CN110088282B - 用磁性颗粒分离高纯度核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的主题是一种从样品溶液分离核酸的方法，其中从样品溶液分离核酸是通过吸附到磁性颗粒，然后通过施加磁场从样品溶液中分离具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒，接着进行至少一个洗涤步骤(w)，包括：(w1)将具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒悬浮于洗涤液中，其是水性溶液，其具有小于100mM的总盐浓度且不含有机溶剂，(w2)在洗涤溶液中孵育具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒，和(w3)从洗涤溶液分离具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒。本发明还涉及使用水性溶液，其具有小于100mM的总盐浓度且不含有机溶剂，作为用于洗涤具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒的洗涤溶液。

Description

用磁性颗粒分离高纯度核酸的方法

本发明涉及从样品溶液分离核酸的方法，其中从样品溶液分离核酸是通过吸附到磁性颗粒，然后通过施加磁场从样品溶液中分离具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒。本发明的主题也可以是在这些方法中洗涤缓冲液的用途。

背景技术

由于DNA或RNA典型存在的复杂系统，获得含有对于分子生物学应用而言足够少的污染物的DNA或RNA相当困难。这些系统例如生物样品，如组织，来自体液例如血液的细胞，培养的细胞或人工系统例如琼脂糖凝胶或PCR反应样品，通常包含相当数量的污染物，在用于分子生物学过程之前，感兴趣的DNA或RNA必须与其分离。

从细胞获得DNA或RNA的常规方案利用将细胞悬浮在溶液中，用酶和/或化学物质裂解细胞，然后将细胞中所含的核酸释放入得到的裂解物溶液。为了分离RNA，常规的用于释放DNA的裂解和溶解过程包括额外的抑制核糖核酸酶和将污染物(包括DNA)与RNA分离的额外手段。

二氧化硅材料包括玻璃颗粒，例如玻璃粉末、二氧化硅颗粒和研磨玻璃纤维滤纸制备的玻璃微纤维以及硅藻土在本领域中与例如离液盐的水性溶液组合使用，以将DNA与其他物质分离，并使DNA适合用于分子生物学过程。

玻璃颗粒、二氧化硅颗粒、硅胶及以上的混合物已被配制成各种不同形式，以制备能可逆结合核酸材料的基质，核酸材料在结合诱导剂，例如离液剂等存在下当与含有所述材料的介质接触时吸附在表面。这些基质设计成在基质接触外力，例如离心力或真空过滤时仍然维持核酸材料的吸附，从而将基质和其上吸附的核酸材料与剩余的介质组分分开。然后通常通过使基质接触洗脱溶液(例如水或洗脱缓冲液)从基质上洗脱核酸物质。许多商业来源提供基于二氧化硅的基质，其设计用于离心和/或过滤分离系统(例如来自QIAGEN(恰根，希尔登(Hilden)，德国)的核酸分离系统的和/>系列)。

已开发了磁力响应性颗粒(本文称作“磁性颗粒”)及其使用方法，用于分离核酸物质。文献中描述了设计用于核酸分离的几类不同的磁性颗粒，可购自商业来源。这些磁性颗粒通常归为两类，设计以可逆地直接结合核酸物质的，以及设计以间接(即通过至少一种中间物质)结合核酸物质的。本文将中间物质称为“标记物”。例如，一种常用的标记物是生物素化寡核苷酸脱氧胸腺嘧啶(oligo-dT)，与mRNA分子的聚腺苷尾在介质内形成氢键。

直接结合核酸的磁性颗粒通常基于二氧化硅，例如涂有磁力响应性硅氧化物的颗粒(也称作磁珠，例如以商标从恰根,希尔登,德国购得的那些；或以商标从普洛麦格(Promega)，麦迪逊(Madison)，美国购得的那些)。在结合诱导剂(例如离液盐，如盐酸胍或异氰酸胍)单独或组合结合添加剂(例如醇，如乙醇等)存在下核酸附着于这些颗粒。在颗粒分离后，如需要可将颗粒温育在水或具有低离子强度的缓冲液中轻易从颗粒洗脱吸附的核酸。

本领域已知数种不同的自动化分离磁性颗粒的方法。一种方法是将磁性或可磁化装置(例如杆)插入含有磁性颗粒的介质中，使磁性颗粒与磁性或可磁化装置结合，和除去磁性或可磁化装置。另外的方法是将磁性或可磁化装置置于盛有介质和磁性颗粒的容器之空间邻近处。磁性颗粒与容器壁结合，可除去介质而无需转移磁性颗粒。

WO01/71732 A2公开了一种制备基于二氧化硅和氧化铁的磁性颗粒的方法，及其在分离生物分子中的用途。感兴趣的分子例如核酸(如DNA和/或RNA)吸附于磁性颗粒，通常随后从溶液中分离磁性颗粒，洗涤和洗脱分子。核酸与磁性颗粒的结合优选在含有高浓度离液盐和/或低分子量醇(例如异丙醇或乙醇)的水性溶液中进行。从磁性颗粒中洗脱核酸优选用低盐缓冲液进行。在该过程中，通常需要以相对纯的形式获得所需的分子，例如核酸。因此，需要尽可能除去来自起始溶液的离液盐。为此通常用一种或多种缓冲液进行洗涤步骤，其优选具有比起始溶液低的盐浓度。为了在多重洗涤步骤中维持结合条件，通常缓冲液含有较高水平的乙醇，例如70％(w/w)的乙醇。在最终洗涤步骤中，可使用纯乙醇。最终洗涤步骤后，通常含有磁珠及与其结合的分子的样品置于室温干燥，从而通过蒸发除去乙醇。然而，由于起始物质中的高盐浓度，以及通常洗涤缓冲液含有盐，用该方法获得的核酸仍可能含有残余的盐。另外，通过干燥除去乙醇通常较费时。在标准过程中，蒸发通常不完全干燥样品，并从其完全除去乙醇。其他洗涤步骤和广泛干燥可进一步增加纯度，但这样的过程可能会更加耗时，而且对于常规使用也不再便利。

WO03/091452 A1公开了一种从具有磁性颗粒的生物材料分离核酸的方法。为了预防磁性颗粒形成聚集物，使用包含低级醇的特殊洗涤溶液。另外，洗涤溶液可包含较高量的离液盐。因此，问题仍然是最终核酸产物可能含有不需要的盐或醇杂质。

WO2005/021748A1公开了另一种从含有磁性颗粒的水性溶液分离生物聚合物的方法。生物聚合物与来自包含盐和乙醇的水性溶液的磁性颗粒结合，然后洗涤并洗脱。为了改善磁性颗粒的处理，加入添加剂例如聚乙二醇。用含有相对较高量的离液盐和乙醇的洗涤溶液进行洗涤步骤，然后干燥除去乙醇。

用磁性颗粒从不同来源分离不同大小的核酸的商业试剂盒例如以商标购自恰根,希尔登,德国。用于例如/>HMW DNA试剂盒的基本方案与上述的类似，包括步骤：在离液盐和乙醇存在下结合来自水性溶液的DNA，然后是洗涤步骤，最后洗脱DNA。在较高盐浓度和乙醇的存在下进行标准洗涤步骤。然而，为了从DNA产物中除去可能影响随后的下游处理的盐和乙醇杂质，包括了最终洗涤步骤，其中当通过磁力固定于样品管壁的结合有DNA的磁性颗粒沉淀物仅是简单用水漂洗。因此当处理时，水最多仅接触附着于样品管壁的沉淀表面。根据手册，重要的是不直接在颗粒上加水，而是小心将其滴入与结合DNA的磁性颗粒沉淀相对的一侧的样品管上。另外，所有滴定步骤都应小心进行，以避免干扰固定的磁性颗粒沉淀。这些预防措施被认为是必须的，因为漂洗步骤实际上是在非结合条件下进行的，在该条件下通常从颗粒上洗脱下核酸。因此，预期密集洗涤会导致核酸损失。因此，在同一方案中，注意到可用纯水作为洗脱缓冲液。然而，由于磁性颗粒沉淀是通过磁力固定在管壁上的，其在这样相对浅表的洗涤过程中并不解聚，且因为该水洗仅仅施加很短的时间，一部分盐和/或乙醇可能仍然滞留在磁性颗粒沉淀中，因此无法除去。因此，需要进一步改善最终纯化分离的纯化形式或溶解形式的核酸的纯度。

US2009/0191566A1公开了一种从水性溶液用磁性颗粒通过亲和结合分离生物聚合物的方法。用第一和第二功能性基团修饰磁珠。特别是功能基团是亲和配体，例如寡dt或链霉亲和素，其与靶分子例如mRNA或生物素标记的DNA特异性结合。如本领域常规实践，洗涤缓冲液必须具有“足够高的盐浓度”，使得“不从固相载体上洗脱核酸，而是与微颗粒保持结合”。因此，通常必须在随后的纯化步骤中除去盐，从而避免下游应用中的损害。

Hawkins等，Nucl.Acids Res.1994，卷21，Nr.21,4543-4544公开了一种用羧基涂覆的磁珠纯化DNA的方法。该文献公开了使用相对较低盐浓度的最终洗涤步骤。然而，所述最终洗涤步骤中实际盐浓度仍然较高，因为先前洗涤步骤的剩余物中有相当高的5M NaCl的盐浓度。总的说，该方法无效，因为洗涤步骤将产率减到了约80％。因此，该方法不适合定量核酸分离。

WO2004/090132 A2公开了一种用固相载体分离基因组核酸的方法，该固相载体包含用于结合核酸的官能团。特别是，使用羧基修饰的磁珠。公开的洗涤缓冲液的性质基本上与上文US2009/0191566 A1公开的相同。另外，洗涤缓冲液应当具有足够高的盐浓度，因此核酸仍然与微粒结合，所以通常必须在随后纯化步骤中除去盐。

WO99/58664描述了类似的用羧基涂覆的磁珠分离核酸的方法。合适的缓冲液应当具有如上面US2009/0191566A1或WO2004/090132所述的性质和较高的盐浓度，以确保核酸保持与微颗粒结合。

总体上，现有技术中仍然持续有对用磁性颗粒分离核酸的简单高效方法的需求，其中在最终分离的核酸，特别是DNA中杂质水平低。

本发明所克服的问题

本发明的技术问题是提供一种从样品溶液分离核酸的方法，其克服了上述缺陷。特别是，本发明的问题是提供一种分离核酸的改进方法，其中最终分离的核酸具有高纯度，不论其是纯的形式或溶解形式。当没有以纯的形式而是以分离产物获得时，核酸应当基本包含，优选甚至由洗脱缓冲液和所需核酸组成。杂质例如盐和有机溶剂(如醇，例如乙醇等)的水平应当要低。

本发明的另一个问题是提供分离高纯度核酸的简单方法。该过程应包括仅数个加工步骤，其应当较简单和方便地进行。因此，该方法应能用于常规的标准实验室实践和自动化形式，即用机器人和工作站。该方法应可用标准实验室材料和装置实现。

发明内容

令人惊讶的是，发现本发明的问题可用权利要求的方法克服。本发明的其他实施方式在本说明书中示出。

本发明的主题是一种从样品溶液分离核酸的方法，其中从样品溶液分离核酸是通过吸附到磁性颗粒，然后通过施加磁场从样品溶液中分离具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒，接着进行至少一个洗涤步骤(w)，包括：

(w1)将具有吸附其上的核酸的磁性颗粒悬浮于洗涤溶液中，其是水性溶液，其具有小于100mM的总盐浓度且不含有机溶剂，

(w2)在洗涤溶液中孵育具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒，和

(w3)从洗涤溶液分离具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒。

本发明方法尤其针对分离核酸。本文所用的“分离核酸”指任何从目标核酸除去污染物和杂质和/或核酸浓度被提高的方法。

本文所用的术语“核酸”特别指包含核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸的聚合物，通常通过亚基之间的磷酸二酯键共价键合，但在一些情况下也通过磷酸硫酯、甲基磷酸酯等共价键合。核酸包括但不限于所有类型的DNA和/或RNA，例如gDNA；质粒DNA,环状DNA；循环DNA；hnRNA；mRNA；非编码RNA(ncRNA),包括但不限于rRNA,tRNA,lncRNA(长非编码RNA),lincRNA(长基因间非编码RNA),miRNA(微小RNA),siRNA(小干扰RNA),snoRNA(小核仁RNA),snRNA(小核RNA)以及stRNA(小时序RNA),piRNA(piwi-相互作用RNA),tiRNA(转录起始RNA),PASR(启动子相关RNA),CUT(隐藏不稳定转录物),胞外或循环RNA；片段化核酸；从亚细胞器官例如线粒体或叶绿体获得的核酸；以及从可能存在于生物样品内的微生物、寄生虫或DNA或RNA病毒获得的核酸。可包含或不包含加入或“掺入”生物样品的核苷酸类似物的合成核酸序列也在本发明的范围内。小RNA或术语小RNA物质特别指长度小于500nt的RNA。根据一个实施方式，核酸是DNA。

样品可包含超过一种类型的核酸。根据想要的用途，可有利地从一个样品分离所有类型的核酸((例如DNA和RNA)或仅某些类型的核酸(例如仅RNA而无DNA，反之亦然，或假设应分别分离DNA和RNA)。所有这些变化形式都在本发明的范围内。在现有技术中，分离DNA或RNA，或平行分离两种类型的核酸的合适方法都是已知的。

本文所用的术语“样品”是广义的，指包括各种含有核酸的来源。样品可以是生物样品，但该术语也包括其他的，例如包含核酸的人工样品。示范性样品包括但不限于一般的体液，全血；血清；血浆；红细胞；白细胞；血沉棕黄层；拭样，包括但不口腔拭样、喉部拭样、阴道拭样、尿道拭样、宫颈拭样、喉部拭样、直肠拭样、病灶拭样、脓肿拭样、鼻咽拭样等；尿液；痰液；唾液；精液；淋巴液；液体(liquor)；羊水；脑脊液；腹腔积液；肺积液；囊肿液；滑液；玻璃体液；房水；囊内液；眼睛洗液；眼睛吸出液；血浆；血清；肺灌注液；肺吸出液；和组织，包括但不限于肝脏、脾脏、肾脏、肺、肠、大脑、心脏、肌肉、胰脏、细胞培养物以及裂解物、抽提物，或获自可能存在于样品上或内的任何细胞和微生物以及病毒的物质等。临床或法医机构获得的含有核酸的物质也在术语样品所指的范围内。另外，本领域技术人员应理解裂解物、提取物或从任何上述示范性样品获得的物质或其部分也在术语样品的范围内。优选样品是衍生自人、动物、植物、细菌或真菌的生物样品。特别是术语“样品”指还含有蛋白质的含核酸的样品。优选样品选自细胞、组织、细菌、病毒和体液，例如血液，血液制品如血沉棕黄层、血浆和血清，尿液，液体，痰液、粪便、CSF和精液，表皮拭样，生物活检样品，骨髓样品和组织样品，优选器官组织样品如肺和肝。优选样品选自全血和血液制品，例如血沉棕黄层、血清或血浆。

核酸还可以是人工合成的核酸，例如来自PCR反应。用于该方法的样品溶液可从生物材料，例如通过细胞或组织裂解或级分和/或预处理体液直接获得。另外，可从核酸处理方法获得样品溶液，这些方法可以是纯化、合成或修饰方法，例如PCR，或从琼脂糖凝胶纯化获得。

在一个优选实施方式中，本发明方法分离的核酸以纯净形式或基本纯的形式获得，或可以是溶解的。优选在纯核酸或溶解的核酸产品中仅包含不可避免的杂质。优选地，分离的核酸的纯度至少是90％，更优选至少90％，和最优选高于99％或99.5％(重量)，以纯核酸或基于所有溶解核酸产品中的固体(除去来自洗脱液的固体添加剂)计。

在本发明方法中，优选通过与磁性颗粒结合从样品溶液中分离核酸。因此，核酸必须能接触磁性颗粒以结合。在一个优选实施方式中，样品溶液是水性溶液，其中通常溶解或悬浮核酸。在先前的起始物质不包含直接能结合的核酸时，优选进行预处理步骤，例如裂解和/或破坏生物物质，例如细胞或组织。

通过与磁珠的吸附从溶液中分离出核酸。在本发明的方法中，核酸与磁性颗粒的结合预期主要是吸附性的。在这种情况中，结合通常是非共价的和可逆的。吸附是核酸分子附着于磁珠表面。在结合步骤中，优选调节条件，使得核酸与磁性颗粒结合，通常通过加入一种或多种离液盐、非离液盐和/或低分子量醇(“结合条件”)。

在本发明的方法中，本发明方法步骤(w)中核酸和磁性颗粒间的结合力优选仅基于吸附。优选其不基于其他结合机制，例如亲和层析或离子交换层析。亲和层析需要两种特定分子(例如抗原和抗体、酶和底物、或受体和配体)根据锁匙原理的高度特异性的相互作用。离子交换层析基于目标分子与基质表面上带电配体之间的特定相互作用。更优选的，方法不是基于核酸与磁性颗粒上结合的羧基之间的特定相互作用。

在一个优选实施方式中，磁性颗粒不被配体，尤其是有机配体修饰。优选的，在颗粒表面没有附着配体。因此，优选颗粒不被亲和配体例如链霉亲和素或聚-dT修饰。另外，优选颗粒不被离子交换配体例如阳离子交换配体修饰。更优选的，其不被羧基修饰和/或在表面上不包含羧基。

在另一个实施方式中，磁性颗粒是双功能的。这意味着它们能吸附核酸，作为第一官能性，但还具有第二官能性。例如，可用亲和配体修饰吸附颗粒，而第二官能性应当是亲和结合。第二官能性可用于在与(w)期间不同的结合步骤中将基质结合到颗粒。

从样品溶液中分离在其上结合有核酸的磁性颗粒是通过施加磁场实现的。通常，磁场施加在样品管外部，从而使得磁性颗粒附着于特定区域，并在其中聚集，例如在样品管一侧。另外，可在样品管中插入磁性装置，或将其置于样品管附近，从而附着磁性颗粒。例如，装置可以是磁性棒。优选在结合步骤中，磁性颗粒以沉淀或簇状聚集。在其上结合有核酸的磁性颗粒聚集后，从样品溶液中分离它们，从而除去样品溶液。

本发明的方法包括至少一个洗涤步骤(w)，其包括至少上述子步骤(w1)、(w2)和(w3)，其以连续形式进行。优选步骤(w)由子步骤(w1)到(w3)组成。

在子步骤(w1)中，其上结合有核酸的磁性颗粒悬浮在洗涤溶液中。在该步骤中，其上结合有核酸的磁性颗粒通常从由磁场固定它们的预定区域脱离。优选除非颗粒转移到另一个试管中，通过磁场固定磁性颗粒从而使其与试管中的液体混合物维持接触。正常情况下，在步骤(w1)之前或期间灭活磁场，从而使得磁性颗粒能容易悬浮在洗涤溶液中。例如，磁性颗粒可通过磁场附着于样品管壁，或附着于试管内的磁性装置，然后关掉、除去或重定位磁场，则磁性颗粒悬浮在洗涤溶液中。优选单个磁性颗粒分散在溶液中，因此任何簇或沉淀都至少部分，优选全部分散。这由温和运动支持。

在一个优选实施方式中，通过优选在垂直方向(即或多或少与试管轴相同的方向)温和搅拌，在步骤(w1)中将磁性颗粒悬浮于洗涤溶液中。在一个高度优选的实施方式中，磁性颗粒被吸引于磁铁，该磁铁相对于试管底部呈垂直方向，并通过关掉、除去或重定位磁铁，在步骤(w1)中掉落到试管内的洗涤溶液中。发现这样的温和搅拌(在该优选实施方式中可通过颗粒运动通过洗涤溶液至试管底部(通过例如重力或还有特定的施加于垂直位置下方的轻磁力)诱导)可支持污染物从磁珠释放。然而，应选择施加的搅拌，使得核酸不会从磁性颗粒显著释放。温和运动可以是例如通过浸入试管中的液体并上下移动的装置实现的，例如磁性棒或例如BioControl提供的还适合通过一旦关闭、除去或重定位磁性装置后，从试管壁或从浸入试管液体的任何类型的磁性装置上用洗涤溶液小心漂洗磁性颗粒来使它们悬浮。应当避免剧烈搅拌，即特别是机械手段例如任何振荡装置引起的。

因此优选的是其上结合有核酸的磁性颗粒不经受机械力。在一个具体优选实施方式后中，其上结合有核酸的磁性颗粒并不经受振荡和/或水平施加的机械力。使用振荡和/或水平机械力的装置的例子是通常已知的实验室涡旋机或实验室摇床。手动振荡通常也是这样的力的例子。然而，还是可以施加垂直方向的温和机械力，例如重力。这可通过使磁珠在一个延伸位置附着于试管壁或浸入试管内液体的磁性装置，然后关闭、除去或重新定位磁性装置实现。由于重力，磁性颗粒沉到试管底部，由于试管内液体粘度而减速。此外，优选使用垂直施加，例如与试管轴具有或多或少相同方向的磁力。然而，应选择磁场，使洗涤溶液中引起的运动不会显著从磁性颗粒上释放核酸。这可通过将磁性装置置于试管外部例如其底部上或底部下方实现。

以相同方法，其上结合有核酸的磁性颗粒优选悬浮在洗涤溶液中，而不施加机械力。在一个具体优选实施方式中，其上结合有核酸的磁性颗粒悬浮在洗涤溶液中，而不施加利用振荡和/或水平施加的机械力。然而，当磁性颗粒悬浮于洗涤溶液中时，可垂直施加温和机械力，如重力。此外，优选使用垂直施加，例如与试管轴具有或多或少相同方向的磁力。

因此，进一步通过这样的温和搅拌可提高分离核酸的纯度。另外，优选在孵育步骤(w2)中没有搅拌，例如搅动或振摇。

在优选实施方式中，在该洗涤步骤(w)中其上结合有核酸的磁性颗粒不经受机械力，尤其是强机械力(例如超过温和搅动)。发现机械力，特别是强机械力可能促进核酸从磁性颗粒上释放。特别是，洗涤步骤(w)中不应搅拌或振摇样品，尤其是机械搅拌或振摇。

步骤(w1)中使用的洗涤溶液是水性溶液。特征是盐浓度低于100mM且不存在有机溶剂。因此，洗涤溶液与在使用磁性颗粒的过程中常用的洗涤溶液不同。根据本发明使用的洗涤溶液是独特的，因为实际上使用的条件是通常认为“非结合”的条件。因此，现有技术中总是用在“结合条件”下的洗涤溶液进行洗涤步骤，其用例如具有1M或以上的高盐浓度调整。根据现有技术，盐通常是离液盐。此外，现有技术中使用的典型洗涤条件包含大量有机溶剂，尤其是乙醇或异丙醇。通过加入高浓度的一种或多种盐和/或有机溶剂，应确保现有技术过程中核酸不会从磁性颗粒脱离从而损失。

如上所述，例如在HMW DNA试剂盒相关的方案中，进行最终洗涤步骤，其中用纯水漂洗其上结合有核酸的磁性颗粒。然而，当磁性颗粒以沉淀形式附着在样品管壁上时，漂洗只能非常简单的进行。当在试管的不同位置加水时，必须小心使沉淀不至于破碎或被机械干扰。当这样处理时，漂洗的水并不进入磁性颗粒沉淀内部，因此在沉淀内仍然基本存在高盐和乙醇环境。本发明的方法截然不同，因为其上结合有核酸的磁性颗粒被悬浮在低盐洗涤溶液中。在现有技术中，假设这样的处理不能用于洗涤，因为它会将核酸从颗粒上洗脱下来。令人惊讶的是，本发明发现洗涤可以在这样的“非结合”条件下在悬液中进行，产物纯度大大增加，而且不会有显著的核酸损失。这是非常有利的，因为可有效从目标核酸除去盐、乙醇和/或其他污染物，而不会显著减少核酸产量。不受理论所限，假设形成中间状态，其中磁性颗粒和核酸分子之间的力暂时防止了核酸分子从颗粒上释放。相反，在平衡状态下(在本发明方法中并不实现)，可能会造成显著的核酸损失。本发明的方法也是高度有利的，因为虽然可能，但不再必需干燥步骤来蒸发有机溶剂，例如乙醇。本发明的方法因此可以大大节约时间，因为除去有机溶剂的干燥步骤如果彻底进行，将非常耗时。

如上所述，洗涤溶液的总盐浓度优选低于100mM。这样的浓度一般对于核酸通过吸附稳定结合于磁性颗粒是不够的。相反，低盐浓度通常会使得磁性颗粒表面和聚阴离子核酸之间的非共价相互作用不稳定。在一个优选实施方式中，洗涤溶液具有低于50mM，优选低于25mM或低于10mM的总盐浓度。在另一个优选实施方式中，洗涤溶液不含任何盐。这意味着在洗涤溶液中不加入盐。因此，仅可能包含不可避免的盐杂质，例如已经掺入磁性颗粒/核酸复合物内的那些。优选洗涤溶液是水，更优选蒸馏水。总的说，在洗涤步骤(w)中稳定磁性颗粒/核酸复合物并不需要在洗涤溶液中加入达100mM的浓度的盐。然而，在最终产物中可能需要很少量的盐，例如作为缓冲物质以稳定产物，或用于其他用途。因此，该盐可能是缓冲物质例如TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)。洗涤溶液的pH可能是7-10之间，尤其是7.5-9之间。

在一个优选实施方式中，步骤(w1)中的样品(悬液)液相条件在加入洗涤溶液后实质上与步骤(w1)中所用的洗涤溶液相同，至少在盐浓度和不含有机溶剂上。因此，优选在步骤(w1)中加入洗涤溶液之前，样品不含有显著量的残余盐或有机溶剂，其可能显著提高液相中的盐浓度或有机溶剂水平。因此，优选步骤(w1)的悬液液相中总盐浓度在加入洗涤溶液后低于100mM，优选低于25mM或低于10mM。另外，优选悬液不包含有机溶剂，除了不可避免的杂质，例如低于2wt％。在优选实施方式中，在紧接步骤(w)的前一方法步骤(或如果重复步骤(w)，在最后一个(w)步骤之前)中的溶液盐浓度不超过2M，优选不超过1M。

如需要，洗涤溶液可包含除了盐和有机溶剂以外的添加剂，例如稳定核酸的化合物，例如蛋白酶或螯合剂如EDTA。在优选实施方式中，洗涤溶液由水和可任选的浓度低于100mM的盐，以及可任选的这样的添加剂组成。

洗涤步骤(w)中的洗涤溶液优选不含有有机溶剂。因此，在优选实施方式中，不包含具有1-5个碳原子的低分子量醇，例如乙醇或异丙醇。因此，洗涤溶液与包含乙醇或异丙醇的过程中所使用的典型常规洗涤溶液不同。在具体实施方式中，洗涤溶液完全不含有机化合物。优选洗涤溶液不含去污剂。

高度优选的是洗涤步骤(w)是本发明方法的最终洗涤步骤。在一个具体优选实施方式中，洗涤步骤(w)后直接是最终从磁性颗粒洗脱核酸的步骤。一般优选步骤(w)中使用的洗涤溶液与洗脱溶液相同。然而，还可能在洗涤步骤(w)后不在一个单独的洗脱步骤中，而是在随后的下游过程中从磁性颗粒释放核酸。

在一个本发明的优选实施方式中，洗涤步骤(w)，即子步骤(w1)到(w3)的组合在5分钟或更短，优选2分钟或更短下进行。这意味着其应在所限定的时间范围内进行。换言之，其上吸附有核酸的磁性颗粒与洗涤溶液接触的时间应在所限定的时间范围内。

在子步骤(w2)中，其上结合有核酸的磁性颗粒孵育在洗涤溶液中。调节孵育时间以尽可能除去污染物，同时避免核酸显著损失。孵育时间越短，产物内可能剩余的污染物越多。因此，优选步骤(w2)中的孵育时间和/或步骤(w)的总体时间(由孵育时间大致决定)是至少3、至少5、至少10、至少20或至少30秒，或至少1分钟。孵育时间越长，核酸损失的风险越大。核酸越短也越可能如此。因此，优选孵育时间和/或步骤(w)的时间是20分钟或更短，10分钟或更短，5分钟或更短，2分钟或更短，1分钟或更短，30秒或更短，20秒或更短，10秒或更短，优选5秒。例如，时间可以是3秒到20分钟，优选5秒到10分钟，10秒到5分钟，20秒到2分钟或30秒到1分钟。在这样的时间跨度内，可实现相对良好的污染物高度损失和核酸高产量之间的平衡。

在子步骤(w3)中，其上结合有核酸的磁性颗粒与洗涤溶液分离。优选通过施加磁场从洗涤溶液中分离在其上结合有核酸的磁性颗粒。优选从溶液除去磁性颗粒的手段在整个过程中相同。

在本发明的方法中，不特别限制要分离的核酸。DNA可以是基因组DNA(gDNA)，质粒DNA(pDNA)，任何长度的DNA片段，例如限制性酶消化产生的，扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)或基于核酸序列的扩增(NASBA)产生的任何长度的扩增DNA，在生物技术化合物例如生物药物等的生产过程中获得的生物加工样品所得的DNA，其中DNA可以是双链或单链。本发明中所用的术语RNA包括但不限于总RNA、mRNA、rRNA或tRNA。其他合适的核酸如上所述。

根据本发明，对于所有链长度的核酸可能高效除去污染物，例如非目标分子、盐和有机溶剂。例如，DNA可以具有10bp到100kbp,优选500bp到50kbp,或1kbp到20kbp的链长度，RNA可具有碱基或核苷酸对应的链长度。

在本发明的优选实施方式中，核酸具有2kbp或以上，优选5hbp或以上，或更优选10kbp或以上或对应数量的碱基或核苷酸的链长度。在优选实施方式中，核酸可以是基因组DNA或质粒DNA。当核酸的链长度接近10kbp或以上，更优选20kbp或以上，或最优选50kbp或以上时，洗涤步骤中的核酸损失可忽略不计。洗涤步骤(w)则可进行相对长的总体时间，范围以分钟计，例如达10分钟。然而出于便利起见，可优选如上所述更短的总体洗涤时间。

可观察到核酸产量有所下降，特别是对于链长较短的DNA。然而，减少洗涤步骤(w)的时间和/或步骤(w2)中的孵育时间，例如至2分钟或以下，1分钟或以下，30秒或以下，20秒或以下，10秒或以下，5秒或以下或3秒可避免核酸损失。总体上，DNA越短，洗涤步骤(w)的时间应越短。在这些情况下本发明方法的核酸损失数量级可能与现有技术的漂洗过程相似，但其额外的优点是除去更多污染物，导致核酸纯度比现有技术的更高。

在本发明的优选实施方式中，核酸的链长度是30kbp或更短，20kbp或更短，或10kbp或更短，或对应的碱基或核苷酸数量，其中洗涤步骤(w)进行2分钟或更短，1分钟或更短，30秒或更短，20秒或更短，10秒或更短，或优选5秒。优选核酸是DNA。在其他优选实施方式中，核酸的链长度是5kbp或更短，或3kbp或更短，2kbp或更短，1kbp或更短，更优选至少500bp，或对应的碱基或核苷酸数量，其中洗涤步骤进行1分钟或更短，或30秒或更短，20秒或更短，10秒或更短，5秒或更短或3秒。优选核酸是DNA。

洗涤步骤(w)可按需经常重复，例如可重复一次，两次，三次或甚至更频繁。然而，发现在仅一次洗涤步骤的简单过程中也可能非常高效地除去杂质。因此，高度优选仅进行洗涤步骤(w)一次。

在优选实施方式中，洗涤步骤(w)在30℃或以下进行，优选在0℃和30℃之间。如果洗涤步骤(w)中的温度太高，核酸会从磁性颗粒上释放并损失。在优选实施方式中，其在室温下，例如约15℃到25℃之间进行。然而还可以冷却样品到例如15℃或以下，最优选5℃或以下。

在优选实施方式中，方法包括额外洗涤步骤，其与洗涤步骤(w)不同。优选这样的额外洗涤步骤在洗涤步骤(w)之前进行。这样的额外洗涤步骤可用如现有技术所述的含有乙醇的常规洗涤缓冲液或溶液进行。用这样的额外洗涤步骤可实现预纯化，从而耗竭盐、醇和/或其他污染物水平。在一个高度优选实施方式中，洗涤步骤(w)是在任选洗脱步骤前最后的洗涤步骤。

在优选实施方式中，洗涤步骤(w)之前吸附有核酸的磁性颗粒进行至少一个预洗涤步骤(p)，其中洗涤溶液调整为核酸结合条件。这意味着在预洗涤步骤(p)中，盐浓度相对高和/或包含有机溶剂。这种结合条件下的洗涤步骤常用于已知方法以从样品溶液除去污染物。在本发明的方法中，还有利的是包括这样的预洗涤步骤(p)以从样品溶液除去污染物，例如蛋白质或其他细胞成分，或不需要的低分子量化合物。

在本发明的一个优选实施方式中，洗涤步骤(w)前在至少一个预洗涤步骤(p)中用洗涤溶液洗涤其上吸附有核酸的磁性颗粒，洗涤溶液是含有高于500mM的总盐浓度和/或包含有机溶剂的水性溶液。更具体地，在预洗涤步骤(p)中，预洗涤步骤(p)洗涤溶液的总盐浓度可以是高于1M或甚至高于2M。在预洗涤步骤(p)中，有机溶剂优选是乙醇或异丙醇。特别是在预洗涤步骤(p)中，洗涤溶液可包含浓度为至少10％、或至少50％重量的低级醇，例如乙醇或异丙醇，或纯酒精。

在本发明的一个实施方式中，进行额外洗涤步骤(p)，其中当用磁场固定结合核酸的磁性颗粒时，用水或用洗涤步骤(w)中所用的低盐缓冲液漂洗磁性颗粒，从而使核酸维持与颗粒结合。然而，由于洗涤步骤(w)比漂洗步骤更高效，优选不包括这样的漂洗步骤。

在本发明的一个优选实施方式中，洗涤步骤(w)后用洗脱溶液从磁性颗粒洗脱核酸。优选，如需要洗脱，在洗涤步骤(w)之后直接进行洗脱步骤。换言之，洗涤步骤(w)之后不进行其他中间处理步骤，尤其是洗涤步骤。洗脱溶液优选是纯水，通常是蒸馏水，或具有低盐浓度的洗脱缓冲液。通常洗脱缓冲液的盐浓度是25mM或以下，其中盐通常是缓冲盐，例如10mM TRIS。洗脱溶液和/或缓冲液的pH可能是7-10之间，尤其是7.5-9之间。洗脱后，核酸优选维持在得到的洗脱溶液内，而通过外力例如离心或磁场从洗脱溶液除去磁性颗粒。然而，也适合通过在随后的下游处理中所用条件下洗脱核酸，而不经过在下游处理步骤前的单独洗脱步骤。

洗涤步骤(w)后，可用洗脱溶液从磁珠洗脱目标核酸。该洗脱步骤可明显与洗涤步骤(w)不同，虽然洗脱溶液可以与洗涤步骤(w)中所用的洗涤溶液相同。在洗涤步骤(w)中，核酸基本应仍然维持与磁性颗粒结合，而在洗脱步骤中调节条件使得核酸能被洗脱。

优选洗脱是通过机械力，延长孵育时间和/或提高温度。在一个优选实施方式中，加入机械力促进核酸从磁性颗粒洗脱。优选通过密集搅拌或振荡，尤其是以高速例如涡旋加速洗脱。洗脱可通过其上吸附有核酸的磁性颗粒在洗脱液中孵育延长的时间段，例如5分钟以上，10分钟以上或60分钟以上。提高温度可促使核酸从磁性颗粒上释放。因此，洗脱可在20℃或以上，例如室温或30℃以上进行。

本文所用的术语“磁性颗粒”包括磁力响应颗粒，其能根据本发明可逆结合核酸，例如通过离子作用等。这类颗粒为本领域技术人员已知。本文所用的术语“磁性”包括磁性材料，例如铁磁性，亚铁磁性，顺磁性或超顺磁性材料。这些磁性材料是上述磁性颗粒的部分，可以任何合适方法掺入颗粒中。

在本发明的一个优选实施方式中，磁性颗粒包含二氧化硅。二氧化硅可以是硅胶、硅氧化物(siliceous oxide)，固态二氧化硅例如玻璃或硅藻土，或以上两种或更多种的混合物形式。二氧化硅可以至少部分存在于珠表面上。为了高效结合，优选二氧化硅存在于颗粒整个表面上。

磁性颗粒可以是二氧化硅涂覆的磁性颗粒。术语“二氧化硅涂覆的磁性颗粒”指涂覆有二氧化硅的磁性颗粒。这些颗粒是本领域技术人员已知的。任何类型的二氧化硅涂覆的磁性颗粒原则上适用于本发明的方法。然而，优选磁性颗粒不是阴离子交换颗粒。

硅胶优选是层析级硅胶，其可从许多不同来源商购。硅胶通常通过酸化含有硅酸盐如硅酸钠的溶液至pH小于10或11，然后将酸化溶液加到胶上来制备(例如Kurt-Othmer化学技术百科全书中的二氧化硅制备讨论,第6卷，第4版，Mary Howe-Grant,编,John Wiley&Sons,pub.,1993,第773-775页)。

玻璃颗粒是优选的结晶二氧化硅(例如α-石英、无定形二氧化硅)颗粒，即使结晶二氧化硅不像玻璃，因为其不是非晶相的，或是主要由二氧化硅制得的玻璃颗粒。玻璃颗粒也是本领域技术人员熟知的。

硅氧化物涂覆的磁性颗粒是用于本发明的二氧化硅磁性颗粒的最优选形式。硅氧化物涂覆的磁性颗粒由硅氧化物涂覆在核心上组成，核心包含至少一种亚铁磁性、铁磁性、超顺磁性或顺磁性材料的颗粒。本发明所用的硅氧化物涂覆的磁性颗粒还具有含水硅氧化物的吸附表面。目标核酸例如DNA或RNA吸附到颗粒的吸附表面，而其他来自核酸来源的物质，特别是有害的污染物例如核酸酶等不吸附于硅氧化物涂覆的磁性颗粒，或与核酸一起从所述颗粒上共同洗脱出来。硅氧化物涂覆的磁性颗粒是本领域技术人员已知的，且可商购(例如磁性颗粒，恰根,希尔登,德国)。

磁性颗粒能与核酸在水性溶液中通过可逆结合核酸(例如通过离子相互作用等)形成复合物。本发明可用任何能与核酸形成复合物的二氧化硅涂覆的磁性颗粒进行。甚至更优选的，本发明的方法用任何形式的硅质氧化物涂覆的磁性颗粒，例如磁珠(恰根,希尔登,德国)进行。本发明的方法中所用的二氧化硅涂覆的磁性颗粒可以是多种不同尺寸的颗粒中的任一种。较小的二氧化硅磁性颗粒提供更大表面积/重量单位用于吸附，但较小的颗粒相较于较大的颗粒掺入的磁性材料量有限。

本文所用的术语“盐”优选指离液盐和非离液盐。典型的，预洗涤步骤(p)的样品溶液和/或洗涤缓冲液包含离液盐和/或非离液盐。发现这样的盐能更高效的在本发明的方法中通过洗涤步骤(w)去除。

在优选实施方式中，离液盐是根据'Hoffmeister-Reihe'的离液离子盐。这样的盐高度溶于水性溶液。这些盐提供的离液离子在蛋白质或核酸的水性溶液中以足够高的浓度导致蛋白质去折叠，核酸丧失二级结构，或双链核酸解链(即链分离)。假设离液离子显示这些效应是由于其破坏水性溶液中存在的氢键网络，从而形成变性的蛋白质和变性的核酸，其比正确折叠的或结构化的对应形式热动力学上更加稳定。样品溶液中的离液盐可选自异氰酸胍、硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、氯化锂、过氯酸钠、三氯乙酸钠或其混合物。在本发明的一个优选实施方式中，样品溶液中的非离液盐选自氯化钠、氯化钾、氯化铵、氯化钙、氯化镁或其混合物。

本发明样品溶液中的盐浓度优选为0.5M-10M。对于任何本发明所用的盐，理想的是盐的浓度在任何使用盐进行本发明方法的溶液中在任何进行本发明的方法的溶液的所有条件下都维持在溶液中盐的溶解度以下。混合物中盐浓度必需足够高以导致生物聚合物吸附于混合物中的二氧化硅磁性颗粒，但不至于高到基本变性或降解核酸，或导致核酸从水性溶液沉淀出来。蛋白质和双链DNA的大分子，例如染色体DNA，通常在离液盐浓度为0.5M-2M下稳定，但已知会从高于约2M的离液盐浓度的溶液沉淀出来(例如US5,346,992，第2栏，56-63行)。相反，RNA和DNA的较小分子例如质粒DNA，染色体DNA的限制性酶切片段或PCR片段，或单链DNA通常在2M-5M的离液盐浓度的溶液中维持不降解，这也是本领域技术人员熟知的。因此，本发明方法中使用的盐浓度依赖于应用领域，是本领域技术人员能理解的，或可轻易确定。

如需要，样品溶液可包含至少一种添加剂，以增强与磁性颗粒的结合。例如，添加剂可以是非离子物质，其可强烈水合，选自乙二醇、四乙二醇、聚亚烷基二醇、环糊精、角叉菜胶、葡聚糖、硫酸葡聚糖、黄原胶、纤维素、羟丙基纤维素、直链淀粉、2-羟丙基β-环糊精、琼脂(Agar Agar)或其混合物。聚亚烷基二醇是优选的，但不限于聚乙二醇、聚丙二醇或其混合物。在优选的实施方式中，添加剂是聚乙二醇。这些添加剂能充分抑制磁性颗粒在水性溶液中在较低浓度下成簇，从而能实现无麻烦的自动化过程，例如不会由于成簇磁性颗粒存在让堵塞滴定管头，WO2005/021748 A1提供了选择和使用这些添加剂的额外信息。

在本发明的一个优选的实施方式中，该方法包括以下步骤：

(a)在含有核酸的样品溶液中加入磁性颗粒，

(b)孵育步骤(a)的样品溶液使核酸吸附到磁性颗粒，

(c)在样品溶液上施加磁场以固定其上吸附有核酸的磁性颗粒；

(d)除去样品溶液；

(e)用在上述洗涤步骤(w)中的洗涤溶液洗涤磁性颗粒，和

(f)用洗脱溶液从所述磁性颗粒洗脱核酸。

优选步骤(a)到(f)以连续方式进行。在该方法中可包括其他步骤，例如在步骤(a)之前预处理原始样品，例如使得核酸能够被结合，如裂解过程释放核酸，和/或为了调节结合条件。在洗涤步骤(e)之前，可进行预洗涤步骤(p)以从核酸和磁性颗粒除去污染物。可重复洗涤步骤(e)即非结合条件下的洗涤步骤(w)，直到如所需除去盐和有机溶剂。在一个具体的实施方式中，方法可基本由步骤(a)到(f)和(p)组成，如需要每一步都可重复。原则上，步骤(a)到(d)和(f)的方法是本领域已知的，因此这些方法步骤可根据现有技术所述进行。

优选本发明方法，或至少提供样品溶液、结合和洗涤，和可任选的洗脱的步骤是在一个试管中进行的。通常在用溶液处理磁性颗粒并从溶液中除去后，还可以从试管除去溶液，然后再进行下一步。

在本发明的一个优选实施方式中，方法是自动化方法。由于本发明方法实现起来相对简单，特别适用于自动化，例如用本领域常用的机器人或工作站。自动化分离磁性颗粒的各种方法是本领域已知的，它们都应当适用于本发明。例如，磁性或可磁化装置可插入含有磁性颗粒的介质，磁性颗粒与磁性或可磁化装置结合，再次除去磁性或可磁化装置。在本发明方法的第二个实施方式中，介质和磁性颗粒(都被吸入滴定管头)的分离由置于滴定管头空间接近处的磁性或可磁化装置实现。当从滴定管头除去介质时，磁性颗粒被维持在滴定管头中，例如在尖端的壁或底部。这两种方法的自动化通常需要特殊的技术手段，例如针对这些方法之一特别构建的机器人。然而方法也可以手动进行。一种除去磁性颗粒的更普遍的原理是将磁性或可磁化装置置于包含介质和磁性颗粒的容器的空间接近处。磁性颗粒与容器壁结合，可除去介质而无磁性颗粒残留。

本发明的主题还包括在从样品溶液分离核酸的方法中，使用总盐浓度小于100mM且不含有机溶剂的水性溶液作为洗涤溶液，来洗涤其上吸附有核酸的磁性颗粒，其中其上吸附有核酸的磁性颗粒悬浮于洗涤溶液。优选应用是在上述方法中，和/或包括本发明方法上述的特定步骤和特征。

使用本发明的方法的核酸可获自生物材料，例如培养物中的原核或整合细胞；或来自组织、肿瘤细胞、外来体、多细胞生物(包括动物和植物)提取或获得的细胞；体液例如血液、淋巴液、尿液、粪便液或精液；食品；化妆品；或任何其他细胞来源，或可以是胞外的。上面进一步描述了合适的样品物质。根据本发明的方法从细胞器、感染细胞的病毒、噬菌体、质粒、类病毒等的DNA或RNA分离一些生物聚合物，例如一些种类的DNA或RNA。细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。可裂解细胞，通常用各种本领域技术人员熟悉的方法处理裂解物，以获得DNA或RNA的水性溶液，在其中进行本发明的分离方法。该溶液中的DNA或RNA通常发现有其他成分，例如蛋白质、RNA(在DNA分离的情况下)、DNA(在RNA分离的情况下)、或其他类型的组分。上面进一步描述了合适的生物聚合物。

在磁性颗粒与核酸接触前，可能必需破坏包含核酸的生物材料。不论核酸来源性质，用本发明方法分离的核酸以水性溶液提供，该溶液包含核酸和与核酸不同的分子，如细胞碎片、多肽等。当要使用本发明的方法分离的核酸物质包含在细胞或包含细胞的组织内时，优选首先通过裂解或破碎细胞或组织产生裂解物(这里称作“粗裂解物”)处理，更优选地进一步通过澄清细胞碎片裂解物处理(例如通过离心或真空过滤)。许多不同的裂解或破碎细胞释放其中包含的核酸物质的已知方法中的任何一种都适用于产生本发明所使用的细胞的水性溶液。选择用于从细胞释放核酸物质的方法由含细胞的材料的性质决定。例如，为了导致具有较硬的细胞壁的细胞，例如真菌或植物细胞释放其中所含的核酸物质，可能需要剧烈的处理，例如强蛋白酶和用颗粒碾磨机或匀浆机机械剪切，或用超声仪使用声波破碎。相反，仅通过将这样的细胞悬浮在水性溶液中，在溶液中加入去污剂，核酸物质可以轻易从具有脂质双层膜的细胞，例如大肠杆菌细菌或动物血细胞中释出。一旦如上所述从裂解或破碎的细胞释放核酸物质，可以用许多不同的本领域已知的技术或这些技术的组合除去可能干扰核酸物质与磁性颗粒吸附的细胞碎片。优选离心粗裂解物除去颗粒状细胞碎片。可任选的，随后进一步通过在上清液中加入第二溶液处理上清液，该第二溶液导致其他细胞组分，例如多肽沉淀，然后从得到的溶液通过离心除去沉淀物。在一个优选实施方式中，如此获得的裂解物或上清液在本发明的方法中用作样品溶液。

还可从人工来源获得核酸。核酸物质可以是扩增反应的产物，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或基于核酸序列的扩增(NASBA)产生的扩增DNA等。核酸物质还可以是任何长度的片段形式，例如限制性酶消化产生的那些。本发明的水性溶液还可以是包含解链的或酶消化的电泳凝胶和核酸物质的水性溶液。

本发明的方法分离的核酸不经进一步分离或纯化即适用于分析或进一步通过分子生物学方法加工，分离的核酸可以通过例如测序、限制性分析或核酸探针杂交分析。因此，本发明的方法可作为基于DNA或RNA分析等的方法的部分应用，用于基因分型，诊断疾病，鉴定病原体，测试食物、化妆品、血液或血制品或其他产品的病原体污染，法医测试，亲子鉴定以及胎儿或胚胎的性别鉴定，或其他优选的非侵袭性产前测试(NIPT)。

可通过任何催化与DNA或RNA反应的外切核酸酶和内切核酸酶加工本发明的方法分离的DNA或RNA，在DNA的情况下，可用限制性酶消化，其切割在DNA中存在的限制性位点。来自洗脱的DNA的限制性片段可连接入载体并转化入合适的宿主，用于克隆或表达。可用任何本领域已知的扩增目标核酸区段的方法扩增洗脱的DNA或RNA的区段。如果洗脱的DNA是质粒或其他类型的自主复制的DNA，可将其转化入合适的宿主以克隆或表达能在转化宿主中表达的DNA上的基因。

本发明方法解决了本发明的问题。提供了高效的分离核酸的方法，其克服了已知方法的缺陷。可以纯净形式和高产量在相对简单和便利的方法中分离核酸。高效除去了来自样品溶液的杂质，例如盐、有机溶剂和污染物。当调节洗涤步骤(w)的孵育时间时，能高产量分离不同链长的核酸。该方法不需要耗时的蒸发有机溶剂的干燥步骤。洗涤步骤(w)中的化学物质和成分都很简单，因为洗涤溶液可以是水或低盐水性溶液，甚至与洗脱溶液相同。

本发明的其他方面示于附图。

图1显示了以图例显示了实施例3的结果。用分光光度法在220-350nm的范围内分析洗脱液中的杂质。虚线表示两个探针和用实施例1的三重洗涤法(比较)分离的DNA。实线表示两个探针和用实施例2的发明水-掉落方法分离的DNA。

图2显示了以图例显示了实施例4的结果。用分光光度法在220-350nm的范围内分析洗脱液中的杂质。虚线表示三个探针和用三重洗涤法(比较)分离的DNA。实线表示探针和用发明水-掉落方法分离的DNA。

图3显示了根据实施例2从大肠杆菌分离的基因组DNA的实施例5中的琼脂糖凝胶。分析来自洗脱液(泳道a)和来自水-掉落洗涤步骤中使用的水(泳道b)的DNA。

图4显示了根据实施例2从大肠杆菌分离的质粒pCMVβ的实施例6中的琼脂糖凝胶。分析来自洗脱液(“洗脱”)和来自水-掉落洗涤步骤中使用的水(“水-掉落”)的DNA。

图5显示了根据实施例2从大肠杆菌分离的质粒pCMVβ的实施例6中的琼脂糖凝胶。在不同孵育时间0、6、12、18和24小时后，分析来自洗脱液(“B:洗脱液”)和来自水-掉落洗涤步骤中使用的水(“A:来自水-掉落的水”)的DNA。在C部分还显示了来自B的洗脱步骤后接着的第二洗脱步骤的结果，其中对第二洗脱步骤的悬液施加机械力和温和加热。

图6显示了根据实施例1和2从大肠杆菌分离的质粒pCMVβ和pUC21的实施例8中的琼脂糖凝胶。分别分析来自洗脱液(“洗脱”)和来自水-掉落洗涤步骤(“掉落”)或漂洗步骤(“漂洗”)中使用的水的DNA。

实施例

实施例1和2：DNA的纯化：

根据本发明的方法(实施例2)和现有技术方法(实施例1)分离来自细菌细胞的DNA。条件和工作溶液如下表1所示。用商标为(恰根,希尔登,德国；目录号51304)购得的试剂盒根据标准方案进行大肠杆菌或全血细胞的裂解。用/>试剂盒根据标准方案(恰根,希尔登,德国；目录号67563)使用磁珠提取平台(商标Gilson吉尔森公司(Gilson Inc.)，米德尔顿，美国(Middleton,US)/SalusDiscovery)用磁性颗粒纯化DNA。在实施例1的标准方法中，DNA与来自包含高浓度离液盐的缓冲液以建立结合条件的磁性二氧化硅颗粒结合。施加磁场将磁性颗粒与样品溶液分离。特别是，将磁性颗粒抽出溶液，随后除去样品溶液。在裂解步骤1(表格)中，仅提取珠而不再悬浮在裂解物中。其上结合有DNA的磁性颗粒根据方案用各种标准洗涤缓冲液洗涤，通过将颗粒释放入样品孔中的洗涤溶液中，洗涤并重新吸附/收集结合DNA的磁性颗粒。关闭、除去或重新定位磁场进行释放，这样其上结合有核酸的磁珠掉入下方的溶液中。在大部分洗涤步骤中，重复这种结合颗粒和“掉落”的循环，以对颗粒施加一些轻微的机械力。每步中磁珠“掉落”的数量也在表格中显示。

在比较实施例1中，洗脱前用蒸馏水在步骤(5a)中小心漂洗其上结合有DNA的磁性颗粒，其通过磁力固定在样品试管上。在该洗涤步骤中不再施加机械力，例如振摇或搅拌。在下文中，该步骤称作“水-漂洗”步骤。

在本发明的实施例中，最后的水-漂洗步骤替换成最终洗涤步骤(5b)，其中其上结合有DNA的磁性颗粒悬浮于蒸馏水。除去磁场释放磁性颗粒，并将磁性颗粒掉入洗涤溶液，然后孵育5-10秒。在该洗涤步骤中不再施加机械力，例如振摇或搅拌。随后，通过重新引发磁力，从洗涤溶液中分离其上结合有核酸的磁性颗粒。在下文中，这样的洗涤步骤(w)被称作“水-掉落”步骤，因为磁性颗粒掉入用于洗涤的水中。

重复使珠掉入洗脱溶液进行洗脱，以促进核酸释放。磁性搅拌3分钟实现洗脱。

表1：实验性条件，包括所用的缓冲液和洗涤步骤次数。在每一步中，从溶液分离磁性颗粒并除去溶液。还显示了“掉落”次数，即在同一溶液中重复释放磁性颗粒的次数。

^d＝掉落,^r＝漂洗

实施例3：来自大肠杆菌的基因组DNA的纯度

用分光光度法测定上文实施例1和2制备的大肠杆菌基因组DNA的杂质。为了从磁性颗粒洗去污染物，将磁性颗粒置于磁性搅拌机中三分钟来进行洗脱。用220nm-350nm的分光光度计分析洗脱物中的杂质，其中测定大部分盐残留物。结果示于图1。虚线显示了根据实施例1的水-漂洗方案分离的DNA用两种探针检测得到的值(比较)。实线显示了根据实施例2的水-漂洗方案分离的DNA用两种探针检测得到的值。220-245nm之间的高OD值通常表示盐和其他污染物。结果显示，用蒸馏水在非结合条件下洗涤结合有DNA的磁性颗粒的本发明的方法比起用现有技术的水-漂洗步骤的比较方法除去的污染物多得多。

实施例4：来自血液的DNA的纯度

根据发明实施例2和修改的比较实施例1的方案制备来自人全血的DNA。在上述实施例1的方法中，水-漂洗步骤5a(见表格)的第三次洗涤步骤用PE缓冲液代替。第一和第二次PE缓冲液洗涤步骤3、4以及第三次PE缓冲液洗涤步骤中，磁性颗粒掉入溶液中三次。比较分离的DNA产物的纯度。其目标是确定是否比较方法中的额外洗涤步骤(3次掉落入乙醇缓冲液PE)可比起颗粒仅掉入水中一次的本发明的方法更高效除去杂质。

结果示于图2。虚线表示用比较性三重洗涤法分离的DNA。实线指用水-掉落法分离的实施例2的DNA。结果显示，本发明的方法比起常规方法能从样品除去显著更多的污染物。每次磁性颗粒掉入洗涤溶液，能引起温和机械力，其实现洗涤磁性颗粒结合的DNA，而无污染物。根据该逻辑，三重样品掉落入洗涤缓冲液应当比起掉落1次在从样品中除去盐和其他污染物要更好。因此，掉入水中一次清洁DNA样品会和颗粒落入标准洗涤缓冲液的三重洗涤步骤密切相似或更好是出乎意料的。

实施例5：来自大肠杆菌的基因组DNA的产量

本发明方法的“水-掉落”步骤用水进行，其通常对结合于磁性颗粒的DNA产生洗脱条件。因此，测定在上述实施例的方法中是否发生DNA损失。在上述实施例2的方法中从大肠杆菌制备基因组DNA(gDNA，长约20kbp)。用琼脂糖凝胶电泳分析来自洗脱液和来自水-掉落洗涤步骤中剩余的水中的DNA。结果示于图3。在洗脱液(泳道a)中的产物可见强gDNA条带，而在水-掉落步骤中使用的水中DNA不可检测(泳道b)。结果显示，尽管在非结合条件下进行，本发明方法的洗涤步骤中DNA的损失可忽略不计。

实施例6：质粒DNA的产量

用实施例2所述标准方案制备携带质粒pCMVβ的大肠杆菌细胞的DNA。在最终洗涤步骤(水-掉落步骤)中，孵育时间是10秒。孵育后，重新收集颗粒并如实施例2所述洗脱。

用琼脂糖凝胶电泳分析来自洗脱液和来自水-掉落洗涤步骤中使用的水中的DNA。结果示于图4。产物可见强质粒DNA条带(“洗脱”，右侧泳道)。在水-掉落步骤所用的水中也可见弱DNA条带(“水-掉落”，左侧泳道)。结果显示，在本发明方法的洗涤步骤中(水-掉落步骤)可能发生少量质粒DNA损失。这些结果提示，DNA产量依赖于核酸长度，而越短的核酸越容易从二氧化硅磁性颗粒上洗脱。然而，对于质粒DNA来说绝对DNA损失仍然相当低，因此本发明的方法适用于产生卓越产量的高度纯化的质粒DNA。

实施例7：孵育时间和机械力对DNA产量的影响

用实施例2所述标准方案制备携带质粒pCMVβ的大肠杆菌细胞的DNA。在最终洗涤步骤(水-掉落步骤)中，孵育时间是0-24小时。在该时间段内，不移动或搅动颗粒，但使其置于试管底部。孵育后，重新收集颗粒并如实施例2所述洗脱。

用琼脂糖凝胶电泳分析来自洗脱液和来自水-掉落洗涤步骤中使用的水中的DNA。结果示于图5。对于分离的DNA可见强质粒DNA条带(“B:洗脱物”)。对于洗涤步骤中使用的水，在0和6小时后仅见到非常微弱的DNA条带(“A:来自水-掉落的水”)。水中的DNA量在24小时内增加，并达到显著水平。总体上，DNA洗脱随孵育时间增加，虽然并没有施加机械力来从颗粒上洗下核酸。结果提示在本发明的方法中可通过减少孵育时间来减少DNA损失。

为了确定机械力和轻微加热在洗脱步骤中的影响，施加了另一个(即第二个)洗脱步骤，其中磁性颗粒在50℃下悬浮于1400rpm的摇床中3分钟。这样的条件代表了常见洗脱条件，通常导致定量洗脱。因此，可以证实DNA是否，和多少DNA在第一次洗脱过程后仍然维持与磁性颗粒结合。图5显示了在使用较温和的洗脱条件的第一次洗脱过程后仍然有一些DNA维持与磁性颗粒结合。然而，额外施加机械力和温和加热进一步从磁性颗粒释放DNA(“C:用机械力和温和加热的第二次洗脱过程后的洗脱液”)。结果显示，强机械力和加热应当在本发明的洗涤步骤中避免，以获得高产量。延长孵育时间至24小时后，洗脱液中的DNA量下降，表明DNA已经被定量释放。

实施例8水-漂洗和水-掉落质粒DNA的比较

根据实施例1和2所述的标准方法平行制备来自携带质粒pCMVβ(约7.2kbp)或质粒UC21(约2.7kbp)的大肠杆菌细胞的DNA。在最终洗涤步骤(水-掉落步骤)中，孵育时间是5秒。孵育后，重新收集颗粒并如实施例1和2所述洗脱。结果示于图6。

已知短核酸从磁性颗粒上以比长核酸更快的速度洗脱。假设这是由于核酸和珠之间的接触点数量更少。因此，已预期对于指定质粒，本发明的水-掉落法会造成可观的核酸损失。然而，从图6的结果出乎意料地显示虽然结合有质粒DNA的磁性颗粒悬浮在洗涤溶液中，核酸损失非常少，而且数量级也与本领域现有技术的短和相当浅表的漂洗方法相类似。无论如何，同时用本发明的水-掉落洗涤方法获得的质粒DNA的纯度与现有技术的漂洗方法相比有所增加，因为颗粒悬浮导致更多污染物被除去。因此，发明方法导致纯度改善，且没有比现有技术更进一步的核酸损失。

Claims (21)

1.一种从样品溶液分离核酸的方法，其中从样品溶液分离核酸是通过吸附到磁性颗粒，然后通过施加磁场从样品溶液中分离具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒，接着进行至少一个洗涤步骤(w)，包括：

(w1) 将具有吸附其上的核酸的磁性颗粒悬浮于洗涤液中，其是水性溶液，其具有小于100mM的总盐浓度且不含有机溶剂，

(w2) 在洗涤溶液中孵育具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒，和

(w3) 从洗涤溶液分离具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒，其中在步骤(w1)期间关掉、除去或重定位磁场，从而使得磁性颗粒掉落到洗涤溶液中。

2.如权利要求1所述的方法，其中核酸是DNA、RNA或DNA和RNA两者。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中洗涤溶液具有低于25mM的总盐浓度。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中洗涤溶液由水和可任选的盐组成。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中洗涤步骤(w)进行5分钟或更短。

6.如权利要求1或2中至少一项所述的方法，其中核酸分别具有至少10kb或至少10kbp的链长度。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述核酸是DNA。

8.如权利要求1或2所述的方法，其中核酸分别具有小于10kb或小于10kbp的链长度，其中洗涤步骤(w)进行2分钟或更短。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述核酸是DNA。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中洗涤步骤(w)具有以下一个或多个特征：

-其上结合有核酸的磁性颗粒不经受机械力，

-其上结合有核酸的磁性颗粒不经受振荡和/或水平施加的机械力，

-其上结合有核酸的磁性颗粒经受垂直施加的机械力，

-其上结合有核酸的磁性颗粒经受磁力，

-其上结合有核酸的磁性颗粒悬浮在洗涤溶液中，而不施加机械力，

-其上结合有核酸的磁性颗粒悬浮在洗涤溶液中，而不施加振荡和/或水平施加的机械力，

-其上结合有核酸的磁性颗粒悬浮在洗涤溶液中，且施加垂直施加的机械力，

-其上结合有核酸的磁性颗粒悬浮在洗涤溶液中，且施加磁力。

11.如权利要求10所述的方法，其中其上结合有核酸的磁性颗粒经受垂直施加的机械力，其中所述垂直施加的机械力是重力。

12.如权利要求10所述的方法，其中其上结合有核酸的磁性颗粒经受磁力，其中所述磁力垂直施加。

13.如权利要求10所述的方法，其中其上结合有核酸的磁性颗粒悬浮在洗涤溶液中，且施加垂直施加的机械力，其中所述机械力是重力。

14.如权利要求10所述的方法，其中其上结合有核酸的磁性颗粒悬浮在洗涤溶液中，且施加磁力，其中所述磁力垂直施加。

15.如权利要求1或2所述的方法，洗涤步骤(w)前在至少一个预洗涤步骤(p)中用洗涤溶液洗涤其上吸附有核酸的磁性颗粒，洗涤溶液是含有高于500mM的总盐浓度和/或包含有机溶剂的水性溶液。

16.如权利要求1或2所述的方法，其中洗涤步骤(w)后用洗脱溶液从磁性颗粒洗脱核酸。

17.如权利要求1或2所述的方法，其中磁性颗粒包含二氧化硅。

18.如权利要求1或2所述的方法，其中样品溶液包含离液盐和/或醇。

19.如权利要求1或2所述的方法，包括步骤：

（a） 在含有核酸的样品溶液中加入磁性颗粒，

（b） 孵育步骤(a)的样品溶液使核酸吸附到磁性颗粒，

（c） 在来自步骤(b)的样品溶液上施加磁场以固定其上吸附有核酸的磁性颗粒，

（d） 除去样品溶液，

(e)在权利要求1的洗涤步骤(w)中用洗涤溶液洗涤磁性颗粒，和

(f)可任选的，用洗脱溶液从所述磁性颗粒洗脱核酸。

20.如权利要求1或2所述的方法，其中该方法是自动化方法。

21.一种水性溶液的用途，其具有小于100mM的总盐浓度且不含有机溶剂，用作在从样品溶液分离核酸的方法中洗涤其上吸附有核酸的磁性颗粒的洗涤溶液，其中其上吸附有核酸的磁性颗粒悬浮于洗涤溶液，所述悬浮过程中关掉、除去或重定位磁场，从而使得磁性颗粒掉落到洗涤溶液中。