CN110272493A

CN110272493A - 靶向cd19的特异性嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和临床应用

Info

Publication number: CN110272493A
Application number: CN201910484370.XA
Authority: CN
Inventors: 代红久; 李艳云
Original assignee: Nanjing Kaidi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Kaidi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-06-05
Filing date: 2019-06-05
Publication date: 2019-09-24

Abstract

本发明涉及一种靶向CD19的特异性嵌合抗原受体T细胞及制备方法和临床应用。本发明基于靶向人CD19单链抗体序列构建靶向CD19特异性嵌合抗原受体以及其修饰的免疫应答细胞，该新型的修饰的免疫应答细胞能有效地靶向攻击多种肿瘤细胞，尤其是表达CD19阳性肿瘤细胞，可用来制备用于治疗肿瘤的制剂。本发明的靶向CD19的修饰的免疫应答细胞制备方法步骤简单，获得的靶向CD19的修饰的免疫应答细胞对肿瘤细胞的杀伤率高，经临床验证在百万级低剂量回输后，复发难治晚期CD19阳性淋巴瘤患者两周后获得临床症状明显缓解、于第77天获得接近完全缓解疗效，无细胞因子释放综合症引起的发热及任何神经毒性副反应发生。

Description

靶向CD19的特异性嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和临床应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗生物医药技术领域，涉及特异性嵌合抗原受体T细胞。

背景技术

随着生物技术的飞速发展，免疫细胞治疗已成为癌症治疗领域的第四大疗法。

癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫检验点阻断治疗等。其中，在细胞治疗领域，嵌合抗原受体修饰的免疫细胞(特别是ChimericAntigen Receptor T-Cell，CAR-T)疗法无疑已成为研究机构和制药公司争相“追捧”的明星。

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受体修饰的T细胞)为代表的免疫疗法，其原理主要是通过基因工程手段对病人自身提取的T细胞进行嵌合抗原受体的修饰形成CAR-T细胞，该T细胞能特异性地识别肿瘤表面相关抗原(肿瘤细胞标志物)，从而靶向杀伤肿瘤。相对于常规免疫细胞，CAR-T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性都更高，并且可以克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。该以CAR-T细胞为代表的修饰免疫细胞疗法在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显着的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

CAR-T免疫疗法是目前最具颠覆性潜力的新兴技术之一，欧美及亚洲各国都在积极开展该疗法的临床试验，其中中国开展临床试验项目最多，达204项，占据了全球CAR-T疗法临床试验的50％。宾夕法尼亚大学医院、费城儿童医院、美国癌症研究院(NCI)、FredHutchinson癌症研究中心、纪念斯隆凯特琳癌症中心和西雅图儿童医院等是最早开展CAR-T细胞疗法的研究机构。新兴国际生物制药公司如Juno、Kite、Celgene、Cellectis、Bluebird，传统国际制药巨头如诺华、百时美施贵宝、辉瑞、强生、吉利德等都投入了大量资金和人力到CAR-T疗法的研发中，其中KITE和诺华公司所研发靶向CD19CART新药产品KTE-C19和CTL-019因为突出疗效先后获得FDA批准。

然而到目前为止，靶向CD19的CAR-T产品普遍存在因细胞因子释放综合症引起的发热或神经毒性副反应，为该产品的广泛临床使用和临床治疗带来较大的挑战。合成生物学技术的兴起和应用，为肿瘤的CAR-T免疫治疗提供更多开发安全、高效的CAR-T的选择，为开发更安全CAR-T新疗法和药物的开发提供了启示。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明的目的是为了克服现有CAR-T临床技术中面临的因细胞因子释放综合症(CRS)引起的发热和神经毒性副反应对患者带来临床治疗安全性问题及低剂量CAR-T治疗药效不明显的挑战，提供靶向人CD19的嵌合抗原受体、及其基因和重组表达载体、工程化的CD19靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其临床应用。本发明的工程化的CD19靶向性的免疫应答细胞能够地提高肿瘤细胞的杀伤效率和临床治疗安全性、有效性，从而提供了一种具有应用前景的安全可靠、高效肿瘤治疗的新手段。

第一方面，本申请提供了一种靶向结合人CD19的单链抗体蛋白或其变体，其包含选自下组的序列：

(1)SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7、所示的抗人CD19单链抗体蛋白的氨基酸序列，或(2)(1)经过氨基酸修饰产生的变体。

发明人经过创造性劳动，不断地进行氨基酸序列设计以及序列的排列组合和筛选，对近数十条CAR分子序列进行随机筛选试验和靶向性功能验证(例如构建病毒载体，以及进一步感染T细胞，获得修饰的T细胞，并检测所得修饰的T细胞的体外杀伤活性等试验)，之后根据多个随机组合的结果比对，再进行序列调整，最终筛选出效果最好的序列，获得了本发明的高效价靶向人CD19的抗人CD19单链抗体嵌合抗原受体序列及其功能性变体。在一些实施方式中，所述氨基酸修饰包括但不限于氨基酸的取代、缺失和添加，所述功能性变体包括但不限于通过一处或多处氨基酸的取代、缺失和添加产生的衍生多肽或肽类似物。

在一些实施方式中，所述靶向结合人CD19的单链抗体蛋白或其变体为SEQ IDNo.4所示或与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有70～99％同源性，优选80～99％，更优选90～99％，最优选95～99％同源性的多肽。

在一些实施方式中，所述靶向结合人CD19的单链抗体蛋白或其变体为SEQ IDNo.5所示或与SEQ ID No.5所示的氨基酸序列具有70～99％同源性，优选80～99％，更优选90～99％，最优选95～99％同源性的多肽。

在一些实施方式中，所述靶向结合人CD19的单链抗体蛋白或其变体为SEQ IDNo.6所示或与SEQ ID No.6所示的氨基酸序列具有70～99％同源性，优选80～99％，更优选90～99％，最优选95～99％同源性的多肽。

在一些实施方式中，所述靶向结合人CD19的单链抗体蛋白或其变体为SEQ IDNo.7所示或与SEQ ID No.7所示的氨基酸序列具有70～99％同源性，优选80～99％，更优选90～99％，最优选95～99％同源性的多肽。

在一些非限制性实施方式中，所述与SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示氨基酸序列具有同源性的多肽是将SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、或SEQ ID No.7中任一所示氨基酸序列经过1～10个氨基酸残基，优选地经过1～5个氨基酸残基或更优选经过1～3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

除了全长多肽之外，本申请第一方面公开的主题还提供本申请公开的主题的多肽或肽结构域中任一段片段。在一些实施方案中，所述片段可以是至少5～15个氨基酸。在一些实施方案中，所述片段是至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸或至少50个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述片段是至少60至80、100、200、300或更多个连续氨基酸。

第二方面，本申请提供了一种靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体，其包含从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列、靶向结合人CD19的单链抗体、跨膜结构域和胞内信号结构域，所述靶向结合人CD19单链抗体包含本申请第一方面所述的靶向结合人CD19单链抗体蛋白或其变体，所述靶向结合人CD19的抗人CD19单链抗体蛋白优选人CD19，所述靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞在效靶比为10:1时对肿瘤细胞杀伤效率达40％～60％。在临床治疗淋巴瘤临床试验中，在回输靶向CD19剂量为6x10^4/公斤的CAR-T细胞后，临床显示没有任何因细胞因子释放综合症引起的发热和神经毒性副反应，临床治疗安全并疗效显着，患者在回输CAR-T细胞后第77天获得接近临床完全缓解的疗效。

在一些实施方式中，所述靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体还包括铰链区。

在一些实施方式中，所述跨膜结构域包括跨膜区。

在一些实施方式中，所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；

在一些实施方式中，所述跨膜区包含CD8跨膜结构区、CD28跨膜结构区、CD3ζ跨膜结构区、CD4跨膜结构区、4-1BB跨膜结构区、OX40跨膜结构区、ICOS跨膜结构区中的任一种。

在一些实施方式中，所述免疫受体酪氨酸活化基序包含CD3ζ链的胞内信号结构域或FcεRIγ胞内信号结构，

在一些实施方式中，所述共刺激信号域包含CD28胞内信号结构域、CD137/4-1BB胞内信号结构域、CD134/OX40胞内信号结构域、ICOS胞内信号结构域中的至少一种。

在一实施方式中，所述铰链区选自CD8α铰链区、IgG铰链区，或包含整个或部分的免疫球蛋白的铰链区或铰链区经过一个或多个氨基酸修饰的变体。

在一实施方式中，所述引导序列选自SEQ ID No.3所示氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述跨膜区为人CD8多肽。在一些实施方式中，所述铰链区为人CD8多肽或其变体。

在一些实施方式中，所述铰链区的人CD8多肽选自SEQ ID No.8所示的多肽。

在本一实施例中，所述跨膜区的人CD8的选自SEQ ID No.9所示的多肽。

在一些实施方式中，所述人4-1BB胞内结构域选自SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的多肽。

在一些实施方式中，所述人CD28胞内结构域选自SEQ ID No.11所示氨基酸序列的多肽。

在一些实施方式中，所述CD3ζ胞内结构域选自SEQ ID No.12所示氨基酸序列的多肽。

在一些实施方式中，所述CD3ζ胞内结构域选自SEQ ID No.13所示氨基酸序列的多肽。

在一些实施方式中，所述靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体是重组表达或由载体表达。

在一实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列从氨基端到羧基端由引导序列、本申请第一方面所述的靶向结合人CD19单链抗体氨基酸序列、人CD8铰链区的氨基酸序列、人CD8跨膜区的氨基酸序列、人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列和人CD3ζ胞内结构域的氨基酸序列依次串联而成；

在一实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列从氨基端到羧基端由引导肽的氨基酸序列、本申请第一方面所述靶向结合人CD19的单链抗体氨基酸序列、人CD8铰链区序列的氨基酸序列、人CD8跨膜区的氨基酸序列、人CD28胞内结构域的氨基酸序列和CD3ζ胞内结构域的氨基酸序列依次串联而成。

在某些非限制性实施方式中，本申请第二方面公开的主题的CAR包含将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的间隔物区(spacer)，又称铰链区。一间隔物区可以是足够柔性的，以允许抗原结合结构域在不同方向上定向，以利于抗原识别。间隔物区区可以是来自IgG1的铰链区、或免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分。一些间隔物区包含免疫球蛋白CH3域或CH3域和CH2域两者一些间隔物区包含整个或部分的免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)铰链区，即落在免疫球蛋白的CH1和CH2域之间的序列，例如，IgG4Fc铰链或CD8铰链。免疫球蛋白来源的序列可以包含一个或多个氨基酸修饰，例如，1、2、3、4或5个取代。在一些非限制性实施方式中，所述间隔物区为铰链区。

在某些非限制性实施方式中，本申请第二方面公开的主题的CAR包括含有CD28多肽的跨膜结构域和含有CD28多肽的共刺激信号传导区。

在一些实施方式中，铰链区包含人CD8多肽。该铰链区CD8多肽选自SEQ ID No.8所示氨基酸序列的多肽。

在一些实施方式中，跨膜区包含人CD8多肽。该跨膜区CD8多肽选自SEQ ID No.9所示氨基酸序列的多肽。

在一些实施方式中，所述人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列选自SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的多肽。

在一些实施方式中，所述人CD28ζ胞内结构域选自SEQ ID No.11所示氨基酸序列的多肽。

在某些非限制性实施方式中，CAR的细胞内结构域可包含可激活或刺激细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)的CD3ζ多肽。CD3ζ包含3个免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)，并且在结合抗原后将激活信号传递到细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)。

在一些实施方式中，所述CD3ζ胞内结构域选自SEQ ID No.12所示氨基酸序列的多肽。在一些非限制性实施方式中，所述人CD3ζ胞内结构域的氨基酸序列选自SEQ ID No.13所示氨基酸序列。

在一示例性实施方式中，所述引导序列如SEQ ID No.3所示。

在一示例性实施方式中，所述抗人CD19单链抗体氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。在一示例性实施方式中，所述抗人CD19单链抗体氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。在一示例性实施方式中，所述抗人CD19单链抗体氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。在一示例性实施方式中，所述抗人CD19单链抗体氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。在一示例性实施方式实施例中，所述人CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；

在一示例性实施方式实施例中，所述人CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；

在一示例性实施方式实施例中，所述人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列如SEQ IDNo.10所示；

在一示例性实施方式实施例中，所述CD28结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；

在一示例性实施方式中，所述CD3ζ结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。

在一示例性实施方式中，所述CD3ζ结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示。

在一非限制性实施方式中，靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体(CAR)是重组表达或由载体表达。

在某些非限制性的实施方式中，本申请的靶向结合人CD19的CAR的细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区，其包含至少一个可提供最佳淋巴细胞活化的共刺激配体分子。其与CAR信号联合诱导CAR+T细胞的效应细胞功能。

其中，所述共刺激配体包括但不限于CD80、CD86、CD70、OX40L、4-1BBL、ICOSL。

在一些非限制性实施方式中，靶向结合人CD19的CAR的细胞内结构域包含共刺激信号传导区，所述共刺激信号传导区，包含两种共刺激分子：CD28和4-1BB或CD28和OX40或4-1BB和ICOS。

在一非限制性实施方式中，本申请的靶向结合人CD19的的CAR细胞内结构域包含4-1BB多肽。4-1BB可以作为肿瘤坏死因子(TNF)配体并具有刺激活性。4-1BBL可以共价连接到的细胞外抗原结合结构域的5’末端。或者，4-1BBL可以共价连接到的细胞内结构域的3’末端。

本申请的非限制性的实施方式中中，4-1BB多肽选自SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

在某些非限制性实施方式中，CAR还可包含将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的间隔区(spacer)。间隔区可以是足够柔性的，以允许抗原结合结构域在不同方向上定向，以利于抗原识别。间隔区可以是来自IgG1的铰链区、或免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分。

在某些非限制性实施方式中，CAR的细胞内结构域可包含可激活或刺激细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)的人CD3ζ多肽。CD3ζ包含3个ITAM，并且在结合抗原后将激活信号传递到细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)。

在某些非限制性的实施方式中，CAR的细胞内结构域还包含至少一个共刺激信号传导区，其包含至少一个可提供最佳淋巴细胞活化的共刺激分子。本文使用的“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。至少一个共刺激信号传导区可包含CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽，或其组合。共刺激分子可以结合共刺激配体，共刺激配体是在细胞表面上表达的蛋白质，其在结合其受体时产生共刺激应答，即实现当抗原结合其CAR分子时所提供的刺激的细胞内应。共刺激配体包括但不限于CD80、CD86、CD70、OX40L、4-1BBL、ICOSL。作为一个实例，4-1BB配体(即4-1BBL)可结合4-1BB(也称为“CD137”)以提供细胞内信号，其与CAR信号联合诱导CAR+T细胞的效应细胞功能。

在一些实施方式中，CAR的细胞内结构域的共刺激信号传导区包含两种共刺激分子：CD28和4-1BB。

4-1BB可以作为肿瘤坏死因子(TNF)配体并具有刺激活性。4-1BB可以作为肿瘤坏死因子(TNF)配体并具有刺激活性。在非限制性的实施方式中，4-1BB多肽具有SEQ ID NO:10的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，并且至多255个氨基酸。或者或另外，在非限制性的各种实施方式中，4-1BB多肽的氨基酸序列为SEQID NO:10的氨基酸。在一个实施方式中，本发明公开的主题的CAR细胞内结构域包含4-1BB多肽。

第三方面，本申请提供了一种编码第二方面所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体的核酸分子，所述核酸分子包含从5‘到3‘依次串联连接的编码引导序列的核苷酸序列、编码抗CD19单链抗体的核苷酸序列、编码跨膜结构域的核苷酸序列和编码胞内信号结构域的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域。

在一些示例性实施方式中，所述核酸分子包含从5‘到3‘依次串联连接的分别编码引导序列、本申请第一方面所述的抗人CD19单链抗体序列、人CD8铰链区序列、人CD8跨膜区序列、人4-1BB胞内结构域序列和人CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列。

在一些示例性实施方式中，所述核酸分子包含从5‘到3‘依次串联连接的分别编码引导序列、本申请第一方面所述的抗人CD19的单链抗体的核苷酸序列、人CD8铰链区的核苷酸、人CD8跨膜区的核苷酸、人CD28胞内结构域的核苷酸序列和人CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体的核酸分子还包括编码铰链区的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述跨膜结构域包括跨膜区。

在一些实施方式中，所述跨膜区包含CD8跨膜结构区、CD28跨膜结构区、CD3ζ跨膜结构区、CD4跨膜结构区、4-1BB跨膜结构区、OX40跨膜结构区、ICOS跨膜结构区中的任一种，

在一些实施方式中，所述免疫受体酪氨酸活化基序包含CD3ζ链的胞内信号结构域或FcεRIγ胞内信号结构。

在一些实施方式中，所述铰链区选自CD8α铰链区、IgG铰链区，或包含整个或部分的免疫球蛋白的铰链区或铰链区经过一个或多个氨基酸修饰的变体。

在一些实施方式中，所述编码引导序列的核苷酸如SEQ ID No.14所示或与SEQ IDNo.14所示核苷酸序列同源。

在一些实施方式中，所述编码抗人CD19单链抗体核苷酸序列如SEQ ID No.15所示或与SEQ ID No.15所示核苷酸序列同源。

在一实施例中，所述编码抗人CD19单链抗体核苷酸序列如SEQ ID No.16所示或与SEQ ID No.16所示的核苷酸序列同源。

在一实施例中，所述编码抗人CD19单链抗体核苷酸序列如SEQ ID No.17所示或与SEQ ID No.17所示的核苷酸序列同源。

在一实施例中，所述编码抗人CD19单链抗体核苷酸序列如SEQ ID No.18所示或与SEQ ID No.18所示的核苷酸序列同源。

在一些实施方式中，所述编码铰链区的人CD8的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示或与SEQ ID No.19所示核苷酸序列同源。

在一些实施方式中，所述编码跨膜区的人CD8的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示或与SEQ ID No.20所示核苷酸序列同源，

在一些实施方式中，所述编码人4-1BB胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示或与SEQ ID No.21所示核苷酸序列同源。

在一些实施方式中，所述编码人CD28胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示或与SEQ ID No.22所示核苷酸序列同源。

在一些实施方式中，所述编码人CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示或与SEQ ID No.23所示核苷酸序列同源。

在一些实施方式中，所述编码人CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示或与SEQ ID No.24所示核苷酸序列同源。

第四方面，本申请提供了一种包含本申请第二方面的嵌合抗原受体或本申请第三方面的核酸的重组载体或表达质粒。

免疫应答细胞(例如，T细胞、CTL细胞、NK细胞)的基因修饰可以通过用重组DNA或RNA构建体转导基本上同源的细胞组合物来实现。在一个实施方案中，载体是逆转录病毒载体(例如，γ逆转录病毒或慢病毒)，其可将DNA或RNA构建体导入宿主细胞基因组。例如，编码抗人CD19的单链抗体，靶向人CD19特异性CAR的多核苷酸可以克隆到逆转录病毒载体中，并且可以从其内源启动子、逆转录病毒长末端重复序列或从替代的内部启动子驱动表达。

也可使用非病毒载体或RNA。可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如使用核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和/或规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)或转基因表达(例如使用天然或化学修饰的RNA)。

在一些实施方式中，所述载体选自γ-逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺联病毒载体。在一示例性实施方式中，所述载体是γ-逆转录病毒载体。

第五方面，本申请提供了一种启动子，用于构建本申请第四方面所述的重组载体和表达本申请第二方面所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体，所述启动子包括但不限于核苷酸序列如SEQ No.25所示的EF1alpha启动子和/或如SEQ No.26所示的EFS启动子。

在一示例性优选实施例中，所述用于用于构建本申请第四方面所述的重组载体和表达本申请第二方面所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体的启动子是如SEQNo.26所示的EFS启动子。

在一示例性优选实施例中，所述用于用于构建本申请第四方面所述的重组载体和表达本申请第二方面所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体的启动子是如如SEQNo.25所示的EF1alpha启动子。

第六方面，本申请提供了一种重组病毒，其是能够表达本发明第二方面所述的靶向CD19的特异性嵌合抗原受体、且能够侵染免疫应答细胞的病毒。

在一些实施方式中，所述免疫应答细胞为细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞或辅助性T细胞等。

在示例性实施方式中，所述免疫应答细胞为细胞毒性T淋巴细胞。

在一些实施方式中，所述病毒为慢病毒、腺病毒、腺联病毒或逆转录病毒等。

在一示例性实施方式中，所述病毒为慢病毒。

在一示例性实施方式中，所述病毒为逆转录病毒。

第七方面，本申请提供了一种分离的修饰的免疫应答细胞，其包含本申请第二方面所述的靶向结合人CD19的嵌合抗原受体，其由本发明第四方面所述的重组载体或表达质粒转化所得。

对于细胞的初始基因修饰以提供靶向人CD19特异性免疫应答细胞，通常使用逆转录病毒载体进行转导，然而可以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统。对于细胞的后续基因修饰以提供包含含有至少两种共刺激配体的抗原递呈复合物的细胞，逆转录病毒基因转移(转导)同样证明是有效的。逆转录病毒载体和合适的组装线的联合也是合适的，其中衣壳蛋白对于感染人细胞是有功能的。

在一些实施方式中，所述免疫应答细胞包括细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞或辅助性T细胞。

在一些实施方式中，所述免疫应答细胞还包含至少一种外源的共刺激配体。

可能的转导方法还包括将细胞与生产细胞的直接共培养。转导病毒载体可用于在免疫应答细胞中表达共刺激配体(例如4-1BBL和IL-12)。优选地，选择的载体表现出高的感染效率和稳定的整合和表达。

在一些实施方式中，优选地，所述至少一种共刺激配体选自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、ICOSL及其组合，或更优选地，所述共刺激配体是4-1BBL。

在一些实施方式中，所述免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞，优选T细胞和自然杀伤(NK)细胞，更优选为T细胞。

可以利用用于CAR表达的载体转导从患者分离的多个T细胞亚群。

第七方面公开的修饰免疫应答细胞可以表达特异性结合人CD19的细胞外标识别结构域，用于治疗或预防瘤形成、免疫性疾病，或抗衰老。

在一示例性实施例中，其中所述修饰的免疫应答细胞为CAR-T细胞。

可以利用靶向人CD19单链抗体嵌合抗原受体制备修饰的遗传修饰的中央记忆型T细胞，然后冷藏保存。

第八方面，本申请提供了本申请的第七方面的分离的嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞的制备方法，包括以下步骤：

首先，将第三方面所述的核酸分子，通过分子克隆的方式连接到表达载体中，获得靶向CD19的特异性嵌合抗原受体的表达载体；

然后将获得的所述靶向CD19的特异性的CAR表达载体转染293T细胞，获得病毒液；

最后用所述病毒液感染免疫应答细胞，从感染后的细胞中获得表达第二方面的靶向CD19的特异性嵌合抗原受体的第七方面的修饰的免疫应答细胞。

在一些非限制性实施方式中，本发明修饰的的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。所述淋巴谱系的细胞选自B、T和自然杀伤(NK)细胞，提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来物质的检测、对宿主外源细胞的检测等功能。淋巴谱系的细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可分化成淋巴样细胞的多能干细胞)。

在一些实施方式中，所述免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞，优选T细胞或自然杀伤(NK)细胞。

在一些实例性实施方式中，T细胞是在胸腺中成熟的淋巴细胞，并且主要负责细胞介导的免疫。T细胞参与获得性免疫系统。

在一些非限制性实施方式中，T细胞包括但不限于T辅助细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中心记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(例如，TEM细胞和TEMRA细胞)、调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、自然杀伤T细胞、粘膜相关恒定T细胞、和γδT细胞。在一些实施方式中，表达CAR的T细胞表达Foxp3以实现和维持T调节表型。

本申请的修饰的免疫应答细胞可以进一步包含至少一种外源性共刺激性配体，使得免疫应答细胞外源性地共表达或被诱导为外源性地共表达基于抗人CD19的单链抗体靶向人CD19的特异性嵌合抗体和至少一种外源性共刺激性配体。靶向人CD19的特异性CAR和至少一种共刺激配体之间的相互作用提供了对于免疫应答细胞(例如，T细胞)的完全激活而言重要的非抗原特异性信号。在一些实施方式中，至少一种共刺激配体选自4-1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、ICOSL，及其组合。在一个实施方式中，共刺激性配体是4-1BBL。

在一优选实施例中，所述分离的修饰的免疫应答细胞为T细胞。

在一优选实施例中，所述分离的修饰的免疫应答细胞为自然杀伤(NK)细胞。

在一些非限制性实施方式中，所述分离的修饰的免疫应答细胞(例如T细胞)可以是自体的、非自体的(例如同种异体的)、或在体外衍生自工程化的祖细胞或干细胞。

第九方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含有效量的如本发明一方面所述的靶向结合人CD19单链抗体蛋白或其功能性变体、第二方面所述的靶向结合人CD19的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸或第七方面的所述的分离的修饰的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂。

第十方面，本申请提供了一种用于治疗或预防疾病、不适或健康失调的受试者的瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、同种异体移植、或移植排斥或抗衰老的试剂盒，其包含本发明第一方面所述的靶向结合人CD19单链抗体蛋白及其功能性变体、第二方能所述的靶向结合人CD19的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸、或第七方面所述的分离的修饰的免疫应答细胞。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包含使用免疫应答细胞治疗或预防疾病、不适或健康失调的受试者的书面说明书。

第十一方面，本申请提供了本发明第一方面所述的靶向结合人CD19单链抗体蛋白及其变体、第二方面所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体、第四方面所述重组载体或表达质粒，第六方面所述重组病毒、第七方面所述的分离的修饰的免疫应答细胞，第九方面的组合物或第十方面的试剂盒在制备治疗，或预防疾病、不适或健康失调的产品中的应用，其中，所述治疗或预防包括步骤向患有与CD19和抗人CD19单链抗体蛋白的特异性相互作用引起的疾病的患者施用对治疗或预防为有效量的本申请第七方面所述的包含靶向CD19单链抗体的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。所述、不适或健康失调与CD19和抗人CD19单链抗体配体蛋白的特异性相互作用有关。

在一些实施方式中，所述疾病、不适或健康失调包括瘤形成、感染、自身免疫性疾病、同种异体移植、移植排斥、衰老。

本发明基于抗人CD19单链抗体分子构建靶向人CD19的特异性嵌合抗原受体(CAR)以及该CAR修饰的T细胞(CAR-T细胞)，该新型CAR-T细胞能有效地靶向攻击多种肿瘤细胞，可用来制备用于治疗肿瘤的制剂，尤其是阳性表达CD19的肿瘤的药物制剂。

本发明的发明人在研究中意外发现，采用本发明构建的包含特异性识别人CD19分离的基于抗人CD19的单链抗体的嵌合抗原受体修饰的T细胞，制备方法步骤简单，在效靶比为10:1时，具有高达40％～60％的肿瘤细胞杀伤率，可明显延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞靶向识别肿瘤细胞特别是表达CD19的肿瘤的能力，加强对淋巴瘤细胞的特异杀伤活性，晚期复发难治的淋巴瘤患者经回输KD-019CAR-T后两个月随访CT扫描显示淋巴瘤患者肿瘤负荷缩小近71％～98％，全血分析CD19+B细胞发现几乎检测不到肿瘤细胞。本发明的基于抗人CD19单链抗体的靶向CD19的嵌合抗原受体的免疫应答细胞为治疗肿瘤提供了一种新的方案选择，具有良好的产业应用前景。

本申请提供了使用此类细胞治疗例如需要增强的免疫应答的疾病的方法。

附图说明

图1作为示例的本发明使用的慢病毒载体结构示意图。

图2为实施例1和2中嵌合抗原受体各部分的连接顺序的示意图。

1为人CD3ζ结构域的氨基酸序列，2为人4-1BB胞内结构域的氨基酸序列，3为人CD8跨膜区的氨基酸序列，4为CD8铰链区的氨基酸序列，5为抗人CD19的单链抗体氨基酸序列，6为引导序列，7为EF1alpha启动子，8为EFS启动子。

图3为实施例2中健康人供体外周血T细胞纯度流式细胞检测结果。

图4为实施例5中对CAR-T细胞活性的流式细胞检测结果。

A.空白对照组：没有感染病毒液的T细胞；B.KD-022对照组:靶向人CLDN18.2的特异性CAR-T细胞；C.KD-019:靶向人CD19的特异性CAR-T细胞。

图5为实施例5中对KD-019CAR分子表达的流式细胞检测结果。

A.空白对照组：没有感染病毒液的T细胞；B.KD-022对照组：靶向人CLDN18.2的特异性CAR-T细胞；C.KD-019:靶向人CD19的特异性CAR-T细胞。

图6为以淋巴瘤细胞Raji为靶细胞测定本申请的靶向CD19的特异性KD-019CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤率测试结果。

图7为以淋巴瘤细胞Raji为靶细胞测定本申请的靶向CD19的特异性KD-019CAR-T细胞的肿瘤动物模型杀伤测试结果。

图8为KD-019CAR-T靶向Raji肿瘤细胞时TNFα(图8A)、IFN-γ(图8B)、IL-10(图8C)、IL-2(图8D)细胞因子释放检测结果。

图9为用B-NSG动物进行KD-019CAR毒理及安全剂量实验的测试结果。

A.毒理实验的测试结果；B.安全剂量实验的测试结果。

图10为用B-NSG动物进行KD-019CAR体内存留实验的测试结果。

图11为实施例2中淋巴瘤患者T细胞纯度的流式细胞检测结果。

图12为实施例12中对KD-019CAR分子表达的流式细胞检测结果。

空白对照组：没有感染病毒液的T细胞；KD-019组:靶向CD19的特异性CAR-T细胞。

图13 KD-019CAR-T回输后淋巴瘤患者外周血CAR-T群检测结果。

图14 KD-019CAR-T回输后淋巴瘤患者全血超敏C反应蛋白检测结果。

图15 KD-019CAR-T回输后淋巴瘤患者全血铁蛋白检测结果。

图16 KD-019CAR-T回输后淋巴瘤患者CT扫描检查结果(一)。

图17 KD-019CAR-T回输后淋巴瘤患者CT扫描检查结果(二)。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术员通常理解的含义。

下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

制备靶向CD19的特异性嵌合抗原受体的表达质粒

步骤1)靶向CD19的特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列的确定

首先，从美国国立医学图书馆NCBI的Genbank数据库中搜索到FMC63-28Z克隆(靶向CD19抗原蛋白的嵌合受体序列)的全长氨基酸序列(如SEQ ID No.1所示)和全长核苷酸序列(如SEQ ID No.2所示)。

其次，构建靶向CD19的特异性嵌合抗原受体。

具体如下：

靶向CD19特异性CAR分子的氨基酸序列：自氨基端到羧基端，由引导肽氨基酸序列(如SEQ ID No.3所示)、抗人CD19单链抗体氨基酸序列(如SEQ ID No.4、所示)、人CD8铰链区氨基酸序列(如SEQ ID No.8所示)、人CD8跨膜区的氨基酸序列(如SEQ ID No.9所示)、人4-1BB胞内结构域氨基酸序列(如SEQ ID No.10所示)、和人CD3ζ结构域氨基酸序列(如SEQID No.12所示)依次串联而成。

靶向CD19特异性CAR分子的核苷酸序列：从5’端到3’端，由编码引导序列的核苷酸序列(如SEQ ID No.14所示)、编码抗人CD19单链抗体序列的核苷酸序列(如SEQ ID No.15、所示)、编码人CD8铰链区的核苷酸序列(如SEQ ID No.19所示)、编码人CD8跨膜区的核苷酸序列(如SEQ ID No.20所示)、编码人4-1BB胞内结构域的核苷酸序列(如SEQ ID No.21所示)、和编码CD3ζ结构域的核苷酸序列(如SEQ ID No.23所示)依次串联而成。

步骤2)表达靶向CD19的特异性CAR分子的质粒的构建和鉴定

全基因合成靶向CD19的特异性CAR分子的核苷酸序列，通过分子克隆的方式连接到慢病毒载体lentiGuide-Puro(Addgene)，构建单一编码框的全长CAR序列表达框，利用EF1alpha启动子(序列表SEQ ID No.25所示)进行表达。具体操作步骤如下：

全基因合成含有启动子、引导序列、抗人CD19单链抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB胞内结构域、和CD3ζ结构域的靶向CD19的特异性CAR分子的核苷酸序列(南京一道生物)，利用

引物

5’-cactttggcgccggctcgagggggcccgggtgcaaagatggataaagttttaaacagagagga-3’(序列表SEQ ID No.27)或

5’-cactttggcgccggctcgagggggcccgggtaggtcttgaaaggagtgggaattggctcc-3’(序列表SEQ ID No.28)和

引物5'-tccagaggttgattgtcgacttaacgcgtttagcgagggggcagggcctgcatgtgaag-3'

(序列表SEQ ID No.29)PCR扩增人工合成CAR分子序列，经Axygen胶回收试剂盒(杭州泽衡)回收，与经过限制性内切酶SmaI和MluI消化的载体lentiGuide-Puro(Addgene)进行同源重组连接。具体重组连接反应的体系和条件如下：

重组连接体系：

胶回收的PCR产物5μl，胶回收的SmaI和MluI酶切lentiGuide-Puro质粒(Addgene)3μl；4X 1402QuickCloning Kit(南京基诺美)5μl；去离子水7μl；连接反应体系体积20μl；

重组连接条件：将上述反应体系置于50℃水浴中，反应15min后置冰上1min.。

取10ul重组连接产物经感受态Stbl3转化，具体转化操作步骤如下。

将5μl连接产物加入到50μl的感受态细胞(Stbl3，购买自美国Invitrogen公司)中，冰浴30min，42℃45s，冰浴2min，然后加入500μl无抗LB液体培养基后，37摄氏度，200rpm震荡培养40min，涂布氨苄抗性的LB固体平板，在37摄氏度培养箱中过夜。等待单菌落出现后，挑取5个大小适中的菌落，提取质粒，并送往商业测序公司测序(南京一道生物)，将测序结果与拟合成的抗人CD19单链抗体特异性CAR分子序列比对证实序列完全正确，证明获得了表达靶向CD19的特异性CAR分子的质粒(简称KD-019CAR慢病毒载体，EFS启动子)。

步骤3)靶向CD19的特异性CAR表达质粒的提取和纯化

将步骤2)中构建的靶向CD19的特异性CAR分子表达质粒的Stbl3菌株在LB培养基中大量培养，采用Qiagen Plasmid Midi Kit(德国Qiagen公司)进行高纯度无内毒素抽提，已备感染。具体操作步骤如下：

1.取150ml过夜培养的菌液，加入离心管中，6000×g离心15分钟，尽量吸除上清(菌液过多时可以通过多次离心将菌液沉淀收集到一个离心管中)。

2.向留有菌体沉淀的离心管中加入4ml溶液P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

3.向离心管中加入4ml溶液P2，温和地上下翻转4-6次使菌体充分裂解，室温(15-25℃)孵育5分钟。

4.向离心管中加入4ml预冷的溶液P3，立即温和地上下翻转4-6次，充分混匀，冰上孵育5分钟。

5.将离心管放入4℃超速离心机，20000×g离心10分钟。

6.柱平衡：向吸附柱加入4ml平衡液QBT,静置，直至液体完全流出。

7.将步骤5中收集的上清液转移到吸附柱中，静置，直至液体完全进入树脂介质。

8.向吸附柱中加入10ml的漂洗液QC，静置，直至液体完全流出，重复操作1次。

9.向吸附柱中加入5ml的洗脱液QF，收集到15ml离心管中。

10.向离心管中加入3.5ml的异丙醇，混匀，≥15000×g 4℃离心30分钟，弃去上清。

11.向留有DNA沉淀的离心管中加入2ml 70％的乙醇溶液,≥15000×g离心10分钟，弃去上清。

12.建议将留有DNA沉淀的离心管开盖，室温放置5-10分钟，加入合适体积的溶液重新溶解DNA，将含有DNA的溶液全部转移到新的1.5ml离心管中，-20℃保存。

实施例2制备靶向CD19的特异性嵌合抗原受体的表达质粒

除了步骤1中，靶向CD19特异性CAR分子的氨基酸序列中抗人CD19单链抗体序列(如SEQ ID No.5所示)，人CD3ζ结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，靶向CD19特异性CAR分子的核苷酸序列中编码抗人CD19单链抗体序列的核苷酸序列(如SEQ ID No.16所示)，

和步骤2)表达靶向CD19的特异性CAR分子的质粒的构建和鉴定部分

全基因合成靶向CD19的特异性CAR分子的核苷酸序列，通过分子克隆的方式连接到慢病毒载体lentiGuide-Puro(Addgene，图1)，构建单一编码框的全长CAR序列表达框阶段，利用EFS启动子(序列表SEQ ID No.26)，其余与实施例1相同。

实施例3制备靶向CD19的特异性嵌合抗原受体的表达质粒

除了步骤1中，靶向CD19特异性CAR分子的氨基酸序列中抗人CD19单链抗体序列(如SEQ ID No.6所示)，靶向CD19特异性CAR分子的核苷酸序列中编码抗人CD19单链抗体序列的核苷酸序列(如SEQ ID No.17所示，其余与实施例1相同。

实施例4制备靶向CD19的特异性嵌合抗原受体的表达质粒

除了步骤1中，靶向CD19特异性CAR分子的氨基酸序列中抗人CD19单链抗体序列(如SEQ ID No.7所示)，人CD3ζ结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，靶向CD19特异性CAR分子的核苷酸序列中编码抗人CD19单链抗体序列的核苷酸序列(如SEQ ID No.18所示，其余与实施例1相同。

实施例5

健康人外周血T细胞的分离培养

取健康供者的新鲜外周血，通过密度梯度离心分离新鲜的外周血单核细胞；再利用偶联了抗-CD3抗体和抗-CD28抗体的顺磁磁珠(购买自美国Invitrogen公司，产品信息为Human T-Activator CD3/CD28，货号：11161D)来富集CD3⁺T细胞，具体来说，将外周血单核细胞稀释至浓度为(10～30)×10⁶个单个细胞/ml，再将磁珠与细胞以3:1的比例在培养皿中混合，室温下共孵育2～3小时，利用磁微粒收集器(Magnetic particlesconcentrator，简称MPC，货号：12301D，购买自美国Invitrogen公司)富集CD3⁺T细胞。最后将富集的CD3⁺T细胞重悬于培养液(购买自美国Life Technologies公司，产品信息为OpTmizer^TM T-Cell Expansion SFM，A1048503)，调至细胞溶度为1×10⁶个/ml，最后在37℃、5％CO₂培养箱中培养2天。T细胞纯度通过流式细胞术，利用抗PE anti-human CD3抗体(购买自美国BioLegend公司，货号：300408)进行检测，结果显示经过磁珠富集后的健康人T细胞纯度超过99％(图3外周血T细胞，对照组为Raji细胞)。

实施例6病毒液的制备

实施例1的步骤3)获得的靶向CD19的特异性CAR表达质粒，以及包装质粒psPAX2和VSVG，按照10：8：5的比例用聚乙烯亚胺转染试剂(408727，Sigma)转染试剂，共转染293T细胞(为ATCC产品，产品编号为：CRL-3216^TM)；具体的包装质粒的制备方法参见Lenti-XPackaging Single Shots(Takara)说明书；具体的转染操作过程参见Sigma转染说明书。

转染后6小时更换为完全培养基(购买自Life Technologies公司，产品货号：11995-065)，培养48小时和72小时后，分别收集病毒上清液，于4℃，3000rpm离心10～15分钟后经0.45μm滤膜过滤，最后于4℃，25000rpm超离心2～3小时，浓缩病毒，将收集的病毒浓缩液转入-80℃保存。

实施例7

靶向CD19的特异性CAR-T细胞的制备

取实施例2获得的CD3⁺T细胞，接种到24孔板，接种浓度为1×10⁵个细胞/ml，在37℃、5％CO₂环境培养约24小时(培养时间依据具体实践而定，一般来说，保证在病毒液感染时细胞汇合率介于50-70％之间)。取实施例3的病毒浓缩液，第二天按照MOI＝1～10的值将病毒液加入细胞培养瓶后，封好口，放入平角离心机后，低速(500g-1000g/min)离心30～60分钟,然后放入培养箱中37℃培养。感染后48小时后获得表达抗人CD19单链抗体CAR分子的T细胞KD-019CAR-T细胞，即新型CAR-T细胞，CAR分子结构如图2，可以进行下一步的功能实验。

其中，A为含EF1a长启动子CAR分子结构；B为含EFS短启动子CAR分子结构。

实施例8鉴定

之后利用7-AAD/CFSE细胞毒性测试试剂盒(购买自Biovision公司，货号：K315-100)，并按照该试剂盒的操作说明书对制备好的CAR-T细胞进行细胞活性测试。流式细胞结果显示KD-019CAR-T细胞活性均大于98％(图4)。

然后利用流式细胞术分析检测感染后CAR分子的表达，具体操作如下。

空白对照组：没有感染病毒液的T细胞。

KD-022对照组：靶向人CLDN18.2的特异性CAR-T细胞。

KD-019组：靶向人CD19的特异性CAR-T细胞。

细胞的制备过程中所收集的待检测细胞。

将上述实验组和对照组，PBS清洗两次后重悬于FACS液(含0.1％叠氮化钠和0.4％BSA的PBS)中。

按照抗体说明书将APC标记的mFab抗体(Alexa647-AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Mouse IgG,115-606-006,Jackson)加入到待检测细胞组和对照组的细胞悬液中，4℃孵育60分钟。采用流式细胞仪(BD FacsCanto II)获取染色细胞，并采用FlowJo软件分析结果。流式结果如图5所示(另注：图5中，横坐标PE-A表示APC受激发后发射出来的荧光(被PMT接收到的那部分)的荧光强度；纵坐标SSC-A代表细胞的颗粒度)，对照组中几乎检测不到CAR分子的表达，KD-019组中CAR分子表达率达到25.3％。

从图5的流式结果可以看出，实施例4的收集的待检测细胞表达了靶向CD19的特异性嵌合抗原受体。

应用例以其效果数据

供试肿瘤细胞系(也称靶细胞系)：淋巴瘤细胞Raji(购自南京科佰生物科技有限公司)。

接下来利用7-AAD/CFSE细胞毒性测试试剂盒(购买自Biovision公司，货号：K315-100)，并按照该试剂盒的操作说明书来评估实施例4所得的靶向CD19的特异性CAR-T细胞对上述靶细胞系的杀伤情况。

具体来说，每一种靶细胞系经过CSFE荧光染色后，以每孔2×10⁴个/ml的接种浓度铺于培养板中。

每一种靶细胞系对应地设置一个实验组和两个对照组，其中，实验组添加的是实施例4所得的靶向CD19的特异性CAR-T细胞的细胞悬液；空白对照组添加的是没有感染病毒的T细胞(即实施例2获得的CD3⁺T细胞)；KD-022对照组添加的是靶向CLDN18.2的无关CAR-T细胞。

上述的实验组，按照三个不同的效靶比(10：1、5：1和1：1)，将实施例4的靶向CD19的特异性CAR-T细胞与靶细胞混合。此处，术语“效靶比”是指效应细胞(靶向CD19的特异性CAR-T细胞)与靶细胞(肿瘤细胞)的数量比。

同样的，空白对照组和KD-022对照组，也各自按照三个不同的效靶比将T细胞与靶细胞混合。

培养20小时后离心去上清，将细胞沉淀物清洗之后用7AAD染色，采用流式细胞仪(BD FacsCanto II)获取染色细胞，并采用FlowJo软件分析结果。

图6所示为以淋巴瘤细胞Raji为靶细胞的肿瘤细胞杀伤率测试结果。从图6可以看出，实施例4的靶向CD19的特异性CAR-T细胞KD-019对淋巴瘤细胞Raji具有明显的杀伤作用(明显高于两个对照组)，并且效靶比10:1对应的肿瘤细胞杀伤率超过50％。

图7所示为CAR-T细胞对淋巴瘤Raji移植瘤裸鼠的肿瘤抑制测试结果。从图7可以看出，实施例4的靶向CD19的特异性CAR-T细胞KD-019对淋巴瘤Raji移植瘤具有明显的抑制作用，在接种30天左右，两个对照组裸鼠全部死亡，生存曲线统计结果显示KD-019CAR-T细胞回输组裸鼠生存时间明显比对照组要长(图7)。

细胞因子释放检测：CAR-T细胞和靶细胞共培养，步骤同前，区别：效靶比为5:1和5:0，且接种杀伤时用不含IL-2的T细胞培养基将CAR-T细胞与靶细胞共培养12～16小时，用标示量ddH2O溶解细胞因子标准品(标示量因细胞因子而定)，室温放置15～20min保证充分溶解，将标准品按推荐梯度倍比稀释，抽取样品细胞上清，用ddH2O稀释10倍，分别将标准品和实验样品加入相应反应孔中，每孔100μL，室温孵育1～3小时，配置1×清洗液，每孔用360ul清洗液清洗4次，并将孔中液体拍干，每孔加入200μL酶标检测抗体，室温孵育1～3小时，重复操作步骤6)，每孔加入200μL显色底物，室温避光孵育30～60分钟，每孔加入50ul终止液，450nm测定吸光值，图8显示，与没有加入靶细胞及对应的对照组比较，KD-019组在加入靶细胞Raji后，TNFα(图8A)、IFN-γ(图8B)、IL-10(图8C)、IL-2(图8D)表达水平存在较为明显的上调。

图9所示为不同剂量的KD-019CAR-T细胞对小鼠主要脏器和生存周期的影响。从图9可以看出，实施例4的靶向CD19的特异性CAR-T细胞KD-019不会引起小鼠心、肝、肺、肾等主要脏器发生炎症、水肿和坏死(图9A)，并且对小鼠的生存周期没有任何负面影响(图9B)。

图10所示为KD-019CAR-T在小鼠体内的存留时间。从图10可以看出，对照组和KD-019CAR-T细胞在注射小鼠10天后体内存留量降到大约50％，17天后下降到大约25％，31天后基本检测不到残留的CAR-T细胞(图10)。

实施例9

淋巴瘤患者T细胞的分离培养

取淋巴瘤供者的新鲜外周血，向血液中加入RosetteSep Human T CellEnrichment Cocktail(购买自STEMCELL Technologies，货号：15061)，室温孵育20～30min，然后通过密度梯度离心分离纯化新鲜的T细胞；再利用偶联了抗-CD3抗体和抗-CD28抗体的顺磁磁珠(购买自美国thermofisher Scientific公司，产品信息为Dynabeads CD3/CD28CTS，货号：40203D)来激活CD3+T细胞。具体来说，先将磁珠用1mL 1×DPBS或AIM-V培养基洗2次，利用磁微粒收集器将磁珠收集(Magnetic particles concentrator，简称MPC，货号：12301D，购买自美国Invitrogen公司)。然后将分离纯化的T细胞用AIM-V完全培养基(购买自美国thermofisher Scientific公司，产品信息为AIM-V，A3021002)稀释至浓度为(3～5)×10⁶/mL，再将磁珠与细胞以2～4:1的比例在离心管中混合均匀。最后将总细胞密度调整为1×10⁶/mL，分至24孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养2天。T细胞纯度通过流式细胞术，利用抗PE anti-human CD3抗体(购买自美国BioLegend公司，货号：300408)进行检测，结果显示经过磁珠富集后的淋巴瘤患者T细胞纯度超过97％(图11患者外周血T细胞，对照组为Raji细胞)。

实施例10

参考实施例6于GMP条件下制备感染实施例9分离的T细胞所需的病毒。

实施例11鉴定

参考实施例6于GMP条件下利用实施例10获得的病毒感染实施例9分离的淋巴瘤患者T细胞来制备回输淋巴瘤患者所需CAR-T细胞。

从图12的流式结果可以看出，实施例4的收集的待检测细胞表达了26.6％靶向CD19的特异性嵌合抗原受体，而对照组中几乎检测不到CAR分子的表达。

图13所示，KD-019CAR-T回输后淋巴瘤患者外周血CAR-T群参考实施例8采用mFab抗体检测结果显示，KD-019CAR-T回输后第7天扩增到峰值，第14天有所回落，第28天重新回到前期第7天位置水平，第77天降低到8％的水平。

晚期复发难治的淋巴瘤患者外周血在GMP条件下完成T细胞分离、病毒感染、CAR-T制备和相关质检后，以67ml生理盐水注射液形式于30分钟内经静脉回输至患者体内，KD-019CAR-T回输前后全血分析(金域医学检验)和CT扫描检测(昆明延安医院)CAR-T回输前第26天和回输后第28天、第77天结果显示，KD-019CAR-T回输后第7天CD19+B肿瘤细胞明显减少直至基本消失，CT扫描肿瘤缩小71～98％，临床接近完全缓解。

图14所示KD-019CAR-T回输后淋巴瘤患者全血超敏C反应蛋白检测结果显示，超敏C反应蛋白水平在回输后第14天明显升高，回输后第77天与回输前第26天比较全血中超敏C反应蛋白水平基本没有明显变化。

图15所示KD-019CAR-T回输后淋巴瘤患者全血铁蛋白检测结果显示，铁蛋白水平在回输后第15天明显升高，回输后第77天与回输前第26天铁蛋白水平比较轻微下降。

图16所示KD-019CAR-T回输后淋巴瘤患者CT扫描结果(一)，CAR-T治疗前26天，右肺旁淋巴结肿大(图16A)，治疗28天后，右肺旁淋巴结缩小，最大垂直径乘积缩小53％(图16B)，治疗77天后，最大垂直径乘积较治疗前缩小71％(图17C)。

图17所示KD-019CAR-T回输后淋巴瘤患者CT扫描结果(二)，CAR-T治疗前，CAR-T治疗前26天，右肺旁存在清晰可见的小结节(图17A)，治疗28天后，小结节缩小，最大垂直径乘积缩小85％(图17B)，77天后，小结节继续缩小,最大垂直径乘积缩小98％以上。

从上述图6-7体外和体内研究结果可以看出，本发明实施例4的靶向CD19的特异性CAR-T细胞能够特异性识别CD19阳性的肿瘤细胞，具有特异高效的靶向杀伤力。

从上述图16-17临床研究结果可以看出，本发明实施例4的靶向CD19的特异性CAR-T细胞能够特异性识别CD19阳性的淋巴肿瘤，患者经回输本发明合成生物技术优化的靶向CD19的KD-019CAR-T细胞6x10^4/公斤，总计三百万细胞后，第28天获得临床症状明显缓解，第77天获得非常好的临床部分缓解，接近临床意义上的完全缓解。

因此，本发明所构建的靶向CD19的特异性嵌合抗原受体、以及经其病毒载体感染的靶向CD19的特异性CAR-T细胞可以应用于治疗白血病、淋巴瘤及其组合。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京凯地生物科技有限公司

<120> 靶向CD19的特异性嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和临床应用

<141> 2019-06-05

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 489

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu

260 265 270

Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr

275 280 285

Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

290 295 300

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

305 310 315 320

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

325 330 335

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

340 345 350

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

355 360 365

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 2

<211> 1467

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120

gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180

aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240

ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300

gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360

ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420

ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480

ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540

gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600

agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660

tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720

tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780

acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1080

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1140

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 4

<211> 242

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp

165 170 175

Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

210 215 220

Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Thr

<210> 5

<211> 245

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys

115 120 125

Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln

130 135 140

Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser

145 150 155 160

Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

165 170 175

Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu

180 185 190

His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

195 200 205

Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr

210 215 220

Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

225 230 235 240

Lys Leu Glu Ile Thr

245

<210> 6

<211> 245

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 7

<211> 242

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser

<210> 8

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 8

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 9

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 9

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 10

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 10

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 11

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

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Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

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Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

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<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

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100 105 110

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 13

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 14

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

atggccctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccccttgctc tgcttcttca tgcagcaagg 60

ccg 63

<210> 15

<211> 726

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60

acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180

tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300

tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

ggtggaggag gcagcggcgg tggagggtct ggtggaggtg gttctgacat ccagatgaca 420

cagactacat cctccctgtc tgcctctctg ggagacagag tcaccatcag ttgcagggca 480

agtcaggaca ttagtaaata tttaaattgg tatcagcaga aaccagatgg aactgttaaa 540

ctcctgatct accatacatc aagattacac tcaggagtcc catcaaggtt cagtggcagt 600

gggtctggaa cagattattc tctcaccatt agcaacctgg agcaagaaga tattgccact 660

tacttttgcc aacagggtaa tacgcttccg tacacgttcg gaggggggac taagttggaa 720

ataaca 726

<210> 16

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60

acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180

tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300

tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

ggctccacct ctggatccgg caagcccgga tctggcgagg gatccaccaa gggcgacatc 420

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gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggactaagt tggaaataac aggctccacc tctggatccg gcaagcccgg atctggcgag 360

ggatccacca agggcgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 420

cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 480

tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 540

accacatact ataattcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 600

agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 660

gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 720

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

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gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggactaagt tggaaataac aggtggagga ggcagcggcg gtggagggtc tggtggaggt 360

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cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 540

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actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 22

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120

tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180

tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240

atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300

gacttcgcag cctatcgctc c 321

<210> 23

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 24

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 25

<211> 1259

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

tgcaaagatg gataaagttt taaacagaga ggaatctttg cagctaatgg accttctagg 60

tcttgaaagg agtgggaatt ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca 120

cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgatc cggtgcctag agaaggtggc 180

gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg 240

gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg 300

ccagaacaca ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg 360

gcccttgcgt gccttgaatt acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc 420

ttcgggttgg aagtgggtgg gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc 480

gtgcttgagt tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc 540

ttcgcgcctg tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg 600

ctgcgacgct ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg 660

gtatttcggt ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt 720

cggcgaggcg gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg 780

gccggcctgc tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa 840

ggctggcccg gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg 900

cagggagctc aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac 960

aaaggaaaag ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg 1020

cgccgtccag gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg 1080

gggaggggtt ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc 1140

cagcttggca cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt 1200

tcattctcaa gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1259

<210> 26

<211> 256

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

taggtcttga aaggagtggg aattggctcc ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg 60

cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gatccggtgc ctagagaagg 120

tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt 180

gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt 240

gccgccagaa cacagg 256

<210> 27

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

cactttggcg ccggctcgag ggggcccggg tgcaaagatg gataaagttt taaacagaga 60

gga 63

<210> 28

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

cactttggcg ccggctcgag ggggcccggg taggtcttga aaggagtggg aattggctcc 60

<210> 29

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

tccagaggtt gattgtcgac ttaacgcgtt tagcgagggg gcagggcctg catgtgaag 59

Claims

1.一种靶向结合人CD19的单链抗体蛋白或其变体，包含下组的：

(1)SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示的抗人CD19单链抗体蛋白的氨基酸序列，或(2)(1)经过氨基酸修饰产生的变体。

2.如权利要求1所述的靶向结合人CD19的单链抗体蛋白或其变体，其特征在于，与

SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示氨基酸序列具有70～99％

同源性。

3.一种靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体，其特征在于，包含从氨基端到羧基端

顺次连接的引导序列、靶向结合人CD19的单链抗体、跨膜结构域和胞内信号结构域，

所述靶向人CD19单链抗体包含权利要求1或2的所述的靶向结合人CD19的单链抗

体蛋白或其变体，所述靶向结合人CD19的单链抗体蛋白优选人CD19。

4.如权利要求3所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体，

其中所述引导序列选自下组：

(1)具有SEQ ID No.3所示氨基酸序列；

所述跨膜结构域为人CD8多肽或其变体，选自SEQ ID No.8所示的多肽；和/或选自SEQID No.9所示的多肽。

5.一种靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体，其特征在于，从氨基端到羧基端由引导序列、权利要求1或2所述的抗人CD19单链抗体蛋白、人CD8铰链区序列、人CD8跨膜区序列、人4-1BB胞内结构域序列和CD3ζ胞内结构域序列依次串联而成；或为氨基酸序列从氨基端到羧基端由引导序列、权利要求1或2所述的抗人CD19单链抗体蛋白、人CD8铰链区序列、人CD8跨膜区序列、人CD28胞内结构域序列和CD3ζ胞内结构域序列依次串联而成。

6.如权利要求5所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体，其中

所述引导序列如SEQ ID No.3所示；和/或

所述抗人CD19单链抗体蛋白如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、或SEQ IDNo.7、中任意一个所示，和/或

所述人CD8铰链区序列如SEQ ID No.8所示；和/或

所述人CD8跨膜区的序列如SEQ ID No.9所示；和/或

所述人4-1BB胞内结构域序列如SEQ ID No.10所示；和/或

所述CD28结构域序列如SEQ ID No.11所示；和/或

所述CD3ζ结构域序列如SEQ ID No.12或SEQ ID No.13所示。

7.权利要求3-6任一项所述的靶向结合抗人CD19的特异性嵌合抗原受体,其是重组表达或由载体表达。

8.如权利要求7所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体，其中所述载体选自γ-逆转录病毒载体、慢病毒载、腺病毒、腺联病毒或优选γ-逆转录病毒载体。

9.编码权利要求3-6任一项所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体的核酸分子，其特征是，包含从5‘到3‘依次串联连接的编码引导序列的核苷酸序列、编码靶向结合人CD19的单链抗体蛋白的核苷酸序列、编码跨膜结构域的核苷酸序列和编码胞内信号结构域的核苷酸序列，其中,所述跨膜结构域包括跨膜区,所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；任选地，所述核酸分子还包括编码铰链区的核苷酸序列。

10.根据权利要求9所述的核酸分子，其特征在于：包含从5‘到3‘依次串联连接的分别编码引导序列、编码权利要求1或2所述靶向结合人CD19的单链抗体蛋白、人CD8铰链区序列、人CD8跨膜区序列、人4-1BB胞内结构域序列和CD3ζ胞内结构域的核苷酸序列；或包含从5‘到3‘依次串联连接的分别编码引导序列、权利要求1或2所述靶向结合人CD19的单链抗体蛋白、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28和CD3ζ序列的核苷酸序列。

11.根据权利要求10所述的核酸分子，其中，

编码所述引导序列的核苷序列如SEQ ID No.14所示，

或编码所述靶向结合人CD19的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、或SEQ ID No.18所示，

或编码所述人CD8铰链区序列如SEQ ID No.19所示，

或编码所述人CD8跨膜区序列如SEQ ID No.20所示，

或编码所述人4-1BB胞内结构域序列如SEQ ID No.21所示，

或编码所述CD28胞内结构域序列如SEQ ID No.22所示，

或编码所述CD3ζ胞内结构域序列如SEQ ID No.23或SEQ ID No.24所示。

12.一种重组载体或表达质粒，其包含权利要求9-11中任一项所述的核酸分子。

13.一种启动子，用于构建权利要求12所述的重组载体和表达权利要求3-6任一项所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体。

14.根据权利要求13所述的启动子，其特征在于，所述启动子选自SEQ No.25所示的EF1α长启动子和如SEQ No.26所示的EFS启动子，或所述启动子为SEQ No.26所示的EFS短启动子。

15.一种重组病毒，其中：

所述重组病毒为能够表达权利要求3-6任一项所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体，且能够侵染免疫应答细胞的病毒；所述病毒包括慢病毒、腺病毒、腺联病毒或逆转录病毒；

所述免疫效应细胞包括细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞或辅助性T细胞。

16.一种分离的修饰的免疫应答细胞，其包含前述权利要求3-6中任一项所述的靶向结合人CD19的特异性嵌合抗原受体，其由权利要求12所述的重组载体或表达质粒转化所得。

17.根据权利要求16所述的分离的修饰的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞，或优选自T细胞和自然杀伤细胞或优选为T细胞。

18.一种分离的修饰的免疫应答细胞的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

首先，将权利要求9-11中任一项所述的核酸分子，通过分子克隆的方式连接到初始表达载体中，获得表达所述靶向CD19的特异性嵌合抗原受体的表达载体；

然后，将获得的所述靶向CD19的特异性嵌合抗原受体的表达载体转染293T细胞，获得病毒液；

最后用所述病毒液感染免疫应答细胞，从感染后的细胞中获得表达靶向CD19的特异性嵌合抗原受体的免疫应答细胞；

其中所述免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化成淋巴样细胞的多能干细胞，或所述免疫应答细胞选自T细胞或自然杀伤细胞。

19.一种治疗或预防瘤疾病、不适或健康失调的药物组合物，其特征是，包含有效量的如权利要求16或17所述的分离的修饰的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂，所述疾病、不适或健康失调与人CD19靶点及其抗人CD19单链抗体蛋白的特异性相互作用有关，所述疾病、不适或健康失调包括、病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、移植排斥和衰老。

20.一种用于治疗或预防瘤疾病、不适或健康失调或衰老的试剂盒形成，其特征是，包含如权利要求16或17中任一项所述的分离的修饰的免疫应答细胞或如权利要求9-11任一项所述的核酸。

21.权利要求12所述重组载体或表达质粒、或权利要求19或20所述的启动子、或权利要求21所述重组病毒、或权利要求22～24任一项所述的分离的修饰的免疫应答细胞、或权利要求14～17所述的核酸、或权利要求1～3任一项所述的靶向CD19单链抗体蛋白或其功能性变体、或权利要求4～14任一项所述的靶向CD19的特异性嵌合抗体在治疗或预防疾病、健康失调或不适或衰老的产品中的应用，所述疾病、健康失调、不适或衰老是与人CD19靶点及其抗人CD19单链抗体蛋白的特异性相互作用有关，所述疾病、健康失调、不适包括CD19在病灶部位细胞表面高表达的肿瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病、炎性疾病、同种异体移植、移植排斥；其中，所述肿瘤表达人的CD19抗原蛋白。

22.如权利要求21所述的应用，其中，所述治疗或预防瘤形成包括减少受试者中肿瘤负荷、增加或延长患有瘤形成的受试者的存活或响应受试者的癌细胞或病原体而增加免疫激活细胞因子。