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CN110241138A - 一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法 - Google Patents

一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法 Download PDF

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CN110241138A
CN110241138A CN201910236645.8A CN201910236645A CN110241138A CN 110241138 A CN110241138 A CN 110241138A CN 201910236645 A CN201910236645 A CN 201910236645A CN 110241138 A CN110241138 A CN 110241138A
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CN
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human
vitro
gene
pluripotent stem
cells
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CN201910236645.8A
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金子兵
刘慧�
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Wenzhou Medical University
Original Assignee
Wenzhou Medical University
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Publication date
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Abstract

本发明提供一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其步骤包括：（a）通过对人胚胎干细胞中人视网膜母细胞瘤RB1等位基因进行基因编辑，或将携带RB1等位基因突变Rb病人的体细胞重编程为人诱导多能干细胞，建立RB1等位基因突变或敲除的人多能干细胞系，进一步筛选及鉴定；（b）利用体外三维视网膜分化体系诱导RB1等位基因突变或敲除的人多能干细胞分化为人视网膜母细胞瘤模型。本发明利用了与病人遗传背景相同的RB1基因突变或敲除的多能干细胞，在体外视网膜组织发育过程中自发形成人视网膜母细胞瘤，能更加真实地模拟病人肿瘤生长环境和肿瘤发生发展过程，为进一步研究肿瘤发病机制及治疗提供了更加可靠的模型。

Description

一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法
技术领域
本发明涉及医学、生命科学用的模型领域，尤其涉及一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法。
背景技术
视网膜母细胞瘤（Rb）是婴幼儿最常见的原发于视网膜的眼内恶性肿瘤，占儿童恶性肿瘤的2%～4%，发病率约为1/15000～1/20000，其中约95%的病例发生在5岁以前，单侧性Rb的发病年龄在2～3岁，双侧性Rb发病更早。Rb病人就诊时多处于中晚期，治疗较困难，易复发转移，严重危害患儿的视力及生命。Rb分为遗传型和非遗传型，遗传型占比约35%-45%，为常染色显性遗传，非遗传型占55%-65%；双眼Rb是多为遗传型的，而非遗传型Rb通常是单眼发病。研究表明，约93％的遗传型和87％非遗传型Rb患者存在肿瘤抑制基因RB1的突变，RB1等位基因的突变或缺失是Rb发生的直接原因。RB1基因位于人类染色体13q14.2，DNA大小为180 kb，所编码的蛋白由928个氨基酸组成，是重要的细胞周期调控蛋白，RB1等位基因发生突变后，细胞将失去正常RB蛋白功能，细胞分化失去控制，从而形成肿瘤。
目前对于Rb的具体发生发展机制及视网膜中Rb细胞来源等并不清楚，这主要受限于缺少合适的疾病模型。目前主要存在三种Rb模型：（1）首先是异种移植模型，将人源性Rb细胞移植到动物眼内或皮下形成异体肿瘤，但需要考虑到当人源细胞注射到动物时，肿瘤微环境发生的改变，可能导致与正常肿瘤细胞在遗传上产生异质性和紊乱，同时异种移植需要经过主体免疫系统的考验，另外，对于肿瘤起源和发生的研究，异体移植模型并不适用；（2）基因工程动物模型，它能够较好的模拟人类疾病的病理生理特征，在其它人类疾病发病机制和临床前研究中广泛应用，但是人类与其他动物有着不同的遗传学，形态学和生理学差异，特别是在所知的动物中，只有人类可自发产生Rb，有RB1基因缺失的小鼠与儿童不同，并不能发生Rb，获取小鼠Rb模型需要将小鼠RB1及P53 或P107 基因一起敲除，另外，鼠Rb来源与人类Rb不同，可能来源于无长突或水平细胞；（3）Rb肿瘤细胞株或肿瘤干细胞也可以用于Rb发病机制，药物筛选等研究，但是它们缺少3D肿瘤环境，即使可以形成肿瘤球结构，也缺少器官样组织学及肿瘤与正常组织间的相互作用。
最近研究发现，利用人类多能干细胞（hPSCs），包括人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）在体外可培育出了与人眼视网膜的结构和成分都相似，结构完整、功能成熟、可感光的视网膜组织模型，并且可以在病人诱导多能干细胞分化来源的视网膜模型上开展疾病致病机理及药物筛选等研究。本发明就是利用人多能干细胞体外3D视网膜诱导分化体系，将RB1基因突变或敲除人多能干细胞分化为人Rb组织模型,可用于后续人Rb的发生、发展机制及治疗研究，为Rb病人的早期诊断和精准化治疗提供科学依据。
选择利用人多能干细胞体外3D视网膜诱导分化体系来建立Rb模型的原因：（1）Rb发病机制较明确，视网膜母细胞瘤基因RB1等位基因的突变或缺失是Rb发生的直接原因，利用基因编辑技术较容易的获取RB1等位基因突变或缺失的人多能干细胞；（2）Rb的发病时间较早，为婴幼儿期（约67%的病例发生在3岁之前，95%发生在5岁以前），特别是双侧性Rb发病更早（发病平均年龄9-12个月），人多能干细胞体外分化视网膜可以重现这一段时期的视网膜发育情况，并且发病越早越容易在早期得到疾病模型；（3）Rb是原发于视网膜的眼内恶性肿瘤，虽然目前对于Rb是否起源于视锥前体细胞还是其他视网膜细胞并不很明确，利用人多能干细胞可体外分化出完整视网膜组织，其中包含可能发生癌变的视锥前体细胞和其他视网膜细胞；（4）在所知的动物中，只有人类可自发产生Rb，人Rb发病机制特殊，缺少合适的动物模型，利用遗传背景相同的人类多能干细胞在体外分化人视网膜组织的过程中自发形成Rb,更适合用于后续发病机制和治疗研究。
发明内容
针对异种移植模型中肿瘤微环境发生的改变，基因工程动物模型中，人类与其他动物有着不同的遗传学，形态学和生理学差异，或直接利用Rb肿瘤细胞株或肿瘤干细胞作为研究模型，但是它们缺少3D肿瘤环境的问题；本发明提供一种人视网膜母细胞瘤模型，本发明的目的在于将RB1基因突变或敲除人多能干细胞分化为人Rb模型，解决现存模型的肿瘤微环境不同，遗传背景差异等问题，为进一步的人Rb发生、发展机制及治疗研究提供更为可靠的肿瘤模型。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明引入了与Rb病人遗传背景相同的RB1基因突变或敲除人多能干细胞系及人多能干细胞体外3D视网膜诱导分化体系。
1.与Rb病人遗传背景相同的RB1基因突变或敲除人胚胎干细胞系制备步骤如下：
1)选择Rb病人常见RB1基因突变位点，即10号外显子第320位氨基酸上，将CGA突变成TGA，可使RB1基因翻译提前终止；选择RB1基因敲除位点位于1号外显子上，可沉默RB1基因表达。
2)Cas9/sgRNA设计：基于sgRNA的设计原则，在靶位点区域设计sgRNA，其对应的oligo序列为CTCTGAGGTTGGAATCACTT。
3)打靶载体构建：使用pCS-3G和LScKO-4G-LR-RR打靶载体，经过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成。
4)阳性克隆筛选及测序验证：将携带sgRNA的pCS-3G-sgRNA1-C和携带同源重组模板的LScKO-4G-LR-RR-hES-ZQ-001-C打靶载体电转H9细胞系，经过药物筛选、阳性克隆富集、PCR筛选，最终得到4个纯合阳性克隆，分别是5，15，20，37号克隆。将突变型等位基因的PCR产物进行测序，测序上游引物为TGGGATGTTTGGAAAATCTTGGCAGT,下游引物为GAAACGTGAACAAATCTGAAACACT，测序结果与野生型基因组序列比对，用于确认突变基因序列在基因组中的具体位置及突变碱基数。
5)同样，对于RB1基因敲除人胚胎干细胞系制备，首先在靶位点区域设计sgRNA，正向序列为: CACCGCGGTGCCGGGGGTTCCGCGG，反向序列为: AAACCCGCGGAACCCCCGGCACCGC。使用px330打靶载体，经过载体构建，电转H9细胞，阳性克隆筛选，PCR验证后得到一个RB1纯合敲除阳性克隆A1，PCR上游引物为TTTTCTCAGGGGACGTTGAAA，下游引物为TCTGATGGACGCTCGCAA。
6)RB1基因突变或敲除人胚胎干细胞系的培养：利用Gibco公司的干细胞专用培养基Essential 8 Medium进行培养，0.5 M EDTA (PH=8.0)稀释1000倍用于细胞消化传代，Nuwacell-hPSC冻存液用于细胞冻存。
7)RB1基因突变或敲除人胚胎干细胞系的干性验证：利用流式细胞术分析RB1基因突变或敲除人胚胎干细胞干性marker基因OCT4的表达情况。
8)RB1基因突变或敲除人胚胎干细胞系的核型分析。
2.Rb病人来源的RB1等位基因突变人诱导多能干细胞系制备步骤如下：
1） 收集病人外周静脉血，利用全外显子测序和直接测序验证筛查存在RB1等位基因突变的病人。
2） 体外分离纯化携带RB1等位基因突变Rb病人外周静脉血中的单个核细胞，并进行扩增培养。
3） 利用非整合型混合质粒电转Rb病人的单个核细胞，通过重编程建立RB1等位基因突变人诱导多能干细胞系。由于病人携带RB1等位基因突变，分离病人外周静脉血中单个核细胞，再将其重编程为人诱导多能干细胞，建立的人诱导多能干细胞与病人具有相同的遗传背景，同样携带RB1等位基因突变。
4） RB1等位基因突变人诱导多能干细胞系的培养：利用Gibco公司的干细胞专用培养基Essential 8 Medium进行培养，0.5 M EDTA (PH=8.0)稀释1000倍用于细胞消化传代，Nuwacell-hPSC冻存液用于细胞冻存。
5） RB1等位基因突变人诱导多能干细胞系的干性验证：利用流式细胞术分析RB1基因突变诱导多能干细胞干性marker基因OCT4的表达情况。
6） RB1等位基因突变人诱导多能干细胞系的核型分析。
3.RB1基因突变或敲除人多能干细胞体外3D视网膜诱导分化，体外三维视网膜分化体系1步骤如下：
1)第0天：将RB1基因突变或敲除人多能干细胞细胞用含有DNase I 和Y-27632的TrypLE Select将细胞消化成单个细胞；用血球计数仪计数，使用添加了20μM Y-27632的Ⅰ型培养基以9000 cells/well种植在V型底96孔板中。
2)细胞种植后第2天，每孔加1% Matrigel，混匀。
3)细胞种植后第6天，每孔更换一半Ⅰ型培养基。
4)细胞种植后第12天，将每孔细胞转移至9 cm无粘附培养皿中培养，加入含有1%Matrigel的Ⅱ型培养基。
5)第18天，更换Ⅲ型培养基。
6)后继续利用Ⅲ型培养基长期培养，每七天更换新鲜Ⅲ型培养基。
4.RB1基因突变或敲除人多能干细胞体外3D视网膜诱导分化，体外三维视网膜分化体系2步骤如下：
7)第0天：将RB1基因突变或敲除人多能干细胞细胞用含0.05 mg/ml DNase I 和10μMY-27632的TrypLE Select消化液将其消化成单细胞。血球计数仪对细胞悬液进行计数后，用添加了20μM Y-27632的Ⅳ型培养基将细胞密度调整至120000 cells/ml，种植于V型底96孔板中（100ul/孔）。
8)细胞种植后第6天，每孔更换一半添加了55ng/ml hBMP4的Ⅳ型培养基。
9)细胞种植后第9天、第12天、第15天，每孔更换一半的Ⅳ型培养基。
10)细胞种植后第18天，将每孔细胞转移至9 cm无粘附培养皿中培养，更换为Ⅲ型培养基。
11)后继续利用Ⅲ型培养基长期培养，每七天更换新鲜Ⅲ型培养基。
本发明的有益效果是：本发明利用了与病人遗传背景相同的RB1基因突变或敲除的干细胞，在体外视网膜组织发育过程中自发形成人视网膜母细胞瘤，能更加真实地模拟病人肿瘤生长环境和肿瘤发生发展过程，为进一步研究肿瘤发病机制及治疗提供了更加可靠的模型。
附图说明
附图1为RB1基因突变打靶载体策略示意图。
附图2为RB1基因突变打靶载体酶切鉴定图。
附图3为RB1基因突变阳性克隆筛选PCR引物设计原则图。
附图4为RB1基因突变阳性克隆筛选PCR部分鉴定结果。
附图5为RB1基因突变阳性克隆筛选中PCR产物测序图。
附图6为RB1基因敲除打靶策略示意图。
附图7为筛选确定的携带RB1突变病人的测序结果图。
附图8为携带RB1突变病人单个核细胞分离培养及重编程流程图。
附图9为携带RB1突变病人来源的单个核细胞及其重编程形成的诱导多能干细胞形态。
附图10为RB1基因突变或敲除人多能干细胞系形态观察。
附图11为RB1基因突变或敲除人多能干细胞系OCT4多能性抗体免疫流式分析图。
附图12为RB1基因突变或敲除人多能干细胞系染色体核型分析图。
附图13为RB1基因突变或敲除人多能干细胞系及正常人多能干细胞系3D视网膜母细胞瘤分化示意图。
附图14为RB1基因突变或敲除人多能干细胞系及正常人多能干细胞系来源3D视网膜母细胞瘤的形态和微型CT扫描图。
附图15为RB1基因突变或敲除人多能干细胞系及正常人多能干细胞系来源3D视网膜母细胞瘤中Rb标志性基因蛋白水平的免疫荧光染色图。
附图16为RB1基因突变或敲除人多能干细胞系及正常人多能干细胞系来源3D视网膜母细胞瘤转录组分析图。
附图17为RB1基因突变或敲除人多能干细胞系及正常人多能干细胞系来源3D视网膜母细胞瘤视网膜下腔移植过程和移植结果。
具体实施方式
1.实验材料
1.1细胞材料
人胚胎干细胞系（H9）来自WiCell Research Institute (Madison, WI)。
1.2本试验所用质粒载体
1)质粒载体： RB1基因突变所用质粒pCS-3G和LScKO-4G-LR-RR来自北京百奥赛图。
2)RB1基因敲除所用质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro购至addgene。
3)体细胞重编程所用质粒Episomal iPSC Reprogramming Plasmids购自SystemBiosciences。
1.3 酶、试剂耗材和试剂盒
1) RB1基因突变载体构建所用引物来自北京百奥赛图，oligo序列sgRNA来源于北京百奥赛图。
2) RB1基因敲除载体构建所用oligo序列sgRNAs 设计利用网站 CRISPR DesignTool (http://crispr.mit.edu/)。
3) 细胞培养：TeSR-E8 medium (Stem cell Technologies)；Stemspan（Stemcell Technologies）；ReproTeSR （Stem cell Technologies）； 胎牛血清（GIBCO）；Matrigel (Becton Dickinson)；0.5 μM EDTA solution (GIBCO)；10 μM Y-27632(Selleck)；TrypLE Select（Gibco）；六孔细胞培养板（Nunc）。
4) RB1基因突变或敲除人胚胎干细胞建系所用试剂材料：电转试剂盒（Lonza）；电转仪 Nucleofector 4D (Lonza)；puromycin抗生素（sigma）。
5) RB1基因突变人诱导多能干细胞建系所用试剂材料：Lymphoprep 淋巴细胞分离液（Stem cell Technologies）。
6) 视网膜类器官分化所用试剂材料：GMEM（Gibco），KSR血清替代物（Gibco），NEAA非必需氨基酸（Gibco），丙酮酸盐（Gibco），β-巯基乙醇（Gibco），青霉素（Gibco），链霉素（Gibco）， IWR1e(Sigma)，hBMP4(Sigma)，胎牛血清（Gibco）， SAG(Sigma)，DMEM/F12（Gibco），N2添加物（Gibco），视黄酸，IMDM（Gibco），Hams F12（Gibco），GlutaMax（Gibco），硫代甘油(Sigma)，V-Lance Knife（ALCON SURGICAL）。
2. 实验方法
2.1 与Rb病人遗传背景相同的RB1基因突变人胚胎干细胞系制备
1) 打靶策略：RB1基因（本课题以hES-ZQ-001-C命名）在 13 号染色体上，全长约178.1kb。NCBI ID:5925。在 hES-ZQ-001-C 基因第320 位的氨基酸由 Arg 突变为终止子，对应的碱基序列由CGA 变为 TGA，打靶策略示意图如图1所示。
2) 靶序列测序确认：不同细胞系，靶基因序列可能有所差异。为了保证所设计Cas9/sgRNA 的效率，首先需要对 H9 细胞系靶位点序列进行 PCR 扩增并测序验证，以保证sgRNA 识别序列与 H9 细胞系 DNA 序列完全一致。PCR引物如下所示：
3)
4) Cas9/sgRNA 设计：基于 sgRNA 的设计原则，在靶位点区域共设计 6 条 sgRNA，其对应的 oligo序列如下：
5)
5’guide Sequence（5’-3’）
Guide#1-C CTCTGAGGTTGGAATCACTT PAM
Guide#2 ATAGCCAATCAATAGATGAC PAM
Guide#3 GCGTTAAAAGTCACAGTAGA PAM
Guide#4 TTCATTAAGGTTGGGATACA PAM
3’Guide#5 ACTTGGTTATCAATACCACC PAM
3’Guide#6 TTCATATACTATTGCCTGCC PAM
6) 打靶载体构建：构建载体pCS-3G-sgRNA1-C和LScKO-4G-LR-RR-hES-ZQ-001-C，经过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成。
7) 阳性克隆筛选：将pCS-3G-sgRNA1-C和LScKO-4G-LR-RR-hES-ZQ-001-C打靶载体电转H9 细胞系，经过药物筛选、阳性克隆富集、 PCR 筛选，最终得到 4 个纯合阳性克隆。 PCR 鉴定方法如下：鉴定引物设计：引物 hES-ZQ-001-L-GT-F和hES-ZQ-001-WT-R，hES-ZQ-001-WT-F和 hES-ZQ-001-C-R-GT-R 设计在野生型基因序列中。所以使用 hES-ZQ-001-C-L-GT-F/hES-ZQ-001-WT-R 和hES-ZQ-001-WT-F/hES-ZQ-001-C-RGT-R 这对引物进行 PCR 时，既能扩增出野生型等位基因的产物，也能扩出突变型等位基因的产物。hES-ZQ-001-C-R-GT-F1/ hES-ZQ-001-C-R-GT-R 这对引物能同时扩增出野生型和点突变等位基因的 PCR 产物，将 PCR 产物测序， 根据测序结果和测序峰图可以判断具体基因型：纯合/杂合/野生型。引物设计原则如图3所示。
引物信息如下：
PCR 条件
PCR 产物测序：将突变型等位基因的 PCR 产物进行测序，测序结果与野生型基因组序列比对，用于确认突变基因序列在基因组中的具体位置及突变碱基数。
2.2 与Rb病人遗传背景相同的RB1基因敲除人胚胎干细胞系制备
1) 打靶策略：RB1基因敲除位点位于1号外显子上，可沉默RB1基因表达,打靶策略如图6所示。
2) Cas9/sgRNA 设计：基于 sgRNA 的设计原则，在靶位点区域共设计 2 对sgRNA，其对应的 oligo序列如下：
3)
Guide Sequence（5’-3’）
Guide#1F CACCGCGGTGCCGGGGGTTCCGCGG
Guide#1R AAACCCGCGGAACCCCCGGCACCGC
Guide#2F CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG
Guide#2R AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC
4) 打靶载体构建：将sgRNA1构建到载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro，经过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成。
5) 电转细胞：将 82 µl的P3 primary cell solution和18μl的Supplement 1 混合，加入2.5ug sgRNA质粒和2.5 ug的打靶载体，混合均匀后加入电转杯中。使用Nucleofector 4D （Lonza）在程序CA-137下对电转杯中的细胞进行电转。电转后，将细胞转移至含有10μM Y-27632的TeSR-E8培养基中，培养基中铺有Matrigel的平板上，在37℃，5％CO2培养箱中培养。
6) 阳性克隆筛选：在培养基中加入浓度为0.22 µg/mL嘌呤霉素，进行筛选。
7) PCR验证：基本的PCR操作步骤，PCR上游引物为TTTTCTCAGGGGACGTTGAAA，下游引物为TCTGATGGACGCTCGCAA。
8) 阳性克隆的培养：一旦产生单一的稳定细胞克隆，将它们分离，在Matrigel预处理的含人干细胞E8培养基的培养皿中进行培养。
2.3 Rb病人来源的RB1等位基因突变人诱导多能干细胞系制备
1） 收集Rb病人外周静脉血2 ml，利用全外显子测序结合直接测序法筛选携带RB1突变的病人。
2） 分离、纯化、扩增携带RB1突变病人的外周静脉血单核细胞：如图8所示，取Rb病人外周静脉血10 ml；利用Lymphoprep淋巴细胞分离液分离纯化单个核细胞；用Stemspan血细胞培养基培养一周促成熟，每隔一天换新鲜培养基。
3） 电转Episomal Reprogramming非整合重编程质粒（含Oct4, Sox2, Lin28,Klf4, L-Myc, p53shRNA和miR-302/367 cluster），诱导外周静脉血单个核细胞重编程为诱导多能干细胞：如图8所示，收集成熟单个核细胞，加电转液（82 µl的P3 primary cellsolution和18μl的Supplement 1）和Episomal iPSC Reprogramming Plasmids，使用Nucleofector 4D （Lonza）在程序CA-137下进行电转。
4） 电转后细胞转移至Matrigel预处理的含血细胞培养基的六孔板中，置37℃低氧培养箱培养；电转第7天换ReproTeSR培养基，继续培养约7天即可见诱导多能干细胞克隆。
5） 待克隆长至合适大小，用枪头将克隆刮下，吸至新的包被有Matrigel的培养皿中，用TeSR-E8培养基培养。
2.4 RB1基因突变或敲除人多能干细胞系（包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞）验证
2.4.1 RB1基因突变或敲除人多能干细胞系的多能性验证
1) 使用普通倒置显微镜进行细胞形态观察。
2) OCT4多能性抗体免疫流式分析：PBS洗涤细胞数次，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA（Gibco）将细胞小心地解离成单细胞悬浮液，1000rpm，室温离心5 min，弃上清。然后将细胞重悬于培养基中，用PEB（含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS）缓冲液中的抗体染色。 在4°C下孵育30分钟。使用以下抗体：Alexa Fluor488小鼠抗Oct3/4（1：100，BD Biosciences，Cat＃560253）。将细胞通过100μm尼龙网过滤，然后通过FACSCanto II（Becton Dickinson）分析荧光。
2.4.2 RB1基因突变或敲除人多能干细胞系的核型分析
将细胞浸泡在0.1μg/ ml秋水仙素在37℃处理2小时，然后用胰蛋白酶消化，重新悬浮并在0.075M氯化钾中37℃下孵育15小时，用3：1甲醇：乙酸固定，然后滴在载玻片上以铺展染色体，最后通过吉姆萨染色显现染色体。
2.5 RB1基因突变或敲除人多能干细胞系及正常人多能干细胞系体外3D视网膜诱导分化
体外三维视网膜分化体系1如下：
1) 第0天：将RB1基因突变或敲除人多能干细胞细胞用含0.05 mg/ml DNaseI 和10μMY-27632的TrypLE Select消化液将其消化成单细胞。血球计数仪对细胞悬液进行计数后，用添加了20μM Y-27632的Ⅰ型培养基将细胞密度调整至90000 cells/ml，种植于V型底96孔板中（100ul/孔）。
2) 细胞种植后第2天，每孔加1% Matrigel，混匀。
3) 细胞种植后第6天，每孔更换一半Ⅰ型培养基。
4) 细胞种植后第12天，将每孔细胞转移至9 cm无粘附培养皿中培养，加入含有1%Matrigel的Ⅱ型培养基。
5) 细胞种植后第18天，用V-Lance Knife将聚集物分离成4-8块，更换为Ⅲ型培养基。
6) 后继续利用Ⅲ型培养基长期培养，每七天更换新鲜Ⅲ型培养基。所用的培养为Ⅰ型培养基：GMEM，含20% 血清替代物，0.1 mM非必需氨基酸，1 mM 丙酮酸盐，0.1 mMβ-巯基乙醇，100 U/ml 青霉素，100 mg/ml链霉素，3 μM IWR1e；Ⅱ型培养基：GMEM，含10% 胎牛血清，0.1 mM非必需氨基酸，1 mM 丙酮酸盐，0.1 Mmβ-巯基乙醇，100 U/ml 青霉素，100 mg/ml链霉素，100 nM SAG；Ⅲ型培养基：DMEM/F12，含10% 胎牛血清，1%N2添加物，0.5μM 视黄酸，100 U/ml 青霉素，100 mg/ml链霉素。
体外三维视网膜分化体系2如下：
1) 第0天：将RB1基因突变或敲除人多能干细胞细胞用含0.05 mg/ml DNaseI和10μMY-27632的TrypLE Select消化液将其消化成单细胞。血球计数仪对细胞悬液进行计数后，用添加了20μM Y-27632的Ⅳ型培养基将细胞密度调整至120000 cells/ml，种植于V型底96孔板中（100ul/孔）。
2) 细胞种植后第6天，每孔更换一半添加了55ng/ml hBMP4的Ⅳ型培养基。
3) 细胞种植后第9天、第12天、第15天，每孔更换一半的Ⅳ型培养基。
4) 细胞种植后第18天，将每孔细胞转移至9 cm无粘附培养皿中培养，更换为Ⅲ型培养基。
5) 后继续利用Ⅲ型培养基长期培养，每七天更换新鲜Ⅲ型培养基。所用的培养为Ⅳ型培养基：45% IMDM，45% HamsF12，10% 血清替代物，1% GlutaMax Supplement，450μM硫代甘油，100 U/ml 青霉素，100 mg/ml链霉素。
2.6 3D视网膜母细胞瘤鉴定
1) 显微镜下对比观察RB1基因突变或敲除人多能干细胞系及正常人多能干细胞系来源的3D视网膜发育情况。
2) 对不同时期的RB1基因突变或敲除人多能干细胞系及正常人多能干细胞系来源的3D视网膜进行免疫荧光染色。
3) 收集不同分化时期的RB1基因突变或敲除人多能干细胞系及正常人多能干细胞系来源的3D视网膜的RNA样品及Y-79细胞系来源的RNA样品，进行转录组分析比较。
4) 将不同分化时期的RB1基因突变或敲除人多能干细胞系及正常人多能干细胞系来源的视网膜细胞及Y-79细胞注射到免疫缺陷小鼠的玻璃体腔或视网膜下腔，通过OCT成像、免疫荧光染色、转录组分析等方法比较其成瘤情况。所有程序均按照道德动物许可协议进行，并经地方当局批准。移植物用PBS洗涤后在37℃用添加0.05mg/ml DNaseI的0.25％胰蛋白酶-EDTA消化 6-8 min。将2μl细胞悬浮液（50,000-80,000个细胞/μl）注射到视网膜下腔或玻璃体腔，具体注射方法为：腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉6周龄免疫缺陷的NOD-Prkdc scid IL2rg em2/SMOC（NSG）小鼠，用1％托吡卡胺滴眼液散瞳。加入2.5％苯肾上腺素盐酸盐溶液，然后滴加一滴局部麻醉剂盐酸丙美卡因（0.5％）。手术显微镜下用33号针头的汉密尔顿注射器进行注射。异种移植后2个月处死小鼠，取眼球进行H＆E染色及免疫荧光染色。OCT成像当天，通过腹膜内注射戊巴比妥钠麻醉小鼠。立即用1％托吡卡胺滴眼液散瞳，然后局部应用氧氟沙星眼膏以防止角膜干燥，使用Micron IVRetinal ImagingMicroscope完成眼底照相和光学相干断层扫描成像。
3. 结果与分析
3.1 RB1基因突变人胚胎干细胞系制备
靶序列测序确认：H9人胚胎干细胞系与 Genebank和 Ensembl 所给序列不一致，以实际测序结果为准。
sgRNA设计：sgRNA 的活性检测，综合考虑活性、特异性等因素选择Guide#1-c进行下一步实验。
打靶载体构建：酶切后载体电泳结果如图2，使用载体酶切位点，EcoRV,BamH+Hind,Not+Sall分别进行酶切，由图2可知，序列大小符合预期大小，另外需要注意：酶切后序列会出现“序列变大”是酶切后质粒的形态改变造成的结果。
阳性克隆筛选：PCR部分鉴定结果如下图4所示，5,15,20和37号为阳性克隆。通过PCR 产物测序，代表性结果如图5所示， 5、 15、 20 和 37 为纯合点突变敲进阳性克隆。
3.2 RB1基因敲除人胚胎干细胞系制备
sgRNA设计：sgRNA 的活性检测，综合考虑活性、特异性等因素选Guide#1F和Guide#1R进行下一步实验。
PCR验证后得到一个RB1纯合敲除阳性克隆A1，A2。
3.3 Rb病人来源RB1基因突变人诱导多能干细胞系制备
Rb病人筛选：筛选得到2例RB1等位基因突变的Rb病人，测序结果如图7所示，测序结果显示第1例病人携带RB1突变c.1216-1G>T，第2例病人携带RB1突变splicing: c.2520+2T>G，两例突变均为Rb病人中常见突变位点。
携带RB1等位基因突变的Rb病人外周静脉血单个核细胞的分离培养及重编程流程如图8所示：抽取Rb病人的外周静脉血10ml，经密度梯度离心后获得单个核细胞；经电转重编程后结果如图9所示，第15天即可见诱导多能干细胞克隆，继续培养至30天后，可得到典型多能细胞克隆状的细胞形态。
建立了2例RB1等位基因突变Rb病人的诱导多能干细胞各三株，代表性结果如图9或10所示，得到的携带RB1等位基因突变的诱导多能干细胞形态正常，呈典型未分化克隆状形态。
3.4 RB1基因突变或敲除人多能干细胞系（包括人胚胎干细胞和诱导多能干细胞）的培养及鉴定
3.4.1 RB1基因突变或敲除人多能干细胞系的多能性验证。
细胞形态观察代表性结果如图10所示：突变和敲除细胞系照片,细胞形态正常，呈典型未分化克隆状形态。
突变和敲除细胞系多能性的鉴定：OCT4多能性抗体免疫流式分析代表性结果如图11所示，显示几乎所有细胞都呈OCT4阳性，说明其仍维持多能性。
3.4.2 RB1基因突变或敲除人多能干细胞系的核型分析
突变和敲除细胞系染色体核型分析，代表性结果如图12所示，分析正常，女性，46 XX染色体。
3.5 RB1基因突变或敲除人多能干细胞系（包括人胚胎干细胞和诱导多能干细胞）及正常人多能干细胞系体外3D视网膜诱导分化
图13为3D视网膜母细胞瘤分化示意图，及分化后形态图，右下框出部分为长出的瘤体。
3.6 3D视网膜母细胞瘤鉴定。
如图14所示，微型CT扫描结果显示具有Rb肿瘤玫瑰花团样结构，质地不均，边缘模糊；如图15所示，Rb特异性的一些marker基因的免疫荧光分析结果显示，Ki67/SYK、Ki67/CDKN2A、Ki67/NSE具有高表达。
转录组分析如图16所示显示高表达Rb特异性的一些marker基因，Rb里低表达的基因，在我们分化肿瘤中也低表达（这些基因都是已报道证明公认的高表达及低表达基因）。
3.7 分化出的Rb视网膜下腔移植
分化出的Rb视网膜下腔移植过程和移植结果如图17所示，分化出的Rb细胞移植到NSG免疫缺陷小鼠视网膜下腔之后可见肿瘤增殖（肿瘤的特性具体无限增殖的能力），60天可见肿瘤。
<110> 温州医科大学
温州医科大学
<120> 一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法
<130> 11
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> pCS-3G-sgRNA1-C
<400> 1
CTCTGAGGTTGGAATCACTT 20
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro
<400> 1
CACCGCGGTGCCGGGGGTTCCGCGG 25
AAACCCGCGGAACCCCCGGCACCGC 50

Claims (16)

1.一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对人胚胎干细胞中人视网膜母细胞瘤RB1等位基因进行基因编辑；
（2）对基因编辑后的人胚胎干细胞进行阳性克隆筛选；
（3）利用体外三维视网膜分化体系诱导阳性克隆分化为人视网膜母细胞瘤模型。
2.根据权利要求1所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的人胚胎干细胞为人胚胎干细胞H9。
3.根据权利要求1所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的基因编辑包括基因突变和基因敲除。
4.根据权利要求3所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的基因突变引入的突变位点为RB1基因的10号外显子第320位氨基酸上，将CGA突变成TGA。
5.根据权利要求3所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的基因敲除的区域为RB1基因的1号外显子上。
6.根据权利要求3所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的基因突变是通过CRISPR/Cas9技术实现。
7.根据权利要求3所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的基因敲除是通过CRISPR/Cas9技术实现。
8.根据权利要求6所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9技术所用的载体为pCS-3G-sgRNA1-C和LScKO-4G-LR-RR，其中所用的pCS-3G-sgRNA1-C质粒携带有效sgRNA，其所对应的oligo序列为CTCTGAGGTTGGAATCACTT，所用的LScKO-4G-LR-RR质粒同源臂上包含突变基因位点。
9.根据权利要求7所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9技术中所用的载体为pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro；所用的sgRNA其所对应的oligo序列包括正向序列为: CACCGCGGTGCCGGGGGTTCCGCGG，反向序列为:AAACCCGCGGAACCCCCGGCACCGC。
10.一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）建立Rb病人来源RB1等位基因突变的人诱导多能干细胞；
（2）利用体外三维视网膜分化体系诱导人诱导多能干细胞分化为人视网膜母细胞瘤模型。
11.根据权利要求10所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的人诱导多能干细胞的制备是通过体细胞重编程技术实现。
12.根据权利要求1或10所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的体外三维视网膜分化体系为体外三维视网膜分化体系1或体外三维视网膜分化体系2中的任意一种；所述的体外三维视网膜分化体系1包括：（1）RB1基因突变或敲除的人多能干细胞的单细胞消化；（2）消化后细胞种植在细胞培养板；（3）利用Ⅰ型培养基诱导分化12天；12天后分化细胞转移至培养皿，更换Ⅱ型培养基诱导分化至第18天；18天后更换Ⅲ型培养基维持长期培养获得人视网膜母细胞瘤模型；所述的体外三维视网膜分化体系2包括：（1）RB1基因突变或敲除的人多能干细胞的单细胞消化；（2）消化后细胞种植在细胞培养板；（3）利用Ⅳ型培养基分化至第6天；第6天利用加入55 ng/ml hBMP4的Ⅳ型培养基进行半量换液；第9天、第12天、第15天，进行Ⅳ型培养基半量换液；18天后更换Ⅲ型培养基维持长期培养获得人视网膜母细胞瘤模型。
13.根据权利要求12所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的体外三维视网膜分化体系1和体外三维视网膜分化体系2的步骤（1）中，单细胞消化所用的酶为Tryp LE Select，含0.05 mg/ml DNase I 和20μM Y-27632。
14.根据权利要求12所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的体外三维视网膜分化体系1和体外三维视网膜分化体系2的步骤（2）中，细胞培养板为V型底96孔板，种植细胞数分别为9000细胞/孔和12000细胞/孔。
15.根据权利要求12所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的体外三维视网膜分化体系1和体外三维视网膜分化体系2的步骤（3）中Ⅰ型培养基为GMEM，含20% 血清替代物，0.1 mM非必需氨基酸，1 mM 丙酮酸盐，0.1 mMβ-巯基乙醇，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，3 μM IWR1e；Ⅱ型培养基为GMEM，含10% 胎牛血清，0.1 mM非必需氨基酸，1 mM 丙酮酸盐，0.1 mM β-巯基乙醇，100 U/ml 青霉素，100 mg/ml链霉素，100nM SAG；Ⅲ型培养基为DMEM/F12，含10% 胎牛血清，1% N2添加物，0.5μM 视黄酸，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素；Ⅳ型培养基为45% IMDM，45% Hams F12，10% 血清替代物，1%GlutaMax Supplement，450μM 硫代甘油，100 U/ml 青霉素，100 mg/ml链霉素。
16.根据权利要求12所述的一种人视网膜母细胞瘤模型的制备方法，其特征在于，所述的体外三维视网膜分化体系1和体外三维视网膜分化体系2的步骤（3）中Ⅱ型培养基诱导分化、Ⅲ型培养基诱导分化均是在低粘附培养皿中进行。
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