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CN110200920B - 一种还原敏感药物组合物及其制备和应用 - Google Patents

一种还原敏感药物组合物及其制备和应用 Download PDF

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CN110200920B CN201910527071.XA CN201910527071A CN110200920B CN 110200920 B CN110200920 B CN 110200920B CN 201910527071 A CN201910527071 A CN 201910527071A CN 110200920 B CN110200920 B CN 110200920B
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Abstract

本发明公开了一种还原敏感药物组合物及其制备和应用，该药物组合物是双‑正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱和药物组成的纳米颗粒(根据情况还包括药效学上可接受的助剂)，具有还原敏感快速降解性，不仅稳定性好、长循环，具有靶向解体和快速释药功能。该还原敏感药物组合物通过薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、超声波分散法、喷雾干燥法、膜挤压法或高压均质法制备，简单工艺。该还原敏感药物组合物用于制备抗肿瘤药物、抗病毒药物、抗菌药物。

Description

一种还原敏感药物组合物及其制备和应用
技术领域
本发明是一种还原敏感药物组合物及其制备和应用，涉及医药技术领域。
背景技术
纳米颗粒是一种重要的药物载体，包括脂质体、固体脂质纳米粒、纳米胶束等，可以负载控释各种药物。疏水性药物通常在纳米颗粒的脂质中。负载药物的纳米颗粒在体内循环过程中，药物易于从纳米颗粒中渗漏出来，影响药效的发挥。
在脂质体表面覆盖亲水性大分子如聚乙二醇，可以延长脂质体在血液中的循环时间，也称为隐形纳米颗粒，减缓药物的渗漏。隐形纳米颗粒不仅具有长循环时间，而且可以利用肿瘤毛细血管增强渗透效应，提高药物的肿瘤靶向作用，提高抗肿瘤效果。但是，由于循环时间过长，又容易导致纳米颗粒在手足部分沉积，例如多柔比星最常见的给药方式是通过纳米颗粒负载注射给药，但是多柔比星长循环纳米颗粒在手足部位的沉积常导致手足病。因此，载药纳米颗粒特别是长循环纳米颗粒在血液中循环有利于到达肿瘤部位，但在肿瘤部位需要快速解体释药，也就是要求具有一定的肿瘤靶向降解作用。
炎症组织、肿瘤组织特别是肿瘤细胞内谷胱甘肽浓度远高于正常组织，利用其微环境可以促进含有双硫键的前药分子或长循环磷脂分子断裂，实现药物的释放和有效药物浓度的提高。但是，前人报道的还原敏感纳米颗粒通常采用正常的长链脂肪酸磷脂，双硫键的断裂不易使纳米颗粒彻底解体。
因此，特别需要发明一种既有组装能力，又具有还原敏感靶向断裂的功能磷脂，其组装的纳米颗粒因还原敏感彻底解体而快速释药，克服长循环纳米颗粒释药太慢的缺陷。
蒽环类药物如多柔比星等是一类重要的抗肿瘤药物，但通常具有心脏毒性、骨髓毒性等。负载于脂质体中可以一定程度降低其毒性，但易于泄漏，释药太快。采用聚乙二醇大分子磷脂构建的纳米颗粒载体可以延长药物释放时间，但是过长循环时间导致纳米颗粒易于在手足部位沉积，引起手足病。因此，特别需要发明一种肿瘤部位微环境响应快速降解释药方法，防止泄漏，但在肿瘤部位易于快速释药的给药系统。
发明内容
技术问题：本发明的目的在于提供一种还原敏感药物组合物及其制备和应用，该药物组合物是双-正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱和药物组成的纳米颗粒(根据情况还包括药效学上可接受的助剂)，具有还原敏感快速降解性；同时提供一种基于该药物组合物的制备方法和其在制备抗肿瘤药物、抗病毒药物、抗菌药物中的应用。
技术方案：本发明提供了一种还原敏感药物组合物，该还原敏感药物组合物为纳米颗粒，包括双-正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱和药物。
其中：
所述的还原敏感药物组合物还包括药效学上可接受的助剂。
所述的还原敏感药物组合物为纳米颗粒中，纳米颗粒为脂质体、固体脂质纳米粒或胶束，且颗粒粒径为10～1000nm。
所述的双-正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱的结构通式如下：
Figure BDA0002098570980000021
式中，m是2～10的正整数，n是7～15的正整数。
所述的所述药物是抗肿瘤药物、抗病毒药物或者抗菌药物。
所述的抗肿瘤药物是紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、7-羟甲基喜树碱、长春新碱、长春瑞滨、安沙霉素、雷帕霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、米托蒽醌、多柔比星、佐柔比星、表柔比星、伊达比星、莎巴比星、他莫昔芬、雷公藤甲素、米伐木肽、熊果酸或者铂药物中的一种。
所述铂药物包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、乐铂或者顺式-双新癸酸-反式-R,R-1,2-环已二胺合铂(Ⅱ)。
所述的抗菌药物是两性霉素B、庆大霉素、制霉菌素、氟康唑、阿米卡星、左氧氟沙星或者硝酸益康唑中的一种。
抗病毒药物是利巴韦林或者阿德福韦酯。
所述的药效学上可接受的助剂为磷脂、甘油酯、脂肪酸、吐温、泊洛沙姆或者胆固醇中的一种或多种。
所述的磷脂包括卵磷脂、合成磷脂。
所述的磷脂包括靶向磷脂。
所述的磷脂包括二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸。
本发明还提供了一种还原敏感药物组合物的制备方法，该还原敏感药物组合物通过薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、超声波分散法、喷雾干燥法、膜挤压法或高压均质法制备。
本发明还提供了一种还原敏感药物组合物的应用，该还原敏感药物组合物应用于抗肿瘤药剂、抗病毒药剂、抗菌药剂的制备。
其中：
所述的药剂为液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂或凝胶剂。
所述的药剂可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。
从体外降解速度来看，本发明的药物组合物表现还原敏感快速降解性。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明所述的还原敏感药物组合物为纳米颗粒，具有还原敏感快速降解性，在炎症、肿瘤部位或肿瘤细胞中高浓度谷胱甘肽存在下，所述双-正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱的双硫键快速断裂，脂质体崩解，快速释放药物，发挥药效；
本发明所述还原敏感药物组合物，不仅稳定性好、长循环，而且在肿瘤部位因还原微环境响应而具有靶向解体和快速释药功能；
本发明所述还原敏感药物组合物可以采用简单工艺，如薄膜法、高压均质法等非常容易地制备，颗粒直径10～1000纳米；
本发明所述的还原敏感药物组合物是脂质体、固体脂质纳米粒或胶束；
本发明所述的还原敏感药物组合物制备得到的抗肿瘤药剂，具有优异抗肿瘤活性；
本发明的还原敏感药物组合物，可用作液体制剂、固体制剂、半固体制剂、灭菌制剂和无菌制剂。
附图说明
图1为多柔比星(DOX)还原响应脂质体透射电镜图；
图2为二硫代磷脂脂质体DOX/12-SS3-LLP脂质体不同状态的电镜结构图，其中图a为二硫代磷脂脂质体12-SS3-LLP透射电镜图(插入图为冷冻透射电镜图)，图b为二硫代磷脂脂质体12-SS3-LLP经二硫苏糖醇处理后的透射电镜图；
图3为负载DOX的还原敏感脂质体在含有(或不含)二硫苏糖醇DTT介质中的释放曲线；
图4为使用A549细胞模型和MCF-7细胞模型评价还原敏感脂质体的体外抗肿瘤效果的示意图，其中图a为使用A549细胞模型评价还原敏感脂质体的体外抗肿瘤效果的示意图，图b为使用MCF-7细胞模型评价还原敏感脂质体的体外抗肿瘤效果的示意图；
图5为负载多柔比星的还原敏感脂质体的体内抗肿瘤效果和毒性示意图，其中图a为肿瘤体积变化，图b为小鼠体重变化，图c为肿瘤重量。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
本发明的还原敏感药物组合物，该还原敏感药物组合物为纳米颗粒，包括双-正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱和药物。
其中：
所述的还原敏感药物组合物还包括药效学上可接受的助剂。
所述的还原敏感药物组合物为纳米颗粒，其粒径为10～1000nm，纳米颗粒可以是脂质体、固体脂质纳米粒或者胶束；
所述双-正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱具有如下结构：
Figure BDA0002098570980000041
式中，m是2～10的正整数，n是7～15的正整数。
所述药物是抗肿瘤药物、抗病毒药物、抗菌药物。
所述抗肿瘤药物是以下其中一种：紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、7-羟甲基喜树碱、长春新碱、长春瑞滨、安沙霉素、雷帕霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、米托蒽醌、多柔比星、佐柔比星、表柔比星、伊达比星、莎巴比星、他莫昔芬、雷公藤甲素、米伐木肽、熊果酸、铂药物。
所述铂药物包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、乐铂或者顺式-双新癸酸-反式-R,R-1,2-环已二胺合铂(Ⅱ)。
所述抗菌药物是以下其中一种：两性霉素B、庆大霉素、制霉菌素、氟康唑、阿米卡星、左氧氟沙星或者硝酸益康唑。
所述抗病毒药物是利巴韦林或者阿德福韦酯。
所述的药效学上可接受的助剂为磷脂、甘油酯、脂肪酸、吐温、泊洛沙姆或者胆固醇中的一种或多种。
所述的磷脂包括卵磷脂、合成磷脂。
所述的磷脂包括靶向磷脂。
所述的磷脂包括二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸。
一种还原敏感药物组合物的制备方法，通过薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、超声波分散法、喷雾干燥法、膜挤压法或高压均质法制备。
一种还原敏感药物组合物的应用，该还原敏感药物组合物应用于抗肿瘤药剂、抗病毒药剂、抗菌药剂的制备。
其中：
所述的药剂为液体制剂、固体制剂、半固体制剂、胶囊剂、颗粒剂或凝胶剂。
药物组合物制备成的药剂可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。
从体外降解速度来看，本发明的药物组合物表现还原敏感快速降解性。
从体外药效筛选来看，本发明还原敏感药物组合物表现良好的抗炎、抗肿瘤活性。
本发明所述还原敏感药物组合物的制备方法，是由双-正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱、药物和药效学上可接受的助剂通过薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、超声波分散法、喷雾干燥法、膜挤压法、或高压均质法等方法制备。
下述通过实施例进一步说明本发明，但本发明不限于以下实施例。
实施例中，以下代号表示的磷脂化合物和结构式如下：
8-SS3-PC双-正辛基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱，
Figure BDA0002098570980000051
10-SS3-PC双-正癸基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱，
Figure BDA0002098570980000061
12-SS3-PC双-正十二烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱，
Figure BDA0002098570980000062
14-SS3-PC双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱，
Figure BDA0002098570980000063
16-SS3-PC双-正十六烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱。
Figure BDA0002098570980000064
10-SS6-PC双-正癸烷基二硫代正己酸甘油磷酸胆碱
Figure BDA0002098570980000065
8-SS11-PC双-正辛烷基二硫代正十一烷酸甘油磷酸胆碱
Figure BDA0002098570980000066
14-SS6-PC双-正十四烷基二硫代己酸甘油磷酸胆碱
Figure BDA0002098570980000067
实施例1
一种还原敏感药物组合物，该药物组合物为多柔比星(DOX)还原响应脂质体，为颗粒状且粒径为110纳米，包括双-正十二烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、多柔比星、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC。
其制备方法如下：
将双-正十二烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱12-SS3-PC 0.5mmol、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 0.5mmol、胆固醇0.3mmol、三氯甲烷20ml加至茄形瓶中溶解，60℃缓慢旋蒸干，氮气吹扫10分钟，在茄形瓶内壁形成一层薄膜；加入20ml硫酸铵溶液，60℃起膜，200nm滤膜过滤，得到脂质体溶液；脂质体溶液用半透膜透析，除去脂质体外面的硫酸铵，将多柔比星盐酸盐0.1mmol加入到脂质体溶液中，50℃下孵育；多柔比星进入脂质体中形成硫酸盐凝胶沉积在脂质体内部，得到多柔比星还原响应脂质体。
采用激光粒度仪测量脂质体平均粒径为110nm，透射电镜测量纳米颗粒的形态，显示球形结构(图1)；将脂质体纳米颗粒溶液冻干，得到粉状纳米颗粒。
该实施例制备得到的多柔比星还原响应脂质体应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例2
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感药物组合物为紫杉醇还原响应脂质体，为颗粒状且粒径为108纳米，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、紫杉醇、二棕榈酸磷脂酰胆碱、胆固醇。
其制备方法如下：
紫杉醇0.1mmol、双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC 1.0mmol、二棕榈酸磷脂酰胆碱1.0mmol、胆固醇0.3mmol、三氯甲烷20ml加至茄形瓶中溶解，60℃缓慢旋蒸干，氮气吹扫10分钟，在茄形瓶内壁形成一层薄膜，加入20ml PBS(pH 7.4)溶液，60℃起膜，200nm滤膜过滤，得到脂质体纳米颗粒。
采用激光粒度仪测量平均粒径，为108nm，透射电镜测量纳米颗粒的形态，显示球形结构；将紫杉醇还原响应脂质体纳米颗粒溶液冻干，得到粉状纳米颗粒。
该实施例制备得到的紫杉醇还原响应脂质体应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例3
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感药物组合物为多烯紫杉醇还原响应脂质体，为颗粒状且粒径为112纳米，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、多烯紫杉醇和助剂卵磷脂和胆固醇。
其制备方法如下：
多烯紫杉醇0.1mmol、双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC 0.2
mmol、卵磷脂0.7mmol、胆固醇0.3mmol、三氯甲烷20ml加至茄形瓶中溶解，60℃缓慢旋蒸干，氮气吹扫10分钟，在茄形瓶内壁形成一层薄膜；加入20ml PBS(pH 7.4)溶液，60℃起膜，200nm滤膜过滤，得到脂质体纳米颗粒溶液。
该实施例制备得到的多烯紫杉醇还原响应脂质体应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例4
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感药物组合物为紫杉醇还原响应隐形脂质体，为颗粒状且粒径为120纳米，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、紫杉醇和二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和胆固醇。
其制备方法如下：
紫杉醇0.1mmol、双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC 0.5mmol、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)0.5mmol、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000，PEG分子量2000)0.1mmol、胆固醇0.3mmol、三氯甲烷20ml加至茄形瓶中溶解，60℃缓慢旋蒸干，氮气吹扫10分钟，在茄形瓶内壁形成一层薄膜；加入20ml PBS(pH 7.4)溶液，60℃起膜，200nm滤膜过滤，得到脂质体纳米颗粒溶液；将脂质体纳米颗粒溶液冻干，得到粉状纳米颗粒。
该实施例制备得到的紫杉醇还原响应脂质体应用于制备抗肿瘤药剂。
为了便于对照，制备紫杉醇普通隐形脂质体，其制备方法同上，除用等摩尔DSPC替代14-SS3-PC外。
实施例5
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感药物组合物为多柔比星还原响应隐形脂质体，为颗粒状且粒径为116纳米，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、多柔比星和助剂胆固醇和二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC。
其制备方法为：
双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC 0.5mmol、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)0.5mmol、胆固醇0.3mmol、三氯甲烷20ml加至茄形瓶中溶解，60℃缓慢旋蒸干，氮气吹扫10分钟，在茄形瓶内壁形成一层薄膜；加入20ml硫酸铵溶液，60℃起膜，200nm滤膜过滤。得到脂质体溶液用半透膜透析，除去脂质体外面的硫酸铵。将多柔比星盐酸盐0.1mmol加入到脂质体溶液中，50摄氏度下孵育。多柔比星进入脂质体中形成硫酸盐凝胶沉积在脂质体内部；然后，加入二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)0.1mmol与脂质体溶液中共孵育30分钟，得到多柔比星还原响应隐形脂质体，将脂质体纳米颗粒溶液冻干，得到粉状纳米颗粒。
该实施例制备得到的多柔比星还原响应隐形脂质体应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例6
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感药物组合物为阿糖胞苷脂质体，为颗粒状且粒径为130纳米，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、阿糖胞苷。
其制备方法如下：
双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC 0.5mmol、二棕榈酰磷脂酰甘油1.0mmol、胆固醇0.2mmol、三油酸甘油酯0.3mmol置于3mL氯仿-乙醚(体积比1∶1)混合溶剂中,搅拌混合,得到混悬液。盐酸阿糖胞苷水溶液2mL(浓度0.1M)加至上述混悬液中,10000rpm高速搅拌成初乳。取初乳1mL快速注入含质量分数4％葡萄糖和40mM赖氨酸混合溶液10mL中,涡旋振荡成复乳,37℃水浴中振摇,用生理盐水稀释至10mL,得到脂质体混悬液。加入10mL生理盐水,3000rpm离心5min,弃去上清液,用生理盐水洗涤沉淀3次。沉淀用生理盐水稀释制成浓度5mM的阿糖胞苷多囊脂质体。
该实施例制备得到的阿糖胞苷脂质体颗粒应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例7
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感脂质体药物组合物为伊立替康脂质体，为颗粒状且粒径为120纳米，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、阿糖胞苷胆固醇、二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
其制备方法如下：
双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC 0.5mmol、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)1.0mmol、胆固醇0.2mmol、二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)0.1mmol溶于适量2mL无水乙醇中，逐滴加入到温度为60℃的蔗糖八硫酸酯三乙胺溶液中，搅拌10min；减压旋蒸除去乙醇，过0.2μm滤膜均化。将空白脂质体混悬液以PBS透析，除去外水相中的蔗糖八硫酸酯三乙胺，得到空白脂质体；分别吸取空白脂质体与伊立替康药物溶液，在60℃水浴条件下孵育载药30min，得到伊立替康脂质体。
该实施例制备得到的伊立替康脂质体颗粒应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例8
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感脂质体药物组合物为长春新碱脂质体，为颗粒状且粒径为132纳米，包括双-正十六烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、长春新碱、胆固醇、二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000，PEG分子量2000)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
其制备方法如下：
长春新碱0.1mmol、双-正十六烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱16-SS3-PC 0.5mmol、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)2.0mmol、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)0.1mmol、胆固醇0.3mmol、三氯甲烷20ml加至茄形瓶中溶解，60℃缓慢旋蒸干，氮气吹扫10分钟，在茄形瓶内壁形成一层薄膜。加入20ml PBS(pH 7.4)溶液，60℃起膜，200nm滤膜过滤，得到脂质体纳米颗粒溶液。
该实施例制备得到的长春新碱脂质体颗粒应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例9
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感脂质体药物组合物为米托蒽醌脂质体，为颗粒状且粒径为120纳米，包括双-正十六烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、米托蒽醌和药效学上可接受的助剂胆固醇、二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
其制备方法如下：
米托蒽醌0.1mmol、双-正十六烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱16-SS3-PC 0.5mmol、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)2.5mmol、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)0.1mmol、胆固醇0.3mmol、三氯甲烷20ml加至茄形瓶中溶解，60℃缓慢旋蒸干，氮气吹扫10分钟，在茄形瓶内壁形成一层薄膜。加入20ml PBS(pH 7.4)溶液，60℃起膜，200nm滤膜过滤，得到脂质体纳米颗粒溶液。
该实施例制备得到的米托蒽醌脂质体颗粒应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例10
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感脂质体药物组合物为两性霉素B脂质体，为颗粒状且粒径为136纳米，包括双-正癸烷基二硫代正己酸甘油磷酸胆碱、两性霉素B、胆固醇、二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
其制备方法如下：
两性霉素B 0.5mmol、双-正癸烷基二硫代正己酸甘油磷酸胆碱10-SS6-PC0.5mmol、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)5.0mmol、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)0.3mmol、胆固醇1.0mmol、三氯甲烷20ml加至茄形瓶中溶解，60℃缓慢旋蒸干，氮气吹扫10分钟，在茄形瓶内壁形成一层薄膜。加入20ml PBS(pH 7.4)溶液，60℃起膜，200nm滤膜过滤，得到脂质体纳米颗粒溶液。
该实施例制备得到的两性霉素B脂质体颗粒应用于制备抗菌药剂。
实施例11
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感脂质体药物组合物为阿米卡星脂质体，为颗粒状且粒径为142纳米，包括双-正辛烷基二硫代正十一烷酸甘油磷酸胆碱、阿米卡星、胆固醇、二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG4000,PEG分子量4000)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
其制备方法如下：
阿米卡星0.1mmol、双-正辛烷基二硫代正十一烷酸甘油磷酸胆碱8-SS11-PC0.5mmol、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC 0.5mmol、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)0.1mmol、胆固醇0.3mmol、三氯甲烷20ml加至茄形瓶中溶解，60℃缓慢旋蒸干，氮气吹扫10分钟，在茄形瓶内壁形成一层薄膜。加入20ml PBS(pH 7.4)溶液，60℃起膜，200nm滤膜过滤，得到脂质体纳米颗粒溶液。
该实施例制备得到的阿米卡星脂质体颗粒应用于制备抗菌药剂。
实施例12
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感脂质体药物组合物为顺铂脂质体，为颗粒状且粒径为110纳米，包括双-正十四烷基二硫代己酸甘油磷酸胆碱、顺铂、卵磷脂、胆固醇。
其制备步骤如下：
双-正十四烷基二硫代己酸甘油磷酸胆碱14-SS6-PC、卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000(摩尔比为2:2:2:0.3)于茄型瓶中，加入15m L氯仿溶解，在45℃水浴中旋蒸除去氯仿，在瓶壁形成一层磷脂薄膜；真空除去残留溶剂，并用氮气吹扫。形成磷脂膜后，加入9m L含有9.0mg顺铂的生理盐水溶液，在37℃恒温振荡器中震荡水化1h；水化完成后，涡旋振荡5min，超声10min，得到多层脂质体悬液。脂质体混悬液依次挤压通过450nm、220nm聚碳酸酯滤膜各5遍；得到平均粒径110nm左右、分布均一的顺铂隐形脂质体。
该实施例制备得到的顺铂脂质体颗粒应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例13
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感脂质体药物组合物为拓扑替康脂质体，为颗粒状且粒径为120纳米，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、伊立替康、胆固醇、二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
其制备方法如下：
双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC 0.5mmol、DSPC 0.5mmol、胆固醇0.2mmol、DSPE-PEG2000 0.1mmol溶于适量2mL无水乙醇中，逐滴加入到温度为60℃的蔗糖八硫酸酯三乙胺溶液中，搅拌10min；减压旋蒸除去乙醇，过0.2μm滤膜均化；将空白脂质体混悬液以PBS透析，除去外水相中的蔗糖八硫酸酯三乙胺，得到空白脂质体；分别吸取空白脂质体与拓扑替康药物溶液，在60℃水浴条件下孵育载药30min，得到伊立替康脂质体。
该实施例制备得到的拓扑替康脂质体颗粒应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例14
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感脂质体药物组合物为多柔比星还原敏感隐形脂质体系列颗粒，包括双-正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱系列(双-正辛基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱8-SS3-PC、双-正癸基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱10-SS3-PC、双-正十二烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱12-SS3-PC、双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC、双-正十六烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱16-SS3-PC)、多柔比星、胆固醇、二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)。
多柔比星还原敏感隐形脂质体系列的制备：
双-正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱系列(双-正辛基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱8-SS3-PC、双-正癸基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱10-SS3-PC、双-正十二烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱12-SS3-PC、双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC、双-正十六烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱16-SS3-PC)0.9mmol，与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺聚乙二醇DSPE-PEG2000 0.1mmol、胆固醇0.3mmol和三氯甲烷20ml混合，60℃旋蒸干溶剂，加入20ml硫酸铵溶液，60℃起膜，并用超声均化，200nm滤膜过滤，得到还原敏感隐形脂质体系列纳米颗粒溶液，分别记为8-SS3-LLP、10-SS3-LLP、12-SS3-LLP、14-SS3-LLP、16-SS3-LLP。
上述脂质体系列溶液用半透膜透析，除去脂质体外面的硫酸铵；将多柔比星盐酸盐0.1mmol加入到脂质体溶液中，50℃孵育；多柔比星进入脂质体中形成硫酸盐凝胶沉积在脂质体内部，得到多柔比星还原响应隐形脂质体系列，分别记为DOX/8-SS3-LLP、DOX/10-SS3-LLP、DOX/12-SS3-LLP、DOX/14-SS3-LLP、DOX/16-SS3-LLP。
多柔比星普通隐形脂质体(记为DOX/LP)的制备方法同上，除用等摩尔DSPC替代14-SS3-PC外。
采用紫外光谱法测量脂质体溶液中多柔比星的含量，计算多柔比星载药效率(EE％)和载药量(DL％)，结果列于表1中。
采用动态激光光散射方法(DLS)测量脂质体颗粒平均直径和表面电位，结果见表1。可以看出，二硫代磷脂长循环脂质体大小为100纳米左右，表面带负电荷，说明脂质体具有稳定性。
透射电镜(TEM,JEOL)和冷冻透射电镜(Tecnai G2F20 200kV，FEI)观察DOX/12-SS3-LLP脂质体的结构，结果如图2a。可以看出，脂质体呈规则球形结构，直径小于DLS测量的脂质体水合动力学直径。冷冻透射电镜显示，二硫代磷脂脂质体12-SS3-LLP呈典型单室脂质体结构，双脂质层厚度大约5纳米(图2a中插入小图)。
表1.载药二硫代磷脂隐形脂质体的表征
Figure BDA0002098570980000131
实施例15
DOX/12-SS3-LLP还原敏感隐形脂质体的裂解
降解实验使用DTT溶液模拟体内还原环境。实施例14的二硫代磷脂隐形脂质体DOX/12-SS3-LLP(10μg/mL)2mL与二硫苏糖醇水溶液(DTT，浓度10mmol/L)0.5mL室温下共孵育1小时。用透射电镜观察脂质体结构变化，结果见图2b。
由图2b可以看出，脂质体在DTT作用下彻底崩解，成为碎片。显然，二硫代磷脂在还原性条件下裂解为非两亲性分子，导致脂质体彻底崩解。这种二硫代磷脂裂解过程对长循环脂质体还原敏感彻底崩解和快速充分释药是有利的。
实施例16
紫杉醇还原响应隐形脂质体体外降解释药试验
实施例4制备的紫杉醇还原响应隐形脂质体纳米颗粒溶于10mL PBS溶液，分成2份，其中一份加入谷胱甘肽(GSH)的PBS缓冲液0.5mL(GSH浓度50mmol)，另一份加入PBS缓冲液0.5mL。对照品是负载相同摩尔含量紫杉醇的普通长循环脂质体(DOX/LP)(除用二硬脂酸甘油磷酸胆碱DSPC替代14-SS3-PC，其它2组分比例和方法与实施例4相同)。放置与培养箱中37℃下孵育，用高效液相色谱检测紫杉醇的含量(Agilent 1100LC,Zorbax反相C18柱，150×4.6mm，5μm，进样量20μL，柱温25℃，检测波长254nm；梯度淋洗：2-90％缓冲液B/A，流速1.0mL/min，缓冲液A:0.1％三氟乙酸TFA的去离子水，缓冲液B:0.1％TFA的乙腈)，计算紫杉醇的释放量。
结果表明，GSH处理的紫杉醇还原响应隐形脂质体溶液在3小时后释放出的紫杉醇达到总量的82％；未经GSH处理的紫杉醇还原响应隐形脂质体溶液3小时后释放出紫杉醇的仅为总量的11％。负载紫杉醇的普通长循环脂质体3小时后释放的紫杉醇是总量的9％。所以，紫杉醇还原响应隐形脂质体具有还原敏感性，在GSH作用下快速释放紫杉醇原药，释放速度远快于普通长循环脂质体。
实施例17
多柔比星还原响应隐形脂质体体外降解释药试验
实施例14制备的多柔比星还原响应隐形脂质体溶液系列DOX/8-SS3-LLP、DOX/10-SS3-LLP、DOX/12-SS3-LLP、DOX/14-SS3-LLP、DOX/16-SS3-LLP各2mL(DOX浓度0.1mg/mL)加入透析袋中(MWCO 8000)。释放介质为含有(或不含)10mM二硫代苏糖醇DTT的PBS缓冲溶液。透析袋连同脂质体浸入释放介质中，体系维持37℃恒温；在不同的时间点取样1mL降解介质，同时补充1mL新释放介质，每个样品的DOX浓度使用紫外分光光度计检测，并计算出最终的释放率。
结果如图3所示，与负载DOX的普通隐形脂质体(DOX/LP，实施例14)相比，负载DOX的还原敏感长循环脂质体在含10mM DTT的释放介质中均呈现高释放率，24小时内累积释放量可达80％左右；相比之下，在无DTT的释放介质中，负载DOX的还原敏感隐形脂质体的累积释放量只能达到10％-20％，由此可见，负载DOX的还原敏感隐形脂质体具有明显的还原响应性，并快速释放出负载的DOX药物。
实施例18
体外肿瘤细胞杀伤实验
实施例14中负载DOX的还原敏感隐形脂质体(DOX/8-SS3-LLP、DOX/10-SS3-LLP、DOX/12-SS3-LLP、DOX/14-SS3-LLP、DOX/16-SS3-LLP)的体外抗肿瘤效果评价使用A549和MCF-7两种细胞模型。A549和MCF-7细胞以10000个细胞/孔的密度接种于96孔培养板中；设置0.001、0.01、0.1、1和10μg/mL五个浓度梯度，孵育时间为24小时；孵育结束后，吸弃每孔中的培养基，加入MTT溶液20μL，37摄氏度孵育4小时。然后，吸弃每孔中的MTT溶液，加入DMSO溶液150μL；最后，使用酶标仪在490nm波长处读取每孔的吸光度(OD)。根据公式计算细胞活性(cell viability)。
Figure BDA0002098570980000151
ODdrug代表孵育药物的孔的OD值、ODcontrol是无药物仅孵育培养基的孔的OD值、ODblank是只加DMSO的孔的OD值。
结果见图4，与DOX/LP(实施例14)相比，DOX/8-SS3-LLP、DOX/10-SS3-LLP、DOX/12-SS3-LLP、DOX/14-SS3-LLP具有相对更强的杀伤细胞的效果。DOX为自由药物，具有最快的细胞摄取速度，因而常显示出较强的杀伤细胞效果。
实验例19
动物体内抗肿瘤实验
裸鼠模型的制备：小鼠选择2月龄，15-20克雌性BALB/c小鼠。收集培养的MCF-7细胞悬液，浓度为1×107个/ml，以每只0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下，直至肿瘤平均大小0.1立方厘米。
分组与给药：裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，肿瘤生长至75mm3时将动物随机分组，实验动物共20只，随机分5组。同时，各组裸鼠开始尾静脉注射给药，给药方案见组别与给药方案，使用测量瘤径的方法，动态观察受试样品的抗肿瘤效应。肿瘤体积(TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2(式3-2)，其中a、b分别表示长宽。
组别及给药方案：给药量5mg/kg。
空白组：生理盐水，静脉注射，每三天注射一次，体积为0.2ml，连续3周。
对照组：多柔比星溶于生理盐水组，静脉注射，每三天注射一次，体积为0.2ml，连续3周。普通负载多柔比星DOX隐形脂质体组(实施例14)，静脉注射，每三天注射一次，体积为0.2ml，连续3周。
药物组：DOX/12-SS3-LLP组(实施例14)；DOX/16-SS3-LLP组(实施例14)。静脉注射，每三天注射一次，体积为0.2ml，连续3周。
在实验过程中，小鼠的体重和肿瘤尺寸每两天记录一次。在给药21天后，所有组的小鼠均被处死，将肿瘤分离出来并称重记录，结果见图5。
与空白组、对照组相比，DOX/12-SS3-LLP组和DOX/16-SS3-LLP组均表现出明显降低肿瘤体积和重量的效果，说明具有更好的抑制肿瘤生长效果(图5a和5c)。其中，DOX/16-SS3-LLP效果最佳，具有比DOX/12-SS3-LLP更好的抑制肿瘤生长的作用。从小鼠体重变化曲线(图5b)可知，多柔比星生理盐水组的体重最低，显示明显的毒副作用；还原敏感长循环脂质体组的体重较高，显示毒性不明显。
实施例20
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感药物组合物为紫杉醇还原响应固体脂质纳米粒，粒径为132nm，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、紫杉醇、硬脂酸、泊洛沙姆Poloxamer188。
其制备方法如下：
紫杉醇0.1g、棕榈酸5.0g、卵磷脂2.0g混合，加热至80℃缓慢溶解，加入20ml PBS(pH 7.4)含有双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC 0.5g和泊洛沙姆Poloxamer188 0.5g水溶液中，高速搅拌，高压均质机均值3次，冷却，得到固体脂质纳米粒。
采用激光粒度仪测量平均粒径，为132nm，透射电镜测量纳米颗粒的形态，显示球形结构。
实施例21
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感药物组合物为紫杉醇还原响应纳米胶束，粒径为120nm，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、紫杉醇、三辛酸甘油酯、吐温80。
其制备方法如下：
多烯紫杉醇0.1mmol、双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC1.0mmol、二棕榈酸磷脂酰胆碱1.0mmol、单辛酸甘油酯2.0mmol、三辛酸甘油酯1.0mmol、吐温80 0.3mmol加热至60℃缓慢溶解，加入20ml PBS(pH 7.4)溶液，高速搅拌，高压均质机均值3次，得到纳米胶束。
采用激光粒度仪测量平均粒径，为120nm，透射电镜测量纳米颗粒的形态，显示球形结构。
实施例22
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感脂质体药物组合物为米伐木肽脂质体，为颗粒状且粒径为132nm，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、米伐木肽、胆固醇、二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
其制备方法如下：
双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC 0.5mmol、DSPC 0.5mmol、胆固醇0.2mmol、DSPE-PEG2000 0.1mmol、米伐木肽0.1mmol溶于5mL二氯甲烷中，加入到250mL茄形瓶中，旋转蒸发除去溶剂，加入5mL生理盐水水化；超声处理5分钟，过0.2μm滤膜均化，得到米伐木肽脂质体纳米颗粒，激光粒度仪测量纳米粒子的平均直径为132nm。
该实施例制备得到的米伐木肽脂质体颗粒应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例23
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感脂质体药物组合物为雷公藤甲素脂质体，为颗粒状且粒径为150nm，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、雷公藤甲素、胆固醇、DSPE-PEG2000、二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG2000-FA)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
其制备方法如下：
双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC 0.5mmol、DSPC 0.5mmol、胆固醇0.2mmol、DSPE-PEG2000 0.1mmol、DSPE-PEG2000-FA 0.02mmol、雷公藤甲素0.05mmol溶于5mL二氯甲烷中，加入到250mL茄形瓶中，旋转蒸发除去溶剂，加入5mL生理盐水水化；超声处理5分钟，过0.2μm滤膜均化，得到具有靶向叶酸受体的雷公藤甲素脂质体纳米颗粒，激光粒度仪测量纳米粒子的平均直径为150nm。
该实施例制备得到的雷公藤甲素脂质体纳米颗粒应用于制备抗肿瘤药剂。
实施例24
一种还原敏感药物组合物，该还原敏感脂质体药物组合物为他莫昔芬脂质体，为颗粒状且粒径为142纳米，包括双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱、他莫昔芬、胆固醇、二硬脂酸甘油磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)和二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
其制备方法如下：
双-正十四烷基二硫代丙酸甘油磷酸胆碱14-SS3-PC 0.5mmol、DSPC 0.5mmol、胆固醇0.2mmol、DSPE-PEG2000 0.1mmol、他莫昔芬0.05mmol溶于10mL乙醚中，加入到250mL茄形瓶中，旋转蒸发除去溶剂，加入5mL生理盐水水化；超声处理5分钟，过0.2μm滤膜均化，得到他莫昔芬脂质体纳米颗粒，激光粒度仪测量纳米粒子的平均直径为142纳米。
该实施例制备得到的他莫昔芬脂质体颗粒应用于制备抗肿瘤药剂。
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权利要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种还原敏感药物组合物，其特征在于：该药物组合物为纳米颗粒，包括双-正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱和药物；
其中所述的双-正烷基二硫代正烷酸甘油磷酸胆碱的结构通式如下：
Figure FDA0003275450180000011
式中，m是2～10的正整数，n是7～15的正整数；
所述纳米颗粒为脂质体、固体脂质纳米粒或胶束，且颗粒粒径为10～1000nm。
2.如权利要求1所述的一种还原敏感药物组合物，其特征在于：所述的还原敏感药物组合物还包括药效学上可接受的助剂。
3.如权利要求1所述的一种还原敏感药物组合物，其特征在于：所述的所述药物是抗肿瘤药物、抗病毒药物或者抗菌药物。
4.如权利要求3所述的一种还原敏感药物组合物，其特征在于：所述的抗肿瘤药物是紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、勒托替康、贝洛替康、7-羟甲基喜树碱、长春新碱、长春瑞滨、安沙霉素、雷帕霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、米托蒽醌、多柔比星、佐柔比星、表柔比星、伊达比星、莎巴比星、他莫昔芬、雷公藤甲素、米伐木肽、熊果酸或者铂药物中的一种；其中所述铂药物包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、乐铂或者顺式-双新癸酸-反式-R,R-1,2-环已二胺合铂(Ⅱ)。
5.如权利要求3所述的一种还原敏感药物组合物，其特征在于：所述的抗菌药物是两性霉素B、庆大霉素、制霉菌素、氟康唑、阿米卡星、左氧氟沙星或者硝酸益康唑中的一种；所述的抗病毒药物是利巴韦林或者阿德福韦酯。
6.如权利要求2所述的一种还原敏感药物组合物，其特征在于：所述的药效学上可接受的助剂为磷脂、甘油酯、脂肪酸、吐温、泊洛沙姆或者胆固醇中的一种或多种。
7.一种如权利要求1～6任一所述的还原敏感药物组合物的制备方法，其特征在于：该还原敏感药物组合物通过薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、超声波分散法、喷雾干燥法、膜挤压法或高压均质法制备；
其中该还原敏感药物组合物应用于抗肿瘤药剂、抗病毒药剂或抗菌药剂的制备，且所述的抗肿瘤药剂、抗病毒药剂或抗菌药剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂。
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