CN103725710B - 一种可自我删除游离载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体提供了一种可自我删除游离载体，所述游离载体的核心功能区域从5’端到3’端包括：人EF1α启动子序列，loxp序列，EGFP编码序列，来源于人β干扰素基因的S/MAR序列，SV40的PolyA序列，小鼠Oct4启动子驱动Cre基因的表达盒序列，loxp序列。利用本发明所述载体进行基因打靶细胞及动物的制备，可删除筛选标记基因且不会产生基因插入突变，消除了marker基因对邻近基因表达的影响及对机体产生的潜在生物安全隐患。

Description

一种可自我删除游离载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种可自我删除游离载体及其应用。

背景技术

猪生理特征与人类相似、及其生命周期长等特点，被认为是理想的动物模型。因此对猪的基因组修饰可以制备类似人类遗传疾病的研究模型，可以被广泛的应该用到人类疾病的病理研究以及治疗药物的研发。此外猪肉也是我国人民主要的动物蛋白来源，对于人民的生活水平提高起到关键性作用。随着我国经济的发展，人民生活生平的提高，中国人猪肉需求量也越来越大，据统计中国每年消费的猪肉量占全世界总量的一半以上。市场的需求扩大，促进了我国现代化规模化养殖业的快速发展。但是同时也提出严峻挑战。在我国，主要畜牧类品种严重依赖于进口，猪品种依赖程度接近90%。这意味着生猪养殖的产业的源头——种畜完全被欧美市场控制，严重的威胁到我国的食品安全。培育自主知识产权的猪新品是现阶段我国迫切需要解决的农业问题。传统的遗传选育方法周期长见效慢，进难以在短期内培育出具有高生产性能猪新品种。自从1997年哺乳动物体细胞克隆技术出现以后，家畜的基因工程育种得到迅速发展，它可以针对单一性状在短期内迅速的提高家畜的生产性能。早期的基因工程育种，主要是外源基因随机整合到基因组中，外源基因表达难以调控，而且表达量不稳定，容易产生基因的插入突变，对转基因动物本身产生不可忽视的安全隐患。锌指核酸酶（ZFN）、TALEN、CRISPR/Cas9是近些年发展可以用于对复杂的基因组定点改造的分子工具。与传统的基因打靶相比其制备简单，而且效率高，被广泛的应用于人和小鼠细胞的基因组精细修饰。目前，这些编辑技术也被应用到大动物的基因组定点修饰。锌指核酸酶（ZFN）、TALEN、CRISPR/Cas9基因编辑技术与体细胞克隆结合可以快捷、高效实现的猪的基因组精细修饰，将来会被广泛应用于猪的生产性能改良和新品种培育。由于猪的胎儿成纤维细胞无法实现单细胞培养，因此在使用锌指核酸酶（ZFN）、TALEN、CRISPR/Cas9实现猪细胞的基因敲除时，必需要有marker基因的辅助筛选，才能获得敲除的细胞克隆。目前的方法是用一段含有新霉素抗性基因表达载体与锌指核酸酶（ZFN）、TALEN或CRISPR/Cas9共转染筛选，虽然能够获得基因敲除的细胞克隆，但是marker基因也同时整合到细胞的基因组中。Marker基因即选择性标记基因是指在遗传转化中能够使转化细胞(或个体)从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因，它们通常可以使转基因细胞产生对某种选择剂具有抗性的产物，从而使转基因细胞在添加这种选择的培养基上正常生长，而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出对此选择剂的敏感由于转基因效率低，因此marker基因可以对阳性克隆进行筛选和富集。但marker基因主要有以下缺点：第一，这种marker基因对邻近基因表达都有影响.第二含有marker基因的转基因动物无法通过动物的生物安全评估，阻碍转基因猪的商业应用。

虽然marker基因也可以用cre/loxp系统直接删除，但是删除marker基因同时在基因组中留下loxp序列，随机插入的loxp序列很有可能产生基因的插入突变，对机体产生潜在的生物安全隐患，同样难以通过转基因动物的安全评估，限制了转基因动物的生产应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种可删除标记基因又不会产生基因插入突变的可自我删除的游离载体。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种可自我删除游离载体，所述游离载体的核心功能区域从5’端到3’端包括：人EF1α启动子序列，loxp序列，EGFP编码序列，来源于人β干扰素基因的S/MAR序列，SV40的PolyA序列，小鼠Oct4启动子驱动Cre基因的表达盒序列，loxp序列。

进一步地，所述游离载体含有筛选标记基因，所述筛选标记基因为抗性基因。

本发明还提供了利用前述游离载体制备无标记基因的基因打靶动物的方法，其具体步骤包括：

1）将所述游离载体与ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9共转染动物胎儿体细胞，药物辅助细胞筛选获得基因敲除细胞克隆；

2）将基因敲除细胞作为核移植供体细胞，离体的卵母细胞作为核移植受体细胞，通过核移植技术获得动物克隆胚胎；克隆胚胎从二细胞期开始表达Oct4基因，同时小鼠Oct4启动子cre酶的表达，使得cre酶介导的位点专一性重组介导游离载体自我删除；

3）克隆胚胎通过手术法移入动物子宫内进行妊娠，获得无标记基因的基因打靶动物。

进一步地，所述动物为猪、牛、羊。

步骤1）中所述药物为G418。

本发明还提供了利用前述游离载体本发明还提供了利用前述游离载体在制备无标记基因动物细胞中的应用。

本发明还提供了利用前述游离载体在制备无标记基因的基因打靶动物中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明将Cre/loxP位点特异重组酶系统与S/MAR元件组合形成一种可控的游离载体。其中S/MAR来源于的人bate干扰素基因，当载体存在S/MAR序列并能够被转录时，载体能够在细胞中自我复制，并伴随细胞分裂传递给子代细胞，载体无需整合到细胞基因组即可以形成稳定遗传。设计载体时在包含有S/MAR元件的序列上下游各插入一个同向loxp序列，Oct4启动子能驱动cre基因在克隆胚胎表达，cre酶介导的位点专一性重组反应将胚胎细胞内载体上S/MAR删除，失去S/MAR元件的载体无法自我复制和再形成游离的附加体状态，最终导致载体从细胞中被删除。本发明发现这种载体可有效的应用于制备无标记基因（marker free）的转基因猪，尤其是ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9介导的基因敲除猪。由于猪的胎儿体细胞无法实现单细胞培养（单独细胞无法增殖形成一个细胞群），因此在利用ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9制备基因修饰猪胎儿体细胞时，需要与表达药物抗性基因的载体共转染，再用药物筛选才能得到基因敲除的细胞克隆。虽然这种方法能够获得基因敲除的猪胎儿体细胞，但同时抗性基因也将整合到细胞基因组。利用我们构建的可自我删除的游离载体与ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9共转染，辅助筛选（表达新霉素抗性基因）可以高效的获得基因敲除细胞克隆。在体细胞核移植后，克隆胚胎中Oct4启动子驱动Cre酶表达删除用于辅助筛选的载体。胚胎移植即可获得无标记基因的基因敲除猪。同时该方法也可以用于其他物种的筛选，以及诱导干细胞的制备。

利用本发明载体结合锌指核酸酶（ZFN）、TALEN、CRISPR/Cas9基因编辑技术制备基因敲除猪，除目的基因的被精确修饰外，其基因组无其他任何改变，该点优于目前所有的转基因猪的marker free方法，同时本发明也可以被用于生产牛，羊等其他家畜转基因育种。

附图说明

图1为本发明所述自我删除的游离载体构建流程图。

图2为本发明所述自我删除的游离载体图谱。

图3为本发明实施例4中基因敲除猪的基因测序鉴定结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中载体设计由本课题组完成，使用的载体均来自于中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，oligoDNA由上海生工合成，序列测定由北京华大完成。Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均来自北京NEB公司，体细胞克隆所用试剂均购自Sigma公司。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆（第三版）》。

实施例1自我删除载体的构建

载体构建步骤如下，构建流程如图1；

1.NheI和AgeI双酶切pEPI-eGFP载体，插入第一个loxp序列，得到中间载体1。

2.PciI和NheI双酶切中间载体1，删除CMV启动子，插入人EF1α启动子替换CMV启动子，得到中间载体2。

3.SalI和MluI双酶切中间载体2，胶回收大片段与SV40PolyA的PCR产物（含有AscI和NotI酶切位点）链接，得到中间载体3。

4.AscI与NotI双酶切pSP72-mOct4-GFPNEO，胶回收目的片段插入中间载体3，得到最终载体pEPI-EF1α-EGFP-Oct4-Cre（如图2），载体序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2MSTN敲除细胞的获得

1.长白胎儿成纤维细胞建立

1）取妊娠30d的长白猪，处死后取输卵管子宫，包扎出口，2h内运回实验室，从子宫内取出胎儿，用含抗生素的DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用眼科剪去除胎儿头部、四肢、内脏，用DPBS冲洗。

2）在直径100mm细胞培养皿内用眼科剪将剩余部分尽量剪碎。

3）加入少许血清，将1ml枪头尖端用剪刀剪断，留下直径约为40mm以上部分，接上1ml枪，将组织块转移到3个T25细胞培养瓶的底壁，用弯头吸管将组织块均匀铺开。

4）将铺有组织块的一面向上，各加入5ml细胞培养液，放入CO₂培养箱，39℃，5%CO₂，100%湿度培养。

5）待培养6-8h后，将铺有组织块的一面翻转，使细胞培养液浸没组织块。

6）培养5天左右观察组织块周围是否有细胞爬出。

7）待细胞生长至80%汇合时，进行传代培养或进行冷冻保存。

2.pEPI-EF1α-EGFP-Oct4-Cre与ZFN（MSTN）共转化

1ug pEPI-EF1α-EGFP-Oct4-Cre与1ugZFN质粒充分混合，加入到2×106细胞移液器吸打混合均匀，整个操作过程操作轻柔；尤其需要注意的是pEPI-EF1α-EGFP-Oct4-Cre质粒必须现用现提，而且确保质粒超螺旋比例为90%以上。

3.G418药物筛选细胞克隆

将电转后的细胞平均接种到6个10cm的细胞培养皿，在添加了10%的胎牛血清的Gibco培养中培养48小时后，加入G418至浓度500ug/ml，连续筛选8天，每两天跟换一次加G418的培养基。

4.敲除阳性克隆PCR产物测序鉴定

待细胞克隆形成后，利用克隆环隔离单细胞克隆并加入胰酶消化细胞，并将来自于单一克隆的细胞接种到48细胞培养板的同一个孔中，加入500ul培养基培养至汇合度达到90%，细胞胰酶消化后扩大到12孔板继续培养，48孔板中剩余的细胞加入培养基继续培养至完全汇合，胰酶消化后收集细胞再用试剂盒提取细胞基因组，以tagctctaagatacaacacaata与ACCATCGGGGTAAGGTACCT为引物进行PCR扩增，扩增产物胶回收后测序，将测序结果与MSTN原序列比对挑选有删除或插入突变的细胞克隆作为下一步体细胞克隆供体。

实施例3MSTN基因敲除猪的胚胎核移植及克隆猪的制备

1.猪卵母细胞体外成熟

从屠宰场取卵巢，放入28℃-35℃，含青霉素和硫酸链霉素的生理盐水中，2h内运回实验室用配有18号针头的20mL注射器抽吸卵巢上3-6mm的卵泡。将抽取液放于50mL离心管中，37℃水浴静置15min去上清，加入PVA-TL-HEPES重悬沉淀，再静置15min，重复一次，将重悬液放入直径60mm的塑料培养皿中，在体式显微镜下，用口吸管挑选卵丘包裹2层以上，致密，而且胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体(Cumulus-Oocyte-complexes,COCs)，用成熟培养液洗涤3遍转入在培养箱中至少已经平衡4h的培养液滴内(每100μL液滴放25枚)。每一直径35mm的塑料培养皿中做4个液滴，用胚胎级矿物油覆盖。

将COCs先在成熟培养液中培养20±2h，然后转移到无hCG以及eCG的成熟液中继续培养20±2h。

2.体细胞准备

利用血清饥饿法，将细胞待其生长至80%汇合时，进行血清饥饿处理，即把培养液中的FBS(Gibco,Life Technologies)浓度从20%降至0.5%继续培养2-5d，按常规方法消化，离心洗涤，最后加1mL显微操作液重悬细胞沉淀备用。

3.受体卵母细胞去核及供体细胞核移植

利用盲吸法进行成熟卵母细胞去核，即成熟40-44h猪卵母细胞，脱卵丘后选择胞质均匀，卵周隙清晰，胞膜完整的卵母细胞放入无Ca²⁺，Mg²⁺HEPES缓冲NCSU-23备用转移到显微操作液滴内：核移植前1h做好，直径60mm细胞培养皿盖中央（液滴50-80μl，2-3mm宽，8-10mm长，石蜡油覆盖），作用15-30min，把供体细胞以及成熟卵母细胞同时转入其中于39%，5%CO₂，100%湿度平衡15min，安装显微固定管以及去核/注射针，调节好操作系统位置，在装配有显微操作仪及恒温台的倒置显微镜下，40×用固定管（内径25-35μm,外径100-120μm）吸持卵母细胞用内径15-25μm的去核/注射针拨动卵母细胞，使第一极体处于钟表1点钟位置200×下，从钟表3点处将去核/注射针刺过透明带，吸出第一极体及其附近少许细胞质退出去核/注射针，将第一极体以及少许胞质吐出挑选直径15-20μm，折光性强，圆形，光滑的体细胞，200×下用去核/注射针吸取一个供体细胞，从去核进针处将体细胞注射到透明带下的卵周隙内用注射针点压透明带，使供体细胞与受体卵胞质的细胞膜彼此紧密接触每批25-30个卵母细胞，构建完成后，结束后将供体细胞-卵胞质构成的细胞对（重构卵）转移到NCSU-23+4mg/ml BSA中，39℃、5%CO₂、100%湿度培养箱中修复1-2h。

4.融合与激活

将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，用融合/激活液洗涤3遍后，每批5个放入已经铺满融合液的融合槽内，用拉制的且尖端很细的实心玻璃针拨动重组卵，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行用ECM2001融合仪施加一个30μs，2.0kv/cm的直流电脉冲诱导融合同时激活，用NCSU-23%+4mg/ml BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中、39℃、5%CO₂、100%湿度培养0.5h～1h后取出，在体视显微镜下判定融合。

5.胚胎培养

在开始显微操作前至少4h预先做好培养液滴，在超净台内取35mm细菌培养皿，做6-8个30μL大的液滴，小心加入2.5-3ml矿物油覆盖，做好标记后放入CO₂培养箱内平衡将上述融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后转入，每个30μL的液滴培养8-10个重构胚，培养48h和168h时记录卵裂和囊胚形成结果。

6.胚胎移植

用公猪试情或者观察压背反应，挑选自然发情母猪，一般在构建克隆胚的当天将在CO₂培养箱中培养12-30h的1-2细胞克隆胚取出，装入2.5ml细管内。用灭菌的锡箔纸包装好,做好标记，放到恒温运输箱中运到猪移植地点，用40-60ml（1mg/100kg体重）生理盐水溶解1-1.5mg硫喷妥钠和地西泮，耳静脉注射20ml，待受体猪初步麻倒后，将其抬到手术架上仰卧（青年后备母猪）或者侧卧（经产母猪）保定对后备母猪：在腹部下面第1对和第2对乳头之间，腹中线局部15×10cm²面积内清洁刮毛后先碘酒消毒,后酒精棉脱碘（对经产母猪：在腹部肷窝部15×10cm²的范围内清洁,刮毛碘酒消毒后酒精脱碘）在准备动刀切开腹中线之前，把前面余下的麻醉药再酌情注射20-30ml，沿腹中线切开一个长约8-10cm的口，打开腹腔，探进去一只手，取出卵巢后用润湿的灭菌脱脂纱布盖上（而对经产母猪:沿侧腹部做一个与腹中线面垂直的长约10cm的切口）在手术人员即将取出卵巢，调整好输卵管伞之际，将装在吸管内的胚胎取出放在热台上，体视显微镜下将胚胎装入移植管内手术人员和胚胎移植人员相互协调，将移植管从输卵管伞部探入输卵管至少5cm大致到了壶腹-峡部结合处，一边推动注射器，以便外撤移植管移植后体视镜下观察胚胎是否仍滞留在移植管内，确认没有后，开始卵巢回位,术口缝合胚胎移植后第10d肌肉注射800IU hCG，13d注射500IU PMSG。

7.囊胚细胞计数

取出重构胚囊胚，在含3.7%多聚甲醛的DPBS中洗涤3遍后再固定10min将固定后的囊胚转移到含10μg/ml Hoechst33342（bisbenzimide）的DPBS中避光的暗盒中室温孵育10min染色结束后，将囊胚转移到载玻片上，尽量少带液体，尽快用9:1（3:1）的凡士林/石蜡油在其四角点四个柱，盖上盖玻片，在实体显微镜下小心按压盖玻片，使卵受压后稍微膨大但不至于破碎为宜，用指甲油封片，Nikon E800显微镜，紫外光激发下观察、照相、计数。

实施例4克隆猪组织基因组DNA的提取和PCR测序鉴定

将组织块剪碎或细胞沉淀放入1.5ml离心管中，加700μl DNA抽提缓冲液，20μl蛋白酶K(20mg/ml)，混匀56℃水浴消化18h以上，直至组织块或细胞沉淀完全消失，间歇摇动以获得更好的效果，加入700μlTris-饱和酚，温和摇动12min，12000rpm离心12min。将上层液相转移至另一新的离心管中，重复上一步骤，将上层液相转移至另一新的离心管中，加入700μl酚:仿（1:1），温和摇动12min，12000rpm离心12min。将上层液相转移至另一新的离心管中，加入700μl氯仿，温和摇动12min，12000rpm离心12min。将上层液相转移至另一新的离心管中，加2倍体积无水乙醇，颠倒混匀后，12000rpm离心10min。弃上清，用70％乙醇洗沉淀和管壁，倾弃乙醇，沥尽残液，室温下敞口放置20～30min，使乙醇完全挥发，加适量（约100μl）TE缓冲液，于56℃水浴中溶解DNA，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA浓度，测量260/280nm波长下检测基因组DNA的浓度和纯度，将其调整至适当浓度，-20℃保存，同时进行PCR测序基因敲出情况，结果显示5头克隆猪的MSTN基因，都发生基因删除突变，并且没有检测到载体序列和新霉素抗性基因（见图3）。结果表明自我删除载体结合MSTN的锌指核酸酶，高效的制备无标记基因的MSTN敲除猪。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种可自我删除游离载体，其特征在于，所述游离载体的核心功能区域从5’端到3’端包括：人EF1α启动子序列，loxp序列，EGFP编码序列，来源于人β干扰素基因的S/MAR序列，SV40的PolyA序列，小鼠Oct4启动子驱动Cre基因的表达盒序列，loxp序列。

2.根据权利要求1所述游离载体，其特征在于，所述游离载体含有筛选标记基因。

3.根据权利要求1或2所述的游离载体在制备无标记基因动物细胞中的应用。