI和SmaI/EcoRI分别对AOX的正向片段、反向片段进行双酶切后，用T4连接酶与回收的pMD19-T载体大片段进行连接反应，即为AOX-RNAi中间载体。

2.3植物表达载体的构建——质粒的酶切与连接(图4)

2.3.1 PBI121质粒的双酶切

用BamHI和ECoRI对表达载体PBI121进行双酶切，回收目的片段。具体操作方法如下：质粒5μL、BamHI 1μL、EcoRI 1μL、10×Q cut buffer 2μL、dd H₂O 11μL，反应总体积为20μL，混匀后37℃水浴过夜。琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，然后用凝胶回收试剂盒(GIANGEN，北京)回收目的片断，备用。

2.3.2 AOX1a过量表达载体的构建

①用BamHI和ECoRI对pMD19-T质粒进行双酶切，回收目的基因片段。

②将回收的目的基因片断与PBI121回收片断用T4连接酶进行连接反应。考虑到插入目的基因与载体DNA之间的摩尔比例差别较大，因此模板和载体的加样量要根据回收片断的浓度作调整。

目的基因片断10μL

PBI121回收片断2μL

T4DNA ligase 1μL

10×buffer 2μL

dd H₂O 5μL

以上样品混匀后，14℃空气浴连接过夜。以备转化用。

2.3.3 AOX-RNAi表达载体的构建

①用BamHI/EcoRI对pMD19-T质粒进行双酶切，回收目的基因片段。

②将回收的目的基因片断与PBI121回收片断用T4连接酶进行连接反应。具体操作与AOX1a过量表达载体连接相同。

以上样品混匀后，14℃空气浴连接过夜。以备转化用。

2.4转化大肠杆菌

①将10μL连接产物加入到100μL感受态细胞中，轻轻摇匀，冰上放置30min；

②42℃水浴中热激90s，热激后迅速置于冰上冷却3～5min；

③向管中加入200μL液体LB培养基，静置l min后，将其放入摇床37℃培养l h，使细菌恢复正常生长。

④取出5000g离心l min，弃上清；加入200μL液体LB培养基。

⑤将上述菌液摇匀后涂布于含有50mg/mL抗生素的固体LB培养基上筛选，37℃培养过夜。

2.5重组质粒的鉴定

待菌落长出后挑单菌落进行重组质粒鉴定，包括菌落(菌液)PCR挑选阳性菌株，提取质粒测序并进行序列比对。具体步骤如下：

①挑单菌落(5～10个)接种到含有抗生素的LB液体(3～5mL)中，37℃摇床(200rpm)震荡培养10～12小时，培养后的菌液进行菌液PCR，鉴定是否成功将片段连接到载体上；

②取1μL菌液作为模板，以目的片段克隆引物和擎科2×TsingKe Master Mix(Red，TSE001)为反应组分进行菌液PCR，PCR反应程序为95℃预变性3min，接下来反应30个循环(94℃，1min；54℃，30s；72℃，50s)，最后72℃延伸10min；

③取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，挑出与阳性对照目的条带一致的菌株作为阳性克隆；

④将阳性克隆菌株菌液一部分保存菌种，另一部分提取质粒或直接送至测序公司进行测序；

⑤待测序结果返回后，将测序序列与目的基因序列进行比对，留存完全匹配的阳性菌株作为构建成功的重组载体。

也可提取质粒进行质粒PCR，质粒的提取按质粒提取试剂盒(上海生工公司)进行，具体如下：

①取4mL过夜培养的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清；

②用250μL已经加入RNase A的buffer P1悬浮细菌沉淀，悬浮应均匀，不应留有小菌块。

③加入250μL buffer P2，温和并充分地上下翻转混合4～6次，使菌体充分裂解，直到形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min；

④加入350μL buffer P3，温和并充分地上下翻转混合6～8次，12000rpm离心10min；

⑤吸取步骤④中的上清液并转移到DNA吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液；

⑥向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm离心30s，弃滤液；

⑦重复步骤⑥；

⑧12000rpm离心2min以除尽漂洗液；

⑨加入30μL ddH₂O，室温静置3min，12000rpm离心1min，洗脱DNA。

如果PCR结果正确，将菌液或质粒送测序公司进行测序，本实验所有测序均由上海生工公司完成。

2.6农杆菌转化

测序正确的质粒进行农杆菌转化，具体方法如下：1.5uL的质粒加入50uL农杆菌感受态细胞(GV3101)，冰上放置30min，液氮冷冻5min。37℃水浴热激5min，加入1mL的LB液体培养基，放入摇床中，28℃条件下振荡培养3-4h，3000rpm离心3min弃800uL上清，200uL混匀涂板晾干、封口、28℃倒置培养1-2d。

3农杆菌介导的番茄的遗传转化

3.1外植体的准备

①种子的消毒

将番茄种子用灭菌水反复冲洗3～5遍后，用75v％酒精浸泡1min，灭菌水漂洗3～5次；接着用1％(W/V)次氯酸钠浸泡8min，再用灭菌水漂洗3～5次，播种在MS培养基上。

②将消毒后的种子置于26℃(16h光照)/18℃(8h黑暗)光照培养箱中培养。

③待种子发芽后，第一片真叶尚未萌出时，切取子叶用于遗传转化实验。

3.2预培养

①用已灭菌的刀片将子叶两端切掉，留取中央部分，长度不超过于1cm。

②将外植体正面朝下，置于预培养基上。

③26℃，黑暗条件(或弱光照)下培养1～2d。

3.3重组农杆菌的准备

取已鉴定的重组农杆菌，接种于4mLLB液体培养基(含50mg/L Kana和50mg/L Rif)中，28℃震荡(200rpm)培养。当OD600达到0.1～0.5时，取出收集菌体(3000rpm离心5min)，再用适量的诱导培养基重悬、稀释菌体，使OD600值为0.1左右，用于转染。

3.4农杆菌转染与共培养

将预培养后的外植体，浸泡到诱导培养基稀释的农杆菌菌液中，15min后取出，期间不停地振荡混匀。用已灭菌的滤纸吸去多余的菌液，然后放入共培养基中，封口，黑暗条件下共培养2d。

3.5再生培养(诱导丛生芽)

黑暗培养2d后，将外植体转到含有相应抗生素的筛选培养基上，置于26℃(16h光照)/18℃(8h黑暗)光照培养箱中培养，直到长出丛生芽。期间每2～3周更换一次培养基。

3.6生根培养

对抗性筛选获得的绿色的生长良好的丛生芽，用已灭菌的刀片切取小芽，转入到生根培养基中培养筛选。同样置于26℃(16h光照)/18℃(8h黑暗)光照培养箱中培养，直到幼芽生根长高。获得的阳性转化苗用于PCR鉴定。

4.转基因植株鉴定

4.1转基因植株总DNA的提取

选取生长良好的具有抗性的转基因植株，提取总DNA，具体方法如下：

①取1g番茄叶片，加液氮快速研磨成粉，转入到2mL EP管中，加入650μL CTAB提取液，10μLβ-巯基乙醇，上下颠倒混匀。

②置于65℃水浴45min，期间上下颠倒几次(不要太剧烈，缓慢轻摇)。

③取出，放冰上5min。

④加入650μL氯仿：异戊醇(体积比为24:1)，颠倒混匀，使其成乳浊状。

⑤12000rpm，离心10min，取上清。

⑥加入500μL氯仿：异戊醇(体积比为24:1)，颠倒混匀，12000rpm，离心10min，取上清。

⑦加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时或过夜。

⑧12000rpm，离心10min，收集沉淀，用70v％乙醇清洗两次。

⑨真空干燥，加100μL ddH₂O重悬DNA沉淀。再加入2μL RNase(10μg/mL)，37℃水浴1h。取出后加入200μL氯仿：异戊醇(体积比为24：1)，颠倒混匀，12000rpm，离心10min，取上清。

⑩加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时或过夜。12000rpm，离心10min，收集沉淀，用70v％乙醇清洗两次。真空干燥，加30～50μL的ddH₂O重悬DNA沉淀，保存于-20℃冰箱中，备用。

4.2转基因番茄的总RNA提取

方法同1.1

4.3转基因植株的抗性基因PCR检测

以新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因设计引物，具体如下：

上游NPTII-F:5'-GAGAGGCTATTCGGCTATG-3'

下游NPTII-R:5'-CTCAGAAGAACTCGTCAAGA-3'

PCR反应条件为：94℃，5min；接下来35个循环(94℃，50s；58℃，30s；72℃，50s)；最后72℃延伸10min。

4.4利用qRT-PCR的方法分析转基因番茄AOX1a基因表达量。筛选出基因AOX1a过表达和AOX-RNAi沉默株系。

提取野生型番茄WT和AOX1a过表达植株及RNAi植株的总RNA，利用qRT-PCR分析AOX1a的基因表达量。通过农杆菌转染技术以及组织培养技术构建转基因番茄并筛选鉴定。如图5、图6所示，通过筛选一共得到6个过表达株系和4个沉默株系。其中，“Sl”为Solanumlycopersicum(番茄)的缩写，SlAOX1a-OE为番茄的AOX1a过表达株系。通过qPCR结果所示，6个过表达株系的AOX1a在转录水平均有显著的上调，其他成员如AOX1b和AOX2则无明显变化，且AOX1a上调最显著的2个过表达株系分别为#2和#5(OE-2#，OE-5#)，其中OE-2#中AOX1a上调了约5倍左右，OE-5#中AOX1a上调了约4倍左右。沉默植株中，AOX1a，AOX1b和AOX2均有不同程度的下调，沉默效果最显著的是13#和19#两个株系。

5抗旱性分析

取生长至3-4周大小的番茄幼苗分组，一组为3盘，一盘为20盆。ACC(1-氨基环丙烷羧酸1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)预处理采用预先配置好的1L溶液，内含番茄生长所需的各种大量元素及微量元素，将溶液倒入托盘中。对照即为不含ACC的营养液。浇完水后将植株放入光照培养箱中，不再浇水从而制造干旱的环境，持续14天。

5.1 AOX1a能响应乙烯信号和干旱胁迫

干旱胁迫第14天ACC预处理后的转基因AOX番茄植株的表型如图7所示。观察表明ACC预处理的AOX1a-RNAi19#的叶片萎蔫程度要明显大于WT和AOX1a-OE2#，AOX1a沉默突变体表现出更差的耐旱性，表明ACC和AOX1a都能参与调控干旱胁迫。

5.2胁迫条件下生理响应差异分析

相对含水量、电导率缺失率、过氧化氢含量都是逆境胁迫下重要的生理指标，我们测定了一系列的生理数据分析。

干旱胁迫下，植物体内的保持水分能力的变化，对WT和AOX1a相关遗传突变体的离体植株相对含水率进行了测定。方法如下：取对照组和胁迫处理后的番茄叶片，称其鲜重(FW)。然后将叶片浸入蒸馏水中，使叶片吸水达到饱和状态。取出叶片用吸水纸吸去表面水分，立即放置于称量瓶中称重得到饱和吸水重量(TW)，然后在105℃烘干后称得叶片组织干重(DW)，用以下公式计算叶片的相对含水量：相对含水量(％)＝(FW-DW)/(TW-DW)。测试结果如图8所示，实验结果表明，在AOX1a-OE中的相对含水量要远远高于WT和AOX1a缺失突变体。

植物细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是其最重要的功能之一。当植物在胁迫条件下时，细胞膜受到不同程度的破坏，膜的透性增加，选择透性丧失，细胞内部分电解质外渗。膜结构破坏的程度与逆境的强度、持续的时间、作物品种的抗性等因素有关。因此，质膜透性的测定常可作为逆境伤害的一个生理指标，广泛应用在植物抗性生理研究中。我们对AOX1a的相关突变体进行了电导率测定，方法如下：称取0.5g番茄叶片剪成0.5-1.0cm的组织切段，然后用去离子水将其洗净后，置于25mL带塞子的试管里，并加入约25mL去离子水，用真空泵抽气15分钟以抽出叶片表面及细胞间隙的空气(中途放气2-3次)。然后在室温下再定容至25mL，并静置1小时，用DDS-II型电导率仪测定电导率(Ri)。测定完后将样品管放置于沸水浴中5分钟以达到100％渗出，冷却到室温后再测定总电导率(Rt)，用相对电解质渗透率R0(％)＝Ri/Rt表示质膜透性。

测试结果如图9所示，结果表明在AOX1a过表达材料中的电导率低于对照组，而RNAi沉默材料电导率则高于对照组。

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H₂O₂发生累积。H₂O₂可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。我们对材料进行了H₂O₂含量测定，方法如下：

①取约0.5g番茄叶片置于研钵中，加入5mL的0.1％(W/V)三氯乙酸(TCA)，迅速研磨至匀浆；

②快速将匀浆转移至2mL EP管中，12000rpm，4℃，离心15分钟；

③取上清0.5mL转移至新的2mL EP管中，加入0.5mL 10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)，再加入1mL 1M KI，混匀并室温反应20分钟；

④使用酶标仪测定390nm处的吸光值，取TCA溶液作为空白对照；

⑤根据H₂O₂的OD390标准曲线，计算样品的H₂O₂含量(nmol·g^-1FW)。

测试结果图10所示，ACC预处理的过表达植株中H₂O₂含量显著低于对照组，而ACC预处理的沉默植株中H₂O₂则明显高于对照组。这一结果说明了，当AOX功能被抑制时，乙烯所诱导的耐旱性大大降低，而AOX功能增强时，乙烯所诱导的耐旱能力则有一定的增强，说明AOX1a参与了乙烯诱导的干旱胁迫，并且过表达AOX1a能够提高植物的抗旱性。

5.3分析胁迫条件下基因表达差异

长日照条件下生长3-4周的各基因型幼苗干旱胁迫处理，提取总RNA，反转录为cDNA后进行实时荧光定量PCR分析。实时荧光定量PCR实验所用试剂盒为Trans StartGreen qPCR SuperMix(Transgen)，按照产品说明书加入反应体系，利用特异性引物扩增干旱胁迫响应基因；PCR反应在荧光定量PCR仪BIO-RAD CFX ConnectTM Real-Time System上进行。管家基因Actin作为内参基因，采用△△C_T方法计算待测基因的相对表达水平，即根据每个PCR反应中荧光信号达到设定阈值的PCR循环数(CT值)进行分析，以Actin作为内参，计算每个样品的△C_T＝(C_{T,interesting} _gene-C_T,atcin)，然后计算△△C_T＝(△C_T-△C_T,wt(0h))，待测基因的相对表达量＝2-△△C_T。以不作任何处理的野生型WT为1.0，计算各突变体及各处理相对于WT的相对表达量。独立重复三次实验，取△△C_T平均值进行计算。

干旱胁迫可以诱导ABA(脱落酸abscisic acid)的合成，ABA通过激活下游响应基因介导植物对胁迫的响应，这些调控ABA合成和ABA响应的调控基因表达的变化可以一定程度上反应ABA信号和胁迫应答信号的变化。因此，我们检测了AOX1a相关突变体植株中ABA合成关键基因和介导胁迫应答的ABA响应标志基因的表达，这些基因包括P5CS1、NCED3、RD29等。上述基因的荧光定量PCR引物列表如图15所示。如图11至图14所示，实验结果表明，干旱胁迫可以诱导这些基因的表达，但其表达量在AOX1a2#与AOX1a5#中要显著高于WT，说明AOX1a过表达植株都具有较强的干旱抗性。

由此可知，AOX1a基因参与乙烯诱导的耐旱性，且能够提高植物的干旱耐受力，对于转基因工程具有很好的应用前景。

上述实施例仅为优选实施例，并不用以限制本发明的保护范围，在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川大学

<120> AOX1a基因在提高植物耐旱性方面的应用

<130> ZX19044

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1482

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

tatataaaat gagtgtattt cattaaagaa attattacca tcacatataa taaaatatat 60

atatataata ttattatttg ccttcttcct caagtttctt tccaaacttc cggcgaacat 120

tttttttgat tccagatttt gatcggaagt tatcaaacat gatgacccgt ggagcaacaa 180

ggatgacacg agttgtcatg ggtcatatgg gtccacgtta cttttcaact acagttctgc 240

gaaataatcc cgggaccgga gttgttgttg gagtcgctgc cggacttttg catggttttc 300

cggcgaatcc atcggagaaa gtggcagtaa cgtgggttag gcatttttcg gctatgggtt 360

cacggagcgc tagtactgcg gctttgaatg ataagcaaca agagaaggaa agtagtgaca 420

aaaaagtgga gaacaccgcc accgccaccg ccgctgtaaa cggtggtgtt ggtaaatctg 480

tggtgagtta ttggggggtt cctccttcaa aggctactaa accagatggt actgaatgga 540

aatggaattg ttttaggcca tgggagactt atgaagctga tatgtcgata gatttgacga 600

aacaccatgc gcctgtaacg tttttggata aatttgctta ttggactgtt aagatccttc 660

gtttccccac tgatgtattt tttcagagga gatatggttg cagagcaatg atgttagaga 720

cagtggcggc ggtgcctgga atggtgggag gtatgttgtt gcattgtaag tcattgaggc 780

gattcgaaca gagtggtgga tggatcaaag ctctgttaga agaagctgaa aacgagagga 840

tgcatttgat gactttcatg gaagttgcaa agccaaatgt atacgaacgt gctctggttt 900

tcgcagtgca aggcgtcttc ttcaacgctt actttgctgc ataccttatt tccccaaaat 960

tggctcatcg tatcgtcgga tatttggaag aagaggctgt acattcgtac accgagttcc 1020

tcaaggaatt ggacaatggt aacattgaga acgttcctgc tcccgctatt gctattgatt 1080

actggcgact gcctaaggat gccactctcc gcgatgttgt cttggttgtt cgggctgatg 1140

aggctcatca tcgcgatgtc aaccactatg catctgacat tcattaccaa ggacaacagc 1200

tgaaggactc accagcacca cttgggtatc actaagcgac taataataaa tacaaagata 1260

tgacttatca agctaaaagt ccgtcactat tttgttcctt tttttgaact ggtaatagag 1320

aatatgtagt aggtattact aatctcgaat gttgatgtac atatttttgt gtggatttgg 1380

ttcgttcttt gctgcctctt catcgataag aggtagagta ggatgacctc tgtatcctat 1440

atattcttga tgaaattata tcatcttttt gtctacttga at 1482

<210> 2

<211> 358

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

Met Met Thr Ala Gly Ala Thr Ala Met Thr Ala Val Val Met Gly His

1 5 10 15

Met Gly Pro Ala Thr Pro Ser Thr Thr Val Leu Ala Ala Ala Pro Gly

20 25 30

Thr Gly Val Val Val Gly Val Ala Ala Gly Leu Leu His Gly Pro Pro

35 40 45

Ala Ala Pro Ser Gly Leu Val Ala Val Thr Thr Val Ala His Pro Ser

50 55 60

Ala Met Gly Ser Ala Ser Ala Ser Thr Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly

65 70 75 80

Gly Gly Leu Gly Ser Ser Ala Leu Leu Val Gly Ala Thr Ala Thr Ala

85 90 95

Thr Ala Ala Val Ala Gly Gly Val Gly Leu Ser Val Val Ser Thr Thr

100 105 110

Gly Val Pro Pro Ser Leu Ala Thr Leu Pro Ala Gly Thr Gly Thr Leu

115 120 125

Thr Ala Cys Pro Ala Pro Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Met Ser Ile

130 135 140

Ala Leu Thr Leu His His Ala Pro Val Thr Pro Leu Ala Leu Pro Ala

145 150 155 160

Thr Thr Thr Val Leu Ile Leu Ala Pro Pro Thr Ala Val Pro Pro Gly

165 170 175

Ala Ala Thr Gly Cys Ala Ala Met Met Leu Gly Thr Val Ala Ala Val

180 185 190

Pro Gly Met Val Gly Gly Met Leu Leu His Cys Leu Ser Leu Ala Ala

195 200 205

Pro Gly Gly Ser Gly Gly Thr Ile Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ala Gly

210 215 220

Ala Gly Ala Met His Leu Met Thr Pro Met Gly Val Ala Leu Pro Ala

225 230 235 240

Val Thr Gly Ala Ala Leu Val Pro Ala Val Gly Gly Val Pro Pro Ala

245 250 255

Ala Thr Pro Ala Ala Thr Leu Ile Ser Pro Leu Leu Ala His Ala Ile

260 265 270

Val Gly Thr Leu Gly Gly Gly Ala Val His Ser Thr Thr Gly Pro Leu

275 280 285

Leu Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ile Gly Ala Val Pro Ala Pro Ala Ile

290 295 300

Ala Ile Ala Thr Thr Ala Leu Pro Leu Ala Ala Thr Leu Ala Ala Val

305 310 315 320

Val Leu Val Val Ala Ala Ala Gly Ala His His Ala Ala Val Ala His

325 330 335

Thr Ala Ser Ala Ile His Thr Gly Gly Gly Gly Leu Leu Ala Ser Pro

340 345 350

Ala Pro Leu Gly Thr His

355

Claims

1.AOX1a基因在提高植物耐旱性方面的应用，其特征在于，将所述AOX1a基因应用于提高植物的耐旱性，所述AOX1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述植物为番茄。

2.如权利要求1所述的AOX1a基因在提高植物耐旱性方面的应用，其特征在于，所述用途包括培育具有抗旱性增强目的性状的番茄植株。

3.一种提高植物耐旱性的方法，其特征在于，通过转基因技术，将AOX1a基因在植物体内进行超表达，所述AOX1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述植物为番茄。

4.如权利要求3所述的提高植物耐旱性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：AOX1a过量表达载体的构建；农杆菌介导的番茄的遗传转化；转基因植株鉴定。

5.根据权利要求4所述的提高植物耐旱性的方法，其特征在于，还包括以下步骤：对所述的转基因植株进行干旱胁迫处理，观察植株抗旱表型进行筛选。