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CN110191722B - 用于治疗htlv-1相关性脊髓病的药物组合物 - Google Patents

用于治疗htlv-1相关性脊髓病的药物组合物 Download PDF

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CN110191722B CN201880007277.3A CN201880007277A CN110191722B CN 110191722 B CN110191722 B CN 110191722B CN 201880007277 A CN201880007277 A CN 201880007277A CN 110191722 B CN110191722 B CN 110191722B
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Daiichi Sankyo Co Ltd
St Marianna University School of Medicine
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Daiichi Sankyo Co Ltd
St Marianna University School of Medicine
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Abstract

本发明提供一种用于治疗HTLV‑1相关性脊髓病的药物组合物，其包含选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂作为有效成分。本发明提供一种用于治疗HTLV‑1相关性脊髓病的药物组合物，其包含1,3‑苯并二氧戊环衍生物或其药学上可接受的盐。

Description

用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物组合物
技术领域
本发明涉及用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物组合物。
背景技术
在约0.25％的人类嗜T淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)的感染者中发病的HTLV-1相关性脊髓病(HAM)是尚未建立治疗方法的难治性神经疾病。一般认为，其症状是起因于HTLV-1感染细胞的过度的免疫应答所导致的神经组织障碍。以往治疗中所使用的甾类、IFNα的治疗效果有限，还存在作为疾病的根本性原因的感染细胞的减少效果不足这样的严重问题。进一步地，HTLV-1与艾滋病毒不同，其病毒基因表达较少，因此，利用逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂的治疗效果也差。
与HTLV-1相关的炎症性疾病由于发病人数非常少，因此用于病因阐明及治疗药开发的研究进展缓慢。需要说明的是，已经明确了专利文献1中记载的特定化合物在作为肿瘤的一种的成人T细胞白血病淋巴瘤(ATL)的治疗中有用(专利文献2)。但是，成人T细胞白血病淋巴瘤(ATL)与HTLV-1相关性脊髓病(HAM)的发病机制是完全相反的，ATL为免疫抑制状态的疾病，而HAM为免疫亢进而产生炎症的疾病。因此，这两种疾病的治疗方法、治疗药都完全不同，成人T细胞白血病淋巴瘤(ATL)利用抗癌剂来进行治疗，而另一方面，HTLV-1相关性脊髓病(HAM)利用抗炎症剂来进行治疗。进而，已经明确了在ATL与HAM中症状所涉及的细胞完全不同(非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2015/141616号公报
专利文献2：日本专利第6009135号公报
非专利文献
非专利文献1：Araya N.,et al.,Viruses,3:1532-1548,2010
发明内容
本发明提供用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物组合物。
本发明人已明确了HTLV-1相关性脊髓病(HAM)患者的CD4+CD25+CCR4+细胞及除此以外的CD4+细胞会过度表达EZH2。本发明人发现：通过EZH2抑制剂，来自HAM患者的脊髓的PBMC的自发增殖活性得到抑制，IL-10产生能力增强，HTLV-1感染细胞数减少并诱导细胞凋亡。另外，本发明人发现，上述EZH2抑制剂所带来的效果在EZH1/2双重抑制剂的情况下会进一步被放大。由此，本发明人发现，HAM中，EZH1和EZH2各自的酶活性的抑制具有治疗上的重要性。本发明基于这些见解。
即，根据本发明，提供以下的发明。
(1)一种用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物组合物，其包含选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂作为有效成分。
(2)根据上述(1)所述的药物组合物，其中，上述抑制剂为EZH1/2双重抑制剂。
(3)根据上述(1)所述的药物组合物，其中，上述抑制剂为选自
N-[(1,2-二氢-4,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-6-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-吲哚-4-甲酰胺、
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4’-(吗啉代甲基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺、
(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、及
(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺
中的化合物或其药学上可接受的盐。
(4)根据上述(1)或(2)所述的药物组合物，其中，上述抑制剂为(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、或者其药学上可接受的盐。
(5)根据上述(1)或(2)所述的药物组合物，其中，上述抑制剂为(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
(6)根据上述(1)或(2)所述的药物组合物，其中，上述抑制剂为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
(7)根据上述(1)或(2)所述的药物组合物，其中，上述抑制剂为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺对甲苯磺酸盐。
(8)一种用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物组合物，其包含选自
N-[(1,2-二氢-4,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-6-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-吲哚-4-甲酰胺、
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4’-(吗啉代甲基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺、
(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、及
(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺
中的化合物或其药学上可接受的盐。
(9)根据上述(8)所述的药物组合物，其中，包含(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
(10)根据上述(8)所述的药物组合物，其中，包含(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
(11)根据上述(8)所述的药物组合物，其中，包含(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺对甲苯磺酸盐。
(12)一种对于有需要的对象治疗HTLV-1相关性脊髓病的方法，其包含下述步骤：向该患者给药治疗上有效量的选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂。
(13)根据上述(12)所述的方法，其中，上述抑制剂为EZH1/2双重抑制剂。
(14)根据上述(12)所述的方法，其中，上述抑制剂为选自
N-[(1,2-二氢-4,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-6-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-吲哚-4-甲酰胺、
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4’-(吗啉代甲基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺、
(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺及
(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺
中的化合物或其药学上可接受的盐。
(15)根据上述(12)或(13)所述的方法，其中，上述抑制剂为(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、或(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、或者其药学上可接受的盐。
(16)根据上述(12)或(13)所述的方法，其中，上述抑制剂为(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
(17)根据上述(12)或(13)所述的方法，其中，上述抑制剂为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
(18)根据上述(12)或(13)所述的方法，其中，上述抑制剂为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺对甲苯磺酸盐。
(19)一种对于有需要的对象治疗HTLV-1相关性脊髓病的方法，其向该对象给药治疗上有效量的选自下述中的化合物或其药学上可接受的盐：
N-[(1,2-二氢-4,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-6-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-吲哚-4-甲酰胺、
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4’-(吗啉代甲基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺、
(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、及
(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺。
(20)根据上述(19)所述的方法，其中，向该对象给药治疗上有效量的(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
(21)根据上述(19)所述的方法，其中，向该对象给药治疗上有效量的(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
(22)根据上述(19)所述的方法，其中，向该对象给药治疗上有效量的(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺对甲苯磺酸盐。
(23)选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
(24)根据上述(23)所述的应用，其中，上述抑制剂为EZH1/2双重抑制剂。
(25)根据上述(23)所述的应用，其中，上述抑制剂为选自
N-[(1,2-二氢-4,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-6-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-吲哚-4-甲酰胺、
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4’-(吗啉代甲基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺、
(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、及
(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺
中的化合物或其药学上可接受的盐。
(26)根据上述(23)或(24)所述的应用，其中，上述抑制剂为(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、或(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、或者其药学上可接受的盐。
(27)根据上述(23)或(24)所述的应用，其中，上述抑制剂为(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
(28)根据上述(23)或(24)所述的应用，其中，上述抑制剂为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
(29)根据上述(23)或(24)所述的应用，其中，上述抑制剂为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺对甲苯磺酸盐。
(30)选自下述中的化合物或其药学上可接受的盐在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用：
N-[(1,2-二氢-4,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-6-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-吲哚-4-甲酰胺、
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4’-(吗啉代甲基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺、
(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、及
(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺。
(31)根据上述(30)所述的应用，其为(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
(32)根据上述(30)所述的应用，其为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
(33)根据上述(30)所述的应用，其为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺对甲苯磺酸盐在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
附图说明
图1示出从HAM患者的外周血中采集的外周血单个核细胞(PBMC)中EZH2的基因表达比健康人的PBMC高的情况。
图2示出作为EZH1/2双重抑制剂的化合物A及化合物B(定义记载于后文)分别抑制HAM中特有地被观察到的无刺激条件下的PBMC的自发性增殖活性的情况。
图3示出作为EZH2抑制剂的E7438和GSK126分别抑制HAM中特有地被观察到的无刺激条件下的PBMC的自发性增殖活性的情况。
图4示出作为EZH1/2双重抑制剂的化合物A及化合物B分别增强作为免疫抑制性细胞因子的IL-10的释放的情况。
图5示出作为EZH1/2双重抑制剂的化合物A及化合物B分别降低HTLV-1原病毒量的情况。
图6示出作为EZH1/2双重抑制剂的化合物A及化合物B分别降低由HAM患者脑脊液建立的HTLV-1感染细胞的存活率的情况。
图7示出作为EZH1/2双重抑制剂的化合物A及化合物B分别呈浓度依赖性地降低由HAM患者脑脊液建立的HTLV-1感染细胞的存活率的情况。
图8示出作为EZH1/2双重抑制剂的化合物A及化合物B分别诱导由HAM患者脑脊液建立的HTLV-1感染细胞的细胞凋亡的情况。
图9示出作为EZH1/2双重抑制剂的化合物A及化合物B分别诱导由HAM患者脑脊液建立的HTLV-1感染细胞的细胞凋亡的情况。与图8相比细胞所来自的患者不同。
具体实施方式
本说明书中，“对象”是指哺乳动物、特别是人。
本说明书中，“HTLV-1相关性脊髓病”(以下有时也称为“HAM”)为遵循WHO指南(Osame M.Review of WHOKagoshima meeting and diagnostic guidelines for HAM/TSP.In:Blattner W,ed.Human Retrovirology:HTLV.New York,New York,USA:RavenPress；1990:191-197.)由医师诊断的、伴有慢性进行性的痉挛性脊髓麻痹的疾病。
HAM在一部分人类嗜T淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)的感染者中发病。HAM中，慢性炎症过程以脊髓、特别是胸髓中下部为中心而发生。在HAM的脊髓病变中，得到了显示出持续发生细胞性免疫反应的所见。
根据HAM的脊髓病变中的HTLV-1感染细胞的使用原位PCR法的分析，仅在浸润的T细胞中确认到HTLV-1感染细胞，在周边的神经细胞、神经胶质细胞中未确认到HTLV-1感染细胞。另外，由HAM的脊髓病灶的病理学分析显示：浸润炎症细胞的主要构成细胞在发病初期为包含HTLV-1感染细胞的CD4阳性细胞，但随着时间推移而变成CD8阳性细胞。因此认为，HAM不是单纯的神经感染症，其症状的核心是，以浸润的HTLV-1感染T细胞为中心的免疫应答失控，形成和/或维持慢性炎症病灶。
成人T细胞白血病淋巴瘤(ATL)是在一部分HTLV-1的感染者中发病的疾病。已知ATL是来源于HTLV-1感染细胞的恶性肿瘤(癌症)，是与HAM完全不同的疾病。认为在HAM和ATL中，HTLV-1感染细胞均为CD4+CD25+CCR4+T细胞。在HAM中，在CD4+CD25+CCR4+T细胞中Foxp3表达下降，INF-γ产生增加(HTLV-1tax的表达也高)，另一方面，调节性T细胞(Treg)受到抑制。与此形成对照的是，在ATL中，在CD4+CD25+CCR4+T细胞中Foxp3表达增高(无HTLV-1tax的表达)、形成免疫抑制状态，并且Treg功能提高，认为这说明了在ATL中临床上所观察到的细胞性免疫缺陷。
这样，在HAM中，其原因在于免疫应答变得过度而形成慢性炎症性病灶，但在ATL中反而形成了免疫抑制状态。
即，如上所述，HAM和ATL的发病机制是相反的，所涉及的细胞成分不同(Araya N.,et al.,Viruses,3:1532-1548,2010)。
本发明人发现，通过利用EZH1/2双重抑制剂对来自HAM患者的PBMC进行处理，使作为免疫抑制性细胞因子的IL-10的产生增加。本发明人还发现，通过利用EZH2抑制剂或EZH1/2双重抑制剂对来自HAM患者的PMBC进行处理，可以抑制其自发增殖活性。本发明人进一步发现，通过利用EZH1/2双重抑制剂对由HAM患者脑脊液建立的HTLV-1感染细胞进行处理，可降低细胞的存活率，并对细胞诱导细胞凋亡。另外，关于来自HAM患者的PBMC的自发增殖活性的抑制，与EZH2抑制剂相比，在EZH1/2双重抑制剂中效果更高。发现：即使EZH2的酶活性抑制效果为同等，在EZH1/2双重抑制剂中效果也高，因此，在来自HAM患者的PMBC的自发增殖活性的抑制中，EZH1的活性抑制也很重要。
因此，根据本发明，提供一种用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物组合物，其包含选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂作为有效成分。
根据本发明，提供一种用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物组合物，其包含EZH1抑制剂作为有效成分。
根据本发明，提供一种用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物组合物，其包含EZH2抑制剂作为有效成分。
另外，根据本发明，提供一种用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物组合物，其包含EZH1/2双重抑制剂作为有效成分。
本发明的药物组合物可以还包含赋形剂。
作为EZH1抑制剂，没有特别限定，可列举例如(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺及(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、以及它们的药学上可接受的盐，可以在本发明中使用。
作为EZH2抑制剂，没有特别限定，可列举例如N-[(1,2-二氢-4,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-6-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-吲哚-4-甲酰胺、N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4’-(吗啉代甲基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺、(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺及(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、以及它们的药学上可接受的盐，可以在本发明中使用。另外，作为EZH2抑制剂，可列举(1S,2R,5R)-5-(4-氨基咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(羟基甲基)环戊-3-烯-1,2-二醇及药学上可接受的其盐，可以在本发明中使用。作为EZH2抑制剂，还可列举N-[(6-甲基-2-氧代-4-丙基-1H-吡啶-3-基)甲基]-1-丙烷-2-基-6-[6-(4-丙烷-2-基哌嗪-1-基)吡啶-3-基]吲唑-4-甲酰胺及药学上可接受的其盐，可以在本发明中使用。另外，作为EZH2抑制剂，还可列举他折司他(tazemetostat)(EPZ-6438)。另外，作为EZH2抑制剂，还可列举N-[(1,2-二氢-6-甲基-2-氧代-4-丙基-3-吡啶基)甲基]-1-)1-甲基乙基)-6-[2-(4-甲基-1-哌嗪基)-4-吡啶基]-1H-吲唑-4-甲酰胺及药学上可接受的其盐，可以在本发明中使用。另外，作为EZH2抑制剂，还可列举Stazi,G.et al,Expert Opinion on Therapeutic Patents,27:7,797-813,2017中记载的各种化合物，可以在本发明中使用。另外，全世界都在进行EZH2抑制剂的开发，例如可以在本发明中使用以下记载的EZH2抑制剂：WO2014/100646、WO2015/057859、WO2016/081523、WO2014/144747、WO2015/010078、WO2015/010049、WO2015/200650、WO2015/132765、WO2015/004618、WO2016/066697、WO2014/124418、WO2015/023915、WO2016/130396、WO2015/077193、WO2015/077194、WO2015/193768、WO2016/073956、WO2016/073903、WO2016/102493、WO2016/089804、WO2014/151369。本发明中，EZH2抑制剂可以还具有EZH1抑制作用，例如可以为EZH1/2双重抑制剂。例如，上述N-[(6-甲基-2-氧代-4-丙基-1H-吡啶-3-基)甲基]-1-丙烷-2-基-6-[6-(4-丙烷-2-基哌嗪-1-基)吡啶-3-基]吲唑-4-甲酰胺及药学上可接受的其盐可以为EZH1/2双重抑制剂。本发明的某一方式中，可以为了治疗而对HTLV-1相关性脊髓病患者给药EZH1抑制剂及EZH2抑制剂这两者。
作为EZH1/2双重抑制剂，没有特别限定，可列举例如(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺及(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、以及它们的药学上可接受的盐，可以在本发明中使用。
(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺公开于WO2015/141616号公报的实施例15，是具有下述结构的化合物。
Figure BDA0002133107740000121
(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺公开于WO2015/141616号公报的实施例35，是具有下述结构的化合物。
Figure BDA0002133107740000131
(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺对甲苯磺酸盐公开于WO2015/141616号公报的实施例80。
N-[(1,2-二氢-4,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-6-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-吲哚-4-甲酰胺也称为GSK126，公开于WO2011/140324的实施例270。
N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4’-(吗啉代甲基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺也称为E7438或EPZ-6438，公开于WO2012/142504的实施例44。
本发明的某一方式中，例如在人EZH1介导的组蛋白甲基转移酶活性的抑制效果中，EZH1抑制剂的IC50可以为1μM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下、90nM以下、80nM以下、70nM以下、60nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、15nM以下或10nM以下。IC50例如可以基于WO2015/141616的试验例1中记载的方法来测定。例如，可以通过对具有EZH1的靶序列(例如人组蛋白H3蛋白质的第12位至第40位的氨基酸序列；作为人组蛋白H3蛋白质的氨基酸序列，可列举例如GenBank登录号：CAB02546.1所登录的序列)的肽检测使氚标记的S-腺苷甲硫氨酸转移的EZH1的活性的抑制效果来测定。EZH1的甲基转移酶活性可以使用PRC2-EZH1复合物来测定。
本发明的某一方式中，例如在人EZH2介导的组蛋白甲基转移酶活性的抑制效果中，EZH2抑制剂的IC50可以为1μM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下、90nM以下、80nM以下、70nM以下、60nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、15nM以下或10nM以下。IC50例如可以基于WO2015/141616的试验例2中记载的方法来测定。例如，可以通过对具有EZH2的靶序列(例如人组蛋白H3蛋白质的第12位至第40位的氨基酸序列；作为人组蛋白H3蛋白质的氨基酸序列，可列举例如GenBank登录号：CAB02546.1所登录的序列)的肽检测使氚标记的S-腺苷甲硫氨酸转移的EZH2的活性的抑制效果来测定。EZH2的甲基转移酶活性可以使用PRC2-EZH2复合物来测定。
本发明的某一方式中，例如在人EZH1介导的组蛋白甲基转移酶活性的抑制效果中，EZH1/2双重抑制剂的IC50可以为1μM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下、90nM以下、80nM以下、70nM以下、60nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、15nM以下或10nM以下，并且，在人EZH2介导的组蛋白甲基转移酶活性的抑制效果中，EZH1/2双重抑制剂的IC50可以为1μM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下、90nM以下、80nM以下、70nM以下、60nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、15nM以下或10nM以下。针对EZH1及EZH2的IC50例如可以分别如上所述进行测定。
本发明的某一方式中，EZH1抑制剂针对例如由HTLV-1相关性脊髓病患者建立的HCT-4细胞株的GI50可以为1μM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下、90nM以下、80nM以下、70nM以下、60nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、15nM以下或10nM以下。本说明书中，“GI50”是指达到某药剂的最大增殖抑制活性的一半所需的该药剂的浓度。
本发明的某一方式中，EZH2抑制剂针对例如由HTLV-1相关性脊髓病患者建立的HCT-4细胞株的GI50可以为1μM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下、90nM以下、80nM以下、70nM以下、60nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、15nM以下或10nM以下。
本发明的某一方式中，EZH1/2双重抑制剂针对例如由HTLV-1相关性脊髓病患者建立的HCT-4细胞株的GI50可以为1μM以下、500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下、90nM以下、80nM以下、70nM以下、60nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、15nM以下或10nM以下。
本发明的化合物可以根据期望制成药学上可接受的盐。药学上可接受的盐是指不具有明显的毒性、可作为药物使用的盐。本发明的化合物具有碱性基团，因此可以通过与酸反应而形成盐。
作为基于碱性基团的盐，可列举例如：氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐之类的氢卤酸盐；硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐之类的C1-C6烷基磺酸盐；苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐之类的芳基磺酸盐；乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐、草酸盐、己二酸盐、马来酸盐等有机酸盐；以及甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐之类的氨基酸盐。
本发明的化合物的药学上可接受的盐有时会由于放置在大气中或重结晶而摄入水分子、形成水合物，这样的水合物也包含在本发明的盐中。
本发明的化合物的药学上可接受的盐有时会由于放置在溶剂中或重结晶而吸收某种溶剂、形成溶剂合物，这样的溶剂合物也包含在本发明的盐中。
另外，在本发明中，在生物体内的生理条件下，通过由酶、胃酸等引起的反应而转化为作为本发明的药物组合物的有效成分的化合物A或化合物B的化合物、即在酶的作用下发生氧化、还原或水解等而转化为化合物A或化合物B的化合物或者在胃酸等的作用下发生水解等而转化为化合物A或化合物B的“药学上可接受的前药化合物”也包含在本发明中。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以通过公知的方法、例如萃取、沉淀、蒸馏、层析、基于析出的分级、重结晶等进行分离、纯化。
本发明的化合物中，构成这种化合物的原子中的一种以上可含有非天然比例的原子同位素。作为原子同位素，可列举例如氘(2H)、氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)等。另外，上述化合物可用例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)等放射性同位素进行放射性标记。经放射性标记的化合物作为治疗或预防剂、研究试剂、例如测试试剂及诊断剂、例如体内影像诊断剂有用。本发明的化合物的全部同位素异构体不论是否为放射性均包含在本发明的范围内。
本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以通过各种方式进行给药。作为其给药方式，可列举例如：利用片剂、胶囊剂、颗粒剂、乳剂、丸剂、散剂、糖浆剂(液剂)等的经口给药；或者利用注射剂(静脉内、肌肉内、皮下或腹腔内给药)、点滴剂、栓剂(直肠给药)等的非经口给药。上述各种制剂可以按照常规方法对主剂使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味矫臭剂、助溶剂、悬浮剂、包衣剂等药物制剂技术领域中通常可以使用的助剂来进行制剂化。
在以片剂的形式使用的情况下，作为载体，可以使用例如：乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸等赋形剂；水、乙醇、丙醇、单糖浆、葡萄糖液、淀粉液、明胶溶液、羧甲基纤维素、虫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯基吡咯烷酮等粘合剂；干燥淀粉、海藻酸钠、琼脂粉末、海带多糖粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、淀粉、乳糖等崩解剂；白糖、硬脂精、可可脂、氢化油等崩解抑制剂；季铵盐类、月桂基硫酸钠等吸收促进剂；甘油、淀粉等保湿剂；淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶态硅酸等吸附剂；精制滑石、硬脂酸盐、硼酸粉末、聚乙二醇等润滑剂等。另外，可以根据需要制成实施了通常的包衣的片剂、例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶包衣片、薄膜包衣片或双层片、多层片。
在以丸剂的形式使用的情况下，作为载体，可以使用例如：葡萄糖、乳糖、可可脂、淀粉、氢化植物油、高岭土、滑石等赋形剂；阿拉伯胶粉末、黄蓍胶粉末、明胶、乙醇等粘合剂；海带多糖、琼脂等崩解剂等。
在以栓剂的形式使用的情况下，作为载体，可以广泛使用本领域中现有公知的载体，可列举例如聚乙二醇、可可脂、高级醇、高级醇的酯类、明胶、半合成甘油酯等。
在以注射剂的形式使用的情况下，可以以液剂、乳剂或悬浮剂的形式使用。这些液剂、乳剂或悬浮剂优选经灭菌且与血液等渗。这些液剂、乳剂或悬浮剂的制造中所使用的溶剂只要是可作为医疗用稀释剂使用的溶剂则没有特别限定，可列举例如水、乙醇、丙二醇、乙氧化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类等。需要说明的是，这种情况下，可以在制剂中包含足以制备等渗性的溶液的量的食盐、葡萄糖或甘油，另外，可以包含通常的助溶剂、缓冲剂、无痛化剂等。
另外，上述制剂中，还可以根据需要包含着色剂、保存剂、香料、风味剂、甜味剂等，而且还可以包含其它药品。
上述制剂中所含的作为有效成分的化合物的量没有特别限定，可以在宽范围内适宜选择，通常在全部组合物中包含0.5至70重量％、优选为1至30重量％。
其使用量根据患者(温血动物、特别是人类)的症状、年龄等而有所不同，在经口给药的情况下，优选将每天的上限2000mg(优选100mg)、下限0.1mg(优选1mg、进一步优选10mg)对于成人根据症状每天给药1至6次。
本发明的药物组合物可以与其它HAM治疗剂组合使用。作为可组合使用的其它HAM治疗剂，没有特别限定，可列举例如选自肾上腺皮质激素、泼尼松龙、干扰素-α、硫唑嘌呤、柳氮磺胺吡啶、抗坏血酸、己酮可可碱、干酪乳杆菌代田株(养乐多400)、红霉素、咪唑立宾、磷霉素、GLYCEOL(甘油果糖氯化钠注射液)、人免疫球蛋白、达那唑、乙哌立松盐酸盐等中的其它HAM治疗剂。
因此，本发明提供一种用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物组合物，其用于与上述其它HAM治疗剂组合使用，包含选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂作为有效成分。另外，本发明提供一种用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的组合药物，其为选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂与上述其它HAM治疗剂中的任意一种以上的组合药物。
根据本发明，提供一种选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
根据本发明，提供一种EZH1抑制剂在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
根据本发明，提供一种EZH2抑制剂在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
根据本发明，提供一种EZH1/2双重抑制剂在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
根据本发明，提供一种选自(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺及(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、以及它们的药学上可接受的盐中的化合物在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
根据本发明，提供一种选自N-[(1,2-二氢-4,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-6-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-吲哚-4-甲酰胺、N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4’-(吗啉代甲基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺、(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺及(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、以及它们的药学上可接受的盐中的化合物在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
在本发明的某些优选方式中，作为用于治疗HTLV-1相关性脊髓病或制造用于该治疗的药物的、作为EHZ1/2双重抑制剂的(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺的药学上可接受的盐，可使用(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺对甲苯磺酸盐。
根据本发明，提供一种对于罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象治疗HTLV-1相关性脊髓病的方法，其包含下述步骤：向该对象给药治疗上有效量的选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂。
根据本发明，提供一种对于罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象治疗HTLV-1相关性脊髓病的方法，其包含下述步骤：向该对象给药治疗上有效量的选自N-[(1,2-二氢-4,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶基)甲基]-3-甲基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-6-[6-(1-哌嗪基)-3-吡啶基]-1H-吲哚-4-甲酰胺、N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4’-(吗啉代甲基)-[1,1’-联苯基]-3-甲酰胺、(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺及(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、以及它们的药学上可接受的盐中的化合物。
根据本发明，提供一种免疫抑制剂，其包含选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂。根据本发明，提供一种选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂，其用于抑制免疫。根据本发明，提供一种选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂在制造用于抑制免疫的药物中的应用。根据本发明，提供一种在有需要的对象中抑制免疫的方法，其包含下述步骤：向该对象给药治疗上有效量的选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂。
在关于免疫的抑制的这些方式的各方式中，上述抑制剂可被给药于例如罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象。另外，在这些方式的各方式中，免疫的抑制可以是在罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象中发生了亢进的炎症的抑制。另外，在该方式的各方式中，作为EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂，可列举并且可以在本发明中使用前文所述的抑制剂。
另外，根据本发明，提供一种用于在对象中增强IL-10的产生量的药物组合物，其包含选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂。根据本发明，提供一种选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂，其用于增强IL-10的产生量。根据本发明，提供一种选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂在制造用于增强IL-10的产生量的药物中的应用。根据本发明，提供一种在有需要的对象中增强IL-10的产生量的方法，其包含下述步骤：向该对象给药治疗上有效量的选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂。
在关于IL-10的产生增强的这些方式的各方式中，上述抑制剂可被给药于例如罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象。另外，在该方式的各方式中，作为EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂，可列举并且可以在本发明中使用前文所述的抑制剂。
另外，根据本发明，提供一种用于抑制对象(例如罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象)中的PBMC的增殖活性的药物组合物，其包含选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂。根据本发明，提供一种选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂，其用于抑制对象(例如罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象)中的PBMC的增殖活性。根据本发明，提供一种选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂在制造用于抑制对象(例如罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象)中的PBMC的增殖活性的药物中的应用。根据本发明，提供一种在有该需要的对象(例如罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象)中抑制PBMC的增殖活性的方法，其包含下述步骤：向该对象给药治疗上有效量的选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂。该方式中，PBMC的增殖活性可以是HTLV-1感染细胞诱发性的自增殖活性。该方式中，PBMC的增殖活性可以是不存在增殖刺激下的自增殖活性。该方式中，PBMC可包含CD4+单阳性T细胞和/或CD8+单阳性T细胞。该方式中，PBMC可包含CD4+CD25+CCR4+T细胞。
在关于PBMC增殖活性的抑制的这些方式的各方式中，上述抑制剂可被给药于例如罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象。另外，在该方式的各方式中，作为EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂，可列举并且可以在本发明中使用前文所述的抑制剂。
根据本发明，提供一种用于对HTLV-1感染细胞诱导细胞凋亡的药物组合物，其包含选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂。根据本发明，提供一种选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂，其用于对HTLV-1感染细胞诱导细胞凋亡。根据本发明，提供一种选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂在制造用于对HTLV-1感染细胞诱导细胞凋亡的药物中的应用。本发明提供一种在有该需要的对象(例如罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象)中对HTLV-1感染细胞诱导细胞凋亡的方法，其包含下述步骤：向该对象给药治疗上有效量的选自由EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂组成的组中的抑制剂。
在关于对HTLV-1感染细胞诱导细胞凋亡的这些方式的各方式中，HTLV-1感染细胞存在于罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象的体内。在这些方式的各方式中，上述抑制剂可被给药于例如罹患HTLV-1相关性脊髓病的对象。另外，在该方式的各方式中，作为EZH1抑制剂、EZH2抑制剂及EZH1/2双重抑制剂，可列举并且可以在本发明中使用前文所述的抑制剂。
实施例
以下将(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺称为化合物A。另外，将(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺称为化合物B。
化合物A按照WO2015/141616号公报的实施例15的记载来合成。化合物B按照WO2015/141616号公报的实施例35的记载来合成。在以下实施例中，使用如上合成的化合物A及B。
需要说明的是，化合物A及B抑制EZH1和EZH2这两者的酶活性(WO2015/141616号公报)。
在以下实施例中，HAM/TSP患者是按照WHO诊断基准由医师诊断的(OsameM.Review of WHO Kagoshima meeting and diagnostic guidelines for HAM/TSP In:Blattner W,ed.Human Retrovirology:HTLV.New York,New York,USA:Raven Press；1990:191-197.)。
实施例1：HAM细胞中的EZH2表达水平的提高
本实施例中，进行由HAM患者得到的外周血单个核细胞(PBMC)和健康人的PBMC的基因表达分析，明确了EZH2的表达水平在来自HAM患者的PMBC中是提高的。
从由5位HAM患者的外周血分离出的外周血单个核细胞(Peripheral BloodMononuclear Cell：PBMC)中，使用人CD4+分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离CD4+细胞后，用结合有抗CCR4抗体(BD551121)的抗小鼠IgG1微珠(Miltenyi Biotec)分离CD4+CCR4+细胞。CD4+CCR4+细胞级分中包含HTLV-1感染细胞。同样从5位健康人的PBMC中分离CD4+CCR4+细胞，作为对照组。从所分离的CD4+CCR4+细胞中回收总RNA，用ReverTra Ace(东洋纺)制作cDNA。使用所制作的cDNA，通过微阵列分析包罗地分析HAM患者CD4+CCR4+细胞与健康人CD4+CCR4+细胞间的基因表达差异。结果，在EZH2的表达量方面可见差异，因此利用实时PCR对EZH2的表达量差异进行了详细分析。在所表达的EZH2的检测中使用的引物组为EZH2#35-F：TGTGGATACTCCTCCAAGGAA和EZH2#35-R：GAGGAGCCGTCCTTTTTCA，探针使用UniversalProbeLibrary#35(Roche)。差异显著性检验使用GraphPad Prism6(MDF)的成对t检验(paired t-test)来进行。结果如图1所示。
如图1所示，HAM患者CD4+CCR4+细胞(HAM-CD4+CCR4+)与来自健康人的CD4+CCR4+细胞(HD-CD4+CCR4+)相比，EZH2mRNA表达显著提高了2.6倍。由该结果可知，来自HAM患者的感染细胞群与来自健康人的细胞群相比，EZH2表达是提高的。
颇具意味的是，HTLV-1感染细胞以外的CD4+T细胞中，EZH2的表达水平也提高。
实施例2：EZH1/2双重抑制剂对HAM的效果
来自HAM患者的PBMC具有在无刺激条件下进行培养时会自发性增殖的特征，这是其它PBMC所不具有的。
因此，使用来自HAM患者的PBMC研究了EZH1/2双重抑制剂的效果。作为EZH1/2双重抑制剂，使用化合物A、化合物B。
化合物A、化合物B的效果通过HAM患者的PBMC中的(1)自发增殖活性、(2)炎症抑制细胞因子IL-10产生量的变化(后述的实施例3)、(3)HTLV-1感染细胞数的变化(后述的实施例4)来进行评价。此时，将DMSO处理组和1μg/ml泼尼松龙(PSL)处理组作为对照。具有炎症抑制作用的PSL可抑制HAM患者的PBMC的自发增殖活性，但在本实验体系和临床上均未显示感染细胞的除去作用。
化合物A、化合物B所带来的抑制来自HAM患者的PBMC的过度免疫应答的效果
将8例HAM患者的PBMC悬浮于培养基(包含10％FBS(GIBCO)的RPMI1640培养基(wako))中，以每孔1×105个细胞接种到96孔圆底板中(对于各浓度，使用3个孔)，按照终浓度为1、10、100或者1000nM的方式添加化合物A或化合物B，在37℃、5％CO2条件下培养6天。将DMSO处理组、1μg/mL PSL处理组作为对照。在培养开始起6天后，向各孔中添加1μCi3H-胸苷，在37℃、5％CO2条件下培养16小时。然后，使用细胞收集器(Tomtec MH3PerkinElmer)，使培养细胞吸附于玻璃过滤器(Printed Filtermat A PerkinElmer)上，干燥后，使固体闪烁剂Meltilex-A(PerkinElmer)掺入。使用MicroBeta(WALLAC MicroBeta TriLux 1450-021)测定被吸入到细胞中的3H-胸苷量(Yamano et al.PLoS One.2009，4(8)：e6517)。将各HAM患者的PBMC的DMSO处理组的3H-胸苷的计数的平均值设为100％，分别计算化合物A、化合物B及1μg/mL PSL处理组的计数的相对值，求出8例HAM患者的平均值。差异显著性检验使用GraphPad Prism6(MDF)的Friedman检验来进行。结果如图2的上半部所示。
如图2的上半部所示，化合物A和化合物B均呈浓度依赖性地抑制全部8例HAM患者的PBMC的自发增殖活性。对于试验中使用的全部例子的平均值而言，在100nM以上的化合物A或化合物B的处理时，均可见统计学上的显著抑制效果。关于此时的GI50，在化合物A的情况下为73.0nM，在化合物B的情况下为33.9nM。因此，启示了EZH1/2双重抑制剂抑制来自HAM患者的PBMC的过度免疫应答的效果。
将使患者数增加到16例且进行同样的实验的结果示于图2的下半部。在使用16例HAM患者的针对自发增殖活性的结果的情况下，关于GI50，在化合物A的情况下为45.6nM，在化合物B的情况下为25.9nM。
在任一实验中，如图2上半部及下半部所示，都在100nM以下的低浓度区域中也观察到化合物A及B对来自HAM患者的PMBC的自发增殖活性的抑制作用。
EZH2抑制剂所带来的抑制来自HAM患者的PBMC的过度免疫应答的效果
在上述实施例中，除使用EZH2抑制剂代替化合物A及B以外，同样地操作来确认对来自HAM患者的PBMC的效果。
作为EZH2抑制剂，使用GSK126(CASNo.：1346574-57-9)和E7438(CASNo.：1403254-99-8)。处理浓度以最终浓度计设为1、10、100、1000或10000nM。对于上述中增加病例前的8位的PBMC实施实验。结果如图3所示。
如图3所示，可以确认E7438(图3的上半部)及GSK126(图3的下半部)分别抑制来自HAM患者的PBMC的自发增殖活性。关于GI50，在E7438的情况下为214.2nM，在GSK126的情况下为724.3nM。
可见，在1μM以下的低浓度区域中，观察到E7438及GSK126对来自HAM患者的PBMC的自发增殖活性的抑制作用。
本实施例中使用的EZH1/2双重抑制剂与EZH2抑制剂在对EZH2的酶活性的抑制效果的强度方面变化不太大。因此可以理解，对于来自HAM患者的PBMC的自发增殖活性的抑制效果而言，不仅是EZH2的抑制的影响大，EZH1的抑制的影响也大。
实施例3：EZH1/2双重抑制剂所带来的炎症抑制性细胞因子IL-10的产生诱导
HAM的症状特征是由PBMC所致的炎症诱发。因此，在本实施例中，对EZH1/2双重抑制剂对从PBMC的细胞因子释放的效果进行了考察。
将上述8例HAM患者的PBMC悬浮于培养基(包含10％FBS的RPMI1640培养基)中，以每孔5×105个细胞接种到48孔板中，按照终浓度为1、10、100、1000nM的方式加入化合物A或化合物B，在合计0.5mL的培养液中在37℃、5％CO2条件下培养12天。将DMSO处理组、1μg/mLPSL处理组作为对照。从培养开始起12天后，对培养液进行离心分离，仅回收培养上清。使用Cytokine Beads分析试剂盒(BD Biosciences)，利用流式细胞仪FACSCantoII(BDBiosciences)测定培养上清中的IL-10浓度(Yamauchi et al.J Infect Dis.2015,211(2):238-48.)。将DMSO处理组的培养液中的IL-10浓度设为100％，对各浓度的化合物A、化合物B或1μg/mL PSL处理组的培养液中的IL-10浓度变化进行比较分析。差异显著性检验使用GraphPad Prism6(MDF)的Friedman检验来进行。结果如图4所示。
如图4所示，化合物A及化合物B均使来自PBMC的IL-10产生量急剧地提高。与作为抗炎症剂已知的PSL进行比较时，在与PSL相比为十分之一左右的浓度下也观察到同等以上的IL-10产生促进。
由此启示了：化合物A及化合物B对来自HAM患者的PBMC起作用，可抑制作为HAM的主要症状之一的炎症。
另一方面，INF-α、TNF-α及IL-6的产生量没有明显的变动。
来自HAM患者的PBMC在无刺激条件下具有自发增殖活性。认为该自发增殖活性是由于HAM感染细胞使免疫系统过度应答而引起的。由实施例3可知，EZH1/2双重抑制剂使来自HAM患者的PBMC产生具有免疫抑制作用的IL-10。启示了如下可能性：EZH1/2双重抑制剂通过具有免疫抑制作用的IL-10来压制免疫系统的过度应答，由此抑制PBMC的自发增殖活性。
实施例4：EZH1/2双重抑制剂所带来的从来自HAM患者的PMBC中除去HTLV-1感染细 胞的除去效果
本实施例中，对EZH1/2双重抑制剂是否具有成为HAM的原因的HTLV-1感染细胞的除去效果进行了研究。
将上述8例HAM患者的PBMC悬浮于培养基(包含10％FBS的RPMI1640培养基)中，以每孔5×105个细胞接种到48孔板中，按照终浓度为1、10、100、1000nM的方式加入化合物A或化合物B，在合计0.5ml的培养液中在37℃、5％CO2条件下培养12天。将DMSO处理组、1μg/mLPSL处理组作为对照。在培养开始起12天后，对培养液进行离心分离，然后回收各培养条件的细胞悬浮液，从离心而除去了上清的细胞块中提取基因组DNA。使用所提取的基因组DNA，通过实时PCR测定HTLV-1原病毒量(感染细胞率)(Yamano et al.Blood.2002,99(1):88-94)。将向各HAM患者的PBMC中添加DMSO并培养后的细胞中的HTLV-1原病毒量设为100％，计算化合物A、化合物B或PSL处理组中的HTLV-1原病毒量的相对值，求出8例HAM患者的平均值。差异显著性检验使用GraphPad Prism6(MDF)的Friedman检验来进行。结果如图5所示。
如图5所示，关于HAM患者的PBMC中的HTLV-1原病毒量，通过化合物A或化合物B的处理，在8例中的5例中观察到减少作用。对于试验中使用的全部HAM患者的平均而言，在1000nM的化合物A或化合物B的处理中观察到显著的原病毒量的减少效果。
实施例5：EZH1/2双重抑制剂对HTLV-1感染细胞的效果
本实施例中，使用由HAM患者脑脊液建立的HTLV-1感染细胞株来考察EZH1/2双重抑制剂对其增殖的效果。
作为上述由HAM患者脑脊液建立的HTLV-1感染细胞株的HCT-4和HCT-5是由长崎国际大学中村龙文教授惠赠的。HCT-4的培养使用包含10％FBS(GIBCO)、1％青霉素-链霉素溶液(Wako)、100U/mL IL-2(细胞科学研究所)的RPMI1640培养基来进行，HCT-5的培养使用10％FBS、1％青霉素-链霉素溶液、1％L-谷氨酰胺(SIGMA)、200U/mL IL-2来进行。在75cm2培养烧瓶中，在培养基20mL中接种3×106个细胞的HCT-4或2.5×106个细胞的HCT-5，添加DMSO并按照终浓度为1μM的方式添加化合物A或B，在反复传代的同时在37℃、5％CO2条件下培养21天。传代中，将DMSO处理组的细胞数在HCT-4的情况下达到3×106个细胞、在HCT-5的情况下达到2.5×106个细胞的培养液量加入到新的培养基中，使其为20mL，进一步以达到相同浓度的方式再添加化合物A或B。在培养期间开始后第7、14、21天的阶段从培养液中回收细胞，计测细胞浓度，由此研究化合物A或B对细胞增殖造成的影响。关于细胞浓度的测定，将培养后的细胞以每孔100μL接种到96孔板中，将细胞计数试剂盒(Cell countingkit)-8(CCK-8)(同仁化学研究所)以每孔10μL加入到各孔中，在37℃下孵育3小时后，用酶标仪(iMark Microplate Reader,Biorad)测定450nm的吸光度。以DMSO处理组为对照，分别计算出化合物A处理组或化合物B处理组中的增殖率。结果如图6所示。
如图6所示，与DMSO处理组相比，化合物A及B均可以大幅降低引起HAM的来自脑脊液的HTLV-1感染细胞的存活率。该结果表明，化合物A及B在HAM的治疗中有效。
然后，在6孔板中接种4.5×105个细胞的HCT-4或3.75×105个细胞的HCT-5，加入用DMSO制备的化合物A或B的稀释系列(从10000nM起进行4倍稀释，共8个梯度)，在合计3mL的培养液中每3～4天重复传代，同时在37℃、5％CO2条件下培养14天。传代中，将DMSO处理组的细胞数在HCT-4的情况下达到4.5×105个细胞、在HCT-5的情况下达到3.75×105个细胞的培养液量加入到新的培养基中，进一步以达到相同浓度的方式再添加化合物A或B，使其为合计3mL的培养液。在各条件下回收培养14天后的细胞，计测细胞浓度，由此研究化合物A或B对细胞增殖造成的影响。关于细胞浓度的测定，将培养后的细胞以每孔100μL接种到96孔板中，将CCK-8以每孔10μL加入到各孔中，在37℃下孵育3小时后，用酶标仪测定450nm的吸光度。以DMSO处理组为对照，计算出化合物A处理组或化合物B处理组中的增殖率。结果如图7所示。
如图7所示，化合物A及B呈浓度依赖性地降低由HAM患者脑脊液建立的HTLV-1感染细胞的存活率。关于对HCT-4细胞的GI50，在化合物A的情况下为7.63nM、在化合物B的情况下为5.92nM，关于对HCT-5细胞的GI50，在化合物A的情况下为185.4nM、在化合物B的情况下为90.6nM。
实施例6：EZH1/2双重抑制剂对HAM感染细胞的细胞凋亡诱导活性
本实施例中，使用实施例5中培养21天后的细胞进行实验。为了检测添加1μM的化合物A或化合物B并培养21天后的细胞中的凋亡细胞，使用PE Annexin V细胞凋亡检测试剂盒I(BD)进行染色，利用FACS进行分析。在本分析中，利用FSC(forward scatter，前向散射)-SSC(side scatter，侧向散射)图检测活细胞。另外，在活细胞中的膜联蛋白(Annexin)V-PE(膜联蛋白V)和7-AAD(7-氨基放线菌素D)的分析中，早期凋亡细胞作为膜联蛋白V(+)7-AAD(-)细胞被检测到。结果如图8(HCT-4细胞)及图9(HCT-5细胞)所示。
如图8所示可知，用化合物A或B处理后的HCT-4细胞中的活细胞减少。另外可知，图8中，用化合物A或B处理后的HCT-4细胞中的早期凋亡细胞增加。
如图9所示可知，用化合物A或B处理后的HCT-5细胞中的活细胞减少。另外可知，图9中，用化合物A或B处理后的HCT-5细胞中的早期凋亡细胞增加。
序列表
<110> 第一三共株式会社（Daiichisankyo Company, LTD）
圣玛丽安娜医科大学（St. Marianna University School of Medicine）
<120> 用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物组合物（Therapeutic agent forHTLV-1-associated myelopathy）
<130> PD20-9020WO
<150> JP 2017-007887
<151> 2017-01-19
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EZH2#35-F
<400> 1
tgtggatact cctccaagga a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EZH2#35-R
<400> 2
gaggagccgt cctttttca 19

Claims (8)

1.EZH1/2双重抑制剂在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用，所述抑制剂为(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、或(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、或者其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述抑制剂为(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述抑制剂为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述抑制剂为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺对甲苯磺酸盐。
5.选自下述中的化合物或其药学上可接受的盐在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用：
(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺、及
(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺。
6.根据权利要求5所述的应用，其为(2R)-7-溴-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺或其药学上可接受的盐在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其为(2R)-7-氯-2-[反式-4-(二甲基氨基)环己基]-N-[(4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,4-二甲基-1,3-苯并二氧戊环-5-甲酰胺对甲苯磺酸盐在制造用于治疗HTLV-1相关性脊髓病的药物中的应用。
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