CN109988231A - 水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用。本发明涉及的水稻基因OsGRF4为穗部性状调控基因，来源于籼稻品种川大粒，该基因表达量的升高导致水稻耐冷性的增强。实验结果表明，在冷胁迫下OsGRF4超表达转基因株系的存活率显著高于野生型，而OsGRF4抑制表达转基因株系的存活率显著低于野生型，本发明首次证明OsGRF4基因具有增强水稻耐冷性的功能。OsGRF4基因对于培育耐冷水稻品种具有较大的应用前景，本发明为植物抗寒育种，特别是水稻抗寒育种提供了新的基因资源。

Description

水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用。

背景技术

据世界实时统计数据库公布，2019年1月，全世界的人口达到了77.15亿。按照每年1亿的增长趋势，到2050年，全球人口总数将接近100亿。据预测，到本世纪中叶，全世界的农业水平要比2005年提高60％-120％才能养活这100亿人口。水稻是最重要的粮食作物之一，全球有一半以上的人口以稻米作为主食，稻谷的产量关系到世界的粮食安全。水稻起源于热带、亚热带，是喜温植物，对低温很敏感。低温冷害严重制约着水稻的播种面积和播种范围，同时严重影响水稻的高产与稳产。仅以我国为例，每年因冷害导致稻谷减产50-100亿公斤(赵正武等，西南农业学报，2006,19:330-335)。因此，当前迫切需要挖掘更多的耐冷功能基因、培育耐冷品种以减少冷害对水稻产量造成的损失。

根据水稻的生长阶段，可以将水稻冷害分为芽期冷害、苗期冷害和生殖期冷害。水稻的耐冷性多由数量性状位点控制，目前，研究者利用籼/粳(少数为粳/粳或野/栽)遗传群体或者利用自然群体进行连锁分析或者关联分析，定位到较多的耐冷QTL(Lv et al.,Plant Cell Environ,2016,39(3):556-570；Wang et al.,Rice,2016,9(1):61)。然而，已克隆的耐冷QTL甚少，严重制约了水稻耐冷性的分子育种进程。因此，迫切需要加快水稻耐冷资源的引进、创制与评价，挖掘更多新的水稻耐冷基因，为明晰水稻耐冷分子机理和调控网络奠定基础，也为更好更快地培育耐冷性增强的水稻新品种提供基因资源和技术支持，对保障我国粮食安全有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用。其中，所述水稻基因OsGRF4为水稻穗部性状调控基因，来源于籼稻品种川大粒。OsGRF4为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

可选地，所述水稻基因OsGRF4的核苷酸序列包含从下组核苷酸序列(1)-(7)中选择的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(2)在严格条件下与(1)的核苷酸杂交且编码植物耐冷相关蛋白的核苷酸序列；

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的核苷酸序列；

(4)与(1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码子的简并性而在序列上不同的核苷酸序列；

(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或者，由于一个或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的氨基酸序列；

(6)(1)-(5)任一核苷酸序列的活性片段；或

(7)与(1)-(5)任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。

其中，(2)-(7)中定义的核苷酸序列具有增强植物耐冷性的功能。

本发明中，所述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本发明中，所述植物包括但不限于水稻、玉米、高粱、小麦和大麦。

第二方面，本发明提供一种提高植物耐冷性的方法，所述方法包括：

1)使植物包含水稻基因OsGRF4；或

2)使植物表达水稻基因OsGRF4。

前述的方法，所述方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

进一步地，所述方法包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导等常规生物学方法将包含水稻基因OsGRF4的重组表达载体导入植物细胞，获得转基因植株；或者，将含有水稻基因OsGRF4的植株与另一植株杂交，获得杂交后代。所获得的后代植株其耐冷性得到改良。

第三方面，本发明提供水稻基因OsGRF4的启动子，所述启动子为：

i)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有启动子活性的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:4所示序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的核苷酸序列；

v)i)～iv)任一核苷酸序列的活性片段；或

vi)与i)～iv)任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明还提供包含所述水稻基因OsGRF4启动子的生物材料。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明首次揭示了水稻OsGRF4基因具有增强植物耐冷性的功能，OsGRF4基因对进一步阐明植物耐冷调控机理和遗传网络有着重要的意义。

(二)实验表明，在冷胁迫下OsGRF4超表达转基因水稻株系的存活率显著高于野生型，可将OsGRF4基因用于植物遗传改良，以获得耐冷性增强的植物。

(三)本发明为植物抗寒育种，特别是水稻抗寒育种提供了新的基因资源，对培育耐冷作物新品种、保障作物生产安全具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中NIL-OsGRF4与NIL-Osgrf4分别于8℃低温处理6天的耐冷表型。其中，NIL-S与NIL-L分别表示NIL-Osgrf4与NIL-OsGRF4。

图2为本发明实施例2中超表达载体构建以及转基因单株的潮霉素PCR检测和测序分析。其中，A为超表达载体图；B为PCR扩增潮霉素基因检测转基因阳性单株；C为测序分析转基因阳性单株。

图3为本发明实施例2中野生型水稻与OsGRF4基因超表达株系分别于8℃低温处理6天的耐冷表型。其中，WT与OX分别表示野生型与OsGRF4超表达转基因株系。

图4为本发明实施例3中野生型水稻与OsGRF4基因干涉株系分别于8℃低温处理6天的耐冷表型。其中，WT与RNAi分别表示野生型与OsGRF4干涉转基因株系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1水稻基因OsGRF4增强植物耐冷性新功能的发现

本发明人最先克隆了水稻穗部性状调控基因OsGRF4，http://rice.plantbiology.msu.edu/数据库编号：LOC_Os02g47280。本发明人在后续的研究过程中，通过查阅文献发现超表达osa-MIR396c基因可以降低水稻对盐和碱胁迫的耐受性，OsGRF4作为osa-MIR396c的一个靶基因，在生理盐水、缺氧、脱落酸和赤霉素处理时水稻OsGRF4的表达量上调，而在砷酸盐处理时OsGRF4的表达量表现为下调(Gao et al.,Planta,2010,231:991–1001)。此外，Kyndt等通过基因差异表达研究发现，水稻在根结线虫侵染前后OsGRF4的表达量有显著差异(Kyndt et al.,New Phytologist,2012,196:887–900)。因此，本发明人推测OsGRF4可能与植物抗逆相关，并以水稻品种川大粒和巨穗稻为材料通过杂交、自交和回交构建了近等基因系NIL-OsGRF4与NIL-Osgrf4(Sun et al.,JIPB,2016,58：836–847)，其中所述OsGRF4为突变优异等位基因，Osgrf4为功能丧失型等位基因。通过冷胁迫对NIL-OsGRF4与NIL-Osgrf4的耐冷性进行比较分析研究，结果显示冷处理后NIL-OsGRF4植株的存活率显著高于NIL-Osgrf4的存活率，增加约50％的存活率(图1)，表明含有基因OsGRF4的植株明显表现出耐冷性。由此可见，水稻基因OsGRF4具有增强植物耐冷的新功能。上述冷处理方法为：50株生长7天并且健康的水稻幼苗经过8℃低温处理6天，然后恢复正常温度生长5天(白天28℃，晚上25℃)，最后调查其存活率，上述每个材料设置3个重复。

上述能提高耐冷性的优异等位基因OsGRF4的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，其基因组核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其启动子核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

实施例2基因OsGRF4超表达载体的构建及水稻的遗传转化

超表达载体的构建：根据目的基因OsGRF4的基因组序列设计带有BamH I酶切位点的引物GRF-OX(F：5′-gcaggtcgacggatcctactacgccacgagataacgaga-3′，R：5′-gaattcccggggatcctgatgttgacggcactgttga-3′)，以亲本川大粒的基因组DNA为模板扩增4073bp的OsGRF4全长DNA(不包含启动子序列)，扩增产物通过琼脂糖电泳鉴定，大小符合目标之后切胶回收。然后将目的片段与全式金公司的克隆T载体(pEASY-Blunt Cloning Kit)连接：1μLPCR回收产物加1μL T载体和3μL的水，室温反应5min。将连接产物全部加入50μL的感受态细胞，轻轻混均匀，冰上放置30min。然后42℃水浴热激30s，立刻放在冰上2min，然后加入250μL的LB培养基，200rpm在37℃培养1h。然后2000rpm将LB培养基离心1min，去掉一部分上清液，保留100μL左右，轻轻悬浮菌液，全部涂于加有抗生素的LB固体培养基平板上，在37℃培养箱中过夜培养。第二天长好单个菌斑之后，分别挑取20个菌斑接种入加有LB液体培养基的试管中，37℃培养箱中培养12h，等菌液浑浊时，分别做菌液PCR，检测目标片段是否正确连入T载体，引物用T载体上的M13引物(M13F：5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′，M13R：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)。对菌液PCR正确的克隆进行测序，分析目标基因的序列是否有突变，序列完全正确的克隆用于后续的表达载体连接。用BamH I分别单酶切连有目标基因的T载体和由Ubiquitin启动子驱动的pCUbi1390表达载体(图2A)，利用Clontech Infusion试剂盒将目的片段与线性化的载体进行融合，转化感受态细胞，挑阳性单克隆质粒并测序。

水稻遗传转化以及表型鉴定：将上述构建的序列正确的质粒转化农杆菌感受态，然后通过农杆菌介导法转化水稻材料NIL-Osgrf4。农杆菌介导的遗传转化方法主要过程：水稻材料经过愈伤组织诱导、愈伤组织继代、预培育、农杆菌培养、农杆菌侵染、愈伤组织洗涤和选择培养、愈伤组织的分化、生根、练苗、移栽，最终得到转基因水稻植株(林拥军等，作物学报，2002，28：294-300)。总共得到28株过表达转基因T0代水稻植株，对T0代转基因苗进行潮霉素基因PCR检测(F:5′-acggtgtcgtccatcacagtttgcc-3′；R:5′-ggaagtgcttgacattggggagttt-3′)，发现转基因阳性单株能扩出目标条带，而转基因阴性单株、水和非转基因阴性对照均扩不出目标条带(图2B)。此外，对转基因阳性苗的OsGRF4基因进行测序分析，结果显示转基因阴性单株在目标位点的碱基为TC，而转基因阳性单株为AA和TC的杂合型双峰(图2C)。测序结果与潮霉素基因PCR检测结果完全一致，最终获得18株超表达阳性转基因单株。对OsGRF4超表达转基因水稻株系和NIL-Osgrf4植株进行冷处理，结果显示冷处理后OsGRF4超表达转基因株系的存活率显著高于野生型NIL-Osgrf4的存活率，增加约44％的存活率(图3)，再次证明基因OsGRF4具有增强植物耐冷的功能。上述冷处理方法参照实施例1。

实施例3 MicroRNA干涉载体的构建及水稻遗传转化

以pNW55载体为模板利用下列引物扩增获得大小为290bp的MicroRNA片段：

I miR-s：5′-agTAAAACGTTGACATCTCCCTTcaggagattcagtttga-3′；

II miR-a：5′-tgAAGGGAGATGTCAACGTTTTActgctgctgctacagcc-3′；

III miR*s：5′-ctAAGGGTGATCTCAACGTTTTAttcctgctgctaggctg-3′；

IV miR*a：5′-aaTAAAACGTTGAGATCACCCTTagagaggcaaaagtgaa-3′。

将290bp的MicroRNA片段添加PstI和SpeI酶切位点，双酶切目的片段和载体pCUbi1390，然后进行连接反应，转化感受态细胞，挑阳性单克隆测序，将得到的正确克隆质粒通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到水稻材料NIL-OsGRF4中。共得到18株T0代植株，对转基因苗进行潮霉素基因PCR检测和测序分析，最后得到10株干涉阳性单株。对OsGRF4抑制表达转基因水稻株系和NIL-OsGRF4植株进行冷处理，结果显示冷处理后OsGRF4抑制表达转基因株系的存活率显著低于野生型NIL-OsGRF4的存活率，减少约44％的存活率(图4)，同样证明基因OsGRF4能调节植物的耐冷性。上述农杆菌介导的水稻遗传转化参照实施例2的方法，上述冷处理方法参照实施例1。

实施例4基因OsGRF4在培育耐冷作物新品种中的应用

在培育作物新品种的过程中，可以采用转基因方法，利用包含本发明基因OsGRF4的植物表达载体转化受体作物而获得转基因作物植株，进而可以提高受体作物的耐冷性。也可以将含有本发明提供的基因OsGRF4的作物植株与另一作物植株杂交获得后代作物植株，所获得的后代作物植株其耐冷性得到改良。所述作物包括水稻、玉米、高粱、小麦和大麦等。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 湖南杂交水稻研究中心

中国科学院亚热带农业生态研究所

<120> 水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用

<130> KHP191111366.9

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1185

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgacgatgc cgtatgcctc cctgtctccg gcggtggccg accaccgctc gtccccggca 60

gccgcgaccg cctccctcct ccccttctgc cgctccaccc cgctctccgc gggcggtggt 120

gttgtcgcga tgggggagga cgcgccgatg accgcgaggt ggccgccggc ggcggcggcg 180

aggctgccgc cgttcaccgc ggcgcagtac gaggagctgg agcagcaggc gctcatatac 240

aagtacctgg tggcaggcgt gcccgtcccg ccggatctcg tgctccccat ccgccgcgga 300

ctcgactccc tcgccgcccg cttctacaac catcccgccc ttggatatgg tccgtacttc 360

ggcaagaagc tggacccaga gccagggcgg tgccggcgta cggacggcaa gaaatggcgg 420

tgctcgaagg aggccgcgcc ggattccaag tactgcgagc gccacatgca ccgcggccgc 480

aaccgtaaaa gaaagcctgt ggaaacgcag ctggtcgccc agtcccaacc gccctcatct 540

gttgtcggtt ctgcggcggc gccccttgct gctgcctcca atggcagcag cttccaaaac 600

cactctcttt accctgctat tgccggcagc aatggcgggg gcggggggag gaacatgccc 660

agctcatttg gctcggcgtt gggttctcag ctgcacatgg ataatgctgc cccttatgca 720

gctgttggtg gtggaacagg caaagatctc aggtatactg cttatggcac aagatctttg 780

gcggatgagc agagtcaact cattactgaa gctatcaaca catctattga aaatccatgg 840

cggctgctgc catctcagaa ctcgccattt cccctttcaa gctattctca gcttggggca 900

ctaagtgacc ttggtcagaa cacccccagc tcactttcaa aggttcagag gcagccactt 960

tcgttctttg ggaacgacta tgcggctgtc gattctgtga agcaagagaa ccagacgctg 1020

cgtcccttct ttgatgagtg gccaaaggga agggattcat ggtcagacct cgctgatgag 1080

aatgctaatc tttcgtcatt ctcaggcacc caactgtcga tctccatacc aatggcatcc 1140

tctgacttct cggcggccag ttctcgatca actaatggtg actga 1185

<210> 2

<211> 3763

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

aaagaccgcg gcgtgtgctt gcgttgcgag cgagcgagag cgagagagag attgagagag 60

agagagggaa gggatgacga tgccgtatgc ctccctgtct ccggcggtgg ccgaccaccg 120

ctcgtccccg gcagccgcga ccgcctccct cctccccttc tgccgctcca ccccgctctc 180

cgcgtaagca acgcgaaccc gcggctacaa cccattttct tggctccagt ggtgcatgtg 240

acaacacggt gagacgttgt gtgtgggtgg gtgggtgcag gggcggtggt gttgtcgcga 300

tgggggagga cgcgccgatg accgcgaggt ggccgccggc ggcggcggcg aggctgccgc 360

cgttcaccgc ggcgcagtac gaggagctgg agcagcaggc gctcatatac aagtacctgg 420

tggcaggcgt gcccgtcccg ccggatctcg tgctccccat ccgccgcgga ctcgactccc 480

tcgccgcccg cttctacaac catcccgccc gtacgtcgtg ttcctatttc ttgcctctcc 540

tctaccatcg ctgcattgct tttggatgct tgtttagtgt cggtttcttt gtttattccg 600

atcaggcgta ctttgcttcc atttgttaat tggctccggg tcatttgtta atccgggtta 660

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ggcttgattt taaatccaaa actcgtgctc gcttcacgat tagcgcatca tttttttttt 780

tggggggggg gggggggagt ttgcccatca ttctgtctct gtttgatctg atagaggacg 840

tgcacacgct cttgtctgaa ataaaatctt ttgtttatca gtatgcccat gggataagcc 900

attttctctg tgaaccaaca ccctggcaaa ctgttttttt gctcgccatt tttgagcgat 960

tgctaagaac agataactat gccctgcata tggatcggat atggacttct caaatattca 1020

aatgccattc tattaggaac tcaaaatgca ttaccaacaa atgcattctt gtgtgtaaca 1080

cggttgctac gatgtgcctg tttttgtaca gttggatatg gtccgtactt cggcaagaag 1140

ctggacccag agccagggcg gtgccggcgt acggacggca agaaatggcg gtgctcgaag 1200

gaggccgcgc cggattccaa gtactgcgag cgccacatgc accgcggccg caaccgtaaa 1260

agaaagcctg tggaaacgca gctggtcgcc cagtcccaac cgccctcatc tgttgtcggt 1320

tctgcggcgg cgccccttgc tgctgcctcc aatggcagca gcttccaaaa ccactctctt 1380

taccctgcta ttgccggcag caatggcggg ggcgggggga ggaacatgcc cagctcattt 1440

ggctcggcgt tgggttctca gctgcacatg gataatgctg ccccttatgc agctgttggt 1500

ggtggaacag gcaaagatct caggtgattg ttcatttctt tttttttaat caaacgccat 1560

atttacttgt ttagcactgt cttgaatcat gatatgtatc cttccgttgt ctaaaaaaaa 1620

ggtgtcatgc tctaactgat tggtgtcagg tggatgcagt tatgaatctg tatttttctt 1680

tgtgatcggt taataactgt gtcccatttg tttgcattgg tggcaatcga accagctgtc 1740

catgctcagt agtactactt cgatttggtg ccgcaatcac tgaaagtctg aaactttact 1800

ctctgcactg caaaattttg tgttatgttt aggtttccag agtgctgcct ctttgccctt 1860

cccatacttt ctggtatcag ttttcagccc cagaagccgg ggacagtctc cataagagat 1920

ttctgctcag gtgaaactgg ggtgcagggt cttaacatgg ctttggccca gtagtttgaa 1980

acatgtactg tccataaaga tgatactact acatatttgt gtctgccctc gcagtgcttg 2040

tgcctgctgg tagctgatca tggcttccct tggcatttac tccacttctt tattcctcca 2100

cagaatccag ttgtttctgt ctctgctctt caggggcagt caattatttg gcccttgcaa 2160

aatactatct ctgaagatgt ctcaccgatc accactatac ctgaaacatt ttccagtggc 2220

cagcgtgagc tgcatgatgc tccaagtcaa ctctatactc atccaatgtt gatgattaga 2280

ttttaacaat gcaactcttt gatttatctt ccctacaaaa aaaaggaact ctttgattta 2340

tctttggtga atctcagtct gaccttagta cctagcctca ttatttactt caccaaatgt 2400

ataactctac agtgcttgtt cgtgttgatt tggtttagtt tagttattga attattcggt 2460

caccttagtc tttgattgtt tttttctttc tgctcttgtc atcaactgtt tagggttcag 2520

ctgacttgct gctgcaacta aactgtcttc tggttttact gcaaaataga atgtttcttg 2580

ggccatgatc tgctgctata tatgattagt taaaccatgg ttctatgttt ttcttatatg 2640

aattcatgac aagaatacta acttttggaa aaggtaattt tatttttttt gtatgataat 2700

aatgctttgg attctttcta gtttatctgt cggacttagg ttaactacat ttcctccggt 2760

acatggattt atttcattct tacaattgag cccttatgaa tattttcttc ctaattctgt 2820

tctaaaaagt tagaattgac atattttcga taggtacatg cctagcactt gcattcgtgt 2880

ttcctactaa ttcccaatca ctgtatcttc tcaaattcag gtatactgct tatggcacaa 2940

gatctttggc ggatgagcag agtcaactca ttactgaagc tatcaacaca tctattgaaa 3000

atccatggcg gctgctgcca tctcagaact cgccatttcc cctttcaagc tattctcagc 3060

ttggggcact aagtgacctt ggtcagaaca cccccagctc actttcaaag gttcagaggc 3120

agccactttc gttctttggg aacgactatg cggctgtcga ttctgtgaag caagagaacc 3180

agacgctgcg tcccttcttt gatgagtggc caaagggaag ggattcatgg tcagacctcg 3240

ctgatgagaa tgctaatctt tcgtcattct caggcaccca actgtcgatc tccataccaa 3300

tggcatcctc tgacttctcg gcggccagtt ctcgatcaac taatggtacg actacttgat 3360

ctccccccaa ttacttcgtg cgtgtttatg tctgtatcct ccaatgtctg aagatttctt 3420

actgaaaacg tcatctggtc tgtgtgcagg tgactgaatg ctgcgtggat gatgatcctg 3480

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gcgcccaccg ttcgatagta gcaaaacatt ctatgcttct gtaatttacc agtgttcccc 3600

tgtcagattt gcgtgtgaaa tcgatcaaac tccgtggtct cctttggacg aagggagatg 3660

tcaatgtttt ccttgatgtt tactgctagt aacatcttat tacttcccaa atgctgatca 3720

gcctctgctt gctatgctct cctgtttgtc gactcaacag tgc 3763

<210> 3

<211> 394

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Thr Met Pro Tyr Ala Ser Leu Ser Pro Ala Val Ala Asp His Arg

1 5 10 15

Ser Ser Pro Ala Ala Ala Thr Ala Ser Leu Leu Pro Phe Cys Arg Ser

20 25 30

Thr Pro Leu Ser Ala Gly Gly Gly Val Val Ala Met Gly Glu Asp Ala

35 40 45

Pro Met Thr Ala Arg Trp Pro Pro Ala Ala Ala Ala Arg Leu Pro Pro

50 55 60

Phe Thr Ala Ala Gln Tyr Glu Glu Leu Glu Gln Gln Ala Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Lys Tyr Leu Val Ala Gly Val Pro Val Pro Pro Asp Leu Val Leu Pro

85 90 95

Ile Arg Arg Gly Leu Asp Ser Leu Ala Ala Arg Phe Tyr Asn His Pro

100 105 110

Ala Leu Gly Tyr Gly Pro Tyr Phe Gly Lys Lys Leu Asp Pro Glu Pro

115 120 125

Gly Arg Cys Arg Arg Thr Asp Gly Lys Lys Trp Arg Cys Ser Lys Glu

130 135 140

Ala Ala Pro Asp Ser Lys Tyr Cys Glu Arg His Met His Arg Gly Arg

145 150 155 160

Asn Arg Lys Arg Lys Pro Val Glu Thr Gln Leu Val Ala Gln Ser Gln

165 170 175

Pro Pro Ser Ser Val Val Gly Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ala Ala Ala

180 185 190

Ser Asn Gly Ser Ser Phe Gln Asn His Ser Leu Tyr Pro Ala Ile Ala

195 200 205

Gly Ser Asn Gly Gly Gly Gly Gly Arg Asn Met Pro Ser Ser Phe Gly

210 215 220

Ser Ala Leu Gly Ser Gln Leu His Met Asp Asn Ala Ala Pro Tyr Ala

225 230 235 240

Ala Val Gly Gly Gly Thr Gly Lys Asp Leu Arg Tyr Thr Ala Tyr Gly

245 250 255

Thr Arg Ser Leu Ala Asp Glu Gln Ser Gln Leu Ile Thr Glu Ala Ile

260 265 270

Asn Thr Ser Ile Glu Asn Pro Trp Arg Leu Leu Pro Ser Gln Asn Ser

275 280 285

Pro Phe Pro Leu Ser Ser Tyr Ser Gln Leu Gly Ala Leu Ser Asp Leu

290 295 300

Gly Gln Asn Thr Pro Ser Ser Leu Ser Lys Val Gln Arg Gln Pro Leu

305 310 315 320

Ser Phe Phe Gly Asn Asp Tyr Ala Ala Val Asp Ser Val Lys Gln Glu

325 330 335

Asn Gln Thr Leu Arg Pro Phe Phe Asp Glu Trp Pro Lys Gly Arg Asp

340 345 350

Ser Trp Ser Asp Leu Ala Asp Glu Asn Ala Asn Leu Ser Ser Phe Ser

355 360 365

Gly Thr Gln Leu Ser Ile Ser Ile Pro Met Ala Ser Ser Asp Phe Ser

370 375 380

Ala Ala Ser Ser Arg Ser Thr Asn Gly Asp

385 390

<210> 4

<211> 2101

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

gttttctttt catcgtagtt tttcttgcag ccggttttca aaccactagt attatagata 60

taattttttt atttgcaatt tattttttac gatttatcaa ccgcagttta tccgattagt 120

ctttggaaaa tgttactgga agaagtaaaa cccagataac ccacaccaaa taatattaat 180

aaaaaatctg catctgcatt atagtacgtc aatccagctc cacatgatac tgatcttgtg 240

gtactgtagt agtaatagta ctccctccgt ccgtcctagt atagtggacg tttccattca 300

ttttatttga aaaattagta caaatataaa aaaagataag tcatatgtaa aatattttga 360

taataaaaca attgacaaac aaaataaata ataattctaa aattttttga ataaaacgaa 420

tgatcaaaaa ttataaacaa aaacttaaga agacaagtaa tatgggacgg aggtagttgt 480

agtatattag tacactgttt tgaggtattc caacgtcgaa taaaacagag aagtaccaca 540

ccattattgt gaactcgaaa cctggtagtg attaattgcc tcatggcaag caaactgaaa 600

caaactacta ttactactgc tctcccgttt tatattgttc atcgtataac ccaaaatcag 660

aatttccaaa ttatatcttg taatcttgac tgcatcgttt gacatacaat actattaaat 720

ctatacatat aaattgagtc tgtatacgta tatacaagca cttgagatgg ttaagcactt 780

tttttagcat tataagtttc ttattttgta ggatttttag tacgaggtaa gacatacttg 840

aaaaaaattc taagaactag agtgcatgtg accacctaac tccttgcaat ttttattctt 900

ataatttgaa aatcctataa accaaataag cccttcaaag gaaattaaat catgaggttt 960

gaggttaggt ttgaattctc taaaaagtgg aggaaaggac tcaacagaaa aaaaaaatcc 1020

tatagaattt cgatcctata aaattttagt taaaaatact ttgttccaaa attgccatgg 1080

ataaaatgta atttctatgc atacgactaa attatcgatg gcaacagtgc atgagcatat 1140

atttatttca ttgacctacg gttgcatgtc tccgatctct atggagtagt accgagacta 1200

agtttagttt caaacttttc cttcaaacat acagcttttt tatcacatta aaactttcct 1260

acgtataaac tttcaacttt tccatcacat ctttcaattt caaccaaact tttaatttta 1320

acgtgaacta aacacaccct gaattcaaaa ctctttttat tttccttcaa gatgtccgat 1380

gcacacgctc tatgtagacg caagaagatg ttggagcagc agactaacag tagcaaaaaa 1440

atggcaggtc gaaaagcaac tgcgacggtt gctccgtcat cctctcatcg cctttttatt 1500

gctccggcgt tgggaaccgc aacaatggaa cagcccaaat cgacagtccc ctcccccccc 1560

tcccccatcc tctctctccc cacgcaatac ttgtcactac tcgcgctgct cactacagcg 1620

tctctgcatg tatatccatc tatccatcca ttcccccatt ttccaaataa aaatacagca 1680

aaccaaacac aaacgcagcc tcgcactgta ctcgaagaaa aatcggtgct gtacgtacta 1740

cgccacgaga taacgagaga gagagagaga gagagagaga ggagaaaatg gaaatgctac 1800

tgctcgtacc acgccgctac gtccgctagg tcgacaggcc cggggggagg caggtgtttg 1860

tcgtctagct cgggtcggag cgcgccttct cgtgtcgggc tcgacgtccg cgactcctcg 1920

cccctggtcg agagctcgca ggcgcagcgg gagagagaga gagagagaga gagacaagcc 1980

gcgcaataaa ggcgcgcgcg cgagcgagcg aagcaaagca ccattactaa agaccgcggc 2040

gtgtgcttgc gttgcgagcg agcgagagcg agagagagat tgagagagag agagggaagg 2100

g 2101

Claims (8)

1.水稻基因OsGRF4在提高植物耐冷性中的应用，其特征在于，所述水稻基因OsGRF4为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)SEQ ID NO:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻、玉米、高粱、小麦和大麦。

3.一种提高植物耐冷性的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)使植物包含水稻基因OsGRF4；或

2)使植物表达水稻基因OsGRF4；

其中，水稻基因OsGRF4的定义同权利要求1中所述。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导的方法将包含水稻基因OsGRF4的重组表达载体导入植物细胞，获得转基因植株。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将含有水稻基因OsGRF4的植株与另一植株杂交，获得杂交后代。

7.根据权利要求3-6任一项所述的方法，其特征在于，所述植物包括水稻、玉米、高粱、小麦和大麦。

8.水稻基因OsGRF4的启动子，其特征在于，所述启动子为：

i)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；

ii)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有启动子活性的核苷酸序列；

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:4所示序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.5％SDS的6×SSC溶液中，在65℃下杂交，然后用含0.1％SDS的2×SSC溶液，含0.1％SDS的1×SSC溶液各洗膜一次；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有70％以上，优选80％以上，更优选90％以上同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。