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CN110234754B - 内胚层细胞团、和由多能细胞制造三胚层中的任意胚层的细胞团的方法 - Google Patents

内胚层细胞团、和由多能细胞制造三胚层中的任意胚层的细胞团的方法 Download PDF

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CN110234754B CN201880008797.6A CN201880008797A CN110234754B CN 110234754 B CN110234754 B CN 110234754B CN 201880008797 A CN201880008797 A CN 201880008797A CN 110234754 B CN110234754 B CN 110234754B
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Abstract

本发明的课题在于提供用于得到最合适的体细胞作为细胞治疗制剂的内胚层细胞团。本发明的内胚层细胞团是细胞团中的未分化细胞的含有率降低、且包含能分化为最合适的体细胞作为细胞治疗制剂的内胚层细胞的细胞团。进而,本发明的源自内胚层细胞团的体细胞作为细胞治疗制剂具有优异的治疗效果。

Description

内胚层细胞团、和由多能细胞制造三胚层中的任意胚层的细 胞团的方法
技术领域
本发明涉及内胚层细胞团。本发明还涉及通过培养、分化诱导多能干细胞来制造三胚层中的任意胚层的细胞团的方法。
背景技术
在供体不足成为课题的脏器移植的替代法、难治性疾病的新型治疗法开发等中,再生医疗给予了很大的期待。由于胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)具有多能性和无限增殖性,因此可期待作为用于制备再生医疗所需的细胞的细胞来源。在实际应用使用了这些多能干细胞的再生医疗时,需要确立将多能干细胞有效地分化诱导为目标细胞的技术,对多种分化诱导方法进行了报告。
例如,作为将多能干细胞分化诱导为三胚层中的任意胚层的培养方法,非专利文献1中记载了:在用涂布了基质胶的培养皿上贴壁培养人ES细胞和人iPS细胞的同时分化诱导为三胚层(内胚层细胞、外胚层细胞或中胚层细胞)。另外,还示出了:通过在分化诱导前用不含蛋氨酸的培养基培养10小时而使细胞周期停止,然后诱导分化为三胚层(内胚层细胞、外胚层细胞或中胚层细胞),由此能够提高分化诱导效率。
还报道了一些有关用于将多能干细胞分化诱导为内胚层细胞的培养基的见解。
例如,专利文献1中记载了:通过向多能细胞培养物供给TGFβ超家族的生长因子来进行向胚体内胚层的分化,接着,通过在SOX17阳性胚体内胚层细胞的细胞培养物或细胞团中降低、去除(eliminating)或消除(removing)TGFβ超家族生长因子信号传递,由此将胚体内胚层细胞分化为PDX1阴性前肠内胚层细胞(第0144~0150段)。
另外,专利文献2中记载了:使多个多能细胞分化为造血前体细胞或内皮细胞的方法,所述方法是将多能细胞分化为造血前体细胞或内皮细胞的方法,其依次包括以下的工序:(a)在包含至少1个生长因子的第1特定培养基中培养或维持多个实质上未分化的多能细胞的工序;(b)在实质上不包含BMP4、VEGF、IL-3、Flt3配体和GMCSF的第2特定培养基中孵育细胞的工序;(c)在包含使多个细胞增殖或促进分化充足量的BMP4和VEGF的第3特定培养基中培养细胞的工序;以及(d)在包含使多个细胞增殖或促进分化充足量的(1)IL-3和Flt3配体、或包含(2)VEGF、FGF-2或FGF-2模仿物和IGF中任意者的第4特定培养基中培养细胞的工序(第0009段)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2016-506736号公报
专利文献2:日本特开2015-192681号公报
非专利文献
非专利文献1:Shiraki N et al.,Methionine metabolism regulatesmaintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.CellMetab.2014May 6;19(5):780-94.
发明内容
发明所要解决的课题
如上所述,虽然报道了用于由多能干细胞经过三胚层(内胚层细胞、外胚层细胞或中胚层细胞)分化诱导为体细胞中的任意者的培养方法,但从提高作为细胞治疗制剂的治疗效果和降低未分化细胞的观点出发,需要进一步提高分化诱导的效率、提高细胞的品质。
因此,本发明的目的在于提供用于得到最合适的体细胞作为细胞治疗制剂的内胚层细胞团。进而,本发明的目的在于提供制造三胚层中的任意胚层的细胞团的方法,该方法包括培养多能干细胞,且是降低细胞团中的未分化细胞的含有率、且可以得到能分化为最合适的体细胞作为细胞治疗制剂的细胞团的制造方法。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究,结果发现:在分化诱导多能干细胞之前,在添加或未添加确定的化合物的条件下进行悬浮培养,并且对于分化诱导,通过添加、降低、去除或消除对分化诱导起作用的因子而能够大幅提高分化诱导为内胚层细胞的效率。进而,本发明人等发现:由得到的内胚层细胞团分化诱导的体细胞能在够发挥较高的治疗效果这点上,与现有的内胚层细胞团相比是优异的内胚层细胞团。本发明是基于这些见解而完成的。
即,根据本说明书,提供以下的发明。
(1)一种内胚层细胞团,其中,相对于OAZ1基因的表达量的Nanog基因的相对表达量为0.8以下,相对于OAZ1基因的表达量的HNF1B基因的相对表达量为1.0以上,呈现出SOX17阳性的细胞比率为80%以上。
(2)根据(1)所述的内胚层细胞团,其中,相对于OAZ1基因的表达量的HNF4A基因的相对表达量进一步为0.5以上。
(3)根据(1)或(2)所述的内胚层细胞团,其中,相对于OAZ1基因的表达量的EpCAM基因的相对表达量进一步为0.6以上。
(4)根据(1)~(3)中任一项所述的内胚层细胞团,其中,相对于OAZ1基因的表达量的VIM基因的相对表达量进一步为12以下。
(5)根据(1)~(4)中任一项所述的内胚层细胞团,其中,相对于OAZ1基因的表达量的SOX2基因的相对表达量进一步为0.11以下。
(6)根据(1)~(5)中任一项所述的内胚层细胞团,其中,相对于OAZ1基因的表达量的c-Myc基因的相对表达量进一步为0.1以下。
(7)根据(1)~(6)中任一项所述的内胚层细胞团,其中,相对于OAZ1基因的表达量的纤维连接蛋白-1基因的相对表达量进一步为1.0以上。
(8)根据(1)~(7)中任一项所述的内胚层细胞团,其中,相对于OAZ1基因的表达量的细胞周期蛋白D1基因的相对表达量进一步为0.015以下。
(9)根据(1)~(8)中任一项所述的内胚层细胞团,其中,相对于OAZ1基因的表达量的基质金属肽酶2基因的相对表达量进一步为0.020以下。
(10)一种由多能干细胞制造内胚层细胞的方法,所述方法包括以下所示的(a)~(b):
(a)用包含2-巯基乙醇的培养基对多能干细胞进行悬浮培养,制备细胞团的工序;以及
(b)用包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基培养上述细胞团后,用未添加FGF2和BMP4的培养基培养的工序。
(11)根据(10)所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基为未添加活化素A的培养基。
(12)根据(10)或(11)所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基为未添加WNT信号活化剂的培养基。
(13)根据(10)~(12)中任一项所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基为未添加FGF2的培养基。
(14)根据(10)~(13)中任一项所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基为未添加TGFβ1的培养基。
(15)根据(10)~(14)中任一项所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基是进一步包含胰岛素的培养基。
(16)根据(10)~(15)中任一项所述的制造方法,其中,未添加FGF2和BMP4的培养基是包含选自胰岛素、运铁蛋白、亚硒酸钠和乙醇胺中的至少1种以上的培养基。
(17)根据(10)~(16)中任一项所述的方法,其中,包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基和/或未添加FGF2和BMP4的培养基是进一步包含2-巯基乙醇的培养基。
(18)根据(10)~(17)中任一项所述的方法,其中,包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基和/或未添加FGF2和BMP4的培养基是以1.0g/L以下的浓度含有葡萄糖的培养基。
(19)一种由多能干细胞制造三胚层中的任意胚层的细胞团的方法,所述方法包括以下所示的(a)~(b):
(a)用包含2-巯基乙醇的培养基对多能干细胞进行悬浮培养,制备细胞团的工序;以及
(b)在能够分化诱导为内胚层细胞、中胚层细胞或外胚层细胞中的任意胚层细胞的条件下培养上述细胞团的工序。
(20)根据(19)所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基为未添加FGF2的培养基。
(21)根据(19)或(20)所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基为未添加TGFβ1的培养基。
发明的效果
本发明的内胚层细胞团是细胞团中的未分化细胞的含有率降低、且包含能分化为最合适的体细胞作为细胞治疗制剂的内胚层细胞的细胞团。进而,源自本发明的内胚层细胞团的体细胞作为细胞治疗制剂具有优异的治疗效果。进而,本发明的制造方法由于使细胞团中的未分化细胞的含有率降低、且可以得到作为细胞治疗制剂能分化为最合适的体细胞的细胞团,因此能够提供高品质的细胞治疗制剂。
附图说明
图1示出对多能干细胞在贴壁培养和悬浮培养中的未分化标志物和原始肠细胞(PGT)标志物的表达进行解析的结果。
图2示出对多能干细胞在贴壁培养和悬浮培养中的SOX17的表达进行解析的结果。
图3示出对多能干细胞在贴壁培养和悬浮培养中的EpCAM和VIM的表达进行解析的结果。
图4示出细胞移植实验中的糖尿病模型小鼠的血液中c肽浓度的测定结果。
图5示出细胞移植实验中的糖尿病模型小鼠的偶然血糖值的测定结果。
图6示出由人iPS细胞向内胚层细胞分化诱导时的OCT4、SOX17和FOXA2的表达水平的测定结果。
图7示出由人iPS细胞向内胚层细胞分化诱导时的SOX2和SXO17阳性细胞的比例测定的结果。
图8示出由人iPS细胞向内胚层细胞分化诱导时在Day5的细胞密度。
图9示出测定由人iPS细胞向内胚层细胞分化诱导时的SOX17和FOXA2的阳性细胞的比例的结果。
图10示出对多能干细胞在贴壁培养和悬浮培养中的纤维连接蛋白-1(FN1)的表达进行解析的结果。
图11示出对多能干细胞在贴壁培养和悬浮培养中的细胞周期蛋白D1的表达进行解析的结果。
图12示出对多能干细胞在贴壁培养和悬浮培养中的CD44的表达进行解析的结果。
图13示出对多能干细胞在贴壁培养和悬浮培养中的基质金属肽酶2(MMP2)的表达进行解析的结果。
图14示出对多能干细胞在贴壁培养和悬浮培养中的胰岛素受体底物蛋白1(IRS1)的表达进行解析的结果。
图15示出以不同的葡萄糖浓度分化诱导多能干细胞时的细胞密度。
图16示出对以不同的葡萄糖浓度分化诱导多能干细胞时的SOX2和Nanog的表达进行解析的结果。
图17示出对以不同的葡萄糖浓度分化诱导多能干细胞时的SOX2的表达进行解析的结果。
图18示出对以不同的葡萄糖浓度分化诱导多能干细胞时的SOX17的表达进行解析的结果。
图19示出对以不同的葡萄糖浓度分化诱导多能干细胞时的SOX2和SOX17阳性率进行测定的结果。
图20示出对以不同的葡萄糖浓度分化诱导多能干细胞时的SOX2和SOX17阳性率进行测定的结果。
图21示出对以不同的葡萄糖浓度分化诱导多能干细胞时的SOX2和SOX17的表达进行解析的结果。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行具体地说明,但下述的说明是为了便于理解本发明的说明,本发明的范围不限定于下述的实施方式,本领域技术人员对下述的实施方式的构成进行适宜置换后的其它实施方式也包括在本发明的范围中。
关于本发明的培养基,“未添加”这一术语是指:在培养物或条件培养基中未添加、和未外因性加入特定的蛋白质、肽和化合物等因子。需要说明的是,在培养物或条件培养基中未添加,且通过培养的连续性操作加入特定的蛋白质、肽和化合物等因子时,调整为低于1%(体积/体积)、低于0.5%(体积/体积)、低于0.1%(体积/体积)、低于0.05%(体积/体积)、低于0.01%(体积/体积)、低于0.001%(体积/体积)。
关于本发明的细胞团,“降低”这一术语是指:在细胞团中不包含、和特定的细胞型(可以是细胞表面标志物的阳性、阴性的比例)在细胞团的总数中以低于30%、20%、低于10%、低于9%、低于8%、低于7%、低于6%、低于5%、低于4%、低于3%、低于2%、低于1%、低于0.9%、低于0.8%、低于0.7%、低于0.6%、低于0.5%、低于0.4%、低于0.3%、低于0.2%、低于0.1%的量存在。
关于本发明的基因表达量,“提高”这一术语是指:与成为比较对象的细胞团中的特定的基因表达量相比基因的表达有所增加,与成为比较对象的细胞团相比,为1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、2.0倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、2.6倍以上、2.7倍以上、2.8倍以上、2.9倍以上、3.0倍以上、3.1倍以上、3.2倍以上、3.3倍以上、3.4倍以上、3.5倍以上、3.6倍以上、3.7倍以上、3.8倍以上、3.9倍以上、4.0倍以上、4.1倍以上、4.2倍以上、4.3倍以上、4.4倍以上、4.5倍以上、4.6倍以上、4.7倍以上、4.8倍以上、4.9倍以上、5.0倍以上、5.1倍以上、5.2倍以上、5.3倍以上、5.4倍以上、5.5倍以上、5.6倍以上、5.7倍以上、5.8倍以上、5.9倍以上、6.0倍以上、6.1倍以上、6.2倍以上、6.3倍以上、6.4倍以上、6.5倍以上、6.6倍以上、6.7倍以上、6.8倍以上、6.9倍以上、7.0倍以上、7.1倍以上、7.2倍以上、7.3倍以上、7.4倍以上、7.5倍以上、7.6倍以上、7.7倍以上、7.8倍以上、7.9倍以上、8.0倍以上、8.1倍以上、8.2倍以上、8.3倍以上、8.4倍以上、8.5倍以上、8.6倍以上、8.7倍以上、8.8倍以上、8.9倍以上、9.0倍以上、9.1倍以上、9.2倍以上、9.3倍以上、9.4倍以上、9.5倍以上、9.6倍以上、9.7倍以上、9.8倍以上、9.9倍以上、10.0倍以上。
关于本发明的基因表达量,“减少”这一术语是指:与成为比较对象的细胞团中的确定的基因表达量相比基因的表达有所减少,与成为比较对象的细胞团相比,为1.1倍以下、1.2倍以下、1.3倍以下、1.4倍以下、1.5倍以下、1.6倍以下、1.7倍以下、1.8倍以下、1.9倍以下、2.0倍以下、2.1倍以下、2.2倍以下、2.3倍以下、2.4倍以下、2.5倍以下、2.6倍以下、2.7倍以下、2.8倍以下、2.9倍以下、3.0倍以下、3.1倍以下、3.2倍以下、3.3倍以下、3.4倍以下、3.5倍以下、3.6倍以下、3.7倍以下、3.8倍以下、3.9倍以下、4.0倍以下、4.1倍以下、4.2倍以下、4.3倍以下、4.4倍以下、4.5倍以下、4.6倍以下、4.7倍以下、4.8倍以下、4.9倍以下、5.0倍以下、5.1倍以下、5.2倍以下、5.3倍以下、5.4倍以下、5.5倍以下、5.6倍以下、5.7倍以下、5.8倍以下、5.9倍以下、6.0倍以下、6.1倍以下、6.2倍以下、6.3倍以下、6.4倍以下、6.5倍以下、6.6倍以下、6.7倍以下、6.8倍以下、6.9倍以下、7.0倍以下、7.1倍以下、7.2倍以下、7.3倍以下、7.4倍以下、7.5倍以下、7.6倍以下、7.7倍以下、7.8倍以下、7.9倍以下、8.0倍以下、8.1倍以下、8.2倍以下、8.3倍以下、8.4倍以下、8.5倍以下、8.6倍以下、8.7倍以下、8.8倍以下、8.9倍以下、9.0倍以下、9.1倍以下、9.2倍以下、9.3倍以下、9.4倍以下、9.5倍以下、9.6倍以下、9.7倍以下、9.8倍以下、9.9倍以下、10.0倍以下、20倍以下、30倍以下、40倍以下、50倍以下、60倍以下、70倍以下、80倍以下、90倍以下、100倍以下、250倍以下、500倍以下、750倍以下、1000倍以下、5000倍以下、10000倍以下。
关于本发明的聚集体,也可以称为“聚集块”或“簇状”这样的术语来使用,通常是指未解离为单细胞的一组细胞。
[1]多能干细胞
本发明的制造方法中,通过培养多能干细胞来制造三胚层(内胚层细胞、中胚层细胞或外胚层细胞)的细胞团。
多能干细胞是具有能够分化为构成生物体的全部种类的细胞的多分化能力(多能性)的细胞,是在适宜的条件下的体外(in vitro)培养时能够维持多能性的同时持续无限增殖的细胞。具体而言可列举出:胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎的原始生殖细胞来源的多能干细胞(EG细胞:Proc Natl Acad Sci U S A.1998,95:13726-31)、源自精巢的多能干细胞(GS细胞:Nature.2008,456:344-9)、人工多能干细胞(induced pluripotent stem cells;iPS细胞)、体性干细胞(组织干细胞)等。多能干细胞优选为iPS细胞或ES细胞,更优选为iPS细胞。需要说明的是,“胚胎(embryonic)”除了通过配子融合而导出的胚胎之外,还指通过体细胞核移植而导出的胚胎。
作为ES细胞,可以使用任意的温血动物,优选为源自哺乳动物的细胞。作为哺乳动物,例如可列举出:小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、绵羊、猪、牛、牛、山羊、猴子或人。可以优选使用源自人的细胞。
作为ES细胞的具体例子,可列举出:通过培养着床以前的早期胚胎而建立的哺乳动物等的ES细胞、通过培养由对体细胞的核进行核移植而制作的早期胚胎而建立的ES细胞、及使用基因工学方法修饰了这些ES细胞的染色体上的基因而成的ES细胞。各ES细胞可以依据本领域中通常实施的方法、公知文献来制备。小鼠的ES细胞是1981年由Evans等人(Evans et al.,1981,Nature 292:154-6)、Martin等人(Martin GR.et al.,1981,ProcNatl Acad Sci 78:7634-8)建立的。人的ES细胞是1998年由Thomson等人(Thomson etal.,Science,1998,282:1145-7)建立的,可以从WiCell研究设施(WiCell ResearchInstitute、网站:http://www.wicell.org/、麦迪逊市、威斯康星州、美国)、美国国立卫生研究所(National Institute of Health)、京都大学等获得,例如可以从Cellartis公司(网站:http://www.cellartis.com/、瑞典)购买获得。
人工多能干细胞(iPS细胞)是通过使体细胞再程序化而得到的具有多能性的细胞。包括京都大学的山中伸弥教授等人的团队、麻省理工学院的Rudolf Jaenisch等人的团队、威斯康星大学的James Thomson等人的团队、哈佛大学的Konrad Hochedlinger等人的团队等在内的多个团队成功地制作了iPS细胞。例如,国际公开WO2007/069666号公报中记载了:包含Oct家族基因、Klf家族基因和Myc家族基因的基因产物的体细胞的核重编程因子、以及包含Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因和Myc家族基因的基因产物的体细胞的核重编程因子,进而记载了通过体细胞的核重编程来制造诱导多能干细胞的方法,所述方法包括使上述核重编程因子与体细胞接触的工序。
用于制造iPS细胞的体细胞的种类没有特别限定,可以使用任意的体细胞。即,体细胞包括构成生物体的细胞的除了内生殖细胞以外的全部细胞,可以是分化的体细胞,还可以是未分化的干细胞。体细胞的来源可以是哺乳动物、鸟类、鱼类、爬虫类、两栖类中的任意者,没有特别限定,优选为哺乳动物(例如,小鼠等啮齿类或人等灵长类),特别优选为小鼠或人。另外,使用人的体细胞时,还可以使用胚胎、新生儿或成人中的任意者的体细胞。作为体细胞的具体例子,例如可列举出:成纤维细胞(例如,皮肤成纤维细胞)、上皮细胞(例如,胃上皮细胞、肝上皮细胞、肺胞上皮细胞)、内皮细胞(例如血管、淋巴管)、神经细胞(例如,神经元、胶质细胞)、胰腺细胞、白细胞(B细胞、T细胞等)、骨髓细胞、肌肉细胞(例如,骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞)、肝实质细胞、肝非实质细胞、脂肪细胞、骨细胞、牙周组织构成的细胞(例如,牙周组织细胞、成牙骨质细胞、牙龈成纤维细胞、骨细胞)、构成肾脏·眼·耳的细胞等。
iPS细胞是具有在给定的培养条件下(例如,培养ES细胞的条件下)长期自我复制能力,另外是具有在给定的分化诱导条件下能分化为外胚层细胞、中胚层细胞或内胚层细胞中的任意胚层细胞的多分化能力的干细胞。另外,iPS细胞可以是具有移植在小鼠等试验动物中时具有形成畸胎瘤能力的干细胞。
为了由体细胞制造iPS细胞,首先,将至少1种以上的再程序化相关基因导入体细胞中。再程序化相关基因是指编码再程序化因子的基因,所述再程序化因子具有使体细胞再程序化而成为iPS细胞的作用。作为再程序化相关基因的组合的具体例子,可以列举出以下的组合,但不限定于这些例子。
(i)Oct基因、Klf基因、Sox基因、Myc基因
(ii)Oct基因、Sox基因、NANOG基因、LIN28基因
(iii)Oct基因、Klf基因、Sox基因、Myc基因、hTERT基因、SV40largeT基因
(iv)Oct基因、Klf基因、Sox基因
除了上述以外还报道了如下方法:进一步减少了导入基因的方法(Nature.2008Jul 31;454(7204):646-50)、利用了低分子化合物的方法(Cell StemCell.2009Jan 9;4(1):16-9、Cell Stem Cell.2009Nov 6;5(5):491-503)、代替基因而利用了转录因子蛋白质的方法(Cell Stem Cell.2009May 8;4(5):381-4)等,可以是利用任意的方法制造的iPS细胞。
[2]三胚层
根据本发明的方法,可由多能干细胞制造内胚层细胞、外胚层细胞、中胚层细胞等三胚层中的任意胚层的细胞团。
作为三胚层,可列举出:内胚层细胞、中胚层细胞、和外胚层细胞。
内胚层细胞具有分化为消化道、肺、甲状腺、胰腺、肝脏等器官的组织、通向消化道的分泌腺的细胞、腹膜、胸膜、喉、耳管、气管、支气管、尿路(膀胱、尿道的大部分、尿管的一部分)等的能力,通常有时称为胚体内胚层(DE)。由多能干细胞分化为内胚层细胞可以通过测定内胚层细胞特异性基因的表达量来确认。作为内胚层细胞特异性基因,例如可以列举出:SOX17、FOXA2、CXCR4、AFP、GATA4、EOMES等。需要说明的是,本说明书中,有时将内胚层细胞也称为胚体内胚层来使用。
中胚层细胞分化为体腔和作为其内衬的中皮、肌肉、骨骼、皮肤真皮、结缔组织、心脏、血管(还包括血管内皮)、血液(还包括血液细胞)、淋巴管、脾脏、肾脏、尿管、性腺(精巢、子宫、性腺上皮)等。作为中胚层细胞特异性基因,例如可以列举出:MESP1、MESP2、FOXF1、BRACHYURY、HAND1、EVX1、IRX3、CDX2、TBX6、MIXL1、ISL1、SNAI2、FOXC1和PDGFRα等。
外胚层细胞形成皮肤的表皮、男性的尿道末端部的上皮、毛发、指甲、皮肤腺(包括乳腺、汗腺)、感觉器官(包括口腔、咽、鼻、直肠的末端部的上皮,唾液腺)晶状体等。外胚层细胞的一部分在发育过程中内陷成槽状而形成神经管,它也是脑、脊髓等中枢神经系统的神经元、黑素细胞等的来源。另外还形成末梢神经系统。作为外胚层细胞特异性基因,例如可以列举出:FGF5、OTX2、SOX1、PAX6等。
利用本发明的方法制造的三胚层细胞团可以是内胚层细胞团、中胚层细胞团或外胚层细胞团中的任意胚层细胞团,特别优选为内胚层细胞团。
根据本发明的方法,使用由多能干细胞分化诱导的内胚层细胞团,可以得到例如能够在胰腺、肝脏、胃、肠等消化系统的治疗中使用的体细胞。以下示例出治疗各消化系统时的一个实施方式,但不限定于这些。
肠系中,在得到了隐窝细胞等肠前体细胞的情况下,通过用导管等将其移植,从而能用于溃疡性大肠炎、克罗恩病、短肠症等的治疗。
胰腺系统中,在得到了胰腺β细胞(有时也称为胰岛素产生细胞)的情况下,通过将其用导管等进行移植或将其封入免疫隔离装置等中进行移植,从而能够用于糖尿病的治疗。
肝脏系统中,例如在得到了白蛋白产生细胞的情况下,通过将其用导管等进行移植或将其封入免疫隔离装置等中进行移植,从而能够用于伴随大量出血的外伤治疗等。
另外,还可以通过利用高分子支撑载体等来培养胰腺、肝脏、胃、肠等消化系统中的治疗用组织而得到。例如,在诱导肝脏组织而得到的情况下,能够用于肝癌、肝硬化、急性肝功能衰竭、血色病等肝代谢障碍的治疗。在得到了肺细胞组织的情况下,通过将其移植至患部而能够用于囊肿性纤维化、哮喘等肺呼吸系统疾病治疗。肾脏系统中,在得到了包含肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞、肾小球细胞等组织的情况下,通过将其直接移植,从而能够用于肾功能衰竭、肾炎的治疗、透析治疗等。通过得到肝脏系统的能物质代谢的细胞,制作白蛋白产生细胞、血液凝固因子产生细胞、α1抗胰蛋白酶等代谢酶产生细胞,将产生的代谢酶直接注射或点滴给药,由此能够用于这些蛋白质缺乏症的治疗。例如,通过得到胰腺β细胞等能够物质代谢的胰腺系统的细胞,直接注射该胰腺β细胞所产生的胰岛素,由此还能用于I型糖尿病的治疗。
进而,利用本发明的方法得到的三胚层中任意胚层的细胞团以及由其得到的体细胞还能用于被检测物质的药效/毒性评价、作用机理的阐明或生物现象机理的解析。
[3]多能干细胞的维持培养
依据本发明的方法进行多能干细胞的分化诱导之前的多能干细胞优选使用未分化维持培养基来维持未分化性。也将使用未分化维持培养基来维持多能干细胞的未分化性的培养称为多能干细胞的维持培养。
未分化维持培养基只要是能够维持多能干细胞的未分化性的培养基就没有特别限定,例如可列举出:包含已知具有维持小鼠胚胎干细胞和小鼠人工多能干细胞的未分化性的性质的白血病抑制因子的培养基、包含已知具有维持人iPS的未分化性的性质的碱性FGF(成纤维细胞生长因子)的培养基等。例如可以使用:包含人iPS细胞培养基(20%Knockout血清替代品(KSR;Gibco公司)、1x非必需氨基酸(NEAA;Wako公司)、55μmol/L 2-巯基乙醇(2-ME;Gibco公司)、7.5ng/mL重组人成纤维细胞生长因子2(FGF2;Peprotech公司)、0.5x青霉素和链霉素(PS;Wako公司)的DMEM/Ham’s F12(Wako公司)或Essentail8培养基(Thermo Fisher Scientific公司)、STEMPRO(注册商标)hESC SFM(Life TechnologiesJapan Ltd.)、mTeSR1(Veritas公司)、TeSR2(Veritas公司)、StemFit(注册商标)等,没有特别限定。
多能干细胞的维持培养可以在适合的饲养层细胞(例如,SL10饲养层细胞、SNL饲养层细胞等)上使用上述的未分化维持培养基来进行。另外,还可以在涂布有玻连蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白或基质胶等细胞粘附蛋白、细胞外基质的细胞培养用培养皿上使用上述的未分化维持培养基来进行。
培养温度只要是适于培养所使用的多能干细胞的培养温度就没有特别限定,通常为30℃~40℃,优选为约37℃。
优选利用CO2孵化器等在约1~10%,优选在5%的CO2浓度气氛下进行培养。
可以在传代的同时进行期望期间的多能干细胞的维持培养,例如优选使用维持培养后的传代数1~100,优选为传代数10~50,更优选为传代数25~40的多能干细胞,来进行聚集体的形成、分化诱导。
[4]多能干细胞通过悬浮培养而形成聚集体
作为用于形成多能干细胞的聚集体的一个实施方式,可以利用CTKSolution(人ES/iPS细胞的解离液:ReproCELL Inc.)等从饲养层细胞剥离未分化且进行维持培养的细胞,用人iPS细胞培养基清洗3~4次而去除饲养层细胞。接着,通过移液而分散成小的细胞块或单细胞,将这些细胞悬浮于培养基中后,在直到悬浮液中的多能干细胞形成聚集体为止的期间边搅拌或旋转边进行悬浮培养。
悬浮培养可以是使用了具有培养基的粘性等、凹凸的微孔等的静置培养,可以是利用旋转器等在液体培养基流动的条件下的培养,优选为在液体培养基流动的条件下的培养。作为在液体培养基流动的条件下的培养,优选以促进细胞的聚集的方式在液体培养基流动的条件下的培养。作为以促进细胞的聚集的方式在液体培养基流动的条件下的培养,例如可列举出:以通过旋转流、摆动流等的流动而产生的应力(离心力、向心力)使细胞集中在一点而在液体培养基流动的条件下的培养、通过直线性往复运动而在液体培养基流动的条件下的培养,特别优选利用了旋转流和/或摆动流的培养。
用于悬浮培养的培养容器优选细胞对容器内表面的粘附性低的容器。作为细胞对这种容器内表面的粘附性低的容器,例如可列举出用具有生物适应性的物质进行了亲水性表面处理的孔板。例如,可以使用Nunclon TMSphera(Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd.),但没有特别限定。另外,培养容器的形状没有特别限定,例如可列举出:培养皿状、烧瓶状、孔状、袋状、旋转瓶状等形状的培养容器。
作为形成聚集体的期间,只要是超过6小时的期间就没有特别限定,具体而言,优选在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周的期间内形成聚集体。
作为悬浮培养培养基,只要包含能使多能干细胞增殖的成分就没有特别限定,可以使用包含1~100μM的Y-27632(Cayman公司)的mTeSR1(Veritas公司)培养基或包含1~100μM的Y-27632(Cayman公司)、1~100mg/mL BSA的Essential8TM等。
作为悬浮培养中的搅拌或旋转的条件,只要是在悬浮液中能使多能干细胞形成聚集体的范围就没有特别限定,上限可以优选为200rpm,更优选为150rpm,进一步优选为120rpm,更优选为115rpm,更优选为110rpm,更优选为105rpm,更优选为100rpm,更优选为95rpm,特别优选为90rpm。下限可以优选为1rpm,更优选为10rpm,进一步优选为50rpm,更优选为60rpm,更优选为70rpm,进一步优选为80rpm,更优选为90rpm。旋转培养时的旋转幅度没有特别限定,下限例如可以为1mm,优选为10mm,更优选为20mm,最优选为25mm。旋转幅度度的上限例如可以为200mm,优选为100mm,优选为50mm,更优选为30mm,最优选为25mm。旋转培养时的旋转半径也没有特别限定,优选将旋转幅度设定为上述的范围。旋转半径的下限例如为5mm,优选为10mm,上限例如可以为100mm,优选为50mm。通过将旋转培养的条件设为该范围而容易制造适宜尺寸的细胞聚集体,故而优选。
另外,悬浮培养可以是通过摆动(rocking)搅拌使液体培养基流动的同时进行的摆动培养。摆动培养通过使收纳有液体培养基和细胞的培养容器在与水平面大致垂直的平面内摆动来进行。摆动速度没有特别限定,例如可以每1分钟2~50次、优选为4~25次(将一个往复作为1次)进行摆动。摆动角度没有特别限定,例如为0.1°~20°,更优选为2°~10°。通过将摆动培养的条件设为该范围而能够制造适宜尺寸的细胞聚集块,故而优选。
进而,还可以通过组合了上述那样的旋转和摆动的运动进行搅拌的同时来培养。
使用了旋转瓶状的培养容器的悬浮培养是在培养容器中使用搅拌叶片并在搅拌液体培养基的同时进行的培养。转速、培养基量没有特别限定。只要是市售的旋转瓶状的培养容器,就可以适宜地使用制造商推荐的培养液量,例如还可以适宜地使用ABLE INC.的旋转瓶等。
本发明中,悬浮培养中的细胞的接种密度只要是使细胞形成聚集体的接种密度就没有特别限定,优选为1×105~1×107个细胞/mL。细胞的接种密度优选2×105个细胞/mL以上、3×105个细胞/mL以上、4×105个细胞/mL以上或优选5×105个细胞/mL以上,优选9×106个细胞/mL以下、8×106个细胞/mL以下、7×106个细胞/mL以下、6×106个细胞/mL以下、5×106个细胞/mL以下、4×106个细胞/mL以下、3×106个细胞/mL以下、2×106个细胞/mL以下、1.9×106个细胞/mL以下、1.8×106个细胞/mL以下、1.7×106个细胞/mL以下、1.6×106个细胞/mL以下、1.5×106个细胞/mL以下。尤其5×105个细胞/mL至1.5×106个细胞/mL的范围的细胞密度是适宜的。
对于细胞的聚集体,每一聚集体包含数百至数千细胞。本发明中,细胞聚集体的大小(直径)没有特别限定,例如可列举出为50μm以上、55μm以上、60μm以上、65μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上、100μm以上、110μm以上、120μm以上、130μm以上、140μm以上、150μm以上、且为1000μm以下、900μm以下、800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、400μm以下。在本发明中具有150μm~400μm的范围的直径的细胞聚集体是适宜的。还可以混有具有上述范围以外的直径的细胞聚集体。
悬浮培养时的培养液量可以根据所使用的培养容器来进行适宜调节,例如使用12孔板(在俯视每孔时的孔底面的面积为3.5cm2)时可以设为0.5ml/孔以上且1.5ml/孔以下,可以更优选设为1ml/孔。例如使用6孔板(在俯视每孔时的孔底面的面积为9.6cm2)时,可以设为1.5mL/孔以上,优选设为2mL/孔以上,更优选设为3mL/孔以上,可以设为6.0mL/孔以下,优选设为5mL/孔以下,更优选设为4mL/孔以下。例如使用125mL三角烧瓶(容量为125mL的三角烧瓶)时,可以设为10mL/容器以上,优选设为15mL/容器以上,更优选设为20mL/容器以上,更优选设为25mL/容器以上,更优选设为20mL/容器以上,更优选设为25mL/容器以上,更优选设为30mL/容器以上,可以设为50mL/容器以下,更优选设为45mL/容器以下,更优选设为40mL/容器以下。例如使用500mL三角烧瓶(容量为500mL的三角烧瓶)时,可以设为100mL/容器以上,优选设为105mL/容器以上,更优选设为110mL/容器以上,更优选设为115mL/容器以上,更优选设为120mL/容器以上,可以设为150mL/容器以下,更优选设为145mL/容器以下,更优选设为140mL/容器以下,更优选设为135mL/容器以下,更优选设为130mL/容器以下,更优选设为125mL/容器以下。例如使用1000mL三角烧瓶(容量为1000mL的三角烧瓶)时,可以设为250mL/容器以上,优选设为260mL/容器以上,更优选设为270mL/容器以上,更优选设为280mL/容器以上,更优选设为290mL/容器以上,可以设为350mL/容器以下,更优选设为340mL/容器以下,更优选设为330mL/容器以下,更优选设为320mL/容器以下,更优选设为310mL/容器以下。例如2000mL三角烧瓶(容量为2000mL的三角烧瓶)的情况下,可以设为500mL/容器以上,更优选设为550mL/容器以上,更优选设为600mL/容器以上,可以设为1000mL/容器以下,更优选设为900mL/容器以下,更优选设为800mL/容器以下,更优选设为700mL/容器以下。例如3000mL三角烧瓶(容量为3000mL的三角烧瓶)的情况下,可以设为1000mL/容器以上,优选设为1100mL/容器以上,更优选设为1200mL/容器以上,更优选设为1300mL/容器以上,更优选设为1400mL/容器以上,更优选设为1500mL/容器以上,可以设为2000mL/容器以下,更优选设为1900mL/容器以下,更优选设为1800mL/容器以下,更优选设为1700mL/容器以下,更优选设为1600mL/容器以下。例如2L培养袋(容量为2L的一次性培养袋)的情况下,可以设为100mL/袋以上,更优选设为200mL/袋以上,更优选设为300mL/袋以上,更优选设为400mL/袋以上,更优选设为500mL/袋以上,更优选设为600mL/袋以上,更优选设为700mL/袋以上,更优选设为800mL/袋以上,更优选设为900mL/袋以上,更优选设为1000mL/袋以上,可以设为2000mL/袋以下,更优选设为1900mL/袋以下,更优选设为1800mL/袋以下,更优选设为1700mL/袋以下,更优选设为1600mL/袋以下,更优选设为1500mL/袋以下,更优选设为1400mL/袋以下,更优选设为1300mL/袋以下,更优选设为1200mL/袋以下,更优选设为1100mL/袋以下。例如10L培养袋(容量为10L的一次性培养袋)的情况下,可以设为500mL/袋以上,更优选设为1L/袋以上,更优选设为2L/袋以上,更优选设为3L/袋以上,更优选设为4L/袋以上,更优选设为5L/袋以上,可以设为10L/袋以下,更优选设为9L/袋以下,更优选设为8L/袋以下,更优选设为7L/袋以下,更优选设为6L/袋以下。例如,20L培养袋(容量为20L的一次性培养袋)的情况下,可以设为1L/袋以上,更优选设为2L/袋以上,更优选设为3L/袋以上,更优选设为4L/袋以上,更优选设为5L/袋以上,更优选设为6L/袋以上,更优选设为7L/袋以上,更优选设为8L/袋以上,更优选设为9L/袋以上,更优选设为10L/袋以上,可以设为20L/袋以下,更优选设为19L/袋以下,更优选设为18L/袋以下,更优选设为17L/袋以下,更优选设为16L/袋以下,更优选设为15L/袋以下,更优选设为14L/袋以下,更优选设为13L/袋以下,更优选设为12L/袋以下,更优选设为11L/袋以下。例如50L培养袋(容量为50L的一次性培养袋)的情况下,可以设为1L/袋以上,更优选设为2L/袋以上,更优选设为5L/袋以上,更优选设为10L/袋以上,更优选设为15L/袋以上,更优选设为20L/袋以上,更优选设为25L/袋以上,可以设为50L/袋以下,更优选设为45L/袋以下,更优选设为40L/袋以下,更优选设为35L/袋以下,更优选设为30L/袋以下。培养液量在该范围内时,容易形成大小适宜的细胞聚集体。
可以适宜选择所使用的培养容器的容量,没有特别限定,作为在俯视收纳液体培养基部分的底面时的面积,下限例如可以使用0.32cm2,优选为0.65cm2,更优选为0.65cm2、进一步优选为1.9cm2,更优选为3.0cm2、3.5cm2、9.0cm2或9.6cm2的培养容器,作为上限,例如可以使用1000cm2、优选为500cm2,更优选为300cm2,更优选为150cm2,更优选为75cm2,更优选为55cm2、进一步优选为25cm2、进一步更优选为21cm2、进一步更优选为9.6cm2或3.5cm2的培养容器。
培养温度只要是适于培养所使用的多能干细胞的培养温度就没有特别限定,通常为30℃~40℃,优选为约37℃。
优选利用CO2孵化器等在约1~10%、优选在5%的CO2浓度气氛下进行培养。
[5]多能干细胞的预培养
在将上述多能干细胞的聚集体或多能干细胞分化诱导为三胚层中的任意胚层的细胞团之前,使用包含2-巯基乙醇的培养基进行悬浮培养,制备细胞团。
用于预培养的培养基根据细胞的种类而可以使用MEM培养基、BME培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、αMEM培养基、IMDM培养基、ES培养基、DM-160培养基、Fisher培养基、F12培养基、WE培养基、RPMI1640培养基或Essential 6TM培养基(Thermo FisherScientific公司)等。
多能干细胞的预培养可以通过悬浮培养来实施。可以通过上述的悬浮培养的条件来进行,进而,还可以预先粘附在微载体等上进行悬浮培养,还可以在仅由细胞构成的细胞聚集块的状态下进行悬浮培养,还可以在细胞聚集块中混有胶原蛋白等高分子,形态没有特别限定。
作为用于预培养的培养基中的2-巯基乙醇的浓度,只要是使分化诱导的效率提高的范围就没有特别限定,例如,作为2-巯基乙醇的浓度,优选1μM以上、2μM以上、5μM以上、10μM以上、20μM以上、30μM以上、40μM以上或50μM以上,优选200μM以下、150μM以下、120μM以下、100μM以下、90μM以下、80μM以下、70μM以下或60μM以下。
用于预培养的培养基还优选为未添加成纤维细胞生长因子2(FGF2:FibroblastGrowth Factor 2)的培养基。通过本发明发现:通过使用未添加FGF2的培养基,从而能够进一步提高分化为三胚层中的任意胚层的细胞团的分化效率。
用于预培养的培养基还优选为未添加转化生长因子β1(TGFβ1:Transforminggrowth factor-β1)的培养基。通过本发明发现:通过使用未添加TGFβ1的培养基,从而能够进一步提高分化为三胚层中的任意胚层的细胞团的分化效率。
用于预培养的培养基还优选为未添加WNT信号活化剂的培养基。通过本发明发现:通过使用未添加WNT信号活化剂的培养基,从而能够进一步提高分化为三胚层中的任意胚层的细胞团的分化效率。
用于预培养的培养基还优选为未添加活化素A(本说明书中有时也称为“ACTIVINA”)的培养基。通过本发明发现:通过使用未添加活化素A的培养基从而能够进一步提高分化为三胚层中的任意胚层的细胞团的分化效率。
用于预培养的培养基还优选为进一步包含胰岛素的培养基。通过本发明发现:通过使用包含胰岛素的培养基,从而能够进一步提高分化为三胚层中的任意胚层的细胞团的分化效率。
预培养用的培养基中还可以加入氨基酸、抗生物质、抗氧化剂、其它添加物。例如还可以添加0.1~2%(体积/体积)的非必须氨基酸、0.1~2%(体积/体积)的青霉素/链霉素、0.1~20mg/mL的BSA或1~20%(体积/体积)的Knockout血清替代品(KSR)等。
培养温度只要是适于培养所使用的多能干细胞的培养温度就没有特别限定,通常为30℃~40℃,优选为约37℃。
优选利用CO2孵化器等在约1~10%,优选在5%的CO2浓度气氛下进行培养。
多能干细胞的预培养的培养期间只要是培养至多分化能力得到提高的天数就没有特别限定,例如超过1周的期间即可。更具体而言,为6天、低于5天、低于4天、低于3天或者为6小时~48小时、为12小时~36小时左右、为18小时~24小时。
[6]向三胚层中的任意胚层的细胞团的分化诱导
本发明中,通过在能够分化诱导为内胚层细胞、中胚层细胞或外胚层细胞中的任意胚层细胞的条件下培养上述的预培养得到的细胞团,从而能够制造三胚层中的任意胚层的细胞团。
在将多能干细胞分化诱导为三胚层中的任意胚层的细胞团时,使用分化诱导化培养基来进行多能干细胞的培养。
作为分化诱导化培养基,只要是分化诱导多能干细胞的培养基就没有特别限定,例如可列举出:含血清培养基、含有血清替代成分的无血清培养基等。
根据所使用的细胞的种类,可以使用灵长类ES/iPS细胞用培养基(Reprocell培养基)、BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM ZincOption培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、HAM培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、和混合了从这些培养基中任选2种以上的培养基而成的培养基等。需要说明的是,只要是能用于培养动物细胞的培养基就没有特别限定。
分化诱导培养基可以包含血清成分或血清替代成分。作为血清成分或血清替代成分,例如可列举出:白蛋白、胰岛素、运铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素(例如锌、硒)、B-27营养强化剂(Thermo Fisher Scientific公司)、N2营养强化剂、N21营养强化剂(R&D Systems公司)、NeuroBrew-21营养强化剂(Miltenyibiotec公司)、KSR2-巯基乙醇、3’硫代甘油、以及它们的等价物。
分化诱导培养基中还可以进一步加入各种添加物、抗生物质、抗氧化剂等。例如还可以添加0.1mM~5mM的丙酮酸钠、0.1~2%(体积/体积)的非必须氨基酸、0.1~2%(体积/体积)的青霉素、0.1~2%(体积/体积)的链霉素、0.1~2%(体积/体积)的两性霉素B、过氧化氢酶、谷胱甘肽、半乳糖、视黄酸(维生素A)、超氧化物歧化酶、抗坏血酸(维生素C)、D-α-生育酚(维生素E)等。
分化诱导培养基中进一步添加分化诱导因子。分化诱导因子的详情后述。
分化诱导时的多能干细胞的培养优选为悬浮培养。细胞可以粘附在微载体等上进行悬浮培养,还可以在仅由细胞构成的细胞聚集块的状态下进行悬浮培养,还可以在细胞聚集块中混有胶原蛋白等高分子,形态没有特别限定。
在用于分化诱导的培养中的培养温度只要是适于培养所使用的多能干细胞的培养温度就没有特别限定,通常为30℃~40℃,优选为约37℃。
优选利用CO2孵化器等在约1~10%、优选在5%的CO2浓度气氛下进行培养。
由多能干细胞向内胚层细胞的分化培养的培养期间只要成为内胚层系列的细胞特性所呈现出的细胞型就没有特别限定,例如,可以是2周以内,更具体而言2天以上且8天以内,更优选为2天以上且7天以内,进一步优选为3天以上且6天以内,作为一个例子是5天。
[7]用于分化诱导为内胚层细胞的分化诱导因子、和其它添加物
对于本发明的内胚层细胞的制造方法,用包含转化生长因子β(TGFβ:Transforming growth factor-β)超家族信号活化剂的培养基培养多能干细胞后,用未添加FGF2和骨形态发生蛋白4(BMP4:Bone morphogenetic protein 4)的培养基进行培养。
TGFβ超家族信号在细胞增殖的调节、分化、广泛的生物系统的发展中发挥着非常重要的作用。通常,通过由配体引起的丝氨酸/苏氨酸受体激酶的多聚化形成启动信号,且对于骨形态发生蛋白(BMP)路径通过所谓Smad1/5/8的细胞内信号分子的磷酸化而启动信号,另外,对于TGFβ/活化素路径以及NODAL/活化素路径通过Smad2/3的磷酸化而启动信号。通过活化受体进行的Smads的羧基末端的磷酸化形成与作为与它们共通的信号转导的Smad4的配体,促进转移至核中。已知活化Smads通过组合转录因子和配体来控制各种生物学效果,进行细胞的状态特异性转录调节。
作为与TGFβ超家族信号路径相关的基因,可列举出:BMP2基因、BMP4基因、BMP5基因、BMP6基因、BMP7基因、BMP8基因、生长分化因子5(GDF5:Growth differentiationfactor 5)基因、GDF6基因、GDF7基因、GDF8基因、抗苗勒氏管激素(AMH:anti-mullerianhormone)基因、配对同源蛋白2(paired like homeodomain 2:PITX2)基因、和NODAL基因等。
作为TGFβ超家族信号活化剂,只要是使骨形态发生蛋白质(BMP)路径、TGFβ/活化素路径、和/或NODAL/活化素路径的信号活化的物质就没有特别限定,
例如,可以使用:活化素A、FGF2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、AMH、PITX2、和/或NODAL等。尤其可以适宜地使用使TGFβ/活化素路径的信号活化的物质,具体而言,优选使用选自活化素A、FGF2和BMP4中的至少1种,特别优选使用活化素A、FGF2和BMP4的全部。
在包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基中使用活化素A时,活化素A的添加初始浓度优选为1ng/mL以上、2ng/mL以上、3ng/mL以上、5ng/mL以上、10ng/mL以上、20ng/mL以上、30ng/mL以上、40ng/mL以上或50ng/mL以上,优选为1000ng/mL以下、900ng/mL以下、800ng/mL以下、700ng/mL以下、600ng/mL以下、500ng/mL以下、400ng/mL以下、300ng/mL以下、200ng/mL以下、150ng/mL以下或100ng/mL以下。
在包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基中使用FGF2时,FGF2的添加初始浓度优选为1ng/mL以上、2ng/mL以上、3ng/mL以上、5ng/mL以上、10ng/mL以上、20ng/mL以上、30ng/mL以上或40ng/mL以上,优选为1000ng/mL以下、900ng/mL以下、800ng/mL以下、700ng/mL以下、600ng/mL以下、500ng/mL以下、400ng/mL以下、300ng/mL以下、200ng/mL以下、150ng/mL、100ng/mL以下、90ng/mL以下、80ng/mL以下或70ng/mL以下。
在包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基中使用BMP4时,BMP4的添加初始浓度优选为1ng/mL以上、2ng/mL以上、3ng/mL以上、5ng/mL以上、6ng/mL以上、7ng/mL以上、8ng/mL以上、9ng/mL以上、10ng/mL以上、11ng/mL以上、12ng/mL以上、13ng/mL以上、14ng/mL以上或15ng/mL以上,优选为1000ng/mL以下、900ng/mL以下、800ng/mL以下、700ng/mL以下、600ng/mL以下、500ng/mL以下、400ng/mL以下、300ng/mL以下、200ng/mL以下、150ng/mL、100ng/mL以下、90ng/mL以下、80ng/mL以下、70ng/mL以下、60ng/mL以下、50ng/mL以下、40ng/mL以下或30ng/mL以下。
未添加FGF2和BMP4的培养基优选包含活化素A。
未添加FGF2和BMP4的培养基包含活化素A时的活化素A的添加初始浓度优选为1ng/mL以上、2ng/mL以上、3ng/mL以上、5ng/mL以上、10ng/mL以上、20ng/mL以上、30ng/mL以上、40ng/mL以上或50ng/mL以上,优选为1000ng/mL以下、900ng/mL以下、800ng/mL以下、700ng/mL以下、600ng/mL以下、500ng/mL以下、400ng/mL以下、300ng/mL以下、200ng/mL以下、150ng/mL以下或100ng/mL以下。
未添加FGF2和BMP4的培养基优选包含选自胰岛素、运铁蛋白、亚硒酸钠和乙醇胺中的至少1种以上。
胰岛素的添加浓度优选为0.001μg/mL以上、0.01μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上,优选为10000μg/mL以下、1000μg/mL以下、100μg/mL以下、10μg/mL以下、9μg/mL以下、8μg/mL以下、7μg/mL以下、6μg/mL以下、5μg/mL以下、4μg/mL以下、3μg/mL以下、2μg/mL以下。运铁蛋白的添加浓度优选为0.001μg/mL以上、0.01μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.11μg/mL以上,优选为10000μg/mL以下、1000μg/mL以下、100μg/mL以下、10μg/mL以下、9μg/mL以下、8μg/mL以下、7μg/mL以下、6μg/mL以下、5μg/mL以下、4μg/mL以下、3μg/mL以下、2μg/mL以下、1.9μg/mL以下、1.8μg/mL以下、1.7μg/mL以下、1.6μg/mL以下、1.5μg/mL以下、1.4μg/mL以下、1.3μg/mL以下、1.2μg/mL以下、1.1μg/mL以下。亚硒酸钠的添加浓度优选为0.001ng/mL以上、0.01ng/mL以上、0.1ng/mL以上,优选为10000ng/mL以下、1000ng/mL以下、100ng/mL以下、10ng/mL以下、1ng/mL以下。乙醇胺的添加浓度优选为0.001μg/mL以上、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上,优选为10000μg/mL以下、1000μg/mL以下、100μg/mL以下、10μg/mL以下、1μg/mL以下、0.9μg/mL以下、0.8μg/mL以下、0.7μg/mL以下、0.6μg/mL以下、0.5μg/mL以下、0.4μg/mL以下。
包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基和/或未添加FGF2和BMP4的培养基优选进一步包含2-巯基乙醇。通过使2-巯基乙醇发挥作用,从而能够提高向内胚层细胞的分化诱导效率。
包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基优选进一步包含WNT信号活化剂。
WNT信号是指促进β-连环蛋白的核转移、发挥作为转录因子的功能的一系列的作用。WNT信号起因于细胞间相互作用,例如包括:由某细胞分泌的NT3A这样的蛋白进一步作用于另一个细胞,细胞内的β-连环蛋白转移至核中,作为转录因子发挥作用的一系列的流程。一系列的流程引起以上皮间充质相互作用为例的器官构建的最初现象。已知WNT信号通过使β-连环蛋白路径、PCP路径、Ca2+路径的三个路径活化,由此控制细胞的增殖、分化、器官形成、初期发育时的细胞运动等各种细胞功能。
作为与WNT信号路径相关的基因,有WNT3A基因等。
作为WNT信号活化剂没有特别限定,只要显示出糖原合成酶激酶-3(GSK-3)的抑制活性就可以是任意的WNT信号活化剂,例如可以使用双吲哚(靛玉红)化合物(BIO)((2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟)、该丙酮肟基类似物BIO-丙酮肟基(2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-丙酮肟基)、噻二唑烷(TDZD)类似物(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)、氧代噻二唑烷-3-硫酮类似物(2,4-二苄基-5-氧代噻二唑烷-3-硫酮)、噻吩基α-氯甲基酮化合物(2-氯-1-(4,4-二溴-噻吩-2-基)-乙酮)、苯基α溴甲基酮化合物(α-4-二溴苯乙酮)、含噻唑脲化合物(N-(4-甲氧基苄基)-N’-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲)、GSK-3β肽抑制剂、例如H-KEAPPAPPQSpP-NH2等,可以特别优选使用CHIR99021(CAS:252917-06-9)。还可以适宜地使用WNT3A。
在包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基中使用CHIR99021时,添加初始浓度优选为0.01μM以上、0.02μM以上、0.03μM以上、0.04μM以上、0.05μM以上、0.1μM以上、0.2μM以上、0.3μM以上、0.4μM以上、0.5μM以上、0.6μM以上、0.7μM以上、0.8μM以上、0.9μM以上、1μM以上或2μM以上,优选为100μM以下、90μM以下、80μM以下、70μM以下、60μM以下、50μM以下、45μM以下、40μM以下、35μM以下、30μM以下、25μM以下、20μM以下、15μM以下、10μM以下或5μM以下。更优选为3μM或4μM。
包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基和/或未添加FGF2和BMP4的培养基至少包含葡萄糖。上述培养基中所含的葡萄糖浓度的下限只要是能使细胞增殖的浓度就没有特别限定,优选0.01g/L以上。另外,上述培养基中所含的葡萄糖浓度的上限只要是不使细胞死亡的浓度就没有特别限定,例如优选10g/L以下。作为其它实施方式,从有效地分化为内胚层系列的体细胞的观点出发,优选以低于2.0g/L含有葡萄糖的培养基。包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基和/或未添加FGF2和BMP4的培养基中的葡萄糖的浓度可以是1.0g/L以下,可以是0.9g/L以下,可以是0.8g/L以下、0.7g/L以下、0.6g/L以下。包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基和/或未添加FGF2和BMP4的培养基包含葡萄糖时,葡萄糖浓度的下限没有特别限定,可以是0.01g/L以上,可以是0.02g/L以上、0.05g/L以上、0.1g/L以上、0.2g/L以上、0.3g/L以上、0.4g/L以上、0.5g/L以上。
作为包含TGFβ超家族信号活化剂的培养基和/或未添加FGF2和BMP4的培养基,通过使用以1.0g/L以下的浓度含有葡萄糖的培养基,从而使SOX2阳性细胞减少、SOX17阳性细胞增加,由此能够获得更适合的细胞团用于分化诱导为体细胞。
[8]内胚层细胞团
根据本发明,提供内胚层细胞团,其相对于OAZ1基因的表达量的Nanog基因的相对表达量为0.8以下,相对于OAZ1基因的表达量的HNF1B基因的相对表达量为1.0以上,呈现出SOX17阳性的细胞比率为80%以上。
相对于鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1:ornithine decarboxylase antizyme 1,基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:4946)基因的表达量的Nanog(Nanog homeobox,基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:79923)基因的相对表达量为0.8以下,优选为0.7以下,可以是0.65以下、0.6以下、0.55以下、0.5以下、0.45以下、0.4以下、0.35以下。Nanog为未分化标志物,因此相对于OAZ1基因的表达量的Nanog基因的相对表达量为0.8以下表示未分化的程度低、即在细胞团中未分化细胞有所降低,意味着进行了有效的分化诱导。
相对于OAZ1基因的表达量的HNF1B(hepatocyte nuclear factor 1beta,基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:6928)基因的相对表达量为1.0以上,优选为1.1以上,可以是1.2以上、1.5以上、1.7以上、2.0以上、2.3以上、2.5以上。由于HNF1B为原始肠细胞(PGT)标志物,因此相对于OAZ1基因的表达量的HNF1B基因的相对表达量为1.0以上意味着是更适合分化诱导为内胚层系列的体细胞的细胞团。
本发明的内胚层细胞团中,呈现出性别决定区Y框蛋白17(SOX17:sexdetermining region Y-box 17)阳性的细胞比率可以是80%以上,优选为85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5以上、99.9以上。由于SOX17为内胚层系标志物,因此呈现出SOX17阳性的细胞比率为80%以上意味着有效地进行了向胚体内胚层(DE)的分化诱导。需要说明的是,在测定呈现出SOX17阳性的细胞比率时,优选使用Becton,Dickinson and Company公司的抗SOX17抗体(目录编号:562594)。
优选本发明的内胚层细胞团中,相对于OAZ1基因的表达量的八聚体结合转录因子4A(HNF4A:octamer-binding transcription factor 4,基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:3172)基因的相对表达量为0.5以上,优选为0.6以上,可以是0.65以上、0.7以上、0.75以上、1.0以上、1.5以上、2.0以上、2.3以上、3以上。由于HNF4A为原始肠细胞(PGT)标志物,因此相对于OAZ1基因的表达量的HNF4A基因的相对表达量为0.5以上意味着是更适合分化诱导为内胚层系列的体细胞的细胞团。
优选相对于OAZ1基因的表达量的上皮特异性黏附分子(EpCAM:epithelial celladhesion molecule,基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:4072)基因的相对表达量为0.6以上,更优选为0.7以上,可以是0.8以上、0.9以上、1.0以上、1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.5以上、2.0以上。由于EpCAM为内胚层系标志物,因此相对于OAZ1基因的表达量的EpCAM基因的相对表达量为0.6以上意味着是更适合分化诱导为内胚层系列的体细胞的细胞团。
优选相对于OAZ1基因的表达量的波形蛋白(VIM:vimentin,基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:7431)基因的相对表达量为12以下,更优选为11以下,可以是10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3.5以下、3.0以下。由于VIM为间充质标志物,因此相对于OAZ1基因的表达量的VIM基因的相对表达量为12以下意味着是更适合分化诱导为内胚层系列的体细胞的细胞团。
优选相对于OAZ1基因的表达量的性别决定区Y框蛋白2(SOX2:sex determiningregion Y-box 2,基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:6657)基因的相对表达量为0.11以下,更优选为0.10以下,可以是0.07以下、0.05以下、0.01以下、0.006以下、0.0045以下。由于SOX2为未分化标志物,因此相对于OAZ1基因的表达量的SOX2基因的相对表达量为0.11以下意味着未分化的程度低、即在细胞团中未分化细胞有所降低,因此说明进行了有效的分化诱导。
优选相对于OAZ1基因的表达量的V-Myc骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(c-Myc:v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog,基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:4609)基因的相对表达量为0.1以下,更优选为0.095以下,可以是0.05以下、0.045以下、0.035以下、0.02以下、0.015以下、0.01以下。由于c-Myc为未分化标志物,因此相对于OAZ1基因的表达量的c-Myc基因的相对表达量为0.1以下意味着未分化的程度低、即在细胞团中未分化细胞有所降低,因此说明进行了有效的分化诱导。
优选相对于OAZ1基因的表达量的八聚体结合转录因子(OCT4:octamer-bindingtranscription factor 4,基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:5460)基因的相对表达量为0.4以下,更优选为0.35以下,可以是0.3以下、0.25以下、0.2以下、0.15以下、0.1以下、0.05以下、0.01以下。由于OCT4为未分化标志物,因此相对于OAZ1基因的表达量的OCT4基因的相对表达量为0.4以下意味着未分化的程度低、即在细胞团中未分化细胞有所降低,因此说明进行了有效的分化诱导。
优选相对于OAZ1基因的表达量的纤维连接蛋白-1(Fibronectin-1基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:2335)基因的相对表达量为1.0以上,更优选为1.1以上,可以是1.2以上、1.3以上、1.4以上、1.5以上、1.6以上。纤维连接蛋白-1是与ECM(细胞外基质:Extracellular matrix)受体相互作用相关的分子。已知ECM对于细胞不仅是支架,而且还发出组织的形态形成·分化·动态平衡所需的信号。因此,相对于OAZ1基因的表达量的纤维连接蛋白-1的相对表达量为1.0以上意味着是更适合分化诱导为内胚层系列的体细胞的细胞团。
优选相对于OAZ1基因的表达量的细胞周期蛋白D1(Cyclin D1基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:595)基因的相对表达量为0.015以下,更优选为0.014以下,可以是0.013以下、0.012以下、0.011以下。细胞周期蛋白D1与细胞周期相关。因此,相对于OAZ1基因的表达量的细胞周期蛋白D1基因的相对表达量为0.015以下意味着为细胞周期容易停止的状态(抑制细胞增殖的状态),因此说明进行了更有效的分化诱导。
优选相对于OAZ1基因的表达量的基质金属肽酶2(matrix metallopeptidase2)(基质金属肽酶2基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:4313)基因的相对表达量为0.020以下,更优选为0.019以下,可以是0.018以下、0.017以下。已知基质金属肽酶2与癌症中的血管新生等相关,分解构成了基底膜的胶原蛋白等细胞外基质。因此,相对于OAZ1基因的表达量的基质金属肽酶2基因的相对表达量为0.020以下意味着细胞外基质的分解得到抑制,与上述纤维连接蛋白-1等ECM的接触稳定、容易进入组织的形态形成·分化·动态平衡所需的信号,因此说明进行了更有效的分化诱导。
优选相对于OAZ1基因的表达量的CD44(CD44基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:960)基因的相对表达量为0.020以下,更优选为0.019以下,可以是0.018以下、0.017以下、0.016以下、0.015以下、0.014以下、0.013以下、0.012以下、0.011以下、0.010以下、0.009以下。CD44已知是以透明质酸作为主要配体的粘附分子,已知与癌细胞的增殖能等相关。由于示出了相对于OAZ1基因的表达量的CD44基因的相对表达量为0.020以下意味着细胞的增殖得到抑制,因此说明进行了更有效的分化诱导。
优选相对于OAZ1基因的表达量的胰岛素受体底物蛋白1(insulin receptorsubstrate1)(胰岛素受体底物蛋白1基因序列参照在美国国立生物技术信息中心的基因数据库中登记的ID:3667)基因的相对表达量为0.0010以下,更优选为0.0009以下,可以是0.0008以下、0.0007以下。已知胰岛素受体底物蛋白1是与PI3K(磷脂酰肌醇-3激酶)-Akt信号传递路径相关的分子,若PI3K-Akt信号被活化则可抑制分化。相对于OAZ1基因的表达量的胰岛素受体底物蛋白1基因的相对表达量为0.0010以下意味着不易进入-Akt信号,因此说明进行了更有效的分化诱导。
相对于OAZ1基因的表达量的Nanog基因的相对表达量、相对于OAZ1基因的表达量的HNF1B基因的相对表达量、相对于OAZ1基因的表达量的HNF4A基因的相对表达量、相对于OAZ1基因的表达量的EpCAM基因的相对表达量、相对于OAZ1基因的表达量的VIM基因的相对表达量、相对于OAZ1基因的表达量的SOX2基因的相对表达量、相对于OAZ1基因的表达量的OCT4基因的相对表达量、相对于OAZ1基因的表达量的c-Myc基因的相对表达量、相对于OAZ1基因的表达量的纤维连接蛋白-1基因的相对表达量、相对于OAZ1基因的表达量的细胞周期蛋白D1基因的相对表达量、相对于OAZ1基因的表达量的基质金属肽酶2基因的相对表达量、相对于OAZ1基因的表达量的CD44基因的相对表达量、以及相对于OAZ1基因的表达量的胰岛素受体底物蛋白1基因的相对表达量是指:将OAZ1基因的表达量设为1时、Nanog基因、HNF1B基因、HNF4A基因、EpCAM基因、VIM基因、SOX2基因、OCT4基因、c-Myc基因、纤维连接蛋白-1基因、细胞周期蛋白D1基因、基质金属肽酶2基因、CD44基因、胰岛素受体底物蛋白1基因的表达量的比率。各基因的表达量的测定可以通过本领域技术人员利用公知的方法来进行。例如,可以通过回收分化诱导的内胚层细胞的总RNA,进行cDNA的合成,以该cDNA作为模板来实施定量的RT-PCR(qPCR),从而能够测定各基因的表达量。Nanog基因、HNF1B基因、HNF4A基因、EpCAM基因、VIM基因、SOX2基因、OCT4基因、c-Myc基因、纤维连接蛋白-1基因、细胞周期蛋白D1基因、基质金属肽酶2基因、CD44基因、胰岛素受体底物蛋白1基因的表达量通过OAZ1基因的表达量而标准化。
呈现出SOX17阳性的细胞比率可以利用流式细胞仪进行测定,没有特别限定。对于使用荧光标记抗体的流式细胞仪,在检查出与阴性对照(同型对照)相比发出更强荧光的细胞时,判定该细胞对于该标志物为“阳性”。荧光标记抗体可以使用该技术领域中公知的任意抗体,例如可列举出通过异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)等而标记的抗体,但不限定于这些。
[9]向胰腺β细胞的分化诱导
由内胚层细胞向胰腺β细胞的分化诱导通常可以按照内胚层细胞(胚体内胚层:Definitive endoderm:DE)→原始肠细胞(Primitive Gut Tube:PGT)→后前肠细胞(Posterior Foregut:PFG)→胰腺前体细胞(胰腺祖细胞:PP)→内分泌前体细胞(Endocrine Precursor:EP)→胰腺β细胞(pancreaticβcell:β)这样的顺序进行。
向胰腺β细胞的分化诱导时的培养温度只要是适于培养所使用的多能干细胞的培养温度就没有特别限定,通常为30℃~40℃,优选为约37℃。
优选利用CO2孵化器等在约1~10%,优选在5%的CO2浓度气氛下进行培养。
作为由内胚层细胞(胚体内胚层)分化诱导为原始肠细胞时使用的培养基,可以使用在基础培养基(例如,DMEM培养基等)中添加了B27营养强化剂、FGF-2和FGF-7、EC23、SB431542、Dorsomorphin和SANT1的培养基。
由内胚层细胞(胚体内胚层)分化诱导为原始肠细胞的培养期间通常为24小时~72小时,优选为36小时~60小时左右。
作为由原始肠细胞分化诱导为后前肠细胞时使用的培养基,可以使用在基础培养基(例如,DMEM培养基等)中添加了B27营养强化剂、FGF-2、EC23、SB431542、Dorsomorphin和SANT1的培养基。
由原始肠细胞后分化诱导为前肠细胞的培养期间通常为48小时~144小时,优选为72小时~120小时左右。
作为由后前肠细胞分化诱导为胰腺前体细胞时使用的培养基,可以使用在基础培养基(例如,DMEM培养基等)中添加了B27营养强化剂、FGF-10、EC23、Dorsomorphin、ALK抑制剂II、吲哚内酰胺V和艾塞那肽-4的培养基。
由后前肠细胞分化诱导为胰腺前体细胞的培养期间通常为24小时~120小时,优选为48小时~96小时左右。
作为由胰腺前体细胞分化诱导为内分泌前体细胞时使用的培养基,可以使用在基础培养基(例如,改良型-DMEM培养基等)中添加了B27营养强化剂、EC23、Dorsomorphin、ALK抑制剂II、SANT1和艾塞那肽-4的培养基。
由胰腺前体细胞分化诱导为内分泌前体细胞的的培养期间通常为24小时~120小时,优选为48小时~96小时左右。
作为由内分泌前体细胞分化诱导为胰腺β细胞的培养基,可以使用在基础培养基(例如,改良型-DMEM培养基等)中添加了B27营养强化剂、FGF-2、BMP-4、HGF、IGF-1、ALK抑制剂II、艾塞那肽-4、烟酰胺、佛司可林的培养基。
由内分泌前体细胞分化诱导为胰腺β细胞的的培养期间通常为96小时~240小时左右。
利用上述的方法得到的胰腺β细胞的胰岛素分泌能力高、能够对糖尿病发挥高的治疗效果。
[10]向中胚层细胞或外胚层细胞的分化诱导
本发明中,将多能干细胞分化诱导为中胚层细胞时例如可以使用记载于日本特表2013-530680号公报中的方法。日本特表2013-530680号公报中记载了由人多能干细胞制造中间中胚层细胞的方法,所述方法包括如下工序:(i)在包含活化素A和Wnt的培养基中培养人多能干细胞的工序;及(ii)在包含BMP和Wnt或Wnt的功能等价物的培养基中,培养工序(i)中得到的细胞的工序。另外,Albert Q Lam et al,J Am Soc Nephrol 25:1211-12225,2015中记载了:通过用作为GSK3β抑制剂的CHIR99021处理人多能干细胞后,用FGF2和视黄酸进行处理,从而能够有效地分化诱导为中胚层细胞。本发明中,还可以使用上述文献中记载的分化诱导因子,将多能干细胞分化诱导为中胚层细胞。
本发明中,将多能干细胞分化诱导为外胚层细胞时例如可以采用如下方法:在包含BMP抑制剂(Noggin等)和TGFβ/ACTIVIN抑制剂的培养基中培养多能干细胞的方法(Chambers SM.et al.,Nat Biotechnol.27,275-280(2009))、在包含BMP抑制剂(Noggin等)和Nodal/ACTIVIN抑制剂的培养基中培养多能干细胞的方法(Beata Surnacz et al.,Stem Cells,2012;30:1875-1884)。
通过以下的实施例对本发明进行具体地说明,但本发明不限定于实施例。
实施例
[实施例1]
<多能干细胞的维持培养>
(TKDN4-M株)
人iPS细胞株TKDN4-M(东京大学医科学研究所)在用MITOMYCIN-C(WAKO公司)处理的SNL FEEDER细胞上用包含人iPS细胞培养基(20%Knockout血清替代品(KSR;GIBCO公司)、1X非必需氨基酸(NEAA;WAKO公司)、55μmoL/L 2-MERCAPTETHANOL(2-ME;GIBCO公司)、7.5NG/ML RECOMBINANT HUMAN FIBROBLAST GROWTH FACTOR(FGF2;PEPROTECH公司)、0.5XPENICILLIN AND STREPTOMYCIN(PS;WAKO公司)的DMEM/HAM‘S F12(WAKO公司))进行未分化维持培养。或者,在用VITRONECTIN(GIBCO)涂布的孔板上,用包含1XPENICILLIN ANDSTREPTOMYCIN AND AMPHOTERICIN B(WAKO公司)的ESSENTIAL 8培养基(E8;GIBCO公司)进行未分化维持培养。需要说明的是,以仅在接种时最终浓度为10μM的方式添加Y27632来进行培养。
(454E2株)
人iPS细胞株454E2(CIRA)在用MITOMYCIN-C(WAKO公司)处理的SNL FEEDER细胞上用包含人iPS细胞培养基(20%Knockout血清替代品(KSR;GIBCO公司)、1X非必需氨基酸(NEAA;WAKO公司)、55μmoL/L2-MERCAPTETHANOL(2-ME;GIBCO公司)、7.5NG/ML RECOMBINANTHUMAN FIBROBLAST GROWTH FACTOR(FGF2;PEPROTECH公司)、0.5X PENICILLIN ANDSTREPTOMYCIN(PS;WAKO公司)的DMEM/HAM‘S F12(WAKO公司))进行未分化维持培养。或者,在用VITRONECTIN(GIBCO)涂布的孔板上,用包含1XPENICILLIN AND STREPTOMYCIN ANDAMPHOTERICIN B(WAKO公司)的ESSENTIAL 8培养基(E8;GIBCO公司)进行未分化维持培养。需要说明的是,以仅在接种时最终浓度为10μM的方式添加Y27632并进行了培养。
<聚集块的制作>
(TkDN4-M株)
为了从用丝裂霉素c(Wako公司)处理的SNL饲养层细胞剥离人iPS细胞株TkDN4-M(东京大学医科学研究所)而用培养基清洗3次,然后进而用PBS进行1次清洗,用accumax(Innova Cell Technologies公司)在37℃下孵育15分钟后通过移液制成单细胞。将制成3×107细胞的单细胞的TkDN4-M悬浮在包含30mL的10μM的Y27632的mTeSR1的培养基中,移至30mL一次性生物反应器(ABLE公司)中并安装在6通道磁力搅拌器(ABLE公司)上,进行1天悬浮培养。
(454E2株)
人iPS细胞株454E2(Cira)用PBS清洗2次后,用Accutase(Innova CellTechnologies公司)在37℃进行5分钟左右孵育,通过移液制成回收的单细胞,然后用DMEM/Ham’s F12进行清洗。将制成3×107细胞的单细胞的454E2悬浮在包含30mL的10μM的Y27632的mTeSR1中,移至30mL一次性生物反应器(ABLE公司)并安装在6通道磁力搅拌器(ABLE公司)上,进行1天悬浮培养。
<多能干细胞的预培养>
将通过维持培养而得到的形成了聚集体的细胞团悬浮在包含20%(体积/体积)Knockout血清替代品(KSR;Gibco公司)、1x非必需氨基酸(NEAA;Wako公司)、55μmol/L 2-巯基乙醇(2-mercaptethanol;Gibco公司)、7.5ng/mL重组人成纤维细胞生长因子(FGF2;Peprotech公司)、0.5×青霉素和链霉素(PS;Wako公司)的DMEM/Ham’s F12(Wako公司)中,移至30mL一次性生物反应器(ABLE公司)中,安装在6通道磁力搅拌器(ABLE公司)上,进行1天悬浮培养。
<向内胚层细胞(胚体内胚层)的分化诱导>
最初的2天将通过预培养而得到的形成了聚集体的细胞团悬浮培养在包含0.5%牛血清白蛋白(BSA;sigma)、0.4×PS、1mmol/L丙酮酸钠(Wako公司)、1xNEAA、80ng/mL重组人活化素A(Peprotech公司)、50ng/mL FGF2、20ng/mL重组骨形态发生蛋白4(BMP4;Peprotech公司)、3μmol/L CHIR99021(Wako公司)的RPMI1640(Wako公司)中。第3天从该培养基中去除BMP4、FGF2、CHIR99021并进行悬浮培养,第4天用进一步加入了1%KSR的培养基进行1天悬浮培养。需要说明的是,安装在6通道磁力搅拌器(ABLE公司)上进行悬浮培养,制备了样品。
[参考例1]
<多能干细胞的维持培养>
利用实施例1中记载的方法同样地进行培养。
<多能干细胞的预培养>
对于通过维持培养而得到的细胞团,将TkDN4-M株在用丝裂霉素c处理的SNL饲养层细胞上、将454E2株在用玻连蛋白涂布的培养皿上,用包含20%Knockout血清替代品、1×非必需氨基酸、55μmol/L 2-巯基乙醇、7.5ng/mL重组人成纤维细胞生长因子、0.5×青霉素和链霉素的DMEM/Ham’s F12,在粘附在饲养层细胞或培养皿上的状态下进行1天培养。
<向内胚层细胞(胚体内胚层)的分化诱导>
对于通过预培养而得到的细胞团,最初的2天用包含0.5%牛血清白蛋白、0.4×PS、1mmol/L丙酮酸钠、1×NEAA、80ng/mL重组人活化素A、50ng/mL FGF2、20ng/mL重组骨形态发生蛋白4、3μmol/L CHIR99021的RPMI1640、在粘附于培养皿上的状态下培养。第3天从该培养基中去除CHIR99021并在粘附在培养皿上的状态下进行培养,第4天用进一步加入了1%(体积/体积)KSR的培养基、在粘附在培养皿上的状态下进行1天培养。
[分化效率的解析]
为了调查实施例1和参考例1中制作的内胚层细胞团中的向胚体内胚层(DE)的分化效率,通过以下所示的步骤,通过定量的RT-PCR和流式细胞仪解析进行了分析。
<定量的RT-PCR>
通过ISOGEN(Wako公司)将分化诱导的内胚层系间细胞的总RNA分离·纯化,使用PrimeScriptII(Takara Bio公司)进行了cDNA的合成。此处将合成的cDNA作为模板,使用GoTaq qPCR master mix(Promega公司)并通过MyiQ qPCR machine(Bio-Rad公司)实施了qPCR。通过SYBR Green的插层法进行检测,通过制作标准曲线的相对定量法进行基因表达量比较。各基因的表达水平通过作为持家基因的OAZ1而标准化。需要说明的是,关于OCT4、SOX2、c-Myc、Nanog、HNH1B和HNF4A的基因,对样品1和2进行了分析。对于纤维连接蛋白-1(FN1)、CyclinD1、CD44、基质金属肽酶2(MMP2)、胰岛素受体底物蛋白1(IRS1),以n=3进行分析,由得到的分析值计算出平均值和标准偏差值。将其详情记载于[表1]。
用于qPCR的引物的碱基序列如下。
C-MYC F:GTC TCC ACA CAT CAG CAC AAC TAC(序列号1)
C-MYC R:TTC GGT TGT TGC TGA TCT GTC(序列号2)
HNF1B F:GAG ATC CTC CGA CAA TTC AAC C(序列号3)
HNF1B R:AAA CAG CAG CTG ATC CTG ACT G(序列号4)
HNF4A F:AAG AGA TCC ATG GTG TTC AAG GAC(序列号5)
HNF4A R:AGG TAG GCA TAC TCATTG TCA TCG(序列号6)
NANOG F:CGA AGA ATA GCA ATG GTG TGA C(序列号7)
NANOG R:GTT GCT CCA GGT TGA ATT GTT C(序列号8)
OAZ1 F:GTC AGA GGG ATC ACA ATC TTT CAG(序列号9)
OAZ1 R:GTC TTG TCG TTG GAC GTT AGT TC(序列号10)
OCT4 F:CGC TTC AAG AAC ATG TGT AAG CTG C(序列号11)
OCT4 R:CTC TCA CTC GGT TCT CGA TAC TG(序列号12)
SOX2 F:ATA AGT ACT GGC GAA CCA TCT CTG(序列号13)
SOX2 R:AAT TAC CAA CGG TGT CAA CCT G(序列号14)
EPCAM F:ATG ATC CTG ACT GCG ATG AGA G(序列号15)
EPCAM R:CAG TGT CCT TGT CTG TTC TTC TGA C(序列号16)
VIM F:GTC ACC TTC GTG AAT ACC AAG AC(序列号17)
VIM R:AGG CAG AGA AAT CCT GCT CTC(序列号18)
纤维连接蛋白-1(FN1)F:CTC TGT CAA CGA AGG CTT GAA C(序列号27)
纤维连接蛋白-1(FN1)R:CAC TTC CAA AGC CTA AGC ACT G(序列号28)
CD44 F:ATA GAA GGG CAC GTG GTG ATT C(序列号29)
CD44 R:ATG TGT CAT ACT GGG AGG TGT TG(序列号30)
细胞周期蛋白D1F:CCG CAC GAT TTC ATT GAA C(序列号31)
细胞周期蛋白D1R:ACT TCA CAT CTG TGG CAC AGA G(序列号32)
基质金属肽酶2(MMP2)F:CAC CCA TTT ACA CCT ACA CCA AG(序列号33)
基质金属肽酶2(MMP2)R:TTG CAG ATC TCA GGA GTG ACA G(序列号34)
胰岛素受体底物蛋白1(IRS1)F:GTT TCA TCT CCT CGG ATG AGT ATG(序列号35)
胰岛素受体底物蛋白1(IRS1)R:TAG TTG CTT AGC TCC TCC TCA CC(序列号36)
<测定的结果>
将测定基因表达量的结果示于图1~图3和图10~图14。
下述表中汇总示出图10~图14的结果。
[表1]
与利用参考例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞相比,利用实施例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞中未分化标志物(OCT4、SOX2、c-Myc和Nanog)的基因表达量有所减少(图1)。
与利用参考例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞相比,利用实施例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞中原始肠细胞(PGT)标志物(HNF1B和HNF4A)的基因表达量有所提高(图1)。
与利用参考例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞相比,利用实施例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞中纤维连接蛋白-1(FN1)的基因表达量有所提高(图10)。
与利用参考例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞相比,利用实施例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞中细胞周期蛋白D1、CD44、基质金属肽酶2(MMP2)、和胰岛素受体底物蛋白1(IRS1)的基因表达量有所减少(图11~图14)。
<流式细胞仪解析>
利用4%PFA(多聚甲醛)将回收并分散至单细胞的细胞在室温下固定20分钟后,用PBS清洗3次,利用冷甲醇在-20℃下进行一夜透明处理。用3%FBS(胎牛血清)/PBS清洗3次后,利用3%FBS(胎牛血清)/PBS进行阻断,利用下述表中的经荧光标记的抗体在4℃下染色30分钟~1小时。用3%FBS(胎牛血清)/PBS清洗1次后,通过FACSVerse(Becton,Dickinsonand Company;BD公司)解析通过了细胞滤网的细胞。
[表2]
抗体名 制造商 目录编号
抗SOX2抗体 Biolegend公司 656110
抗SOX17抗体 BD公司 562594
抗FOXA2抗体 BD公司 561589
与利用参考例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞相比,利用实施例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞中作为内胚层系标志物的EpCAM的基因表达量有所提高,呈现出SOX17阳性的细胞占90%以上(图2和图3)。
与利用参考例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞相比,利用实施例1中记载的方法分化诱导的内胚层细胞中作为间充质标志物的VIM的基因表达量有所减少(图3)。
[实施例2]
<分化诱导为胰腺β细胞的>
利用实施例1和参考例1中记载的方法而得到的由内胚层细胞向胰腺β细胞的分化诱导基于Yabe SG,Fukuda S,Takeda F,Nashiro K,Shimoda M,Okochi H.Efficientgeneration of functional pancreaticβ-cells from人induced pluripotent stemcells.J Diabetes.2017Feb;9(2):168-179中记载的方法来实施。具体而言Primitive GutTube(PGT)分化用包含0.5%BSA、1mmol/L丙酮酸钠、1×NEAA、0.4×PS、50ng/mL FGF2、50ng/mL重组人FGF7(Peprotech公司)、2%B27supplement(Gibco公司)、0.67μmol/L EC23(Santa Cruz公司)、1μmol/L dorsomorphin(Wako公司)、10μmol/L SB431542(wako公司)、0.25mol/L SANT1(Wako公司)的RPMI1640培养2天。
对于Posterior Fore Gut(PFG)分化,用包含0.4×PS、1×NEAA、50ng/mL FGF2、2%B27、0.67μmol/L EC23、1μmol/L dorsomorphin、10μmol/L SB431542、0.25μmol/LSANT1的DMEM-高葡萄糖(Wako公司)培养4天。
对于胰腺祖细胞(PP)分化,用包含0.4×PS、1×NEAA、50ng/mL重组人FGF10(Peprotech公司)、2%B27、0.5μmol/L EC23、1μmol/L dorsomorphin、0.25μmol/L SANT1、5μmol/L Alk5抑制剂II(Biovision公司)、0.3μmol/L indolactam V(ILV;Cayman公司)的DMEM-高葡萄糖培养3天。
对于内分泌祖细胞分化,用包含0.4×PS、2mmol/L L-谷氨酰胺、2%B27、0.2μmol/L EC23、1μmol/L dorsomorphin、0.25μmol/L SANT1、5μmol/L Alk5抑制剂II、50ng/mL艾塞那肽4(Sigma公司)的改良型-DMEM(Gibco公司)培养3天。
胰腺β细胞分化用包含0.4×PS、2mmol/L L-谷氨酰胺、2%B27、10ng/mL BMP4、10ng/mL FGF2、50ng/mL重组人肝细胞生长因子(HGF;Peprotech公司)、50ng/mL胰岛素样生长因子1(IGF1;Peprotech公司)、5μmol/L Alk5抑制剂II、50ng/mL艾塞那肽4、5mmol/Lnicotinamide(Sigma公司)、5μmol/L佛司可林(Wako公司)的改良型-DMEM培养6天。将由此得到的细胞称为iPS-β细胞。
<向糖尿病模型小鼠的移植实验(糖尿病模型非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠实验)>
将分化诱导为上述胰腺β细胞时得到的iPS-β细胞用HBSS清洗一次后,悬浮在包含3.33μg/mL的iMatrix-511(Wako公司)的HBSS中,通过汉密尔顿注射器(Hamilton CompanyJapan K.K.)将悬浮的细胞移植至糖尿病模型NOD/SCID小鼠(CLEA Japan,Inc.)的左肾被膜下(小鼠个体9A-1、9A-2、9B-2给药4×106个细胞,27B-1给药6×106个细胞)。糖尿病模型NOD/SCID小鼠使用从尾静脉给药130mg/kg的链脲佐菌素(STZ;Sigma公司)且血糖值为250mg/dL以上的个体。移植(0天)从STZ给药(-14天)至14天后进行。从尾静脉采取血液并使用Glutest Neo Alpha(三和化学株式会社)测定了偶然血糖值。在移植后从尾静脉采集血液样品至Fisherbrand肝素处理红细胞压积测定管(Fisher Scientific公司),通过离心分离(10分钟、4℃、800×g)分离血清后使用人超灵敏C肽ELISA试剂盒(Mercodia公司)进行了小鼠血液中人C肽测定。移植了由利用参考例1中记载的方法而得到的内胚层细胞制作的iPS-β细胞的小鼠个体9A-1、9A-2、9B-2在移植后12周进行了血液样品采集,移植了由利用实施例1中记载的方法而得到的内胚层细胞制作的iPS-β细胞的小鼠个体27B-1在移植后2周、6周、11周、16周进行了血液样品采集。
为了调查在生物体内的功能而调查了小鼠血液中人C肽的浓度,将结果示于图4。由利用参考例1中记载的方法而得到的内胚层细胞制作的iPS-β细胞在移植12周后,小鼠血液中人C肽的浓度为十几pM左右,但由利用实施例1中记载的方法而得到的内胚层细胞制作的iPS-β细胞在移植2周后,小鼠血液中人C肽的浓度超过50pM,进而,在这之后C肽量增加,在16周时增加至接近300pM。如上所述,利用本发明的方法,能使移植至小鼠的人iPS细胞来源胰腺β细胞所分泌的小鼠血液中人C肽量大幅增加。
另外,将测定了糖尿病模型小鼠的偶然血糖的结果示于图5。
未移植细胞的小鼠个体中,在移植后140天显示出血糖值为400~600mg/dL且是非常高的值,与此相对,移植了由利用实施例1中记载的方法而得到的内胚层细胞制作的iPS-β细胞的个体中,在移植后血糖值降低,在移植后60天降低至250mg/dL,在移植后140天显示出为125mg/dl这样几乎正常值。由该结果证实了:利用本发明的方法进行分化诱导而得到的体细胞(胰腺β细胞)对治疗糖尿病是非常有效的。
[实施例3]
<由多能干细胞向内胚层细胞分化诱导时的BSA和ITS的效果>
利用实施例1中记载的方法进行多能干细胞的维持培养和预培养,利用以下的方法验证了由多能干细胞向内胚层细胞分化诱导时添加BSA和ITS的有用性。作为iPS细胞株,使用253G1(Cira)和454E2(Cira)。
第一个条件中,最初的2天用包含10mg/mL(1.0%)牛血清白蛋白、0.4×PS、1mmol/L丙酮酸钠、1×NEAA、80ng/mL活化素A、50ng/mL FGF2、20ng/mL BMP4、3μmol/L CHIR99021、1:50000ITS-X(Gibco公司)的RPMI1640培养。第3天从该培养基中去除BMP4、FGF2、CHIR99021并进行培养,用进一步加入了1%KSR的培养基培养一天。
第二个条件中,最初的2天用包含2.5mg/mL(0.25%)牛血清白蛋白、0.4x PS、1mmol/L丙酮酸钠、1×NEAA、80ng/mL活化素A、50ng/mL FGF2、20ng/mL BMP4、3μmol/LCHIR99021、1:5000ITS-X的RPMI1640培养。第3天从该培养基中去除BMP4、FGF2、CHIR99021并进行培养,用进一步加入了1%KSR的培养基培养一天。
为了调查分化为内胚层细胞的分化效率,通过ISOGEN(Wako公司)将利用这些方法而分化诱导的内胚层细胞团的总RNA分离·纯化,使用PrimeScript II(Takara Bio公司)进行了cDNA的合成。将此处合成的cDNA作为模板,使用GoTaq qPCR master mix(Promega公司)并通过MyiQ qPCR machine(Bio-Rad公司)实施了qPCR。通过SYBR Green的插层法进行检测,通过制作标准曲线的相对定量法进行基因表达量比较。作为未分化标志物的OCT3/4、作为分化标志物的SOX17的表达水平通过作为持家基因的OAZ1而标准化。
用于qPCR的引物的碱基序列如下。
OAZ1-F:GTC AGA GGG ATC ACA ATC TTT CAG(序列号19)
OAZ1-R:GTC TTG TCG TTG GAC GTT AGT TC(序列号20)
OCT4-F:CGC TTC AAG AAC ATG TGT AAG CTG C(序列号21)
OCT4-R:CTC TCA CTC GGT TCT CGA TAC TG(序列号22)
SOX17-F:TAC ACA CTT CCT GGA GGA GCT AAG(序列号23)
SOX17-R:CCA AAC TGT TCA AGT GGC AGA C(序列号24)
FOXA2-F:GAG ATC TAC CAG TGG ATC ATG GAC(序列号25)
FOXA2-R:CAC CTT CAG GAA ACA GTC GTT G(序列号26)
将上述的测定结果示于图6。
在1%BSA-1:50000ITS-X的条件和0.25%BSA-1:5000ITS-X的条件的任意条件下,DE标志物的SOX17和FOXA2的表达水平均较高,由此确认了进行了有效的分化诱导。需要说明的是,与1%BSA-1:50000ITS-X的条件相比,在0.25%BSA-1:5000ITS-X的条件下培养的样品中作为未分化标志物的OCT4的表达水平进一步显著降低,而内胚层系标志物的SOX17和FOXA2的表达水平进一步显著增高,由此确认了与1%BSA-1:50000ITS-X的条件相比,0.25%BSA-1:5000ITS-X的条件是更有效的。
[实施例4]
<由多能干细胞向内胚层细胞分化诱导时的2-巯基乙醇的效果>
利用实施例1中记载的方法进行多能干细胞的维持培养和预培养,利用以下的方法验证了由多能干细胞向内胚层细胞分化诱导时添加2-巯基甲醇的有用性。
用Accutase((Innova Cell Technologies公司)剥离培养至亚汇合(80%左右)的细胞并回收,进行颗粒化后,以每1mL包含5×105个细胞的方式添加包含10mg/mL BSA、10μMY27632的Essentil8并使细胞再悬浮,以4ml/孔的比例接种在悬浮培养用6孔板(SumitomoBakelite Co.,Ltd.)中。在轨道摇床(Optima co.,Ltd.)上以90rpm的旋转速度培养一夜而制作了细胞聚集块。然后,将培养基更换为20%Knockout血清替代品、1×非必需氨基酸、55μmol/L 2-巯基甲醇、7.5ng/mL重组人成纤维细胞生长因子、1x青霉素和链霉素和两性霉素B并进行1天培养,然后进行4天胚体内胚层(DE)分化,最初的1天在包含0.5%牛血清白蛋白、1×PSB、1mmol/L丙酮酸钠、1×NEAA、80ng/mL活化素A、50ng/mL FGF2、20ng/mL BMP4、3μmol/L CHIR99021的RPMI1640中添加55μmol/L 2-巯基乙醇或1%N21supplement(R&DSystems Inc.)进行培养。第2天和第3天从该培养基中去除BMP4、FGF2、CHIR99021并将活化素A的浓度设为100ng/mL,添加55μmol/L 2-巯基乙醇或1%N21营养强化剂进行培养,第4天用进一步加入了1%KSR的培养基培养一天。
<细胞密度计数>
进行向内胚层细胞的分化诱导后,用Accutase在37℃下处理5~10分钟,通过移液使细胞单分散,进行台盼蓝染色后,使用血细胞计数板计数了分化诱导为内胚层细胞的细胞团的细胞数,测定了细胞密度。
<流式细胞仪解析>
进行向内胚层细胞的分化诱导后,利用4%PFA(多聚甲醛)将回收并分散至单细胞的细胞在室温下固定20分钟后,用PBS清洗3次,利用冷甲醇在-20℃下进行一夜透明处理。用3%FBS(胎牛血清)/PBS清洗3次后,利用3%FBS(胎牛血清)/PBS进行阻断,利用下述表中的经荧光标记的抗体在4℃下染色30分钟~1小时。用3%FBS(胎牛血清)/PBS清洗1次后,通过FACSVerse(Becton,Dickinson a11d Company;BD公司)解析通过了细胞滤网的细胞。
[表3]
抗体名 制造商 目录编号
抗SOX2抗体 Biolegend公司 656110
抗SOX17抗体 BD公司 562594
还进行了如下实验:在上述中,未使用55μmol/L 2-巯基乙醇,除此以外利用同样的方法进行了培养。
还进行了如下实验:在上述中,使用N21-MAX Media Supplement(R&D Systems公司)(但是不包含胰岛素)代替55μmol/L 2-巯基乙醇,除此以外利用同样的方法进行培养。
从N21-MAX Media Supplement中去除了胰岛素而得到的组成如下所述。
白蛋白(牛)、L-肉碱、过氧化氢酶、皮质酮、乙醇胺、谷胱甘肽、半乳糖、运铁蛋白、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、黄体酮、腐胺、维生素A乙酸酯、视黄醇、亚硒酸盐、超氧化物歧化酶、三碘-L-甲状腺原氨酸、D,L-α-生育酚、D,L-α-生育酚乙酸酯
对于上述培养后(第5天)的细胞,将通过FACS测定SOX2、SOX17为阳性的细胞的比例的结果示于图7。另外,将测定上述培养后(第5天)的细胞的细胞密度的结果示于图8。
在添加了2-巯基乙醇、未添加2-巯基乙醇中的任意情况下,均观察到分化为内胚层细胞。进而,添加了2-巯基乙醇的情况下,由细胞密度的测定结果还观察到生存细胞数的增加。另外,使用从N21-MAX Media Supplement中去除了胰岛素而得到的组合物的情况下,也观察到生存细胞数的增加。进而可知,添加了2-巯基乙醇的情况下,未分化残留率(SOX2阳性细胞率)有所降低。即使添加2-巯基乙醇,内胚层系分化效率(SOX17阳性细胞率、FOXA2阳性细胞率)实质上也未发生变化。
[实施例5]
<预培养多能干细胞时的FGF2和TGFβ1的研究>
对TkDN4-M株进行了实施例1中记载的未分化维持之后,用Accutase剥离培养至亚汇合(80%左右)的细胞并回收,进行颗粒化后,以4mL/孔添加包含10mg/mL BSA、10μMY27632的Essentil8,然后将颗粒化的细胞悬浮于孔中,利用轨道摇床以90rpm的旋转速度培养12小时而制作了细胞聚集体。
在对制作的细胞聚集体进行预培养时,用包含5mg/mL BSA、1xNEAA、55μmol/L 2-巯基乙醇、1xPS的Essential 6培养基(不含FGF2且不含TGFβ)培养一天后,制备了实施例1中记载的已开始分化诱导的样品1。另外,在对另行制作的细胞聚集体进行预培养时,用包含5mg/mL BSA、1×NEAA、55μmol/L 2-巯基乙醇、1xPS的Essential 8培养基培养一天后,制备了实施例1中记载的已开始分化诱导样品2。此外,通过以下所示的流式细胞仪解析对制备的样品1和2的分化诱导效率进行了验证。
<流式细胞仪解析>
进行了向内胚层细胞的分化诱导后,回收细胞并利用4%PFA(多聚甲醛)将分散至单细胞的细胞在室温下固定20分钟后,用PBS清洗3次,利用冷甲醇在-20℃下进行一夜透明处理。用3%FBS(胎牛血清)/PBS清洗3次后,利用3%FBS(胎牛血清)/PBS进行阻断,利用下述表中的经荧光标记的抗体在4℃下染色30分钟~1小时。用3%FBS(胎牛血清)/PBS清洗1次后,通过FACSVerse(Becton,Dickinson and Company;BD公司)解析通过了细胞滤网的细胞。
[表4]
抗体名 制造商 目录编号
抗SOX2抗体 Biolegend 656110
抗SOX17抗体 BD 562594
抗FOXA2抗体 BD 561589
对于上述培养后(第4天)的细胞,通过FACS测定了SOX17、FOXA2为阳性的细胞的比例,将结果示于图9。
在样品1和2中分别观察到向内胚层细胞的分化诱导。进而证实了样品1中向内胚层细胞的分化诱导效率高于样品2。即,证实了:在对多能干细胞进行预培养时,若使用未添加FGF2和TGFβ1的培养基,则使内胚层细胞向的分化诱导的效率提高。
[实施例6]
<由多能干细胞向内胚层细胞分化诱导时的葡萄糖的效果>
(聚集块的制作)
用PBS对利用实施例1的方法维持培养的TkDN-4株进行1次清洗,用Accutase进行3至5分钟处理并剥离,分散至单细胞。将该细胞悬浮在包含最终浓度5mg/mL的BSA(和光纯药工业株式会社)和10μM的Y-27632(和光纯药工业株式会社)的Essential 8TM培养基,将其中一部分进行台盼蓝染色并调查了细胞数。制备成每1mL包含5×105个细胞。以4ml/孔的比例接种在悬浮培养用6孔板(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)中。将接种了细胞的孔板在旋转摇荡器(Optima co.,Ltd.)上以90rpm的速度沿着水平面以描绘旋转幅度(直径)为25mm的圆的方式进行旋转培养,在5%CO2、37℃的环境下进行1天悬浮培养。
(预培养)
将通过上述的维持培养而得到的形成了聚集体的细胞团再悬浮在包含20%(体积/体积)Knockout血清替代品(KSR;Gibco公司)、1x非必需氨基酸(NEAA;Wako公司)、55μmol/L 2-巯基乙醇(2-mercaptethanol;Gibco公司)、7.5ng/mL重组人成纤维细胞生长因子(FGF2;Peprotech公司)、0.5×青霉素和链霉素(PS;Wako公司)的DMEM/Ham’s F12(Wako公司)中,以4ml/孔的比例接种在悬浮培养用6孔板(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.)中。将接种了细胞的孔板在旋转摇荡器(Optima co.,Ltd.)上以90rpm的速度沿着水平面以描绘旋转幅度(直径)为25mm的圆的方式进行旋转培养,在5%CO2、37℃的环境下进行1天悬浮培养。
(向内胚层细胞(胚体内胚层)的分化诱导)
对于通过预培养而得到的形成了聚集体的细胞团,在最初的第1天,在包含0.5%牛血清白蛋白(BSA;sigma)、0.4×PS、1mmol/L丙酮酸钠(Wako公司)、1xNEAA、80ng/mL重组人活化素A(Peprotech公司)、50ng/mL FGF2、20ng/mL重组骨形态发生蛋白4(BMP4;Peprotech公司)、3μmol/L CHIR99021(Wako公司)的不含葡萄糖RPMI1640(Wako公司)中以各最终浓度为(0g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L或4g/L)的方式添加葡萄糖并进行悬浮培养。
在第2天和第3天,从该培养基中去除BMP4、FGF2、CHIR99021并进行了悬浮培养。需要说明的是,第2天和第3天的培养基中的葡萄糖浓度与第1天同样为0g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L或4g/L。悬浮培养如下进行:以4ml/孔的比例接种在悬浮培养用6孔板(SumitomoBakelite Co.,Ltd.)中,在旋转摇荡器(Optima co.,Ltd.)上以90rpm的速度沿着水平面以描绘旋转幅度(直径)为25mm的圆的方式进行旋转培养,在5%CO2、37℃的环境下进行。
在第4天(Day4),按照以下的步骤进行了分化诱导为内胚层细胞的细胞团中的细胞密度的测定。
<细胞密度计数>
分化诱导为内胚层细胞后,用Accutase在37℃下处理5~10分钟,通过移液使细胞单分散,进行台盼蓝染色后,使用血细胞计数板对细胞数进行计数,测定了分化诱导为内胚层细胞的细胞团的细胞密度。
将细胞密度的测定结果示于图15。判明了葡萄糖浓度越低细胞密度越高。但是,在葡萄糖浓度为0g/L时细胞死亡。
在第1天~第4天(Day1~Day4),通过定量RT-PCR(步骤如实施例1和参考例1所述)进行了分化诱导为内胚层细胞的细胞团的基因表达的解析。将结果示于图16~图18。
由图16和图17的结果可知,在葡萄糖浓度为1.0g/L以下时,有未分化细胞(SOX2阳性细胞、Nanog阳性细胞)减少的倾向。
由图18的结果启示出:葡萄糖浓度较低者在较早阶段开始进行内胚层分化。
在第4天,按照以下的步骤通过流式细胞仪解析测定了SOX2和SOX17的阳性率。
<流式细胞仪解析>
进行向内胚层细胞的分化诱导后,利用4%PFA(多聚甲醛)将回收并分散至单细胞的细胞在室温下固定20分钟后,用PBS清洗3次,利用冷甲醇在-20℃下进行一夜透明处理。用3%FBS(胎牛血清)/PBS清洗3次后,利用3%FBS(胎牛血清)/PBS进行阻断,利用下述表中的经荧光标记的抗体在4℃下染色30分钟~1小时。用3%FBS(胎牛血清)/PBS清洗1次后,通过FACSVerse(Becton,Dickinson and Company;BD公司)解析通过了细胞滤网的细胞。
[表5]
抗体名 制造商 目录编号
抗SOX2抗体 Biolegend公司 656110
抗SOX17抗体 BD公司 562594
将流式细胞仪解析的结果示于图19。
由图19的结果可知,葡萄糖浓度为1.0g/L以下时,有未分化细胞(SOX2阳性细胞)减少的倾向。可推测出:由于未分化的iPS细胞(SOX2阳性细胞)的葡萄糖需求量高,因此在葡萄糖浓度为1.0g/L以下的条件下未分化细胞(SOX2阳性细胞)无法存活而死亡。
[实施例7]
<由多能干细胞向内胚层细胞分化诱导时的葡萄糖的效果>
如下表所示变更了第1天、第2天和第3天的培养基中的葡萄糖浓度(g/L),除此以外与实施例6同样地进行了由多能干细胞向内胚层细胞的分化诱导。
[表6]
第1天 第2天 第3天
实验1 2 2 2
实验2 2 2 0.5
实验3 2 0.5 0.5
实验4 0.5 0.5 0.5
在第4天,按照与实施例6同样的步骤通过流式细胞仪解析测定了分化诱导为内胚层细胞的细胞团的SOX2和SOX17的阳性率,将结果示于图20。
由图20的结果可知:有葡萄糖浓度为0.5g/L培养的期间越长,SOX2阳性细胞越减少、SOX17阳性细胞越增加。
另外,将上述的流式细胞仪解析的结果示于图21。图21的左边的图表示实验1的情况,图21的右边的图表示实验4的情况。
由图21的结果可知:以葡萄糖添加浓度为0.5g/L进行培养时,SOX2阳性细胞减少、SOX17阳性细胞增加。
序列表
<110> 株式会社钟化(Kaneka Corporation)
<120> 内胚层细胞团、和由多能细胞制造三胚层中的任意胚层的细胞团的方法(An endodermal cell population and a method for producing a cell populationof any of three germ layers from multi potent cells)
<130> 171530A
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 引物
<400> 1
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<223> 人工序列的描述: 引物
<400> 2
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<210> 20
<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的描述: 引物
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gtcttgtcgt tggacgttag ttc 23
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<212> DNA
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cgcttcaaga acatgtgtaa gctgc 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述: 引物
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ctctcactcg gttctcgata ctg 23
<210> 23
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tacacacttc ctggaggagc taag 24
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ccaaactgtt caagtggcag ac 22
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gagatctacc agtggatcat ggac 24
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caccttcagg aaacagtcgt tg 22
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ctctgtcaac gaaggcttga ac 丂 22
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cacttccaaa gcctaagcac tg丂 22
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atagaagggc acgtggtgat tc丂 22
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atgtgtcata ctgggaggtg ttg丂 23
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<212> DNA
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ccgcacgatt tcattgaac丂 19
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acttcacatc tgtggcacag ag丂 22
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cacccattta cacctacacc aag 23
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ttgcagatct caggagtgac ag 22
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gtttcatctc ctcggatgag tatg 24
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<400> 36
tagttgctta gctcctcctc acc 23
20

Claims (9)

1.一种由多能干细胞制造内胚层细胞的方法,所述方法包括以下所示的(a)~(b):
(a)用包含2-巯基乙醇的培养基对多能干细胞进行悬浮培养,制备细胞团的工序;以及
(b)用包含活化素A、FGF2、BMP4、BSA和CHIR99021的培养基对所述工序(a)中得到的细胞团进行悬浮培养后,用未添加CHIR99021、FGF2和BMP4的培养基悬浮培养所述细胞团的工序。
2.根据权利要求1所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基为未添加活化素A的培养基。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基为未添加WNT信号活化剂的培养基。
4.根据权利要求1或2所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基为未添加FGF2的培养基。
5.根据权利要求1或2所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基为未添加TGFβ1的培养基。
6.根据权利要求1或2所述的制造方法,其中,包含2-巯基乙醇的培养基是进一步包含胰岛素的培养基。
7.根据权利要求1或2所述的制造方法,其中,未添加CHIR99021、FGF2和BMP4的培养基是包含选自胰岛素、运铁蛋白、亚硒酸钠和乙醇胺中的至少1种以上的培养基。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其中,包含活化素A、FGF2、BMP4、BSA和CHIR99021的培养基和/或未添加CHIR99021、FGF2和BMP4的培养基是进一步包含2-巯基乙醇的培养基。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中,包含活化素A、FGF2、BMP4、BSA和CHIR99021的培养基和/或未添加CHIR99021、FGF2和BMP4的培养基是以1.0g/L以下的浓度含有葡萄糖的培养基。
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