CN106636125A - 一种提高植物基础抗逆的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种提高植物基础抗逆的方法及其应用，属于植物抗逆领域。本发明利用生物技术上调植物体内ERF‑VII成员的表达量，ERF‑VII在植物体内的表达量上调后，植物的基础抗逆增加。ERF‑VII成员表达上调后，在各种非生物胁迫下，如干旱、强光、高温、重金属离子胁迫下，植物通过ERF‑VII上调活性氧合成关键基因RbohD的表达，并通过活性氧传递逆境信号，使植物更早地感应胁迫，上调相关胁迫响应基因，从而使植物对逆境的耐受性增强。本发明发现了过表达拟南芥ERF‑VII家族基因成员AtERF74能显著提高植物基础抗逆性，使植株通过更快迅速地ROS迸发传递信号，激活下游胁迫响应基因，响应环境胁迫。
Description
技术领域
本发明属于植物抗逆领域，特别涉及一种提高植物基础抗逆的方法及其应用。
背景技术
随着气候变暖和温室效应日益严重，植物和作物正面临着越来越多的环境胁迫，如干旱、水淹、高温、盐胁迫等，环境胁迫已成为限制作物产量的重要影响因素之一。
活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是氧分子在还原反应中产生的中间产物。其中，H2O2是ROS最重要的成员，其它形式的ROS都可以转化为H2O2，H2O2能够轻易地透过细胞膜和质膜，使其能在细胞内和细胞间自由流动。一方面，ROS对DNA、蛋白质、不饱和脂等大分子有明显的破坏作用，从而使蛋白质降解，膜脂过氧化，DNA断裂；另一方面ROS还作为一个重要的信号分子，参与调控植物的生长发育以及各种胁迫反应，如真菌入侵的防御、非生物胁迫的响应、气孔开合的调控和木质素的合成调控等。在植物正常生长中，ROS主要作为线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的代谢产物，而在逆境胁迫时，ROS可在细胞质中通过NADPH氧化酶(Respiratory burst oxidase homologue，Rboh)和细胞壁结合的三型过氧化物酶(cell wall bound type III peroxidases)产生。这种在植物抗逆早期迅速产生的ROS被称作为ROS迸发，而这种ROS信号的迸发可以被植物感知并作为警报信号往下游传递，从而启动各种胁迫应答机制。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种提高植物基础抗逆的方法。利用生物技术上调植物体内乙烯响应因子第七亚家族(ethylene responsefactor VII，ERF-VII)成员的表达量，ERF-VII在植物体内的表达量上调后，植物的基础抗逆增加。本发明涉及ERF-VII成员表达上调后，在各种非生物胁迫下，如干旱、强光、高温、重金属离子胁迫下，植物通过ERF-VII上调活性氧合成关键基因RbohD的表达，并通过活性氧传递逆境信号，使植物更早地感应胁迫，上调相关胁迫响应基因，从而使植物对逆境的耐受性增强。
本发明的另一目的在于提供上述提高植物基础抗逆的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提高植物基础抗逆的方法，通过使植物的ERF-VII家族基因上调，来提高植物的基础抗逆。
所述的ERF-VII家族基因上调为ERF74基因上调。
所述的ERF-VII家族基因上调为通过转基因技术上调ERF-VII家族基因成员，达到植物的基础抗逆目的。
所述的植物为拟南芥、杨树、桉树或水稻。
进一步的，所述的植物为拟南芥。
一种ERF-VII家族基因上调的植物，通过上述方法获得。
所述的ERF-VII家族基因上调的植物在正常种植，盐碱地和其他难于种植植物的土地种植。
所述的提高植物基础抗逆的方法在提高植物基础抗逆中的应用。
当前在植物抗逆的生理与分子调控研究中，已有很多研究表明逆境可导致H2O2的累积，且已发现H2O2能作为信号分子传递信号，使植物响应逆境。但对于H2O2在逆境中如何被迅速产生，如何作为信号进行传导和如何被消除的分子机制的研究仍十分缺乏。本发明的意义在于提出H2O2在逆境早期如何被ERF-VII家族成员调控，迅速迸发并传递信号使植物响应逆境。本发明通过提高ERF-VII家族成员的表达量，提高植物的基础抗逆。
本发明首先通过利用嵌合抑制基因沉默技术(Hiratsu et al.,2004)抑制拟南芥ERF-VII家族成员ERF71～ERF75的转录活性，研究ERF-VII家族在植物体中的功能。研究发现，ERF74dominant repressor(ERF74-DR)转基因植株对强光和干旱胁迫的耐受性大大降低。基于发明人的工作经验，发明人认为这种表型是由于植物体内ROS平衡受到破坏所造成的。通过对拟南芥基因组中ERF-VII家族成员的分析可知，拟南芥基因组中，ERF-VII家族共有5个成员，分别是ERF71～ERF75，基于现今对ERF-VII家族的研究进展，发明人认为在ERF-VII家族中ERF74，ERF75起到主要作用。进而发明人构建了35S::ERF74过表达植株，并从ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)订购到了erf74，erf75的突变体，并对它们进行杂交，最终得到erf74erf75双突变体植株。
将35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株进行干旱胁迫处理发现，erf74erf75突变体植株在干旱10天后已严重枯萎，erf74也有轻度枯萎症状，erf75则无明显枯萎症状，而35S::ERF74则长得比野生型更为健康。对以上植株浇水恢复3天后，35S::ERF74，WT，erf75植株表型得到恢复，而erf74erf75突变体植株则有一半的植株不能恢复表型而死亡，其他继续存活的植株也长得比野生型小。虽然大部分erf74突变体植株浇水后并没有死亡，但观察发现其部分叶子因失水而枯萎变黑。
接着对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株进行强光处理并观察表型，研究发现erf74erf75叶片已变为紫黑色，而过表达和野生型植株叶片依然为绿色，对以上植株叶片进行花青素含量测定发现erf75，erf74，erf74erf75植株的花青素含量比野生型上升了5～15倍，这表明erf75，erf74，erf74erf75植株受到不同程度强光胁迫。
为了进一步研究ERF74和ERF75是否在其他未研究的胁迫，如高温和重金属逆境起作用，发明者对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75的原生质体进行42℃高温处理，在高温处理0S、180S、600S、900S后，加入二乙酸荧光素(fluorescein diacetate，FDA)进行染色，并利用细胞流式仪测定原生质体的存活状况。从流式图中可以发现，35::ERF74过表达原生质体对高温有较高的耐受性，在高温处理900S后依然有50％的细胞存活，而erf74erf75突变体植株对高温的耐受性明显下降，在高温处理180S后就只有37.8％的细胞存活，而到了900S后存活的细胞只剩下20.9％。这表明ERF74和ERF75在高温胁迫的响应中起到重要作用。
发明者也对以上原生质体进行氯化铝处理，利用细胞流式仪测定细胞存活率。研究发现erf74，erf74erf75突变体在氯化铝处理下存活率出现不同程度的下降，35::ERF74过表达原生质体则对氯化铝处理有较高的耐受性。这表明ERF74和ERF75同样在重金属离子胁迫的响应中起到重要作用。
以上逆境处理实验结果表明，在拟南芥中过表达ERF-VII家族成员ERF74能提高植株对干旱、强光、高温和重金属离子的耐受性，而erf75，erf74，erf74erf75植株则对干旱、强光、高温和重金属离子的耐受性减弱。这表明ERF74和ERF75在植物抗逆中起到重要作用。
以下为ERF74和ERF75在植物抗逆中所起作用进行阐述。
运用qRT-PCR和反式激活方法分析ERF71～ERF75在胁迫处理和恢复时表达量的变化。研究发现ERF74和ERF75的表达量均受强光，干旱，高温和氯化铝诱导，表达量均大幅上升，且胁迫结束后，ERF74和ERF75的表达量很快下调到原来水平。而ERF71～ERF73的表达量虽然也会受到某种胁迫的的诱导，但诱导量总体不如ERF74和ERF75明显。ERF74和ERF75在逆境中表达量的上升表明其在植物胁迫中发挥重要作用。
为了研究在水淹，干旱和强光处理下，AtERF74在植物体内定位的变化，将AtERF74转入pEarleyGate101(p35S::AtERF74-GFP)形成融合蛋白。再转入农杆菌C58，侵染烟草叶片。在激光共聚焦显微镜下观察到AtERF74在正常情况下大部分定位在细胞膜中，而在水淹(水淹3h后马上在光共聚焦显微镜下观察)、干旱(转化前10天停止浇水，并持续到观察，共干旱13天)和强光(观察前36h放置300μmol·m-2·s-1光强的培养箱中)在处理下，AtERF74将会从细胞膜转移到细胞核中。这表明ERF74在植株正常生长条件下，定位在细胞膜中，不起转录激活作用，而当植物受到胁迫时，瞬间重定位到细胞核中。
对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体或植株进行高温、ABA、AlCl3、水淹、干旱和强光处理，并利用6-羧基-2,7-二氯荧光素乙酸乙酯(H2DCFDA，2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，一种非极性化学物，可自由扩散进入细胞，其被ROS氧化后会生成具有高荧光强度的DCF)对细胞进行染色，然后通过细胞流式仪对细胞体内ROS量进行检测。研究发现，erf75，erf74，erf74erf75原生质体的ROS早期迸发受到不同程度的抑制，而35S::ERF74原生质体早期的ROS迸发则出现得更早更强。这表明ERF74和ERF75对植株抗逆早期的ROS迸发起到不可或缺的作用。
RbohD(NADPH-dependent oxidase D)是植物产生ROS的重要基因，发明者利用qPCR和反式激活方法检测ERF74和ERF75的增加或缺少是否会影响RbohD在逆境条件下的表达量。研究表明，RbohD的表达量受到干旱，强光，水淹，高温和氯化铝胁迫的诱导，且这种诱导在35S::ERF74植株中有所增强，而在erf75，erf74，erf74erf75植株中有不同程度减弱。
此前已有多篇文章报道，ERF转录因子与GCC元件结合(Fujimoto et al.,2000)。通过启动子分析，发现RbohD上游1,709bp有一个GCC元件。发明者利用Gateway系统构建了1.876kb的RbohDpro1-LUC(含有GCC元件)和1.676kb的RbohDpro2-LUC(缺少GCC元件)两个载体并核35S::ERF71-75(ERF71-75-PUGW2)载体共同转入到拟南芥野生型原生质体细胞中。研究表明，ERF71，ERF73，ERF75对RbohD启动子有较弱的激活作用，而ERF74则对RbohD启动子有较强的激活作用。当RbohD启动子失去GCC元件后，ERF74的激活作用下降了60％。
为了获得AtERF74与RbohD结合的直接证据，发明者进行了凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)。ERF74蛋白与RbohD启动子的GCC元件混合后明显出现滞留条带，证实了ERF74与RbohD直接结合。当把GGCGGC序列突变成GGAGGA后，滞留条带消失；加入20倍和100倍不含有生物素标记的RbohD probe后，滞留条带亮度明显减弱，突变实验和竞争实验均表明ERF74与RbohD probe特异结合。综上所述。发明者通过反式激活实验和凝胶迁移实验证实了AtERF74通过GCC元件与RbohD直接结合。
发明者通过qPCR和反式激活检测发现水淹响应基因SUS4、LDH，干旱响应基因RD20，氯化铝响应基因AOX1a，高温响应基因HSP18.2的诱导均依赖于ERF74-Rbohd信号通路，当野生型植株或原生质体细胞经过30分钟的10μM DPI(RbohD抑制剂)预处理后，以上响应基因的诱导均受到抑制，运用rbohd突变体进行相似实验也出现同样的情况。而erf74erf75突变体也因为不能在胁迫中上调RbohD的表达，是逆境响应基因的诱导受到抑制。
另外，在杨树，桉树，水稻等植物中也存在ERF-VII家族，他们的过表达植株也有可预期的基础性抗逆提高的结果。ERF-VII家族基因的过表达植株在杨树，桉树，水稻等植物中也可以通过转基因获得。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
随着气候变暖和温室效应日益严重，环境胁迫已成为限制作物产量的重要影响因素之一。而随着经济的发展，我国可用耕地却越来越少。通过转基因增加树木，农作物的基础抗性则变相增加了树木和作物的产量，降低种植成本，使更多的干旱和重金属污染的土地适合种植树木和植物。对改善空气质量，水土流失，缓解粮食压力有着重要作用。本发明发现了过表达拟南芥ERF-VII家族基因成员AtERF74能显著提高植物基础抗逆性，使植株通过更快迅速地ROS迸发传递信号，激活下游胁迫响应基因，响应环境胁迫。
附图说明
图1是ERF74-DR转基因植株的表型。
图2是35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75在正常生长条件，干旱条件和强光条件的表型。
图3是35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体在热处理和氯化铝处理期间，细胞存活率随时间的变化图。
图4是AtERF74在正常生长条件，水淹，干旱和强光处理下的亚细胞定位图。
图5是35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株或原生质体在各种处理下，细胞体内平均ROS量随处理时间变化的曲线图。
图6是35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株在不同处理条件下，RbohD表达量变化图。
图7是35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体细胞在不同条件，RbohD基因表达量变化图。
图8是反式激活验证ERF74通过GCC元件与RbohD结合。
图9是凝胶滞留实验验证ERF74通过GCC元件与RbohD结合。
图10是逆境响应基因在不同逆境条件下表达量的变化。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1
将pERF74-ERF74转入PHGEAR载体中。再转入农杆菌C58，侵染拟南芥WT中，T1代潮霉素筛选得到阳性的转基因获得ERF74dominant repressor(ERF74-DR)转基因植株，观察表型，发现56.8％的转基因植株(ERF74-DR)出现叶片发黑现象，见图1(a)。进一步进行干旱(Drought)逆境试验，将ERF74-DR和WT植株正常浇水15天后，停止浇水15天，发现ERF74-DR植株枯死，而WT植株生长还较为正常，见图1(b)。
实施例2
将35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75种子播种后，正常生长。干旱试验为将15天正常生长的植株停止浇水15天后恢复浇水3天并观察表型，结果如图2所示，发现erf74，erf74erf75对干旱耐受性减弱，而35S::ERF74则对干旱耐受性增强。强光(HL)试验为将20天正常生长植株转移到强光条件下生长10天并观察表型。另将同时播种的植株在正常生长条件下生长作为对照。结果如图2所示，erf75，erf74，erf74erf75对强光耐受性减弱，35S::ERF74对强光耐受性增强。
实施例3
将将正常生长20～25天的35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株提取原生质体后，进行42度高温(Heat)和0.5mM氯化铝(Al)处理预定时间后，加入FDA进行染色，通过流式细胞仪进行检测原生质体细胞的死活。实验发现，结果如图3所示，35::ERF74过表达植株对高温有较高的耐受性，在高温处理900S后依然有50％的细胞存活，而erf74erf75突变体植株对高温的耐受性明显下降，在高温处理180S后就只有37.8％的细胞存活，而到了900S后存活的细胞只剩下20.9％。而氯化铝处理结果也与高温处理结果相近。
实施例4
为了研究在水淹(Flooding)，干旱和强光处理下，AtERF74在植物体内定位的变化，将AtERF74转入转入pEarleyGate101(p35S::AtERF74-GFP)形成融合蛋白。再转入农杆菌C58，侵染烟草叶片。在激光共聚焦显微镜下观察到AtERF74在正常情况下大部分定位在细胞膜中，而在水淹(水淹3h后马上在光共聚焦显微镜下观察)、干旱(转化前10天停止浇水，并持续到观察，共干旱13天)和强光(观察前36h放置300μmol·m-2·s-1光强的培养箱中)在处理下，AtERF74将会从细胞膜转移到细胞核中，结果如图4所示。
实施例5
对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体或植株进行高温、ABA(脱落酸)、AlCl3、水淹、干旱和强光处理，并利用6-羧基-2,7-二氯荧光素乙酸乙酯(H2DCFDA，2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate)对细胞进行染色，然后通过细胞流式仪对细胞体内ROS量进行检测。
首先，对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体进行20μM ABA处理，结果如图5(b)所示。ABA不算是一种逆境胁迫，只是一种与ROS产生相关的转导信号。在ABA处理原生质体仅7分钟时，35S::ERF74，WT，erf75原生质体就产生非常明显的ROS迸发，而erf74只产生少量ROS迸发，而erf74erf75几乎观察不到有ROS迸发的产生，直到ABA处理15分钟时，才在erf74erf75原生质体中观察到较明显的ROS迸发。而到了ABA处理60分钟时，发现erf74，erf74erf75植株的ROS总量明显高于35S::ERF74和WT植株。
接着对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体细胞进行了42℃高温处理，结果如图5(a)所示。在高温处理45s时，所有的原生质体细胞均有不同程度的ROS迸发出现，到180s时出现ROS迸发的顶峰。此时，35S::ERF74原生质体细胞的ROS迸发强度明显高于WT。而erf74和erf74erf75原生质体细胞只有较弱的ROS迸发出现。到了420s，所有原生质体细胞的ROS迸发基本消失，并保持平稳。420s后erf74和erf74erf75原生质体细胞内ROS有少量上升，而35S::ERF74原生质体细胞内ROS却有所减少
然后对35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体细胞进行0.5mM氯化铝处理，结果如图5(c)所示。研究发现在氯化铝处理原生质体5～10分钟时，35S::ERF74，WT原生质体细胞就产生非常明显的ROS迸发，而erf74，erf75和erf74erf75原生质体细胞只产生少量ROS迸发。到了氯化铝处理60分钟时，erf74，erf74erf75原生质体细胞的ROS总量远远高于35S::ERF74和WT原生质体细胞。发明者对以上植株进行水淹，干旱，强光试验，结果如图5(d)～(f)所示，也得到相类似的结果。
实施例6
利用qPCR检测ERF74和ERF75的增加或缺少是否会影响RbohD在逆境条件下的表达量。通过提取35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75植株在各处理时间段的叶片RNA，并反转录成cDNA，最后通过qPCR进行分析发现，RbohD的表达量受到干旱，强光和水淹条件的诱导，且这种诱导在35S::ERF74植株中有所增强，而在erf75，erf74，erf74erf75植株中有不同程度减弱，结果如图6所示。
接着将RbohD约1.8kb启动子连到Luciferase报告基因中(pRbohD-LUC)，并将此载体(pRbohD—PUGW35)分别转入35S::ERF74，WT，erf74，erf75，erf74erf75原生质体细胞中，然后对以上原生质体细胞进行42℃高温处理5分钟，20μM ABA和0.5mM氯化铝处理15分钟，然后检测LUC报告基因的荧光强度，结果如图8所示。研究发现在氯化铝，ABA和高温处理下，pRbohD-LUC报告基因的荧光强度都有所增高，但RbohD在erf74，erf74erf75突变体中的诱导则受到了不同程度的抑制。
实施例7
通过启动子分析，发现RbohD上游1,709bp有一个GCC元件，此前已有多篇文章报道，ERF转录因子与GCC元件结合(Fujimoto et al.,2000)。所以发明者利用Gateway系统构建了1.876kb的RbohDpro1-LUC(含有GCC元件)和1.676kb的RbohDpro2-LUC(缺少GCC元件)两个载体。发明者将这两个载体和35S::ERF71-75(ERF71-75-PUGW2)载体分别转入野生型原生质体细胞中。研究发现，结果如图7所示，ERF71，ERF73，ERF75对RbohD启动子有较弱的激活作用，而ERF74则对RbohD启动子有较强的激活作用。当RbohD启动子失去GCC元件后，ERF74的激活作用下降了60％。
为了获得AtERF74与RbohD结合的直接证据，进行了凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)。首先通过大肠杆菌，原核表达出GST-ERF74融合蛋白。结果如图9所示，凝胶迁移实验表明ERF74蛋白与RbohD启动子的GCC元件混合后明显出现滞留条带，证实了ERF74与RbohD直接结合。而当发明者把GGCGGC序列突变成GGAGGA后，滞留条带消失；加入20倍和100倍不含有生物素标记的RbohD probe后，滞留条带亮度明显减弱，突变实验和竞争实验均表明ERF74与RbohD probe特异结合。
通过qPCR和反式激活检测发现水淹响应基因SUS4、LDH，干旱响应基因RD20，氯化铝响应基因AOX1a，高温响应基因HSP18.2的诱导均依赖于ERF74-Rbohd信号通路，当野生型植株或原生质体细胞经过30分钟的10μM DPI(RbohD抑制剂)预处理后，以上响应基因的诱导均受到抑制，运用rbohd突变体进行相似实验也出现同样的情况。而erf74erf75突变体也因为不能在胁迫中上调RbohD的表达，是逆境响应基因的诱导受到抑制，结果如图10所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种提高植物基础抗逆的方法，其特征在于：通过使植物的ERF-VII家族基因上调，来提高植物的基础抗逆。
2.根据权利要求1所述的提高植物基础抗逆的方法，其特征在于：
所述的ERF-VII家族基因上调为ERF74基因上调。
3.根据权利要求1所述的提高植物基础抗逆的方法，其特征在于：
所述的ERF-VII家族基因上调为通过转基因技术上调ERF-VII家族基因成员，达到植物的基础抗逆目的。
4.根据权利要求1～3任一项所述的提高植物基础抗逆的方法，其特征在于：所述的植物为拟南芥、杨树、桉树或水稻。
5.根据权利要求1～3任一项所述的提高植物基础抗逆的方法，其特征在于：所述的植物为拟南芥。
6.一种ERF-VII家族基因上调的植物，其特征在于通过权利要求1～5任一项所述的方法获得。
7.根据权利要求6所述的ERF-VII家族基因上调的植物，其特征在于：
所述的ERF-VII家族基因上调的植物在正常种植，盐碱地和其他难于种植植物的土地种植。
8.权利要求1～5任一项所述的提高植物基础抗逆的方法在提高植物基础抗逆中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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