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CN110049998B - 抗程序性细胞死亡1(pd-1)的抗体及其用途 - Google Patents

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CN110049998B CN201780055472.9A CN201780055472A CN110049998B CN 110049998 B CN110049998 B CN 110049998B CN 201780055472 A CN201780055472 A CN 201780055472A CN 110049998 B CN110049998 B CN 110049998B
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Abstract

本文公开一种针对人类程序性细胞死亡1(PD‑1)的抗体或其抗原结合片段、编码该抗体或其抗原结合片段的核酸、包括该核酸的载体、经该载体转化的经分离细胞、用于产生该抗体或其抗原结合片段的方法、以及含有该抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗癌症的组合物。该结合至PD‑1的新颖抗体或其抗原结合片段可结合至PD‑1并抑制PD‑1的活性，因此可用于研发针对多种与PD‑1相关的疾病的免疫治疗剂。

Description

抗程序性细胞死亡1(PD-1)的抗体及其用途
技术领域
本公开文本涉及一种针对人类程序性细胞死亡1(PD-1)的抗体或其抗原结合片段、编码该抗体或其抗原结合片段的核酸、包括该核酸的载体、经该载体转化的经分离细胞、用于产生该抗体或其抗原结合片段的方法、以及含有该抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗癌症的组合物。
背景技术
目前广泛应用的第一代化学治疗抗癌药和第二代靶向抗癌药具有以下问题：抗癌药毒性产生的副作用，高抗药性风险，以及只能将其给予具有特定基因突变的患者的限制。免疫抗癌药(免疫肿瘤学药物)称为“第三代抗癌药”，其克服了这些问题，作用于免疫细胞的信号传导路径以激活免疫细胞，并由此攻击癌细胞，从而提供治疗效果。与常规抗癌药不同，免疫抗癌药可以利用人类免疫系统治疗疾病的方式应用于包括癌症在内的多种疾病，并且所报告的副作用少于常规抗癌药。
PD-1(也称为“CD279”)是与CD28/CTLA4共刺激性/抑制性受体家族结合的55KD受体蛋白(Blank等人,2005Cancer Immunol Immunother 54:307-314)。
通过克隆编码PD-1的基因和cDNA来检查在小鼠和人类中的特征(Ishida等人,1992EMBO J 11:3887-3395；Shinohara等人,1994 Genomics 23:704-706)。全长PD-1含有288个氨基酸残基(NCBI登录号：NP_005009)。细胞外结构域由氨基酸残基1-167组成，并且细胞质C末端尾含有氨基酸残基191-288，其含有两个假设的免疫调节基序，即免疫受体酪氨酸基抑制性基序(ITIM；Vivier等人,1997Immunol Today 18:286-291)和免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM；Chemnitz等人,2004J Immunol 173:945-954)。
迄今，已知两个序列相关配体PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)与PD-1特异性地相互作用以诱导细胞内信号传导，并抑制CD3和CD28介导的T细胞激活(Riley,2009Immunol Rev229:114-125)，从而最终调节T细胞活性，例如，减少其他生长因子和细胞因子的分泌，以及降低细胞生长，以及减少IL-2和IFN-γ的分泌。
PD-1的表达在诸如T细胞、B细胞、单核细胞和天然杀伤(NK)细胞等免疫细胞中常见，并且在诸如肌肉、上皮和神经组织等其他人类组织中几乎不表达。另外，高PD-1表达水平通常与免疫细胞的活性相关。例如，在人类T细胞系Jurkat由PHA(植物血细胞凝集素)或12-O-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯或TPA激活时，PD-1的表现上调，如根据Weston印迹法所见。由于抗CD3抗体的刺激，在经刺激的小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞以及初代人类CD4+ T细胞中观察到相同现象。PD-1表达增加引起对效应T细胞的刺激并将活化的效应T细胞引导至耗尽和减少免疫激活的方向。因此，已知PD-1介导的抑制性信号在免疫耐受中具有关键作用。
肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)中的PD-1表达增加以及肿瘤细胞中的PD-1配体表达增加已在多种癌症中报道，并且已在其他类型的组织和器官中报道，包括肺、肝、胃、乳房、卵巢、胰腺、黑色素细胞和食道。更通常地，PD-1和PD-L1在所述癌症中的表达与关于患者存活结果的较差预后相关。通过转基因小鼠更详细地描述PD-1信号传导对用于癌症移除或耐受的免疫系统调节的重要性，该转基因小鼠通过敲除PD-1基因来抑制异种移植癌细胞的生长。
PD-1信号传导的上调导致免疫耐受性癌症增生以及人类病毒感染和转移。流行性乙型肝炎病毒、HBV和HCV诱导肝细胞中PD-1配体过表达，并激活效应T细胞中的PD-1信号传导，导致T细胞耗尽和对病毒感染的耐受。类似地，HIV感染通常通过类似的机制逃避人类免疫系统。PD-1信号传导可通过拮抗性分子进行治疗性调节，使得免疫细胞可从耐受恢复，并且可被再次激活以消除癌症和慢性病毒感染。
纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)是单克隆抗体，已知可作为靶向PD-1的药物并且用作恶性黑色素瘤和非小细胞肺癌的治疗剂。然而，据报道，由于需要高生产成本和准确检验，这些药物会对患者造成巨大的经济压力。因此，业内急需研发新的靶向PD-1的治疗剂，其可克服常规药物的限制。
在这种技术背景下，本发明人做出巨大努力来研发用于治疗癌症的特异性结合至PD-L1的抗体。因此，本发明人已使用噬菌体展示技术研发出以高亲和性与PD-L1结合的抗PD-L1抗体，并且已发现所述抗PD-L1抗体可显著抑制PD-1/PD-L1复合物的形成，由此实现本公开文本。
公开内容
技术问题
因此，本公开文本的一个目标是提供针对PD-1或其抗原结合片段的新颖抗体。
本公开文本的另一个目标是提供编码该抗体或其抗原结合片段的核酸。
本公开文本的另一个目标是提供包括该核酸的载体、引入了该载体的重组细胞以及其产生方法。
本公开文本的另一个目标是提供含有该抗体或其抗原结合片段的用于预防或治疗癌症的组合物。
技术方案
根据本公开文本，上述和其他目标可通过提供结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段来完成，所述抗体或其抗原结合片段包括：重链可变区，其包括重链CDR1，该重链CDR1包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:1至30中所述的序列组成；重链CDR2，该重链CDR2包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:31至56中所述的序列组成；和重链CDR3，该重链CDR3包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:57至79中所述的序列组成；以及轻链可变区，其包括轻链CDR1，该轻链CDR1包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:198至222中所述的序列组成；轻链CDR2，该轻链CDR2包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:223至241中所述的序列组成；和轻链CDR3，该轻链CDR3包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:242至269中所述的序列组成。
根据本公开文本的另一方面，提供编码该抗体或抗原结合片段的核酸。
根据本公开文本的另一方面，提供包括该核酸的表达载体。
根据本公开文本的另一方面，提供经该表达载体转化的细胞。
根据本公开文本的另一方面，提供用于产生该抗体或其抗原结合片段的方法，包括(a)培养细胞，并且(b)从所培养的细胞回收抗体或其抗原结合片段。
根据本公开文本的另一方面，提供用于预防或治疗癌症的组合物，其含有该抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
附图说明
根据以下具体实施方式，结合附图，将更清楚地理解本公开文本的上述和其他目标、特征和其他优点，在所述附图中：
图1是显示PD-1表达载体的示意图，该PD-1表达载体包括与其羧基末端融合的人类Fc或小鼠Fc；
图2显示PD-1蛋白纯化的结果；
图2A显示在10％SDS-PAGE凝胶上，在RE(还原性)和NR(非还原性)条件下，关于PD1-hFc的蛋白质鉴定的结果；
图2B显示在1ml/min的流速下，且使用PBS作为显影溶剂的G-3000 SWXL SEC-HPLC的结果；
图2C显示在10％SDS-PAGE凝胶上，在RE(还原性)和NR(非还原性)条件下，关于PD1-mFc的蛋白质鉴定的结果；
图2D显示在1ml/min的流速下，且使用PBS作为显影溶剂的G-3000 SWXL SEC-HPLC的结果；
图3显示抗体与PD-1的结合能力，取决于淘选次数；
图4显示测量单噬菌体与PD1-His的结合能力的ELISA结果；
图5显示鉴定PD-1抗体纯度的SDS-PAGE分析的结果；
图6显示PD-1抗体的体外效能的评估结果；
图7显示PD-1抗体的浓度依赖性体外效能评估的结果；
图8显示基于平均荧光强度(MFI)，抗体浓度依赖性结合至细胞表面上过表达的人类PD-1的结合能力；
图9显示PD1-hFc与PD1-45D6之间、PD1-hFc与PD1-49A2之间的动力学的测量结果；
图10显示优化单克隆的筛选结果；
图11显示PD1抗体与亲代抗体之间的表达率的比较分析；
图12显示关于根据本公开文本的PD1抗体的体外效能的评估结果；
图13显示根据本公开文本的PD-1抗体的浓度依赖性体外效能评估的结果；
图14显示单克隆抗体的关于所选PD1抗体变体与细胞表面上表达的PD-1的结合的鉴定结果；
图15显示单克隆抗体的所选PD1抗体变体与细胞表面上表达的PD-1的结合能力的测量结果；
图16显示关于所选抗体防止PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2复合物形成的抑制性活性，使用酶免疫吸附的鉴定结果；
图17显示PD1-hFc蛋白与PD1-45D6、PD1-49A2和PD1-49A2(2B9)之间的动力学的测量结果；
图18是显示PD1突变体的示意图；
图19显示关于所选噬菌体对PD-1突变体的结合能力，使用酶免疫吸附的鉴定结果，其中随着结合能力下降，相应值减小；
图20显示关于所选抗体对PD-1突变体的结合能力，使用酶免疫吸附的鉴定结果；
图21显示关于结合特异性，使用酶免疫吸附的鉴定结果；
图22显示在HEK-293细胞中瞬时表达后生产率的比较结果；并且
图23显示关于在异质性MLR(混合淋巴细胞反应)期间PD1单克隆抗体活性增加的鉴定结果。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本公开文本所属领域技术人员所了解的相同的含义。通常，本文中所用的术语为本领域所熟知并且以普通方式使用。
在一个方面中，本公开文本涉及结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：重链可变区，其包括重链CDR1，该重链CDR1包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:1至30中所述的序列组成；重链CDR2，该重链CDR2包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQID NO:31至56中所述的序列组成；和重链CDR3，该重链CDR3包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:57至79中所述的序列组成；以及轻链可变区，其包括轻链CDR1，该轻链CDR1包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:198至222中所述的序列组成；轻链CDR2，该轻链CDR2包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:223至241中所述的序列组成；和轻链CDR3，该轻链CDR3包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:242至269中所述的序列组成。
本发明人做出大量努力研发结合至PD-1的用于化学疗法的抗体，已知PD-1在多种癌症中表达。因此，本发明人使用噬菌体展示技术制备以高亲和性与PD-1结合的抗PD-1抗体，并且发现所述抗PD-1抗体可抑制PD-1的活性。
如本文中所用术语“程序性细胞死亡1(PD-1)”是信号传导蛋白，已知其功能为调节T细胞的激活和功能。T细胞的PD-1与癌细胞表达配体PD-L1在肿瘤微环境下的结合激活PD-1信号传导路径，并由此诱导T细胞的失活。在诸如恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾癌等多种癌症中发现此现象。
如本文中所用，术语“抗体”是指特异性结合至PD-1的抗PD-1抗体。本公开文本的范围不仅包括特异性结合至PD-1的完整抗体，还包括该抗体分子的抗原结合片段。
完整抗体是指具有两个全长轻链和两个全长重链的结构，其中每一轻链通过二硫键与相应重链连接。重链恒定区具有伽马(γ)、缪(μ)、阿尔法(α)、德耳塔(δ)和伊普西隆(ε)型，并且分为以下亚类：伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)、阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)。轻链恒定区具有卡帕(κ)和兰布达(λ)型。
该抗体或抗体片段的的抗原结合片段是指至少具有抗原结合能力并且包括Fab、F(ab')、F(ab')2和Fv的片段。在这些抗体片段中，Fab是指包括重链和轻链各自的可变区、轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)的结构，其各自具有一个抗原结合位点。Fab'与Fab的不同之处在于，其进一步包括铰链区，铰链区包括重链CH1结构域C末端的至少一个半胱氨酸残基。F(ab')2是由Fab'铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键产生。Fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，并且用于产生Fv的重组技术公开于PCT国际公开案中，例如WO 88/01649、WO 88/06630、WO 88/07085、WO 88/07086和WO 88/09344。双链Fv是一片段，其中重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接，并且单链Fv是一片段，其中重链可变区和轻链可变区通常通过共价键经由之间的肽连接体连接，或在C末端直接连接，形成像双链Fv一样的二聚体样结构。所述抗体片段可使用蛋白酶获得(例如，Fab可通过用木瓜蛋白酶限制性裂解完整抗体来获得，并且F(ab')片段可通过用胃蛋白酶限制性裂解完整抗体来获得)，并且可通过遗传重组技术来制备。
在一个实施方案中，本公开文本的抗体是Fv形式(例如，scFv)、Fab或完整抗体形式。另外，重链恒定区可选自由伽马(γ)、缪(u)、阿尔法(α)、德耳塔(δ)或伊普西隆(c)组成的同种型。例如，恒定区可为γ1(IgG1)、γ3(IgG3)或γ4(IgG4)。轻链恒定区可为κ或λ。
如本文中所用，术语“重链”涵盖全长重链和其片段二者，该全长重链包括含有具有足够可变区序列以赋予针对抗原的特异性的氨基酸序列的可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。如本文中所用，术语“轻链”涵盖全长轻链和其片段二者，该全长轻链包括含有具有足够可变区序列以赋予针对抗原的特异性的氨基酸序列的可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。
本公开文本的抗体包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、短链Fv(scFV)、短链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键Fv(sdFV)、抗个体基因型(抗Id)抗体或所述抗体的表位结合片段，或诸如此类。
单克隆抗体是指相同抗体，不包括可能的天然存在的突变，其中从基本上同质的抗体群体获得的抗体(也就是，构成该群体的每一抗体)可以少量存在。单克隆抗体具有高度特异性并且是针对单一抗原位点所诱导。
“人源化”形式的非人类(例如，鼠类)抗体是嵌合抗体，含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基经来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区(供体抗体)的残基替代，具有所需特异性、亲和性和能力。
术语“人类抗体”意指源自人类免疫球蛋白的分子，其中包括互补决定区和结构区的构成该抗体的所有氨基酸序列是由人类免疫球蛋白组成。
一些重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时其余一条或多条链包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，该“嵌合”抗体与源自另一物种或属于另一抗体种类或亚类的抗体以及所述抗体的展现所需生物活性的片段中的相应序列相同或同源。
如本文中所用，术语“抗体可变结构域”是指抗体分子的轻链和重链区域，包括互补决定区(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。
术语“互补决定区”(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其对于抗原结合是必需的。每个可变结构域通常具有三个CDR区，鉴定为CDR1、CDR2和CDR3。
在本公开文本中，结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段包括：
重链可变区，其包括：
重链CDR1，其选自下组，该组由SEQ ID NO:1至30组成；
重链CDR2，其选自下组，该组由SEQ ID NO:31至56组成；和
重链CDR3，其选自下组，该组由SEQ ID NO:57至79组成；以及
轻链可变区，其包括：
轻链CDR1，其选自下组，该组由SEQ ID NO:198至222组成；
轻链CDR2，其选自下组，该组由SEQ ID NO:223至241组成；和
轻链CDR3，其选自下组，该组由SEQ ID NO:242至269组成。
具体而言，结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段包括：
重链可变区，其包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ IDNO:57的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:32的重链CDR2和SEQ IDNO:58的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:33的重链CDR2和SEQ IDNO:59的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:33的重链CDR2和SEQ IDNO:60的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:33的重链CDR2和SEQ IDNO:61的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:33的重链CDR2和SEQ IDNO:62的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:3的重链CDR1、SEQ ID NO:34的重链CDR2和SEQ IDNO:63的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:4的重链CDR1、SEQ ID NO:35的重链CDR2和SEQ IDNO:64的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:5的重链CDR1、SEQ ID NO:36的重链CDR2和SEQ IDNO:65的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:6的重链CDR1、SEQ ID NO:37的重链CDR2和SEQ IDNO:66的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:32的重链CDR2和SEQ IDNO:67的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:7的重链CDR1、SEQ ID NO:38的重链CDR2和SEQ IDNO:68的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:8的重链CDR1、SEQ ID NO:39的重链CDR2和SEQ IDNO:69的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:9的重链CDR1、SEQ ID NO:40的重链CDR2和SEQ IDNO:70的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:10的重链CDR1、SEQ ID NO:41的重链CDR2和SEQID NO:71的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:11的重链CDR1、SEQ ID NO:42的重链CDR2和SEQID NO:72的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:12的重链CDR1、SEQ ID NO:43的重链CDR2和SEQID NO:73的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:13的重链CDR1、SEQ ID NO:44的重链CDR2和SEQID NO:74的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:14的重链CDR1、SEQ ID NO:45的重链CDR2和SEQID NO:75的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:15的重链CDR1、SEQ ID NO:46的重链CDR2和SEQID NO:76的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:8的重链CDR1、SEQ ID NO:47的重链CDR2和SEQ IDNO:77的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:16的重链CDR1、SEQ ID NO:48的重链CDR2和SEQID NO:78的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:17的重链CDR1、SEQ ID NO:49的重链CDR2和SEQID NO:58的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:18的重链CDR1、SEQ ID NO:50的重链CDR2和SEQID NO:58的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:19的重链CDR1、SEQ ID NO:51的重链CDR2和SEQID NO:58的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:20的重链CDR1、SEQ ID NO:52的重链CDR2和SEQID NO:58的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:21的重链CDR1、SEQ ID NO:51的重链CDR2和SEQID NO:58的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:22的重链CDR1、SEQ ID NO:53的重链CDR2和SEQID NO:58的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:23的重链CDR1、SEQ ID NO:49的重链CDR2和SEQID NO:58的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:17的重链CDR1、SEQ ID NO:54的重链CDR2和SEQID NO:58的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:24的重链CDR1、SEQ ID NO:55的重链CDR2和SEQID NO:58的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:21的重链CDR1、SEQ ID NO:51的重链CDR2和SEQID NO:58的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:25的重链CDR1、SEQ ID NO:56的重链CDR2和SEQID NO:57的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:26的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQID NO:57的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:27的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQID NO:57的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:28的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQID NO:57的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:29的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQID NO:57的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:30的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQID NO:57的重链CDR3；
重链可变区，其包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:32的重链CDR2和SEQ IDNO:79的重链CDR3；或
重链可变区，其包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:32的重链CDR2和SEQ IDNO:57的重链CDR3。
另外，结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段包括：
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:198的轻链CDR1、SEQ ID NO:223的轻链CDR2和SEQID NO:242的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:199的轻链CDR1、SEQ ID NO:224的轻链CDR2和SEQID NO:243的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:200的轻链CDR1、SEQ ID NO:225的轻链CDR2和SEQID NO:244的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:201的轻链CDR1、SEQ ID NO:226的轻链CDR2和SEQID NO:245的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:202的轻链CDR1、SEQ ID NO:227的轻链CDR2和SEQID NO:246的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:203的轻链CDR1、SEQ ID NO:228的轻链CDR2和SEQID NO:247的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:204的轻链CDR1、SEQ ID NO:229的轻链CDR2和SEQID NO:248的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:249的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:206的轻链CDR1、SEQ ID NO:231的轻链CDR2和SEQID NO:250的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:207的轻链CDR1、SEQ ID NO:232的轻链CDR2和SEQID NO:251的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:208的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:209的轻链CDR1、SEQ ID NO:233的轻链CDR2和SEQID NO:253的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:210的轻链CDR1、SEQ ID NO:234的轻链CDR2和SEQID NO:254的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:211的轻链CDR1、SEQ ID NO:235的轻链CDR2和SEQID NO:255的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:212的轻链CDR1、SEQ ID NO:236的轻链CDR2和SEQID NO:256的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:213的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:257的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:214的轻链CDR1、SEQ ID NO:237的轻链CDR2和SEQID NO:258的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:215的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:249的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:211的轻链CDR1、SEQ ID NO:238的轻链CDR2和SEQID NO:259的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:216的轻链CDR1、SEQ ID NO:238的轻链CDR2和SEQID NO:260的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:217的轻链CDR1、SEQ ID NO:239的轻链CDR2和SEQID NO:261的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:218的轻链CDR1、SEQ ID NO:240的轻链CDR2和SEQID NO:262的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:219的轻链CDR1、SEQ ID NO:241的轻链CDR2和SEQID NO:263的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:220的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:215的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:264的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:265的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:221的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:266的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:267的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:257的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:220的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:267的轻链CDR3；
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:222的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:268的轻链CDR3；或
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:220的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:269的轻链CDR3。
具体而言，根据本公开文本的抗体或其抗原结合片段可包括以下重链可变区和轻链可变区：
包括SEQ ID NO:2的重链CDR1、SEQ ID NO:33的重链CDR2和SEQ ID NO:62的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:201的轻链CDR1、SEQ ID NO:226的轻链CDR2和SEQID NO:245的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:3的重链CDR1、SEQ ID NO:34的重链CDR2和SEQ ID NO:63的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:202的轻链CDR1、SEQ ID NO:227的轻链CDR2和SEQID NO:246的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:4的重链CDR1、SEQ ID NO:35的重链CDR2和SEQ ID NO:64的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:203的轻链CDR1、SEQ ID NO:228的轻链CDR2和SEQID NO:247的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:5的重链CDR1、SEQ ID NO:36的重链CDR2和SEQ ID NO:65的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:204的轻链CDR1、SEQ ID NO:229的轻链CDR2和SEQID NO:248的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:32的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:249的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:6的重链CDR1、SEQ ID NO:37的重链CDR2和SEQ ID NO:66的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:206的轻链CDR1、SEQ ID NO:231的轻链CDR2和SEQID NO:250的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:32的重链CDR2和SEQ ID NO:67的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:207的轻链CDR1、SEQ ID NO:232的轻链CDR2和SEQID NO:251的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:208的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:7的重链CDR1、SEQ ID NO:38的重链CDR2和SEQ ID NO:68的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:209的轻链CDR1、SEQ ID NO:233的轻链CDR2和SEQID NO:253的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:8的重链CDR1、SEQ ID NO:39的重链CDR2和SEQ ID NO:69的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:210的轻链CDR1、SEQ ID NO:234的轻链CDR2和SEQID NO:254的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:11的重链CDR1、SEQ ID NO:42的重链CDR2和SEQ ID NO:72的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:213的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:257的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:3的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:215的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:249的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:13的重链CDR1、SEQ ID NO:44的重链CDR2和SEQ ID NO:74的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:211的轻链CDR1、SEQ ID NO:238的轻链CDR2和SEQID NO:259的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:15的重链CDR1、SEQ ID NO:46的重链CDR2和SEQ ID NO:76的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:217的轻链CDR1、SEQ ID NO:239的轻链CDR2和SEQID NO:336的轻链CDR3的轻链可变区；或
包括SEQ ID NO:8的重链CDR1、SEQ ID NO:47的重链CDR2和SEQ ID NO:77的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:218的轻链CDR1、SEQ ID NO:240的轻链CDR2和SEQID NO:337的轻链CDR3的轻链可变区。
根据本公开文本的一个实施方案，通过优化程序对抗体进行进一步筛选，并且本发明的抗体或其抗原结合片段可包括以下重链可变区和轻链可变区：
包括SEQ ID NO:17的重链CDR1、SEQ ID NO:49的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:220的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:18的重链CDR1、SEQ ID NO:50的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:215的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:19的重链CDR1、SEQ ID NO:51的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:218的轻链CDR1、SEQ ID NO:240的轻链CDR2和SEQID NO:337的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:20的重链CDR1、SEQ ID NO:52的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:264的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:21的重链CDR1、SEQ ID NO:51的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:265的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:22的重链CDR1、SEQ ID NO:53的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:221的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:266的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:23的重链CDR1、SEQ ID NO:49的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:17的重链CDR1、SEQ ID NO:54的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:215的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:249的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:24的重链CDR1、SEQ ID NO:55的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:267的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:21的重链CDR1、SEQ ID NO:51的重链CDR2和SEQ ID NO:58的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:220的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:221的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:266的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:215的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:220的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:215的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:25的重链CDR1、SEQ ID NO:56的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:257的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:26的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:220的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:267的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:27的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:28的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；
包括SEQ ID NO:29的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:205的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:252的轻链CDR3的轻链可变区；或
包括SEQ ID NO:30的重链CDR1、SEQ ID NO:31的重链CDR2和SEQ ID NO:57的重链CDR3的重链可变区，以及包括SEQ ID NO:220的轻链CDR1、SEQ ID NO:230的轻链CDR2和SEQID NO:267的轻链CDR3的轻链可变区。
术语“框架区”(FR)是指除了CDR残基以外的可变结构域残基。每个可变结构域通常具有4个FR，鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4。
根据本公开文本的一个实施方案，该抗体或其抗原结合片段可包括：
重链可变区FR1，其选自下组，该组由SEQ ID NO:80至95组成；
重链可变区FR2，其选自下组，该组由SEQ ID NO:96至113组成；
重链可变区FR3，其选自下组，该组由SEQ ID NO:114至134组成；或
重链可变区FR4，其选自下组，该组由SEQ ID NO:135至145组成。
另外，该抗体或其抗原结合片段可包括：
轻链可变区FR1，其选自下组，该组由SEQ ID NO:270至294组成；
轻链可变区FR2，其选自下组，该组由SEQ ID NO:295至315组成；
轻链可变区FR3，其选自下组，该组由SEQ ID NO:316至355组成；或
轻链可变区FR4，其选自下组，该组由SEQ ID NO:356至367组成。
“Fv”片段是含有完整抗体识别和结合位点的抗体片段。所述区域包括二聚体，例如scFv，所述二聚体由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域组成，所述重链可变结构域与所述轻链可变结构域相互非常紧密地共价连接。
“Fab”片段含有轻链的可变结构域和恒定结构域，以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段通常包括一对Fab片段，所述Fab片段通过位于其之间的在其羧基端附近的铰链半胱氨酸共价连接。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。Fv多肽可进一步包括VH结构域与VL结构域之间的多肽连接体，以使scFv可形成用于抗原结合的所需结构。
PD-1抗体为单价或二价，且包括短链或双链。功能上，PD-1抗体的结合亲和性在10-5M至10-12M范围内。例如，PD-1抗体的结合亲和性为10-6M至10-12M、10-7M至10-12M、10-8M至10-12M、10-9M至10-12M、10-5M至10-11M、10-6M至10-11M、10-7M至10-11M、10-8M至10-11M、10-9M至10-11M、10-10M至10-11M、10-5M至10-10M、10-6M至10-10M、10-7M至10-10M、10-8M至10-10M、10-9M至10- 10M、10-5M至10-9M、10-6M至10-9M、10-7M至10-9M、10-8M至10-9M、10-5M至10-8M、10-6M至10-8M、10- 7M至10-8M、10-5M至10-7M、10-6M至10-7M或10-5M至10-6M。
结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段可包括重链可变区，该重链可变区包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:146至193中所述的序列组成。结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段可包括重链可变区，该重链可变区选自下组，该组由SEQ ID NO:146至193组成。在本公开文本的一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可包括SEQ ID NO:151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、163、165、166、168、169或171至188的重链可变区。
另外，结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段可包括轻链可变区，该轻链可变区包括与选自下组的序列具有90％或更高序列同一性的序列，该组由如SEQ ID NO:368至420中所述的序列组成。结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段可包括轻链可变区，该轻链可变区选自下组，该组由如SEQ ID NO:368至420中所述的序列组成。在本公开文本的一个实施方案中，结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段可包括SEQ ID NO:371至380、383、385、386、388、389或391至415的轻链可变区。
在根据本公开文本的具体实施方案中，结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段可包括：
SEQ ID NO:151的重链可变区和SEQ ID NO:371的轻链可变区；
SEQ ID NO:152的重链可变区和SEQ ID NO:372的轻链可变区；
SEQ ID NO:153的重链可变区和SEQ ID NO:373的轻链可变区；
SEQ ID NO:154的重链可变区和SEQ ID NO:374的轻链可变区；
SEQ ID NO:155的重链可变区和SEQ ID NO:375的轻链可变区；
SEQ ID NO:156的重链可变区和SEQ ID NO:376的轻链可变区；
SEQ ID NO:157的重链可变区和SEQ ID NO:377的轻链可变区；
SEQ ID NO:158的重链可变区和SEQ ID NO:378的轻链可变区；
SEQ ID NO:159的重链可变区和SEQ ID NO:379的轻链可变区；
SEQ ID NO:160的重链可变区和SEQ ID NO:380的轻链可变区；
SEQ ID NO:163的重链可变区和SEQ ID NO:383的轻链可变区；
SEQ ID NO:165的重链可变区和SEQ ID NO:385的轻链可变区；
SEQ ID NO:166的重链可变区和SEQ ID NO:386的轻链可变区；
SEQ ID NO:168的重链可变区和SEQ ID NO:388的轻链可变区；
SEQ ID NO:169的重链可变区和SEQ ID NO:389的轻链可变区；
SEQ ID NO:171的重链可变区和SEQ ID NO:391的轻链可变区；
SEQ ID NO:172的重链可变区和SEQ ID NO:392的轻链可变区；
SEQ ID NO:173的重链可变区和SEQ ID NO:393的轻链可变区；
SEQ ID NO:174的重链可变区和SEQ ID NO:394的轻链可变区；
SEQ ID NO:175的重链可变区和SEQ ID NO:395的轻链可变区；
SEQ ID NO:176的重链可变区和SEQ ID NO:396的轻链可变区；
SEQ ID NO:177的重链可变区和SEQ ID NO:397的轻链可变区；
SEQ ID NO:178的重链可变区和SEQ ID NO:398的轻链可变区；
SEQ ID NO:179的重链可变区和SEQ ID NO:399的轻链可变区；
SEQ ID NO:180的重链可变区和SEQ ID NO:400的轻链可变区；
SEQ ID NO:181的重链可变区和SEQ ID NO:401的轻链可变区；
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SEQ ID NO:181的重链可变区和SEQ ID NO:403的轻链可变区；
SEQ ID NO:181的重链可变区和SEQ ID NO:404的轻链可变区；
SEQ ID NO:181的重链可变区和SEQ ID NO:405的轻链可变区；
SEQ ID NO:182的重链可变区和SEQ ID NO:406的轻链可变区；
SEQ ID NO:182的重链可变区和SEQ ID NO:407的轻链可变区；
SEQ ID NO:182的重链可变区和SEQ ID NO:408的轻链可变区；
SEQ ID NO:182的重链可变区和SEQ ID NO:409的轻链可变区；
SEQ ID NO:183的重链可变区和SEQ ID NO:410的轻链可变区；
SEQ ID NO:184的重链可变区和SEQ ID NO:411的轻链可变区；
SEQ ID NO:185的重链可变区和SEQ ID NO:412的轻链可变区；
SEQ ID NO:186的重链可变区和SEQ ID NO:413的轻链可变区；
SEQ ID NO:187的重链可变区和SEQ ID NO:414的轻链可变区；或
SEQ ID NO:188的重链可变区和SEQ ID NO:415的轻链可变区。
在具体实施方案中，结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段可包括：
SEQ ID NO:155的重链可变区和SEQ ID NO:375的轻链可变区；
SEQ ID NO:158的重链可变区和SEQ ID NO:378的轻链可变区；
SEQ ID NO:165的重链可变区和SEQ ID NO:385的轻链可变区；
SEQ ID NO:171的重链可变区和SEQ ID NO:391的轻链可变区；
SEQ ID NO:175的重链可变区和SEQ ID NO:395的轻链可变区；
SEQ ID NO:176的重链可变区和SEQ ID NO:396的轻链可变区；
SEQ ID NO:178的重链可变区和SEQ ID NO:398的轻链可变区；
SEQ ID NO:181的重链可变区和SEQ ID NO:401的轻链可变区；或
SEQ ID NO:181的重链可变区和SEQ ID NO:405的轻链可变区。
根据本公开文本的序列中由X或Xaa表示的部分是指未指定氨基酸，并且指示可包括任何氨基酸。
“噬菌体展示”是用于展示突变体多肽的技术，该突变体多肽作为与例如噬菌体(例如纤维状噬菌体)颗粒表面上的外壳蛋白的至少一部分的融合蛋白。噬菌体展示的有用性在于快速且有效地对大型随机化蛋白质突变体文库中以高亲和性结合至靶抗原的序列进行分类。已使用在噬菌体上展示肽和蛋白质文库来筛选数百万个多肽，以鉴定具有特异性结合性质的多肽。
噬菌体展示技术已提供用于生成和筛选结合至特异性配体(例如，抗原)的新颖蛋白质的有效工具。使用噬菌体展示技术，可生成大型蛋白质突变体文库，并且可对以高亲和性与靶抗原结合的序列进行快速分类。使编码突变型多肽的核酸与编码病毒外壳蛋白(例如，基因III蛋白或基因VIII蛋白)的核酸的序列融合。已研发出单相噬菌体展示系统，其中编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因III蛋白的一部分的核酸序列融合。在单相展示系统中，融合基因以低水平表达，还表达野生型基因III蛋白，并由此维持颗粒感染性。
对于抗体噬菌体展示文库的研发，重要的是证明肽在纤维状噬菌体表面上的表达以及功能性抗体片段在大肠杆菌(E.coli)的外周细胞质中的表达。通过多种方法制备抗体结合多肽或抗原结合多肽的文库，例如通过插入随机DNA序列或克隆相关基因序列来修饰单一基因的方法。可针对具有所需特征的抗体结合蛋白或抗原结合蛋白的表达对文库加以筛选。
对于产生具有所需特征的抗体，噬菌体展示技术相对于常规杂交瘤和重组方法具有若干优点。这种技术可在不使用动物的情况下，在短时间内生成具有多个序列的大型抗体文库。杂交瘤的产生和人源化抗体的产生可能需要数月的产生时间。另外，由于不需要免疫力，噬菌体抗体文库可生成针对具有毒性或具有低抗原性的抗原抗体。噬菌体抗体文库还可用于产生和鉴定新颖治疗性抗体。
可使用从未经免疫的人类、种系序列或已使用噬菌体展示文库进行免疫的幼稚B细胞Ig库生成人类抗体的技术。可使用各种淋巴组织来制备天然或非免疫原性抗原结合文库。
用于从噬菌体展示文库鉴定和分离高亲和性抗体的技术对于分离新的治疗性抗体是重要的。从文库分离高亲和性抗体可取决于文库大小、细菌细胞中的生产效率和文库的多样性。文库的大小会因抗体结合蛋白或抗原结合蛋白的无效折叠和由于存在终止密码子所致的无效产生而降低。在抗体结合结构域或抗原结合结构域没有正确折叠时，可抑制在细菌细胞中的表达。可通过使可变/恒定界面表面上的残基或所选CDR残基交替突变来改善表达。在细菌细胞中生成抗体噬菌体文库时，框架区序列是提供适当折叠的元件。
在高亲和性抗体的分离中，重要的是生成抗体结合蛋白或抗原结合蛋白的多个文库。已发现CDR3区经常参与抗原结合。由于重链上的CDR3区根据大小、序列和结构维度形态显著变化，可使用其来制备多个文库。
还可通过在每一位置使用所有20种氨基酸随机化可变重链和轻链的CDR区来产生多样性。使用所有20种氨基酸产生多样性增加的抗体序列，并增加鉴定新抗体的机会。
根据本公开文本的抗体或抗体片段可包括本文中所述的本公开文本的抗PD-1抗体以及其生物等效物的序列，只要该抗体或抗体片段可特异性识别PD-1即可。例如，可对该抗体的氨基酸序列进行额外变异，以进一步改善抗体的结合亲和性和/或其他生物学性质。所述变异包括例如抗体氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。所述氨基酸变异是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性(同一性)来进行，例如疏水性、亲水性、电荷或大小。对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析证明，所有精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电的残基，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似大小，并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似形状。因此，基于这些考虑，将精氨酸、赖氨酸和组氨酸；以及丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸视为生物学功能等效物。
在另一方面中，本公开文本涉及编码该抗体或其抗原结合片段的核酸。
该抗体或其抗原结合片段可通过分离编码根据本公开文本的抗体或其抗原结合片段的核酸以重组方式产生。分离核酸并插入可复制载体中以实施进一步克隆(DNA扩增)或进一步表达。基于此，在另一方面中，本公开文本涉及含有核酸的载体。
术语“核酸”旨在涵盖DNA(gDNA和cDNA)和RNA两种分子，以及核苷酸，核苷酸是核酸的基础构成单元，包括天然来源的核苷酸以及其中糖或碱基部分经修饰的类似物。编码本公开文本的重链和轻链可变区的核酸的序列可变。所述变异包括核苷酸的添加、缺失或者非保守取代或保守取代。
根据本公开文本的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列或其编码核酸也被解释为包括显示与相应SEQ ID NO中所述序列具有实质同一性的序列。术语“显示实质同一性的序列”意指在比对本公开文本的序列以尽可能多地对应于任何其他序列并使用本领域中常用算法分析所比对序列时，显示至少90％、最优选地至少95％、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高同一性的序列。
基于此，根据本公开文本的抗体或其抗原结合片段可具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性。所述同一性可通过本领域已知方法对序列进行对比和/或比对来测定。例如，根据本公开文本的核酸或蛋白质的百分比序列同一性可使用序列对比算法(即，BLAST或BLAST 2.0)、人工比对或目测检查来测定。
编码该抗体的DNA可使用常规程序(例如，使用特异性结合至编码抗体重链和轻链的DNA的寡核苷酸探针)容易地分离或合成。可获得多种载体。载体组分通常包括但不限于一种或多种以下组分：信号序列、复制起点、一种或多种标记物基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
如本文中所用，术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具，并且包括：质粒载体；粘粒载体；和病毒载体，例如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。载体中编码该抗体的核酸与启动子可操作连接。
术语“可操作连接”意指核酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列或转录调节子结合位点阵列)与另一核酸序列之间的功能性连接，并且是通过核酸序列的转录和/或翻译来调节的。
在使用原核细胞作为宿主时，载体通常包括能实施转录的强启动子(例如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子或T7启动子)、起始翻译的核糖体结合位点以及转录/翻译终止序列。另外，例如，在使用真核细胞作为宿主时，载体包括源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人类血红蛋白启动子和人类肌酸启动子)，或源自动物病毒的启动子(例如腺病毒后期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV LTR启动子、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、埃伯斯坦-巴尔(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子和劳氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)启动子)，且通常具有多聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
任选地，该载体可与另一序列融合，以有利于由其表达的抗体的纯化。待融合序列包括例如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)、6x His(六组氨酸；Quiagen，美国)等。
载体包括本领域中一般用作可选标记物的抗生素抗性基因，并且其例子包括以下各项的抗性基因：氨苄西林、庆大霉素、羧苄西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素。
在另一方面中，本公开文本涉及经上文所提到的载体转化的细胞。用于产生本公开文本的抗体的细胞可为原核生物、酵母或高等真核细胞，但不限于此。
可使用芽孢杆菌属(Bacillus，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和土利真杆菌(Bacillus tuligensis))、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas，例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、以及原核宿主细胞例如奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和葡萄球菌属(Staphylococcus，例如，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus))的株系。
对动物细胞的兴趣最大并且有用宿主细胞系的例子包括但不限于COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S或HT1080。
在另一方面中，本公开文本涉及用于产生该抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：(a)培养细胞；并且(b)从所培养的细胞回收抗体或其抗原结合片段。
可以在各种培养基中培养细胞。可无限制地使用任何市售培养基作为培养基。可以适当浓度包括本领域技术人员熟知的所有其他必需补充物。诸如温度和pH等培养条件已用于所选表达用宿主细胞，该条件对于本领域技术人员将显而易见。
如本文中所用，术语“转化”意指将含有编码靶蛋白的核酸的载体引入宿主细胞中，使得可在该宿主细胞中表达该核酸编码的蛋白质。经转化核酸包括插入且定位于宿主细胞染色体中的经转化核酸和定位于染色体外的经转化核酸二者，只要其可在宿主细胞中表达即可。另外，核酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。核酸可以任何形式引入，只要可将其引入宿主细胞中并在其中表达即可。例如，核酸可以表达盒的形式引入宿主细胞中，表达盒是含有自表达所需所有元件的基因构建体。表达盒通常包括启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和与核酸可操作连接的翻译终止信号。表达盒可带有容许自身复制的表达载体。核酸还可以其自身形式引入宿主细胞中，并且与在宿主细胞中表达所需的序列可操作连接。
对该抗体或其抗原结合片段的回收可通过例如以下方式来实施：离心或超滤以移除杂质，且例如使用亲和层析纯化所得产物。可使用其他纯化技术，例如阴离子或阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、羟磷灰石色谱等。
在另一方面中，本公开文本涉及含有该抗体或其抗原结合片段作为活性成分的用于预防或治疗癌症的组合物。
本公开文本提供例如用于预防或治疗癌症的组合物，其含有：(a)药学有效量的根据本发明的针对PD-1的抗体或其抗原结合片段；和(b)药学上可接受的载剂。本公开文本还涉及用于预防或治疗癌症的方法，其包括以患者所需的有效量给予根据本公开文本的针对PD-1的抗体或其抗原结合片段。
在本公开文本中，癌症优选地选自下组，该组由以下各项组成：黑色素瘤、肺癌、肝癌、神经胶质细胞瘤、卵巢癌、结肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、乳腺癌、转移癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、前列腺癌和胰腺癌，但不限于此。
如本文中所用，术语“治疗”意指通过给予组合物来抑制或减轻癌症或由此引发的一种或多种症状，以及预防癌症进展或治疗癌症，所述癌症治疗逆转疾病的症状，并且如本文中所用，术语“预防”意指通过给予组合物产生的抑制或延迟癌症进展的任何行动。在本公开文本中，预防或治疗癌症是通过根据本公开文本获得的抗体与PD-1之间的结合来实施。结合至PD-1的抗体显著抑制PD-1的活性，由此预防或治疗癌症。
如本文中所用的术语“药学上可接受的载剂”是指不损害所给予化合物的生物学活性或性质且不刺激生物体的载剂或稀释剂。配制为液体溶液的用于组合物的可接受药物载剂已灭菌且是生物相容的，并且其例子包括盐水、无菌水、林格溶液(Ringer'ssolution)、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇和其中一种或多种的混合物。如果需要，可添加其他常规添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。另外，可另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，以配制可注射溶液(例如水性溶液、悬浮液和乳液)、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。
可将含有该抗体和药学上可接受的载剂的用于预防或治疗癌症的组合物应用于含有其作为活性成分的任何配制品，并且可经制备用于经口或非经肠配制。药物配制品可包括适于以下各项的配制品：经口、经直肠、经鼻、局部(包括在颊和舌下)、皮下、经阴道或非经肠(包括肌内、皮下和静脉内)给予，或吸入或吹入。
含有本公开文本的组合物作为活性成分的用于经口给予的配制品的例子包括片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、经制备粉剂或颗粒剂、乳液、硬胶囊或软胶囊、糖浆剂或酏剂。为了制备诸如片剂和胶囊等配制品，可纳入粘合剂(例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶)、赋形剂(例如磷酸二钙)、崩解剂(例如玉米淀粉或甘薯淀粉)、润滑剂(例如硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠或聚乙二醇蜡)，并且除了上述成分以外，胶囊配制品可进一步含有液体载剂，例如脂肪油。
含有本公开文本的组合物作为活性成分的用于非经肠给予的配制品的例子包括注射形式，例如皮下注射、静脉内注射或肌内注射；栓剂或喷雾剂形式，例如可经由呼吸器吸入的气溶胶。对于制备为可注射配制品，本公开文本的组合物可在水中与稳定剂或缓冲剂混合以制备溶液或悬浮液，并且溶液或悬浮液可基于用于给予的安瓿或小瓶单位来配制。对于栓剂注射，可配制用于经直肠给予的组合物，例如含有常规栓剂基质(例如可可脂或其他甘油酯)的栓剂或灌肠剂制剂。对于诸如气溶胶等喷雾剂配制品，可混合诸如推进剂等添加剂，使得水分散性浓缩物或湿粉剂得以分散。
在另一方面中，本公开文本涉及用于预防或治疗癌症的方法，其包括给予含有该抗体的用于预防或治疗癌症的组合物。
如本文中所用，术语“给予”是指通过任何适当方法将根据本公开文本的药物组合物引入患者中。本公开文本的组合物的给予途径可为任何途径，包括经口或非经肠途径。具体而言，药物组合物可以常规方式经由以下途径给予：经口、经直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、经皮、鼻内、吸入、经眼或真皮内途径。
本公开文本的治疗方法包括给予药学有效量的根据本公开文本的用于预防或治疗癌症的组合物。对于本领域技术人员将显而易见，可根据医学专家的适当判断来决定适当的总日剂量。对于某一患者的特定治疗有效量优选地取决于多种因素，包括要实现的反应的类型和程度，以及所用其他试剂的存在、特定组合物，和患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，该组合物的给予时间、给予途径和分泌速率，治疗期，以及与该特定组合物结合或同时使用的药物，并且取决于药学领域熟知的类似因素。因此，优选地在考虑上述因素后确定适于本公开文本的目标的用于预防或治疗癌症的组合物的有效量。
另外，本公开文本的治疗方法可应用于可发展由于PD-1活性过高所致的疾病(例如肿瘤发展和新生血管形成)的任何动物，并且该动物包括人类和灵长类动物以及家畜，例如牛、猪、绵羊、马、狗和猫。
在另一方面中，本公开文本涉及含有根据本公开文本的PD-1抗体或其抗原结合片段的用于诊断癌症的组合物。本公开文本还涉及通过用根据本公开文本的PD-1抗体或其抗原结合片段处理来诊断癌症的方法。
可通过用根据本公开文本的针对PD-1的抗体测量样品中的PD-1表达水平来诊断癌症。表达水平可通过常规免疫分析方法来测量，该常规免疫分析方法包括但不限于放射免疫分析、放射免疫沉淀、免疫沉淀、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附分析(ELISA)、捕获ELISA、抑制或竞争分析、夹心分析、流式细胞术、免疫荧光染色和使用针对PD-1的抗体的免疫亲和性纯化。
可通过分析免疫分析过程的最终信号强度来诊断癌症。也就是说，在根据本公开文本的标记物的蛋白质于生物学样品中高度表达，且因此生物学样品的信号强于正常生物学样品(例如，正常胃组织、血液、血浆或血清)的信号时，诊断为癌症。
在另一方面中，本公开文本涉及含有用于诊断癌症的组合物的用于诊断癌症的试剂盒。根据本公开文本的试剂盒包括根据本公开文本的针对PD-1的抗体，并且可通过分析样品与抗体之间反应时生成的信号来诊断癌症。信号可包括但不限于与抗体偶合的酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、萤光素酶或细胞色素P450。在这种情况下，在使用碱性磷酸酶作为酶时，作为该酶的底物，使用显色反应底物，例如溴氯吲哚磷酸盐(BCIP)、氮蓝四唑(NBT)、萘酚-AS-B1-磷酸盐和ECF(增强化学荧光)；并且在使用辣根过氧化物酶时，使用诸如以下各项的底物：氯萘酚、氨基乙基咔唑、二氨基联苯胺、D-荧光素、光泽精(硝酸双-N-甲基吖啶鎓)、苄氧基试卤灵(resorufin benzyl ether)、鲁米诺(luminol)、Amplex Red试剂(10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪)、HYR(对苯二胺-HCl和儿茶酚)、TMB(四甲基联苯胺)、ABTS(2,2'-吖嗪-二[3-乙基苯并噻唑啉磺酸])、邻苯二胺(OPD)和萘酚/焦宁(pyronin)、葡萄糖氧化酶、t-NBT(氮蓝四唑)或m-PMS(吩嗪硫酸甲酯)，但本公开文本不限于此。
另外，根据本公开文本的试剂盒还可包括用于生成可检测信号的标记，并且该标记可包括化学(例如，生物素)、酶(碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶和细胞色素P450)、放射性物质(例如C14、I125、P32和S35)、荧光物质(例如荧光素)、发光物质、化学发光物质和FRET(荧光共振能量转移)，但不限于此。
用于癌症诊断的酶活性的测量或信号的测量可通过本领域中已知的多种方法来实施。因此，可对PD-1表达进行定性或定量分析。
在下文中，将参照实施例更详细地描述本公开文本。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅用于说明本公开文本，并且不应被视为限制本公开文本的范围。
实施例1：PD-1抗原的表达和纯化
1.PD-1蛋白表达载体的产生
对于PD-1的克隆，通过聚合酶链式反应(PCR)，使用在5'和3'处含有限制性酶SfiI位点的用于PD1的引物(表1)实施扩增，以使用Jurkat细胞cDNA文库(Stratagene，美国)仅获得细胞外结构域。经扩增PCR产物是通过使用N293F载体将人类Fc(SEQ ID NO:196)和小鼠Fc(SEQ ID NO:197)融合至羧基末端(图1)来制备。
[表1]
名称 5'->3'序列 SEQ ID NO.
PD1-F ccaggatggttcttagactcccc 194
PD1-R caccagggtttggaactggc 195
2.PD-1抗原的表达和纯化
为了在动物细胞中表达抗原，用质粒DNA对HEK-293F细胞进行转染。用于转染的多聚复合物(polyplex)反应溶液是通过以下方式制备：将25μg质粒DNA与3ml的Freestyle293表达培养基混合，并将2mg/ml的PET(聚乙烯亚胺，polyplusA-transfection，美国)与所得混合物再次进一步混合。使多聚复合物反应溶液在室温下反应15分钟，并且然后在40ml具有1x 106个细胞/ml的浓度的培养基中，在37℃和8％CO2下以120rpm培养24小时。在转染24小时后，将Soytone(BD，美国)作为补充物添加至终浓度为10g/L。使用瞬时表达系统，使用HEK-293F经7天产生抗体。进行亲和层析以从培养溶液获得抗原。通过以5,000rpm离心10分钟以移除细胞来获得上清液，并在第7天从培养基回收细胞碎片。使上清液与用DPBS洗涤的重组蛋白A琼脂糖树脂在4℃下反应16小时。
在使用重组蛋白A琼脂糖树脂时，用0.1M甘氨酸洗脱蛋白质，并用500μl的1MTris-HCl中和，以进行初次纯化。使用Superdex 200(1.5cm*100cm)凝胶过滤层析对经初次纯化的蛋白质进行二次纯化。
通过SDS-PAGE凝胶和尺寸排阻色谱[TSK-GEL G-3000 SWXL尺寸排阻色谱(SEC)(Tosoh)]鉴定经纯化蛋白质的纯度。
因此，确认经纯化PD1蛋白具有95％或更高的纯度，如图2A至2D中所示。
实施例2：PD-1人类抗体的筛选
1.抗原制备
将实施例1中制备的PD1-hFc和PD1-mFc以及购自Sino Biological Inc.的PD1-his(目录号，10377-H08H)作为蛋白质抗原以50ug剂量涂布于免疫吸附管上，并且然后加以封阻。
2.生物淘选
通过用细菌感染人类scFv文库(具有2.7x 1010各种各样的)并且然后在30℃下培养16小时来获得人类抗体文库噬菌体。在培养后，对培养溶液进行离心，用PEG浓缩上清液，并且然后溶解于PBS缓冲液中，以制备人类抗体文库。将人类抗体文库噬菌体装填至免疫管中，随后在室温下反应2小时。在用1X PBS/T和1X PBS洗涤后，仅洗脱与抗原特异性结合的scFv-噬菌体。
用大肠杆菌再次感染经洗脱噬菌体并扩增(淘选过程)，以获得阳性噬菌体池。使用在第一轮淘选中扩增的噬菌体以与上文相同的方式实施第二轮和第三轮淘选过程，但只有PBST洗涤步骤的次数增加。
因此，如表2中所示，可见在第三轮淘选期间，与输入噬菌体相比，与抗原结合(输出)的噬菌体数略有增加。
[表2]
淘选(次)数 输入噬菌体数 输出噬菌体数
1 2X 1013 3.6X 107
2 1.2X 1013 7X 107
3 2X 1013 2X 109
3.多聚噬菌体ELISA
实施多聚噬菌体ELISA(酶联免疫分析)以研究在实施例2中通过每一轮淘选过程获得的阳性多聚scFv-噬菌体抗体池对抗原的特异性。
将在第一轮至第三轮淘选过程后冷冻的细胞储液添加至含有5ml的2x YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中至OD600为0.1，并且然后在37℃下培养2至3小时(OD600＝0.5至0.7)。感染M1辅助噬菌体并在含有2x YTCMK、5mM MgCl2和1mM IPTG的培养基中在30℃下培养16小时。将所培养细胞离心(4,500rpm，15min，4℃)，并将上清液转移至新管(第一轮至第三轮淘选的多聚scFv-噬菌体)。将两种抗原各自以100ng/孔的密度用涂布缓冲液涂布于96孔免疫板(NUNC 439454)上，在4℃下16小时，并使用溶解于PBS中的4％脱脂乳封阻每个孔。
用0.2ml的PBS/T洗涤每个孔，并将100μl第一轮至第三轮淘选的多聚scFv-噬菌体添加至每孔，随后在室温下反应2小时。再次用0.2ml PBS/T将每孔洗涤4次，并将二级抗体抗M13-HRP(Amersham 27-9421-01)以1:2000稀释，并在室温下反应1小时。在用PBS/T洗涤后，将OPD片剂(Sigma.8787-TAB)溶解于PC缓冲液中，并以100μl/孔的浓度添加所得溶液，以诱导显色10分钟。然后，在490nm下用分光光度计(Molecular Device)测量吸光度。
结果显示于图3中。如从图3可见，ELISA显示，对两种PD-1抗原的结合能力在第三多聚scFv-噬菌体中有所加强。
4.阳性噬菌体的筛选
将从具有高结合能力的多克隆噬菌体抗体组(第三轮淘选)获得的菌落在1ml 96深孔板(Bioneer 90030)中在37℃下培养16小时。将由此生长的100至200μl细胞添加至含有2x YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中至OD600为0.1，并添加至含有1ml 2x YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中，并且然后在96深孔板中在37℃下培养2至3小时至OD600为0.5至0.7。以1:20的MOI感染M1辅助噬菌体并在含有2x YTCMK、5mM MgCl2、1mM IPTG的培养基中在30℃下培养16小时。
将抗原PD1以100ng/孔的密度涂布于96孔免疫板上，在4℃下16小时，并使用溶解于PBS中的4％脱脂乳封阻每孔。将用0.2ml PBS/T洗涤并培养16小时的每种单克隆scFv-噬菌体(100scFv-噬菌体)以100μl剂量添加至每孔并在室温下反应2小时。再次用0.2ml PBS/T将每孔洗涤4次，并将二级抗体抗M13-HRP稀释至1/2000，并在室温下反应1小时。在用0.2ml PBS/T洗涤后，进行显色并在490nm下测量吸光度。
因此，如图4中所示，获得总计数十种用于PD1的单噬菌体克隆作为针对每一抗原具有高结合能力的单噬菌体克隆。
5.阳性噬菌体抗体的碱基序列分析
使用DNA纯化试剂盒(Qiagen，德国)使所选单一克隆经历DNA-prep以获得DNA，并请求对DNA的序列分析(Solgent)。基于序列分析结果鉴定所选抗体的VH和VL的CDR区，并使用NCBI网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/上的Ig BLAST程序研究这些抗体与种系抗体组之间的相似性(同一性)。因此，获得15种对PD1具有特异性的噬菌体抗体并归纳于下表3中。
[表3]PD1单克隆的特征
克隆名称 VH 同一性 VL 同一性 组
纳武单抗 VH3-33 91.80％ L6 98.90％
派姆单抗 VH1-2 79.60％ L25 80.80％
PD1-29A2 VH3-9 91.80％ V2-17 86.50％ 1
PD1-29H3 VH3-9 90.80％ V1-11 88.50％ 2
PD1-31F3 VH1-69 92.90％ V1-13 93.90％ 3
PD1-32A6 VH1-69 87.80％ L5 91.60％ 4
PD1-41C9 VH3-30 95.80％ O1 92.10％ 5
PD1-42G4 VH3-11 93.80％ O2 93.80％ 6
PD1-44B5 VH3-30 99.00％ V1-16 85.60％ 7
PD1-45D6 VH3-30 95.80％ O1 93.10％ 8
PD1-45F1 VH1-46 91.80％ V2-13 93.80％ 9
PD1-45F4 VH3-9 90.80％ V2-1 77.70％ 10
PD1-48A9 VH1-69 79.60％ O1 96.00％ 11
PD1-49B9 VH3-9 88.70％ V1-2 93.90％ 12
PD1-49A2 VH3-30 97.90％ O1 93.10％ 13
PD1-51D9 VH1-3 82.70％ A3 94.00％ 14
PD1-52E8 VH3-9 91.80％ V2-17 90.50％ 15
包括所选抗体的重链和轻链CDR和FR序列的抗体，以及包括所选抗体的重链和轻链CDR和FR序列的重链可变区和轻链可变区显示于下表4和5中。
[表4]PD1克隆的重链可变区
Figure GDA0001989870450000311
Figure GDA0001989870450000321
Figure GDA0001989870450000331
Figure GDA0001989870450000341
Figure GDA0001989870450000351
Figure GDA0001989870450000361
Figure GDA0001989870450000371
[表5]PD1克隆的轻链可变区
Figure GDA0001989870450000372
Figure GDA0001989870450000381
Figure GDA0001989870450000391
Figure GDA0001989870450000401
Figure GDA0001989870450000411
Figure GDA0001989870450000421
实施例3：PD-1人类抗体的产生
1.scFv形式至IgG形式的转化
对重链和轻链进行PCR(iCycler iQ，BIO-RAD)以将所选15种针对PD1的单克隆噬菌体抗体从噬菌体转化为IgG完整载体。因此，获得重链和轻链，并用限制性酶切割(消化)每种克隆的载体以及重链和轻链。用DNA-凝胶萃取试剂盒(Qiagen)从载体和重链中的每一者洗脱DNA。通过以下方式进行连接：混合1μl(10ng)载体、15μl(100-200ng)重链、2μl的10x缓冲液、1μl连接酶(1U/μl)和蒸馏水，使混合物在室温下静置1至2小时，将所得混合物注射至经转化细胞(感受态细胞，XL1-蓝)中，将细胞置于冰上5分钟并使细胞在42℃下经历90秒热休克。
在热休克后，将1ml培养基添加至细胞，并且然后使细胞在37℃下生长1小时，铺展于LB Amp板上，并在37℃下孵育16小时。将由此获得的菌落用5ml LB Amp培养基接种，在37℃下培养16小时，并使用DNA-prep试剂盒(Nuclogen)使其经历DNA-prep。请求所获得DNA的序列分析(Solgent)。
因此，确认15种针对PD1的克隆的重链和轻链序列转化为完整IgG，与表3中所示15种克隆的噬菌体抗体的序列相对应。为了转染至HEK 293F细胞中，使转化为完整IgG的各个克隆的重链和轻链在100ml的LB Amp培养基中生长，并使用Midi-prep试剂盒(QIAgen)获得DNA。
2.人类抗体产生
将经克隆pNATVH和pNATVL载体以6:4的比率共转染至HEK293F细胞中，并在第7天收集上清液，通过离心和0.22μm顶部滤纸去除细胞和碎片，并收集上清液且对上清液进行蛋白A亲和层析以纯化IgG抗体。在纯化后，经甘氨酸缓冲液分离抗体，并更换缓冲液，使得最终再悬浮缓冲液为PBS。通过BCA和nano drop对经纯化抗体进行定量，并将15种抗体各自以5ug剂量在还原性和非还原性条件下加载，并通过SDS-PAGE分析以测定经纯化蛋白质的纯度和迁移率(图5)。
因此，如图5中所示，在非还原性条件下检测所有15种抗体的分子量为150kDa或更高，且产生纳武单抗作为对照抗体。
实施例4：PD-1单克隆抗体的特征
1.抗体活性的评估
对所选抗体的活性的测试是使用PD1/PD-L1阻断生物分析试剂盒(promega，J1250)来实施。将高度表达PD-L1的CHO细胞系铺展于96孔板上，培养16小时或更久，用以恒定浓度连续稀释的每种抗体处理，并且然后与高度表达人类PD-1的Jurkat细胞系一起培养6小时。用分光光度计(SpectraMax M5分光光度计，Molecular Devices，美国)测定抗体抑制的恢复程度，其是根据荧光素酶降解底物产生的发光强度来测定的。基于该值发现包括对照抗体在内的16种PD-1抗体的活性通过形成PD-1/PD-L1复合物而恢复减小的信号，且41C9、45D6和49A2展现与对照抗体相似的活性(图6)。
为了以浓度依赖性方式测量PD-1抗体41C9、45D6和49A2的活性，再次进行连续稀释和PD1/PD-L1阻断生物分析，以按浓度梯度依赖性方式恢复减小的信号。恢复程度可表示为EC50(在50％恢复信号水平下mAb的有效浓度)，使用Graphpad Prism6进行分析，并且EC50的体外效能抑制恢复能力显示于图7中。
2.PD1抗体与过表达细胞的亲和性
关于高度表达PD-1的转化细胞池，用含有人类PD-1的质粒pcDNA3.1(NM_005018.2)转化HEK293E，并在含有150ug/ml Zeocin(编号R25001，Thermo Fisher)的选择培养基中进行筛选。通过荧光激活的细胞分选(FACS)分析，使用抗PD-1(编号557860，BD)鉴定并选择每一细胞池，且将其用于功能性分析，例如FACS结合分析或FACS竞争分析。
从高度表达人类PD-1的转化细胞池各自制备每个样品0.5至1x 106个细胞，并且将抗体以恒定稀释率连续稀释，并与所制备细胞在4℃下反应20分钟。然后，用含有2％胎牛血清的PBS(编号LB001-02，Welgene)将细胞洗涤三次，并与抗人类IgG抗体(编号FI-3000，Vectorlabs)在4℃下反应20分钟，该抗人类IgG抗体与FITC(异硫氰酸荧光素)荧光物质偶联。然后，使细胞经历与上文相同的洗涤过程，并且然后用FACSCanto II流式细胞仪(BDBiosciences，美国)作为流式细胞仪将细胞悬浮于0.5ml含有2％FBS(编号26140-079，Thermo Fisher)的PBS中。因此，所有三种PD-1抗体都特异性结合，并根据通过GraphpadPrism6的分析函数获得的平衡解离常数(Kd)测定其结合能力。
因此，如从图8可见，可通过MFI(平均荧光强度)来发现以浓度依赖性方式与细胞表面上过表达的人类PD-1结合的抗体的结合能力。
3.与PD1-45D6和PD1-49A2具有相似序列的阳性噬菌体抗体的筛选
除了41C9以外，对45D6和49A2实施额外抗体筛选，认为41C9在FACS中具有极佳活性和结合能力。
通过与实施例2中相同的程序进一步筛选与PD1-45D6和49A2具有相似序列的抗体。其特征归纳于下表6中。
[表6]额外筛选的45D6和49A2样抗体克隆的特征
克隆名称 VH 同一性 VL 同一性2 组
PD1-72D10 VH3-30 96.90％ O1 94.10％ 1
PD1-74A11 VH3-30 97.96％ O1 95.05％ 2
PD1-75C10 VH3-30 96.94％ O1 95.05％ 3
PD1-74A01 VH3-30 95.92％ O1 92.08％ 4
PD1-74H12 VH3-30 94.90％ O1 92.08％ 5
4.使用ProteOn XPR36的PD1抗体的亲和性
使用ProteOn XPR36(BioRad)仪器。将GLC传感器芯片(BioRad)安装在该仪器上并用PBST缓冲液洗涤，并用EDC/磺基NHS混合溶液激活羧甲基葡聚糖表面。在GLC传感器芯片上注射并固定以5ug/ml浓度溶解于10mM乙酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中的PD1-hFc。
为了使保持未与PD1蛋白反应的活化羧基失活，使1M乙醇胺流入并注射10mM甘氨酸(pH 2.0)，以洗涤保持未与传感器芯片结合的蛋白质。然后，在结合和解离期间随时间收集传感图数据，同时使用PBST缓冲液容许抗体以30μL/min的流速(30nM至0.123nM)流动10min。
平衡解离常数(KD)是通过绘制传感图数据的曲线并根据浓度将传感图数据拟合于平衡状态中来计算。因此，45D6和49A2分别展现0.001nM和0.019nM的KD，指示与PD1抗原的高亲和性(图9)。
实施例5：对PD1抗体、45D和49A2的抗体优化
1.用于优化PD1-45D6和49A2抗体的文库的产生
对于抗体优化，通过固定重链并注射Ybiologics,Inc所拥有的105-106轻链(LC)池来产生新LC改组文库。还通过以下三种方法来实施抗体优化：LC改组；核心堆积+LC改组，对结构上重要的位点(例如重链的疏水核心、暴露残基、电荷簇、盐桥)的残基进行比较分析，使该残基突变为保守残基，并且然后实施LC改组；以及在抗体可变区中的DNA的情况下，CDR热点+LC改组，包括使可在体内亲和性成熟过程中频繁突变的突变热点随机突变，并且然后实施LC改组。
为了产生LC改组文库，用BstX I切割(消化)45D6和49A2抗体的LC基因并且然后将其用作载体，并将Ybiologics,Inc.所拥有的文库池切割(消化)为BstX I并用作插入物。在用连接酶连接后，使用用于电穿孔转化的细胞进行转化。通过在正方形板上收集经转化细胞产生抗体文库。因此，获得约1.5x107个不同文库。序列分析的结果显示，所有HC序列相同，并且LC序列彼此不同。
为了产生核心堆积+LC改组文库，用保守氨基酸序列替代45D6和49A2抗体的框架(FR)位点，用BstX I切割LC基因并且然后将其用作载体，并用BstX I切割Ybiologics,Inc.拥有的文库池并且然后将其用作插入物。在用连接酶连接后，使用用于电穿孔转化的细胞进行转化。通过在正方形板上收集经转化细胞产生抗体文库。因此，获得约8.4x 106个不同文库。序列分析的结果显示，HC的FR位点经保守氨基酸序列替代，且LC序列彼此不同。
为了产生核心热点+LC改组文库，用保守氨基酸序列替代45D6抗体的框架(FR)位点，用Sfi I切割CDR1的热点文库并将其用作插入物，并用Sfi I切割Ybiologics,Inc.拥有的文库池并且然后将其用作载体。在用连接酶连接后，使用用于电穿孔转化的细胞进行转化。通过在正方形板上收集经转化细胞产生抗体文库。因此，获得约5.6x 106个不同文库。序列分析的结果显示，HC的FR位点经保守氨基酸序列替代，CDR1的热点序列发生随机突变，且LC序列彼此不同。
实施例6：PD-1人类抗体的筛选
1.抗原制备
将Ybiologics,Inc生产的PD1-hFc和PD1-mFc以及购自Sino Biological Inc.的PD1-his(目录号，10377-H08H)作为蛋白质抗原以50ug剂量涂布于免疫吸附管上，并且然后加以封阻。
2.生物淘选
通过用细菌感染人类scFv文库(具有2.7x 1010各种各样的)并且然后在30℃下培养16小时来获得人类抗体文库噬菌体。在培养后，对培养溶液进行离心，用PEG浓缩上清液，并且然后溶解于PBS缓冲液中，以制备人类抗体文库。将人类抗体文库噬菌体装填至免疫管中，随后在室温下反应2小时。在用1X PBS/T和1X PBS洗涤后，仅洗脱与抗原特异性结合的scFv-噬菌体。
用大肠杆菌再次感染经洗脱噬菌体并扩增(淘选过程)，以获得阳性噬菌体池。对于抗体优化，仅实施第一轮淘选。因此，如表7中所示，可见在第一轮淘选期间，与输入噬菌体相比，与抗原结合(输出)的噬菌体数略有增加。
[表7]在优化淘选中抗体效价的对比
样品 输入噬菌体数 输出噬菌体数
45D6(LS) 1.3X 1013 2.8X 107
45D6(核心堆积+LS) 1.1X 1013 4.8X 107
45D6(CDR热点+LS) 1.1X 1013 3.6X 106
49A2(LS) 1.3X 1013 1.8X 107
49A2(CDR热点+LS) 1.1X 1013 1.6X 106
3.阳性噬菌体的筛选
将从淘选获得的菌落在1ml 96深孔板(Bioneer 90030)中在37℃下培养16小时。将由此生长的100至200μl细胞添加至含有2x YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中至OD600为0.1，并添加至含有1ml 2x YTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中，并且然后在96深孔板中在37℃下培养2至3小时至OD600为0.5至0.7。以1:20的MOI感染M1辅助噬菌体并在含有2x YTCMK、5mM MgCl2和1mM IPTG的培养基中在30℃下培养16小时。
将抗原PD1以100ng/孔的密度涂布于96孔免疫板上，在4℃下16小时，并使用溶解于PBS中的4％脱脂乳封阻每孔。将用0.2ml PBS/T洗涤并培养16小时的每种单克隆scFv-噬菌体(100scFv-噬菌体)以1μl剂量添加至每孔，并在室温下反应2小时。再次用0.2ml PBS/T将每孔洗涤4次，并将二级抗体抗M13-HRP稀释至1/2000，并在室温下反应1小时。在用0.2mlPBS/T洗涤后，进行显色并在490nm下测量吸光度。
因此，获得对每种抗原的结合能力高于亲代抗体(49A2或45D6)的单一噬菌体克隆，且结果显示于图10中。
4.阳性噬菌体抗体的碱基序列分析
使用DNA纯化试剂盒(Qiagen，德国)使所选单一克隆经历DNA-prep以获得DNA，并请求对DNA的序列分析(Solgent)。基于序列分析结果鉴定所选抗体的VH和VL的CDR区，并使用NCBI网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/上的Ig BLAST程序研究这些抗体与种系抗体组之间的相似性(同一性)。因此，获得25种结合能力高于亲代抗体的噬菌体抗体(49A2：10种，45D6：15种)并归纳于下表8中。
[表8]通过优化选择的PD1抗体变体的单克隆的特征
Figure GDA0001989870450000471
Figure GDA0001989870450000481
包括所选抗体的重链和轻链CDR和FR序列的抗体，以及包括所选抗体的重链和轻链CDR和FR序列的重链可变区和轻链可变区显示于下表9和10中。
[表9]PD1人类抗体的重链可变区
Figure GDA0001989870450000482
Figure GDA0001989870450000491
Figure GDA0001989870450000501
Figure GDA0001989870450000511
Figure GDA0001989870450000521
[表10]PD1人类抗体的轻链可变区
Figure GDA0001989870450000522
Figure GDA0001989870450000531
Figure GDA0001989870450000541
Figure GDA0001989870450000551
Figure GDA0001989870450000561
Figure GDA0001989870450000571
Figure GDA0001989870450000581
实施例7：PD-1人类抗体的产生
1.scFv形式至IgG形式的转化
对重链和轻链进行PCR(iCycler iQ，BIO-RAD)以将所选25种针对PD1的单克隆噬菌体抗体从噬菌体转化为IgG完整载体。因此，获得重链和轻链，并用限制性酶切割(消化)每种克隆的载体以及重链和轻链。用DNA-凝胶萃取试剂盒(Qiagen)从载体和重链中的每一者洗脱DNA。通过以下方式进行连接：混合1μl(10ng)载体、15μl(100-200ng)重链、2μl的10x缓冲液、1μl连接酶(1U/μl)和蒸馏水，使混合物在室温下静置1至2小时，将所得混合物注射至经转化细胞(感受态细胞，XL1-蓝)中，将细胞置于冰上5分钟并使细胞在42℃下经历90秒热休克。
在热休克后，将1ml培养基添加至细胞，并且然后使细胞在37℃下生长1小时，铺展于LB Amp板上，并在37℃下孵育16小时。将由此获得的菌落用5ml LB Amp培养基接种，在37℃下培养16小时，并使用DNA-prep试剂盒(Nuclogen)使其经历DNA-prep。请求所获得DNA的序列分析(Solgent)。
因此，确认25种针对PD1的克隆的重链和轻链序列转化为完整IgG，与噬菌体抗体的序列相对应。为了转染至HEK 293F细胞中，使转化为完整IgG的各个克隆的重链和轻链在100ml的LB Amp培养基中生长，并使用Midi-prep试剂盒(QIAgen)获得DNA。
2.人类抗体产生
将经克隆pNATVH和pNATVL载体以6:4的比率共转染至HEK293F细胞中，并在第7天收集上清液，通过离心和0.22μm顶部滤纸去除细胞和碎片，并收集上清液且对上清液进行蛋白A亲和层析以纯化IgG抗体。在纯化后，经甘氨酸缓冲液分离抗体，并更换缓冲液，使得最终再悬浮缓冲液为PBS。通过BCA和nano drop对经纯化抗体进行定量，并将25种抗体各自以5ug剂量在还原性和非还原性条件下加载，并通过SDS-PAGE分析以测定经纯化蛋白质的纯度和迁移率。另外，将一些上清液加载于SDS-PAGE上以与亲代抗体对比表达率，大多数抗体的表达多于亲代抗体，且结果可见于图11。
实施例8：PD-1单克隆抗体的特征
1.抗体活性的评估
对所选抗体的活性的测试是使用PD1/PD-L1阻断生物分析试剂盒(promega，J1250)来实施。将高度表达PD-L1的CHO细胞系铺展于96孔板上，培养16小时或更久，用以恒定浓度连续稀释的每种抗体处理，并且然后与高度表达人类PD-1的Jurkat细胞系一起培养6小时。用分光光度计(SpectraMax M5分光光度计，Molecular Devices，美国)测定抗体抑制的恢复程度，其是根据荧光素酶降解底物产生的发光强度来测定的。基于该值发现24种PD-1抗体的活性通过形成PD-1/PD-L1复合物而恢复减小的信号，并且45D6抗体中的45D6-3D2、45D6-3H7、45D6-5B2和45D6-5B5以及49A2抗体中的49A2-1B2、49A2-1H8、49A2-2A6和49A2-2B9展现高于亲代抗体的活性和与对照抗体类似的活性(图12)。
为了以浓度依赖性方式测量8种PD-1抗体(45D6-3D2、45D6-3H7、45D6-5B2、45D6-5B5、49A2-1B2、49A2-1H8、49A2-2A6、49A2-2B9)的活性，再次进行连续稀释和PD1/PD-L1阻断生物分析，以按浓度梯度依赖性方式恢复减小的信号。恢复程度可表示为EC50(在50％恢复信号水平下mAb的有效浓度)，使用Graphpad Prism6进行分析，并且49A2-1B2展现最高的EC50体外效能抑制恢复能力(图13，表11)。
[表11]所选PD1抗体变体的单克隆的活性
Figure GDA0001989870450000601
Figure GDA0001989870450000611
2.PD1抗体与过表达细胞的亲和性
关于高度表达人类PD-1的转化细胞池，用含有人类PD-1(NM_005018.2)或人类PD-L1(NM_014143.2)的pcDNA3.1质粒转化HEK293E，并在含有400ug/ml Zeocin(编号R25001，Thermo Fisher)的选择培养基中进行筛选。通过荧光激活的细胞分选(FACS)分析，使用抗PD-1(编号557860，BD)鉴定并选择每一细胞池，且将其用于功能性分析，例如FACS结合分析或FACS竞争分析。从高度表达人类PD-1的转化细胞池制备每个样品0.5至1x 106个细胞，并且将抗体以恒定稀释率连续稀释，并与所制备细胞在4℃下反应20分钟。然后，用含有2％胎牛血清的PBS(编号LB001-02，Welgene)将细胞洗涤三次，并与抗人类IgG抗体(编号FI-3000，Vectorlabs)在4℃下反应20分钟，该抗人类IgG抗体与FITC(异硫氰酸荧光素)荧光物质偶联。然后，使细胞经历与上文相同的洗涤过程，并且然后用FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences，美国)作为流式细胞仪将细胞悬浮于0.5ml含有2％FBS(编号26140-079，Thermo Fisher)的PBS中。
从高度表达人类PD-1的转化细胞池各自制备每个样品0.5至1x106个细胞，并且将抗体以恒定稀释率连续稀释，并与所制备细胞在4℃下反应20分钟。然后，用含有2％胎牛血清的PBS(编号LB001-02，Welgene)将细胞洗涤三次，并与抗人类IgG抗体(编号FI-3000，Vectorlabs)在4℃下反应20分钟，该抗人类IgG抗体与FITC(异硫氰酸荧光素)荧光物质偶联。然后，使细胞经历与上文相同的洗涤过程，并且然后用FACSCanto II流式细胞仪(BDBiosciences，美国)作为流式细胞仪将细胞悬浮于0.5ml含有2％FBS(编号26140-079，Thermo Fisher)的PBS中。根据通过Graphpad Prism6的分析函数获得的平衡解离常数(Kd)测定结合能力。因此，如从图15可见，可通过MFI(平均荧光强度)来发现以浓度依赖性方式与细胞表面上过表达的人类PD-1结合的抗体的结合能力。如从图14和15可见，不包括49A2(亲代49A2)的抗体展现类似结合能力。
3.通过酶免疫吸附，抗体针对PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2复合物形成的抑制能力
将人类PD-1-Fc(S1420，Y-Biologics)或PD-L2-Fc(编号10292-H02H，Sino)添加至96孔免疫微量板(编号439454，Thermo)的孔中，并且然后用含有0.05％tween-20的PBS(编号P9416，Sigma-Aldrich)洗涤三次，随后使其在含有4％脱脂乳(编号232120，Becton，Dickinson and Company)的洁净溶液中在室温下静置1小时，以阻断非特异性结合。同时，使人类PD-L1-His(S1479，Y-Biologics)或PD-1-His(S1352，Y-Biologics)与以恒定稀释率连续稀释的抗体在室温下反应1小时，随后使其在经制备微量板中在室温下静置1小时。在使所得产物经历与上文相同的洗涤方法后，将稀释至1:2000的抗生物素His抗体(编号MA1-21315-BTIN，Thermo)添加至微量板的孔中，使其在室温下反应1小时，将稀释至1:5000的抗生蛋白链菌素聚HRP抗体(编号21140，Pierce)添加至微量板的孔中，在室温下反应1小时，并且然后以相同方式洗涤。将100ul TMB底物溶液(编号T0440，Sigma-Aldrich)添加至反应产物，遮光，并使反应产物在室温下静置3分钟，添加50μL 2.5M硫酸(编号S1478，Samchun)以停止反应，并在450nm下使用分光光度计(编号GM3000，
Figure GDA0001989870450000621
Discover SystemPromega)测量吸光度。结果显示于图16中。
4.使用ProteOn XPR36的PD1抗体的亲和性
使用ProteOn XPR36(BioRad)仪器。将GLC传感器芯片(BioRad)安装在该仪器上并用PBST缓冲液洗涤，并用EDC/磺基NHS混合溶液激活羧甲基葡聚糖表面。在GLC传感器芯片上注射并固定以5ug/ml浓度溶解于10mM乙酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中的PD1-hFc。
为了使保持未与PD1蛋白反应的活化羧基失活，使1M乙醇胺流入并注射10mM甘氨酸(pH 2.0)，以洗涤保持未与传感器芯片结合的蛋白质。然后，在结合和解离期间随时间收集传感图数据，同时使用PBST缓冲液容许抗体以30μL/min的流速(30nM至0.123nM)流动10min。
平衡解离常数(KD)是通过绘制传感图数据的曲线并根据浓度将传感图数据拟合于平衡状态中来计算。因此，49A2(2B9)展现0.001nM的KD，指示对PD1抗原的高亲和性(图17)。
其他抗体对人类PD-1蛋白的亲和性、对猴PD-1蛋白的亲和性以及对大鼠PD-1蛋白的亲和性显示于表12至14中。
[表12]人类PD1蛋白与所选抗体之间的结合动力学
Ab KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s)
PD1 49A2 2.371ⅹ10-10 3.953ⅹ105 9.372ⅹ10-5
PD1 49A2 1H8 1.245ⅹ10-11 2.201ⅹ105 2.741ⅹ10-6
PD1 49A2 1B2 1.659ⅹ10-10 3.853ⅹ105 6.390ⅹ10-5
PD1 49A2 2A6 6.907ⅹ10-11 3.101ⅹ105 2.142ⅹ10-5
PD1 49A2 2B9 1.0ⅹ10-12 3.774ⅹ105 1.0ⅹ10-7
PD1 45D6 1.0ⅹ10-12 2.701ⅹ105 1.07ⅹ10-7
PD1 45D6 3D2 1.0ⅹ10-12 1.81ⅹ105 1.0ⅹ10-7
PD1 45D6 3H7 2.53ⅹ10-11 3.076ⅹ105 7.781ⅹ10-6
PD1 45D6 5B2 5.818ⅹ10-11 3.315ⅹ105 1.928ⅹ10-5
PD1 45D6 5B5 4.773ⅹ10-11 2.96ⅹ105 1.413ⅹ10-5
[表13]猴PD1蛋白与所选抗体之间的结合动力学
Ab KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s)
PD-1-49A2 1.0ⅹ10-12 1.683ⅹ105 1.0ⅹ10-7
PD-1-49A2-2B9 1.0ⅹ10-12 1.853ⅹ105 1.0ⅹ10-7
PD-1-45D6 1.0ⅹ10-12 1.535ⅹ105 1.0ⅹ10-7
PD-1-45D6-5B2 1.0ⅹ10-12 2.078ⅹ105 1.0ⅹ10-7
[表14]大鼠PD1蛋白与所选抗体之间的结合动力学
Ab KD(M) Ka(1/Ms) Kd(1/s)
PD-1-49A2-2B9 4.231ⅹ10-9 1.478ⅹ105 6.252ⅹ10-4
PD-1-45D6 2.391ⅹ10-9 5.544ⅹ104 1.326ⅹ10-4
PD-1-45D6-5B2 4.590ⅹ10-9 1.879ⅹ105 8.626ⅹ10-4
实施例9：PD1单克隆抗体的表位的测定
将结合至PD1抗原的单克隆scFv-噬菌体在含有2xYTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中在37℃下培养16小时。将由此生长的细胞在含有2xYTCM、2％葡萄糖和5mM MgCl2的培养基中培养至OD600为0.1，并且然后在37℃下培养2至3小时，OD600为0.5至0.7。以1:20的MOI感染M1辅助噬菌体并在含有2xYTCMK、5mM MgCl2和1mM IPTG的培养基中在30℃下培养16小时。
将抗原PD1野生型(WT)或若干种变体(图18)以100ng/孔的密度涂布于96孔免疫板上，在4℃下16小时，并用溶解于PBS中的4％脱脂乳封阻各孔。用0.2ml PBS/T洗涤每孔，并且然后将培养16小时的单一克隆scFv-噬菌体(每一100scFv-噬菌体)以100μl剂量添加至每孔并在室温下反应2小时。再次用0.2ml PBS/T将每孔洗涤4次，并且然后将第二抗体抗M13-HRP稀释至1/2000并在室温下反应1小时。在用0.2ml PBS/T洗涤后，进行显色并在490nm下测量吸光度。
因此，确认所选单一克隆scFv-噬菌体、对照scFv-噬菌体和PD-1变体显示不同结合行为并因此具有不同表位(图19)。
将抗原PD1野生型(WT)或若干种变体(图18)以100ng/孔的密度涂布于96孔免疫板上，在4℃下16小时，并用溶解于PBS中的4％脱脂乳封阻各孔。用0.2ml PBS/T洗涤每孔，并且然后将培养16小时的单一克隆scFv-噬菌体以100μl(1ug/ml)剂量添加至每孔并在室温下反应2小时。再次用0.2ml PBS/T将每孔洗涤4次，并且然后将第二抗体抗Fab稀释至1/2000并在室温下反应1小时。在用0.2ml PBS/T洗涤后，进行显色并在490nm下测量吸光度。
因此，确认对照scFv-噬菌体和PD-1变体显示不同结合行为并因此具有不同表位(图20)。
实施例10：PD1亲代抗体的特异性结合
为了鉴定PD1亲代抗体和对照抗体(纳武单抗)对除了PD1抗原以外的多种抗原的结合能力(表15)，将约90种非特异性抗原以100ng/孔的密度涂布于96孔免疫板上，在4℃下16小时，且使用溶解于PBS中的4％脱脂乳封阻各孔。用0.2ml PBS/T洗涤每孔，并且然后将亲代抗体和对照抗体以100μl(1ug/ml)剂量添加至每孔并在室温下反应2小时。再次用0.2ml PBS/T将每孔洗涤4次，并且然后将第二抗体抗κ-HRP稀释至1/2000并在室温下反应1小时。在用0.2ml PBS/T洗涤后，进行显色并在490nm下测量吸光度。
[表15]
Fc GP1BA LRRN4 TLR3 LRTM1 TPBG SEMA5A SEMA5A SLITRK5 EPYC LINGO1 OGN
OPTC RTN4RL1 LRRC4C LRRTM2 TLR4 TLR7 TLR9 LRRN1 SLITRK2 FZD10 C2orf28 SUSD1
FSTL3 SPOCK1 CD209 CD97 SCARF1 WIF1 TNR EMR1 SPARC DNER 8AM81 FSTL1
Kremen1 CFC1 TMEFF2 NRG4 SPOCK2 CD40LG FASLG TNFSF4 GREM1 Fc LRP11 LRP12
APCDD1 CHRDL1 DKK4 DMP1 LRP6 TNFSF9 TNFSF8 TNF TNFSF12 TMED1 CD320 SOST
C18orf1 OSTM1 NBL1 DKK3 ECM1 TNFSF18 TNFSF13 DKK1 SELP HAPLN4 ULBP1 SPNT2
PLXDC1 PLXDC2 PODXL CDCP1 P13 WFDC2 AGR2 AGR3 CREG1 EV12A RAET1E MICA
CD86 ICOSLG CD276 PDCD1 BTN2A1 BTN3A2 BTN3A1 BTNL9 BTN3A3 BTN1A1 Fc 空白
因此，确认对照抗体和亲代抗体二者都仅与PD1抗原特异性结合，不结合至未指定抗原(图21)。
实施例11：PD1单克隆抗体在瞬时表达系统中的生产率的对比
可见在通过瞬时表达系统产生和纯化时，经优化抗体由于极佳物理性质而具有相对均一的高生产率。一些抗体的生产率高于常规市售抗体(图22)。
实施例12：PD1单克隆抗体在同种异体MLR反应中的活性增加
将T细胞与从不同人类分离的单核细胞源树突细胞以1∶10的比率混合并培养5天，并测量培养基中干扰素γ的量。因此，含有45D6和49A2的亲代抗体的培养基展现干扰素γ的量的浓度依赖性增加(图23)。
实施例13：PD1单克隆抗体的热稳定性测试
将抗体蛋白于DPBS中稀释至3uM，45ul，与5ul 200x Sypro橙染料(编号S6650，Thermo)混合，并且然后以50ul剂量等分至qPCR管(编号B77009，B57651，bioplastics)中。使用Biorad CFX96实时PCR系统进行QPCR。qPCR条件给定如下：在25℃下反应30秒，以1℃升温直至99℃，且同时在每一温度下反应1min，且最终在25℃下反应10秒。使用Tm(熔融温度)作为抗体结构未结合的比率常数。结果显示于下表16中。
[表16]
样品 Tm
派姆单抗 63
Opdivo 64
45D6 63
49A2 63
49A2-2B9 64
工业利用度
根据本公开文本的结合至PD-1的新颖抗体或其抗原结合片段可结合至PD-1并抑制PD-1的活性，因此可用于研发针对多种与PD-1相关的疾病的免疫治疗剂。
尽管已详细描述本公开文本的具体配置，但本领域技术人员将了解，本描述仅作为优选实施方案来提供用于说明性目的，且不应视为限制本公开文本的范围。因此，本公开文本的实质范围是由随附权利要求和其等效内容来限定。
文本文件
参见所附的序列表。
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<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
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<223> 人工序列
<400> 20
Gly Phe Thr Phe Pro Ile Tyr Ala
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 21
Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr Ala
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 22
Gly Phe Thr Phe Lys Tyr Tyr Ala
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 23
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 24
Gly Phe Thr Phe Leu Val Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 25
Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr Ala
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 26
Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 27
Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Ala
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 28
Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Ala
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 29
Gly Phe Thr Phe Met Arg Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 30
Gly Phe Thr Phe Trp Thr Tyr Ala
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 31
Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 32
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 33
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 34
Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Ile Ile Pro Leu Phe Ser Thr Ala
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 37
Ile Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala
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<211> 8
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 39
Ile Ser Trp Asn Ser Asn Asn Ile
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Leu His Ala Asp Ser Gly Lys Thr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Val Ile Pro Thr Leu Gly Leu Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 45
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 60
Ala Arg Ser Ile Arg Gln Ile Leu Asp Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<211> 14
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 62
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 63
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1 5 10 15
<210> 64
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 64
Ala Lys His Lys Gly Leu Pro Phe Asp Trp Ser Pro Asp Gly Phe Asp
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Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 65
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 66
Val Thr Ser Gly Pro Phe Gly Glu Phe Arg Asn
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<211> 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 67
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 68
Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr
1 5 10 15
Phe Asp Met
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 69
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 70
Ala Arg Gly Thr His Trp Leu Asp Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 71
Ala Arg Glu Glu Gln Phe Leu Ile Ala Leu Ala Gly Arg Tyr Phe Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 72
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 72
Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 73
Ala Arg Ile Gly Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 74
Ser Thr Ser Gly Leu Gly Val His Ala
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 75
Ala Arg Asp Ser Phe Gly Gly His Leu Asp Leu
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 76
Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 77
Ala Arg Gly His Asn Tyr Leu Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Tyr
1 5 10
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<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 78
Ala Ser Val Ser Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Gln Gly Thr Phe
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 79
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 79
Ala Arg Thr Thr Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 80
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 81
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 82
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 83
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 83
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 84
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 84
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 85
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 85
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 86
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 87
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 87
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 88
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 88
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 89
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 90
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 90
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 91
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 92
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 93
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 94
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser
20 25
<210> 95
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 96
Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Val
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 97
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Val
<210> 98
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 98
Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 99
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 100
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 101
Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met Ala
1 5 10 15
Asp
<210> 102
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 102
Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Asp
<210> 103
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 103
Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Ile
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 104
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 105
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Ala Pro Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Trp
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 106
Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Leu
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 107
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 108
Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 109
Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Asn
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 110
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Glu
<210> 111
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 111
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly
<210> 112
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 112
Leu Thr Trp Val Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
1 5 10 15
Phe
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 113
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr
1 5 10 15
Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 114
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
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35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 115
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Pro Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 116
Val Tyr Ala Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 117
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
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Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 118
His Ser Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 119
Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Val
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Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 120
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
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Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asp
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 121
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr
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Ser Thr Ser Ser Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<211> 38
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 124
Gly Tyr Ala Gln Thr Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ile Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 125
Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
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Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 126
Thr Tyr Ala Gln Asn Phe Gln Asp Thr Val Thr Ile Ile Ala Asp Lys
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Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Asn Leu Arg Ser Glu Asp
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 127
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn
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<223> 人工序列
<400> 128
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Gly Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 132
Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
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Asp Asp Ser Lys Ser Ile Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 133
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
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35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 134
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
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Ser Lys Asn Met Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 142
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 143
Trp Gly Gln Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 144
Trp Gly Gln Gly Thr Pro Ile Thr Val Ser Ser
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 145
Trp Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 146
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 147
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 148
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gln Gln Gln Ile Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 149
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 149
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ile Arg Gln Ile Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 150
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 150
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Pro Xaa Ser Arg Ser Arg Leu Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 151
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 151
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Xaa Thr Ser Pro Leu Asp Met Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 152
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 152
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Leu His Gln Met Asn Glu His Glu Phe Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 153
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 153
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Leu Phe Ser Thr Ala His Ser Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Lys Gly Leu Pro Phe Asp Trp Ser Pro Asp Gly Phe Asp
100 105 110
Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 154
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 154
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Arg Asn
20 25 30
Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met
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Ala Asp Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Val Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Ile Glu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 155
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 155
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 156
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 156
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Val Thr Ser Gly Pro Phe Gly Glu Phe Arg Asn Trp Gly Leu Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 157
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 157
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 158
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 158
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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85 90 95
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100 105 110
Ser Ser
<210> 159
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 159
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Gly Ile Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
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<400> 187
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 188
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 188
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Thr Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 189
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 190
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 192
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Ser Ser
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<211> 114
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<223> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列
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caccagggtt tggaactggc 20
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<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe
50 55 60
Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu
65 70 75 80
Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
85 90 95
Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
100 105 110
Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser
115 120 125
Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met
130 135 140
Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro
145 150 155 160
Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn
165 170 175
Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser
195 200 205
Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
225 230
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Arg Asp Ile Ser Arg Trp
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Gln Ser Leu Val His
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 200
Gln Ala Ile Ser Asn Trp
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Ala Leu Ser Lys Gln Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 203
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<211> 6
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<211> 6
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr
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<211> 9
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 212
Arg Ser Asn Phe Gly Ala Gly His Asp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 213
Gln Ser Leu Leu Asp Ser His Asp Gly Asn Thr Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn Thr
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列
<400> 215
Gln Ser Leu Phe Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<210> 217
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Asn Tyr
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 218
Ala Leu Ser Lys Glu Tyr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 219
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1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 220
Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr
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<210> 221
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 221
Gln Ser Leu Leu Asp Arg Asp Gly Gly His Thr Tyr
1 5 10
<210> 222
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 222
Gln Ser Leu Leu Asp Arg Gly Gly Gly His Thr Tyr
1 5 10
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 223
Gly Ala Ser
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 224
Lys Ile Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 225
Ala Thr Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 226
Lys Asp Thr
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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1
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<211> 3
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 228
Gly Asn Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 229
Arg Ala Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 230
Thr Leu Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 231
Ala Ala Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 232
Asn Tyr Asp
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 233
Gly Lys Asn
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 234
Gln Asp Thr
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Asp Val Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 236
Gly Asn Asn
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 237
Arg Asp Asp
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 238
Glu Val Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 239
Leu Gly Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 240
Lys Asp Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 241
Asp Ala Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 242
Gln Gln Gly Lys Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 243
Met Gln Ser Thr Gln Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 244
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 244
Gln Gln Thr Asp Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 245
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 245
Gln Ser Ile Thr Asp Lys Ser Gly Thr Asp Val Ile
1 5 10
<210> 246
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 246
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val
1 5 10
<210> 247
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 247
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val
1 5 10
<210> 248
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 248
Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 249
Leu Gln Arg Met Gly Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 250
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 250
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Arg Thr
1 5
<210> 251
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 251
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Trp Leu
1 5 10
<210> 252
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 252
Met Gln Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 253
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 253
Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Lys Ser Leu Val
1 5 10
<210> 254
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 254
Met Thr Trp Asp Val Asp Thr Thr Ser Met Ile
1 5 10
<210> 255
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 255
Ser Ser Phe Thr Ser Ser Ser Thr Val Val
1 5 10
<210> 256
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 256
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Gly
1 5 10
<210> 257
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 257
Met Gln Arg Ile Asp Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 258
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 258
Ala Ser Trp Asp Asp Thr Leu Asn Gly Trp Val
1 5 10
<210> 259
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 259
Ser Ser Phe Ala Arg Asn Ser Asn Tyr Val
1 5 10
<210> 260
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 260
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
20 25
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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<223> 人工序列
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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His
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<223> 人工序列
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Tyr
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<223> 人工序列
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Tyr
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<223> 人工序列
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Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 301
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 302
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
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Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile
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Tyr
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<223> 人工序列
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Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile
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Tyr
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<223> 人工序列
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Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Tyr
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Tyr
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Tyr
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Tyr
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<223> 人工序列
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Tyr
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<223> 人工序列
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Val Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
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Tyr
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
<400> 315
Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 316
Ser Leu Arg Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
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Thr Tyr Phe Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 317
Asn Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 318
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 319
Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
1 5 10 15
Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Gly Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 320
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 320
Arg Leu Thr Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Arg Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 321
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 321
Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Ala
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 322
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 322
Asp Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 323
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 323
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 324
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 324
Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 325
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 325
Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 326
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 326
Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Glu Phe Asn Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 327
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 328
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 328
Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Arg Asp Glu Ser
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 329
Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 330
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 330
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Glu Tyr Tyr Cys
35
<210> 331
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 331
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Leu Tyr Tyr Cys
35
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 332
Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
1 5 10 15
Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 333
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 333
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 334
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 334
Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala
20 25 30
Asp Tyr Tyr Cys
35
<210> 335
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 335
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1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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20 25 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 339
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1 5 10 15
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<220>
<223> 人工序列
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1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 341
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35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 342
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1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 343
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<220>
<223> 人工序列
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1 5 10 15
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20 25 30
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35
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 345
His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Leu Tyr Tyr Cys
35
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 346
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1 5 10 15
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35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 347
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1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asn Val Gly
20 25 30
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35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 348
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1 5 10 15
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20 25 30
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35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 349
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<220>
<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 355
His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser His
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Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 363
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 364
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<213> 人工序列
<220>
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 366
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 367
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 368
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Arg Trp
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 369
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Leu
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 370
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Asn Trp
20 25 30
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
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<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 371
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Met Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Ser Lys Gln Tyr Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
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<210> 372
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 372
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Met Ser Glu Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Arg Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
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100 105 110
<210> 373
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 373
Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Lys Ser Ala Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
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100 105 110
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 374
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105
<210> 375
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 375
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
Arg Met Gly Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 376
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 376
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Thr Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 377
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 377
Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Asn Ile Val Ile Ser Cys Ser Ala Ser Thr Phe Asn Ile Gly Thr Thr
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Tyr Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Ala Trp Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 378
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 378
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Asn Leu Arg
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 379
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 379
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Lys Ser
85 90 95
Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 380
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 380
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ala Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Asn Ile Ile Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Thr Lys Tyr Val
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Thr Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Arg
65 70 75 80
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85 90 95
Met Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 381
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 381
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
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85 90 95
Ser Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 382
Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Arg Ser Asn Phe Gly Ala Gly
20 25 30
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Leu Ser Ala Trp Gly Val Arg Arg Arg Asp Gln Ala Asp Arg Pro
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65 70 75 80
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<400> 407
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<400> 408
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<220>
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Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
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Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Arg Asp Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 412
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20 25 30
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65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
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100 105 110
Lys
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<211> 113
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 413
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1 5 10 15
Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Glu Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
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Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
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Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
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Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
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Lys
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Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
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<212> PRT
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1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Arg
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Gly Gly Gly His Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
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Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser His Arg Ala Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
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Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln
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<400> 420
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
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65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
Arg Ile His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys

Claims (10)

1.一种结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含SEQ ID NO: 17的重链CDR1、SEQ ID NO: 54的重链CDR2和SEQ IDNO: 58的重链CDR3；以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO: 205的轻链CDR1、SEQ ID NO: 230的轻链CDR2和SEQ ID NO: 267的轻链CDR3。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
SEQ ID NO: 80的重链可变区FR1；
SEQ ID NO: 97的重链可变区FR2；
SEQ ID NO: 114的重链可变区FR3；和
SEQ ID NO: 137的重链可变区FR4。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
SEQ ID NO: 276的轻链可变区FR1；
SEQ ID NO: 302的轻链可变区FR2；
SEQ ID NO: 346的轻链可变区FR3；和
SEQ ID NO: 356的轻链可变区FR4。
4.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其包含：包含序列SEQ ID NO: 178的重链可变区和包含序列SEQ ID NO: 398的轻链可变区。
5.一种核酸，其编码权利要求1至4中任一项的抗体或其抗原结合片段。
6.一种表达载体，其包含根据权利要求5的核酸。
7.一种用根据权利要求6的表达载体转化的细胞。
8.一种用于产生结合至PD-1的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含：
(a) 培养根据权利要求7的细胞；并且
(b) 从所述细胞的培养物中回收该抗体或其抗原结合片段。
9.一种用于治疗癌症的组合物，其包含权利要求1至4中任一项的抗体或其抗原结合片段作为活性成分，其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：黑色素瘤、肺癌、肝癌、神经胶质细胞瘤、卵巢癌、结肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、乳腺癌、转移癌、前列腺癌和胰腺癌。
10.包含权利要求1至4中任一项的抗体或其抗原结合片段作为活性成分的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：黑色素瘤、肺癌、肝癌、神经胶质细胞瘤、卵巢癌、结肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、乳腺癌、转移癌、前列腺癌和胰腺癌。
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