CN109985252A - 一种新型双模态小分子造影剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型双模态小分子造影剂及其制备方法与应用。本发明利用ICG可选择性富集于肝癌区域，与周围组织形成较强对比的特点，选取其关键结构作为载体，与泛影酸、碘海醇等富含碘基团的CT造影剂官能团相连接，在获取肝癌靶向性的同时，增加穿透能力，设计合成了小分子近红外/CT双模态造影剂。本发明的小分子造影剂水溶性好，毒性低，两种造影模态相互印证，丰富诊断信息，提高诊断精度，为临床上肝癌的早期诊断提供可行的新型造影剂。
Description
技术领域
本发明属于造影剂领域，具体涉及一种新型双模态小分子造影剂及其制备方法与应用。
背景技术
肝癌是死亡率最高的恶性肿瘤之一，我国每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例数的51％，严峻的形势给社会和医疗带来了沉重的负担。肝癌早期发病颇隐匿，无明显的症状和体征。患者被确诊肝癌时，往往分期较晚，预后差，5年生存率不高。因此发展一种有效可靠的诊断手段可以使得肝癌能够被早期发现，早期治疗以提高病患的存活率，在临床上具有较高的应用价值。
计算机断层扫描(Computed Tomography，CT)具有分辨率高、成本低、造影效率高等优点，已成为临床上使用最普遍的造影手段之一。CT利用人体不同组织对X线的吸收与透过率的不同，对检查部位进行成像，从而能发现体内细微病变。目前，已上市CT造影剂多含碘化合物。碘的原子序数较大，含碘化合物多具有较强的组织穿透力，富集在相关区域可增加成像亮度，提高诊断精度。临床上广泛使用的有泛影酸钠、碘海醇、碘佛醇、碘克沙醇等，通过灌注成像等方式反映局部组织血流灌注量的改变，从而获得丰富的诊断信息。临床现有的CT造影剂不具备对肝癌的靶向能力，因此，开发能够用于肝癌早期诊断的造影剂是亟待解决的难题。
近红外荧光成像以其高灵敏度、无电离辐射、操作简便、费用低以及可实时成像成为目前的研究热点。近红外荧光成像检测信号处于近红外区域(700～900nm)，在这个区域内生物体的荧光背景干扰小、穿透能力相对较强。吲哚菁绿(Indocyanine Green，ICG)是FDA唯一批准的近红外成像试剂，经静脉注射后由肝胆系统排泄。通过检测血液中含量，可检测肝功能是否正常。吲哚菁绿能够靶向肝癌组织，但由于穿透力弱，成像深度仅有5-10mm，只能检测肝脏表面的肿瘤组织，无法识别出肝脏内部的肿瘤，使其使用受到限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有近红外成像试剂例如吲哚菁绿穿透力弱，成像深度仅有5-10mm，只能检测肝脏表面的肿瘤组织，无法识别出肝脏内部的肿瘤等的缺陷，而提供了一种新型双模态小分子造影剂及其制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种新型双模态小分子造影剂，为如式(1)所示的化合物，
其中，CT表示碘化有机分子；
Linker表示连接链，结构为表示连接位置，M选自-COO-、-CO-、-NH-或-O-；N选自-COO-、-CO-、-NH-或-O-；X为-O-；m为0、1、2、3、4、5或6；m’为2、3、4、5或6；
NIR表示菁类染料衍生物，结构为R1、R2、R3、R4、R5和R6相同或不同，彼此独立地选自羧基、氨基、羟基、磺酸基或氢原子；Y选自羧酸阴离子、磺酸阴离子或磷酸阴离子；Rx为H或卤素；Ry和Rz为H，或Ry和Rz与其相连的碳一起形成3-6元碳环；n为1、2、3或4；
W表示碱金属。
优选地，所述碘化有机分子为含有羧基的碘化有机分子，其中，羧基脱去羟基后的羰基与Linker相连。
优选地，所述碘化有机分子为芳香族含碘化合物，芳环上可存在多个碘原子，结构为其中，Rc1、Rc2、Rc3、Rc4和Rc5中至少一个为I，其余选自I、-COOH、-NH2、-CONH2或-CONHCH3；更优选地，Rc1、Rc2、Rc3、Rc4和Rc5中至少三个为I。
优选地，所述中，M和N为-NH-或-O-；m为0、2或3；m’为2、3或4；更优选地，m为0时m’为2、3或4；m为2或3时m’为2。
优选地，所述中，R1、R3、R4和R6相同，选自氢原子；R2和R5相同，选自羧基；当Ry和Rz为H时，Rx为H；当Ry和Rz与其相连的碳一起形成3-6元碳环时，Rx为卤素，选自F、Cl、Br或I；n为2或3。
优选地，当Ry和Rz与其相连的碳一起形成3-6元碳环时，所述的3-6元碳环结构为
优选地，NIR菁类染料衍生物的R1、R2或R3与左侧Linker相连，R4、R5或R6与右侧Linker相连。
优选地，W选自Na或K。
优选地，所述CT的结构为
优选地，所述Linker的结构为
优选地，所述NIR的结构为
优选地，所述造影剂选自如下结构的化合物中的任一种：
本发明还提供一种新型双模态小分子造影剂的制备方法，其包括以下步骤：在碱和缩合剂的作用下，将连接Linker的有机碘化分子(CT-Linker)与NIR在室温下进行缩合反应得到，反应如下所示：
所述NIR与连接Linker的有机碘化分子的摩尔比为1:(2.3-2.5)；NIR与碱的摩尔比为1:(3-3.5)；NIR与缩合剂的摩尔比为1:(3-3.5)；
其中，CT表示碘化有机分子；
Linker表示连接链，结构为M选自-COO-、-CO-、-NH-或-O-；N选自-COO-、-CO-、-NH-或-O-；X为-O-；m为0、1、2、3、4、5或6；m’为2、3、4、5或6；
NIR表示菁类染料衍生物，结构为R1、R2、R3、R4、R5和R6相同或不同，彼此独立地选自羧基、氨基、羟基、磺酸基或氢原子；Y选自羧酸阴离子、磺酸阴离子或磷酸阴离子；Rx为H或卤素；Ry和Rz为H，或Ry和Rz与其相连的碳一起形成3-6元碳环；n为1、2、3或4；
W表示碱金属。
优选地，所述反应所用的溶剂为酰胺类溶剂、酮类溶剂、腈类溶剂和亚砜类溶剂中的一种或多种。更优选地，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或多种。
优选地，所述碱为无机碱或有机碱；所述的无机碱选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸钾中的一种或多种；所述的有机碱选自三乙胺、二异丙基乙胺和吡啶中的一种或多种。当所述碱仅为有机碱时，反应结束后，需要在碱金属氢氧化物的存在下，进行成盐反应。
优选地，所述缩合剂为环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。
优选地，所述的制备方法中，反应的时间可不作具体限定，优选以NIR消失或不再进行反应时作为反应的终点。
具体制备过程如下：
将对肼基苯甲酸与3-甲基-2-丁酮经Fisher吲哚合成反应得到化合物2。
化合物2与1,3-丙磺酸内酯或1,4-丁磺酸内酯反应得到3系列化合物。
3系列化合物与戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐发生亲核加成消除反应得到5系列化合物。
三氯氧磷，N,N-二甲基甲酰胺，环己酮，苯胺反应得到4b。
3系列化合物与4b发生亲核加成消除反应得到6系列化合物。
Linker系列化合物与二碳酸二叔丁酯反应生成单边Boc保护的8系列化合物。
泛影酸与氯化亚砜反应得到化合物7。
化合物7与8系列化合物反应得到9系列化合物。
化合物9通过三氟醋酸脱Boc得到10系列化合物。
10系列化合物与5系列化合物或6系列化合物经缩合得到终产物。
优选地，上述9系列化合物的合成方法包括下列步骤：7系列化合物在碱的存在下与Linker系列化合物反应。所述碱优选为无机碱和/或有机碱。所述的无机碱优选碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸钾中的一种或多种。所述的有机碱优选三乙胺、二异丙基乙胺和吡啶中的一种或多种。当所述碱仅为有机碱时，反应结束后，需要在碱金属氢氧化物的存在下，进行成盐反应，得到目标化合物。7系列化合物与Linker系列化合物的摩尔比优选为1:(1.3-1.5)。反应温度优选为室温。
优选地，终产物的合成方法包括下列步骤：5系列化合物在碱和缩合剂的存在下与10系列化合物反应。终产物的合成方法中，溶剂优选为酰胺类溶剂、酮类溶剂、腈类溶剂和亚砜类溶剂中的一种或多种，更优选N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或多种。所述碱优选为无机碱和/或有机碱。所述的无机碱优选碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸钾中的一种或多种。所述的有机碱优选三乙胺、二异丙基乙胺和吡啶中的一种或多种。当所述碱仅为有机碱时，反应结束后，需要在碱金属氢氧化物的存在下，进行成盐反应，得到目标化合物。所述缩合剂优选为环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。5系列化合物与10系列化合物的摩尔比优选为1:(2.3-2.5)。5系列化合物与碱的摩尔比优选为1:(3-3.5)。5系列化合物与缩合剂的摩尔比优选为1:(3-3.5)。5系列化合物与10系列化合物反应的温度优选为室温。
优选地，终产物的合成方法包括下列步骤：6系列化合物在碱和缩合剂的存在下与10系列化合物反应。终产物的合成方法中，溶剂优选为酰胺类溶剂、酮类溶剂、腈类溶剂和亚砜类溶剂中的一种或多种，更优选N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或多种。所述碱优选为无机碱和/或有机碱。所述的无机碱优选碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸钾中的一种或多种。所述的有机碱优选三乙胺、二异丙基乙胺和吡啶中的一种或多种。当所述碱仅为有机碱时，反应结束后，需要在碱金属氢氧化物的存在下，进行成盐反应，得到目标化合物。所述缩合剂优选为环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。6系列化合物与10系列化合物的摩尔比优选为1:(2.3-2.5)。6系列化合物与碱的摩尔比优选为1:(3-3.5)。6系列化合物与缩合剂的摩尔比优选为1:(3-3.5)。6系列化合物与10系列化合物反应的温度优选为室温。
优选地，终产物的合成方法优选包括下列步骤：将5系列化合物或6系列化合物与缩合剂在冰浴下混合(活化)，然后加入10系列化合物的溶液，其中溶剂优选与反应溶剂相同，进行所述反应。
优选地，终产物的合成方法结束后，若碱选用的是有机碱，还包括后处理的操作。所述后处理的操作包括成盐与重结晶。所述成盐过程使用氢氧化钠与5系列化合物或6系列化合物的摩尔比优选为1:(1.05-1.15)。所述重结晶的溶剂为摩尔比为1:(15-25)的水与异丙醇混合溶液，甲醇与二氯甲烷混合溶液，甲醇与氯仿混合溶液或甲醇与乙酸乙酯混合溶液。
优选地，上述的泛影酸还可以替换成2,3,5-三碘基苯甲酸或2,4,6-三碘基苯甲酸。
本发明还提供所制备的述如式(1)所示的化合物作为造影剂在近红外/CT成像中的应用。
本发明所述如式(1)所示的化合物作为造影剂使用时，可配制静脉注射剂使用。在配制静脉注射剂时，常用辅料为注射用无菌用水与泊洛沙姆188，泊洛沙姆质量分数为2-4％，所述如式(1)的化合物的质量分数为9-11％，其余为无菌水。
本发明中，室温是指10-30℃。
本发明中，CT是指计算机断层扫描技术，利用X线断层扫描，电光子探测器接收，并把信号转化为数字输入电子计算机，再由计算机转化为图像，从而区分不同密度部位的一种手段。
本发明的有益效果为：
(1)本发明利用ICG可选择性富集于肝癌区域，与周围组织形成较强对比的特点，选取其关键结构作为载体，与泛影酸、碘海醇等富含碘基团的CT造影剂官能团相连接，在获取肝癌靶向性的同时，增加穿透能力，设计合成了小分子近红外/CT双模态造影剂。体内外实验证实，本发明的小分子造影剂水溶性好，毒性低，两种造影模态相互印证，丰富诊断信息，提高诊断精度，为临床上肝癌的早期诊断提供可行的新型造影剂。
(2)本发明所制备的化合物可被肝癌组织特异性吸收，使得该造影剂具有显著的肝癌靶向特征。
(3)本发明所制备的化合物在近红外/CT成像中的成像效果均与单模态阳性药效果类似，从而可结合两类造影手段的优势。
(4)本发明所制备的化合物具有较好的水溶性，在水中溶解度可达到100mg/mL，可通过静脉注射给药。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的化合物与泛影酸的体外CT值对比图。
图2为泛影酸的体外CT值线性图。
图3为本发明实施例1制备的化合物的体外CT值线性图。
图4为本发明实施例1制备的化合物与ICG的MTT细胞活力测试图。
图5为本发明实施例1制备的化合物在肝癌细胞与正常肝细胞中的细胞摄取评价图。
图6为本发明实施例1制备的化合物与ICG的活体小动物近红外成像图。
图7为本发明实施例1制备的化合物的活体小动物CT成像图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的发明内容作进一步地说明。
实施例1
制备化合物CNCI-1，结构式如下：
步骤1：将4g 4-肼基苯甲酸、3.96mL 3-甲基-2-丁酮、4.32g醋酸钠、60mL醋酸投入250mL三颈瓶中，氮气保护；25℃搅拌3h，随后120℃反应7h；反应结束后，用水将混合物转移二氯甲烷(DCM)萃取，合并浓缩有机相；采用柱层析分离(DCM:甲醇＝50:1)，浓缩得到黄色固体化合物2，收率61％。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):8.17(d,J＝8.19Hz,1H),8.08(s,1H),7.67(d,J＝8.19Hz,1H),2.41(s,3H,),1.40(s,6H)。
步骤2：向250mL三颈瓶中依次投入4g化合物2，11.93mL1,4-丁磺酸内酯，50mL邻二氯苯，氮气保护，180℃回流9h；反应结束后大量固体析出，抽滤，丙酮洗涤三次，得到粉红色固体化合物3，收率93％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm)：8.40(s,1H),8.17(dd,2H),4.52(t,2H),2.90(s,3H),2.51(t,2H),1.97(m,2H),1.77(m,2H),1.58(s,6H)。
步骤3：依次向250mL三颈瓶中加入2g化合物3，784mg戊二烯醛缩二苯胺盐酸盐，30mL醋酸酐，18mL冰醋酸，最后加入808.8mg醋酸钠，氮气保护，120℃回流45min；反应结束后，加入50mL无水乙醚，将析出的固体抽滤得到粗品，随后进行重结晶，溶剂选用摩尔比为4:1的异丙醇与水混合溶液，得到绿色化合物5a，收率76％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):8.08(d,2H,J＝1.2Hz),7.98(dd,2H,J＝1.1,8.2Hz),7.95(m,5H),7.51(d,2H,J＝8.7Hz),6.65(t,2H,J＝12.4Hz),6.54(d,2H,J＝13.6Hz),4.11(m,4H),3.09(m,4H),1.75(m,8H),1.67(m,12H)。
步骤4：在250mL三颈瓶中，将5.8mL乙二胺溶于15mL干燥的DCM中。冰浴，氮气保护，无水反应，开始搅拌。将3.2mL二碳酸二叔丁酯溶于65mL干燥的DCM中，缓慢滴加至反应体系。滴加完毕，撤除冰浴，换成25℃油浴反应18h。反应结束后，过滤除去副产物，向残留物中加入饱和碳酸氢钠溶液。用DCM萃取，合并浓缩有机相，得淡黄色油状物8-1，收率71％。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):3.15(t,J＝6.5Hz,2H),2.77(t,J＝6.5Hz,2H),1.47(s,9H)。
步骤5：向250mL三颈瓶中投入6g泛影酸，60mL氯化亚砜，氮气保护，无水反应，75℃回流3h。待反应结束后，减压除去氯化亚砜，正己烷洗涤残留物，得到淡黄色固体化合物7，收率75％。
步骤6：将2g化合物7，1.32mL三乙胺，30mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)加入250mL三颈瓶中，无水反应，氮气保护。25℃下滴加DMF溶解的708mg化合物8-1。滴加完毕后，继续25℃反应12h。反应结束后，减压除去溶剂，加入DCM有大量固体析出，水洗，抽滤得到粗品。加入DCM打浆，抽滤得淡黄色固体化合物9-1，收率84％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.99(m,2H),3.17(m,4H),2.02(s,6H),1.39(s,9H)。
步骤7：将3.09g化合物9-1，3mLDCM，3mL三氟乙酸加入25mL三颈瓶中，氮气保护，25℃反应3h。反应结束后，减压除去三氟醋酸，分别用丙酮与DCM各洗涤反应混合物，得微黄色固体化合物10-1，收率82％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.02(m,2H),3.44(m,2H),2.98(t,2H),2.02(s,6H)。
步骤8：冰浴下，将1g化合物5a，784mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、(EDCI)，0.55mg 1-羟基苯并三唑(HOBt)，0.57mL三乙胺，无水DMF 60mL投入250mL三颈瓶，无水反应，氮气保护，搅拌1.5h。滴加1.97g化合物10-1的DMF溶液，滴加完毕，撤除冰浴，室温反应12h。减压旋干溶剂，柱层析分离(DCM:甲醇＝2:1-4:1)，合并浓缩收集的组分，旋干溶剂得到深绿色固体。将固体溶于甲醇，加入氢氧化钠(54mg,1.36mmol)，回流2min，将溶剂旋至固体将要析出，进行重结晶，溶剂选用摩尔比为20:1的异丙醇与水混合溶液，得到深绿色固体CNCI-1，收率42％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.96(m,4H),8.81-8.40(m,4H),8.01(s,2H),7.90-7.88(m,5H),7.48(d,J＝8.13Hz,2H),6.62-6.48(m,4H),4.11(br,4H),3.52(m,8H),2.51(m,4H),2.02(s,12H),1.75(m,8H),1.66(s,12H)。
制备流程如下所示。
实施例2
制备化合物CNCI-2，结构式如下：
制备方法同实施例1，除了步骤4中用1,3-丙二胺代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCI-2，收率39％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.95(m,4H),8.63-8.46(m,4H),8.03(s,2H),8.03-7.88(m,5H),7.48(d,J＝8.13Hz,2H),6.66-6.48(m,4H),4.11(br,4H),3.40(m,8H),2.53(m,4H),2.01(s,12H),1.85(m,4H),1.74(m,8H),1.66(s,12H)。
实施例3
制备化合物CNCI-3，结构式如下：
制备方法同实施例1，除了步骤4中用1,4-丁二胺代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCI-3，收率30％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.95(m,4H),8.63-8.46(m,4H),8.02-7.87(m,7H),7.47(d,J＝7.65Hz,2H),6.62-6.49(m,4H),4.11(br,4H),3.42(m,8H),2.54(m,4H),2.01(s,12H),1.92-1.73(m,16H),1.66(s,12H)。
实施例4
制备化合物CNCI-4，结构式如下：
制备方法同实施例1，除了步骤4中用1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCI-4，收率30.2％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.95(m,4H),8.63-8.46(m,4H),8.02-7.87(m,7H),7.47(d,J＝7.65Hz,2H),6.62-6.49(m,4H),4.11(br,4H),3.42(m,16H),3.38(m,8H),3.24(m,4H),2.01(s,12H),1.92-1.73(m,12H),1.66(s,12H)。
实施例5
制备化合物CNCI-5，结构式如下：
制备方法同实施例1，除了步骤4中用2(2,2'–(2,2'-氧双(乙烷-2,1-二基)双(氧))二(乙胺))代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCI-5，收率24％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.02-9.91(m,4H),8.7-8.59(m,4H),8.03(s,2H),7.95-7.81(m,5H),7.47(d,J＝8.52Hz,2H),6.61(t,2H),6.50(d,2H),4.10(m,4H),3.54(m,24H),3.44(m,8H),2.50(m,4H),2.01(s,12H),1.76-1.65(m,8H),1.56(s,12H)。
实施例6
制备化合物CNCII-1，结构式如下：
制备的前两个步骤同实施例1，得到化合物3。
然后再制备NIR，具体步骤如下：
步骤一：在250mL单颈瓶中，加入26mL DMF，磁力搅拌，冰浴下滴加22mL POCl3。滴加完毕后，继续冰浴搅拌30min，撤除冰浴，加入11mL环己酮，氮气保护，加热回流1h。降至室温，改用机械搅拌，滴加36mL摩尔比1:1的苯胺与乙醇混合溶液。滴加完毕后，继续搅拌1h。加入220mL摩尔比10:1的为水和HCl的混合溶液，冰浴搅拌2h。抽滤，冰水、丙酮、乙醚洗涤滤饼。将固体打浆洗涤(PE:EA＝2:1)，得紫色固体4，收率32％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):8.40(s,2H),7.50-7.38(m,8H),7.21-7.16(m,2H),2.71(t,4H),1.80(m,2H)。
步骤二：在25mL单颈瓶中，依次加入173mg化合物3，87mg化合物4，68mg醋酸钠，1mL醋酸和2mL醋酸酐，氮气保护，120℃回流搅拌45min。溶液变为绿色，采用柱层析分离(PE:EA＝2:1)监测至反应完全，停止加热，降至室温，将反应液倒入10mL乙醚中，绿色固体析出。抽滤，乙醚洗涤固体，柱层析分离(DCM:甲醇＝3:1)，得绿色固体5b，收率46％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):8.27(d,J＝14.2,2H),8.07(d,J＝1.5,2H),7.97(d,J＝1.6,2H),7.51(d,J＝8.4,2H),6.60(d,J＝13.8,2H),4.44–4.34(m,4H),2.58(d,J＝6.7,4H),2.04(dt,4H),1.70(s,12H)。
得到绿色固体5b后，继续按照实施例1中的方法，除了将化合物5b代替化合物5a进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCII-1，收率15.3％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.02-9.91(m,4H),8.75-8.20(m,4H),7.91(d,J＝12.24Hz,2H),7.79(s,2H),7.72(d,J＝8.28Hz,2H),6.96(d,J＝8.07Hz,2H),5.56(d,J＝11.58Hz,2H),3.83(m,4H),3.67(m,8H),2.56(m,4H),2.50(m,4H),1.99(s,12H),1.66-1.57(m,22H)。
制备流程如下所示。
实施例7
制备化合物CNCII-2，结构式如下：
制备方法同实施例6，除了用1,3-丙二胺代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCII-2，收率14.2％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.00-9.90(m,4H),8.59-8.27(m,4H),7.87-7.73(m,6H),6.96(d,J＝7.77Hz,2H),5.56(d,J＝13.56Hz,2H),3.77(m,4H),3.32-3.24(m,8H),2.56(m,4H),2.50(m,4H),1.99(s,12H),1.88-1.66(m,26H)。
实施例8
制备化合物CNCII-3，结构式如下：
制备方法同实施例6，除了用1,4-丁二胺代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCII-3，收率21％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.98-9.87(m,4H),8.59-8.24(m,4H),7.92-7.73(m,6H),6.95(d,J＝7.83Hz,2H),5.56(d,J＝13.2Hz,2H),3.84(m,4H),3.31-3.21(m,8H),2.55(m,4H),2.50(m,4H),1.99(s,12H),1.87-1.57(m,30H)。
实施例9
制备化合物CNCII-4，结构式如下：
制备方法同实施例6，除了用1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCII-4，收率17.1％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.98-9.87(m,4H),8.74-8.55(m,4H),7.91-7.74(m,6H),6.95(d,J＝8.13Hz,2H),5.56(d,J＝13.4Hz,2H),3.77(m,4H),3.56(m,16H),3.39(m,8H),2.56(m,4H),2.50(m,4H),1.99(s,12H),1.68-1.57(m,22H)。
实施例10
制备化合物CNCII-5，结构式如下：
制备方法同实施例6，除了用2(2,2'–(2,2'-氧双(乙烷-2,1-二基)双(氧))二(乙胺))代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCII-5，收率15.6％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.00-9.89(m,4H),8.68-8.32(m,4H),7.92-7.74(m,6H),6.95(d,J＝8.32Hz,2H),5.56(d,J＝12.8Hz,2H),3.76(m,4H),3.51(m,24H),3.39(m,8H),2.56(m,4H),2.49(m,4H),1.99(s,12H),1.67-1.57(m,22H)。
实施例11
制备化合物CNCIII-1，结构式如下：
制备方法同实施例1，除了步骤2中用1,3-丙磺酸内酯代替1,4-丁磺酸内酯与化合物2进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCIII-1，收率28.8％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.97(m,4H),8.78-8.39(m,4H),8.00(s,2H),7.96-7.86(m,5H),7.52(d,J＝7.95Hz,2H),6.56(m,4H),4.23(br,4H),3.49-3.44(m,8H),2.56(m,4H),2.00(s,12H),1.96(m,4H),1.64(s,12H)。
实施例12
制备化合物CNCIII-2，结构式如下：
制备方法同实施例11，除了用1,3-丙二胺代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCIII-2，收率28.2％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.98(m,4H),8.76-8.48(m,4H),8.04(s,2H),7.93-7.90(m,5H),7.55(d,J＝7.71Hz,2H),6.59(m,4H),4.28(m,4H),3.40(m,8H),2.56(m,4H),2.03(m,16H),1.86(m,4H),1.68(s,12H,4CH3)。
实施例13
制备化合物CNCIII-3，结构式如下：
制备方法同实施例11，除了用1,4-丁二胺代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCIII-3，收率19.1％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.97(m,4H),8.61-8.43(m,4H),8.00-7.86(m,7H),7.50(d,J＝7.80Hz,2H),6.60-6.52(m,4H),4.23(br,4H),3.21-3.19(m,8H),2.54(m,4H),1.99(m,16H),1.66(m,20H)。
实施例14
制备化合物CNCIII-4，结构式如下：
制备方法同实施例11，除了用1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCIII-4，收率46.8％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.95(m,4H),8.72-8.52(m,4H),8.02-7.87(m,7H),7.50(d,J＝7.83Hz,2H),6.55-6.52(m,4H),4.23(br,4H),3.51(m,16H),3.35(m,8H),2.56(m,4H),1.99(s,16H),1.63(s,12H)。
实施例15
制备化合物CNCIII-5，结构式如下：
制备方法同实施例11，除了用2(2,2'–(2,2'-氧双(乙烷-2,1-二基)双(氧))二(乙胺))代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCIII-5，收率29.8％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.94(m,4H),8.77-8.58(m,4H),8.01(s,2H),7.89-7.84(m,5H),7.53(d,J＝8.52Hz,2H),6.55(m,4H),4.24(br,4H),3.52(m,24H),3.42(m,8H),2.55(m,4H),1.99(m,16H),1.64(s,12H)。
实施例16
制备化合物CNCIV-1，结构式如下：
制备方法同实施例6，除了用1,3-丙磺酸内酯代替1,4-丁磺酸内酯与化合物2进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCIV-1，收率20.7％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.03-9.97(m,4H),8.88-8.2(m,4H),7.90(d,2H,J＝12.24Hz),7.80(s,2H),7.72(d,2H,J＝8.46Hz),7.02(d,J＝7.71Hz,2H),5.66(d,2H),3.91(br,4H),3.60(m,8H),2.58(m,4H),2.00(s,12H),1.89(m,4H),1.72(m,2H),1.59(s,12H)。
实施例17
制备化合物CNCIV-2，结构式如下：
制备方法同实施例16，除了用1,3-丙二胺代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCIV-2，收率14.2％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.05-9.95(m,4H),8.63-8.32(m,4H),7.94(d,2H,J＝12.93Hz),7.84(s,2H),7.76(d,2H,J＝8.13Hz),6.99(d,J＝8.25Hz,2H),5.58(d,2H,J＝12.66Hz),3.80(br,4H),3.27(m,8H),2.59(m,4H),2.00(s,12H),1.82(m,4H),1.74(m,6H),1.62(s,12H)。
实施例18
制备化合物CNCIV-3，结构式如下：
制备方法同实施例16，除了用1,4-丁二胺代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCIV-3，收率14％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.02-9.91(m,4H),8.76-8.27(m,4H),7.94(d,2H,J＝12.69Hz),7.83(s,2H),7.76(d,2H,J＝8.28Hz),6.98(d,J＝7.92Hz,2H),5.58(d,2H,J＝12.84Hz),3.81(br,4H),3.29(m,8H),2.59(m,4H),2.51(m,4H),2.00(s,12H),1.80(m,14H),1.62(s,12H)。
实施例19
制备化合物CNCIV-4，结构式如下：
制备方法同实施例16，除了用1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCIV-4，收率19.2％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.03-9.92(m,4H),8.78-8.39(m,4H),8.00-7.86(m,7H),7.52(d,J＝8.13Hz,2H),5.56(d,J＝13.4Hz,2H),3.77(m,4H),3.56(m,16H),3.39(m,8H),2.56(m,4H),2.50(m,4H),1.99(s,12H),1.68-1.57(m,22H)。
实施例20
制备化合物CNCIV-5，结构式如下：
制备方法同实施例16，除了用2(2,2'–(2,2'-氧双(乙烷-2,1-二基)双(氧))二(乙胺))代替乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCIV-5，收率20％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.01-9.90(m,4H),8.68-8.31(m,4H),7.90(d,2H,J＝12.30Hz),7.82(s,2H),7.73(d,2H,J＝7.41Hz),7.02(d,J＝8.52Hz,2H),5.66(d,2H,J＝12.84Hz),3.91(br,4H),3.52(m,24H),3.40(m,8H),2.58(m,4H),1.99(s,12H),1.89(m,4H),1.71(m,2H),1.57(s,12H)。
实施例21
制备化合物CNCV-2，结构式如下：
制备方法同实施例2，除了用2,3,5-三碘基苯甲酸代替泛影酸进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCV-2，收率46％。
1HNMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.95(m,4H),8.65-8.48(m,4H),8.03(s,2H),8.01-7.90(m,5H),7.76(s,2H),7.62(s,2H),7.45(d,J＝8.13Hz,2H),6.65-6.49(m,4H),4.12(br,4H),3.42(m,8H),2.53(m,4H),1.85(m,4H),1.76(m,8H),1.68(s,12H)。
实施例22
制备化合物CNCV-3，结构式如下：
制备方法同实施例21，除了用1,3-乙二醇代替1,3-乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCV-3，收率26％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):9.98(m,4H),8.60-8.46(m,4H),8.31(s,2H),7.99-7.86(m,5H),7.75(s,2H),7.62(s,2H),7.49(d,J＝8.13Hz,2H),6.62-6.48(m,4H),4.09(br,4H),3.40(m,8H),2.54(m,4H),1.81(m,4H),1.72(m,8H),1.61(s,12H)。
实施例23
制备化合物CNCVI-2，结构式如下：
制备方法同实施例3，除了用2,4,6-三碘基苯甲酸代替泛影酸进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCVI-2，收率43％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.03(m,4H),8.78-8.57(m,4H),8.03(s,2H),8.03-7.88(m,5H),7.82(s,4H),7.48(d,J＝8.13Hz,2H),7.21(s,4H),6.62-6.45(m,4H),4.23(br,4H),3.39(m,8H),2.57(m,4H),1.95(m,4H),1.83(m,8H),1.58(s,12H)。
实施例24
制备化合物CNCVI-3，结构式如下：
制备方法同实施例23，除了用1,3-乙二醇代替1,3-乙二胺进行反应，其余合成步骤不变，得到终产品化合物CNCVI-3，收率29％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ(ppm):10.04(m,4H),8.59-8.38(m,4H),8.06(s,2H),8.11-7.91(m,5H),7.77(s,4H),7.51(d,J＝8.13Hz,2H),6.88-6.47(m,4H),4.21(br,4H),3.36(m,8H),2.58(m,4H),1.87(m,4H),1.74(m,8H),1.66(s,12H)。
应用实验
本发明的细胞实验选用HepG2(人肝癌细胞)与L02(人正常肝细胞)细胞进行体外培养。其中，所述的HepG2细胞来自中国科学院上海细胞所，所述的L02细胞来自于上海复生生物科技有限公司。所述HepG2细胞在含有10％FBS，100IU/mL青霉素和100mg/mL链霉素的HyClone DMEM培养基中培养。所述L02细胞在含有10％FBS，100IU/mL青霉素和100mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养。
本发明的动物实验中的模型鼠为普通裸鼠经腋下接种HepG2细胞，饲养裸鼠1周，得到肿瘤模型。
本发明的动物实验中的模型兔为普通大耳兔肝脏原位接种VX2(兔源肝癌细胞)，饲养兔2-3周，得到肿瘤模型。
参见图1是实施例1制备的化合物CNCI-1与泛影酸钠体外CT强度对照图，将化合物CNCI-1与泛影酸钠在1.5mL的EP管中分别配制等体积的浓度梯度溶液(40mg I/mL-0)置于Siemens Inveon PET/CT下进行成像，分析成像结果，在图示浓度梯度范围内，这两种造影剂具有近似的CT信号强度。
参见图2和图3分别是泛影酸与实施例1制备的化合物CNCI-1的体外CT强度线性图，在上述浓度梯度范围内，将CT值绘制成回归曲线，横坐标为两种造影剂的含碘量(mg I/mL)，纵坐标为CT值，两条曲线的R2均大于0.99，说明这两种造影剂在图示浓度梯度具有良好的线性关系。
参见图4是实施例1制备的化合物CNCI-1与ICG的MTT细胞活力测试图。测试化合物CNCI-1和ICG对HepG2细胞的细胞毒性，于37℃将细胞接种到96孔板(6×103细胞/孔)上，5％CO2条件下共孵育24小时。随后，在新鲜培养基中加入CNCI-1或ICG(0-100μM)加入至孵育体系。48小时后，进行标准MTT测定检测细胞活力。其中横坐标指化合物以及ICG用量，纵坐标指化合物及ICG对细胞的抑制率。图中表明，化合物CNCI-1与ICG的浓度小于100μM时，HepG2的细胞均存活率在80％以上，说明该造影剂具有良好的细胞相容性且毒性较低。
参见图5是实施例1制备的化合物CNCI-1与ICG在肝癌细胞HepG2与正常肝细胞L02中的体外细胞摄取评价图。首先，将HepG2在5％CO2，37℃下在12孔板(2.0×105细胞/孔)上孵育24小时，随后用含有化合物CNCI-1(25μM)的培养基替换原培养基，孵育1小时。经PBS洗涤两次并用4％多聚甲醛溶液固定，通过共聚焦显微镜(Olympus，Japan)分析CLSM图像。以相同方法处理L02细胞作为对照。图4A中DAPI为活细胞细胞核染色，图4B中化合物CNCI-1染色，图4C中MERGE图为图4A和图4B叠加在一起的图。实验结果显示化合物CNCI-1被吞噬进入肝癌细胞内，而在这正常肝细胞中没有此现象发生，说明化合物CNCI-1肝癌细胞中的摄取效率远高于正常肝细胞。
参见图6是实施例1制备的化合物CNCI-1的活体小动物近红外成像图。IVIS成像光谱系统用于进行NIRF荧光成像实验，并通过IVIS 4.5 Living Imaging软件(PerkinElmer，U.S.)在此参数(λex＝780nm，λem＝831nm，曝光时间＝5.8秒)下进行分析。实验选取两组HepG2腋下接种裸鼠，分别经尾静脉注射浓度为10mg/kg的化合物CNCI-1与ICG的2％泊洛沙姆溶液0.2mL，在不同时间段对实验鼠进行近红外成像，记录不同时间段的活体模型鼠近红外成像结果。图中圆圈部位指示肿瘤位置，肿瘤区域成像亮度远高于周围组织。因此，在近红外成像下均能显示化合物CNCI-1与ICG在肿瘤区域的富集，且化合物CNCI-1具有更好的对比度。
参见图7为本发明造影剂最优选化合物的活体小动物CT成像图。实验采用大耳兔原位接种兔源肝癌VX2细胞，建造肝癌模型。实验兔经静脉快速推注给药(化合物浓度100mg/mL,给药7mL)，利用Siemens Inveon PET/CT对兔子进行肝脏灌注成像，得到兔子肝部的CT图像，A为兔子肝部横切面造影图，B为兔子肝部侧切面造影图，C为兔子肝部竖切面造影图，标尺位置指示肝癌附近的异生血管，D为仪器拟合出其肝脏部位的立体图像，箭头所指示即为拟合生成的异生血管立体图像。体内CT实验结果显示，肝癌处异生的血管显像明显，呈现高亮，通过处理且能拟合出异生血管的3D影像，可用于指示肝癌位置。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种新型双模态小分子造影剂，其特征在于：为如式(1)所示的化合物，
CT-Linker-NIR-Linker-CT·W+
(I)，
其中，CT表示碘化有机分子；
Linker表示连接链，结构为M选自-COO-、-CO-、-NH-或-O-；N选自-COO-、-CO-、-NH-或-O-；X为-O-；m为0、1、2、3、4、5或6；m’为2、3、4、5或6；
NIR表示菁类染料衍生物，结构为R1、R2、R3、R4、R5和R6相同或不同，彼此独立地选自羧基、氨基、羟基、磺酸基或氢原子；Y选自羧酸阴离子、磺酸阴离子或磷酸阴离子；Rx为H或卤素；Ry和Rz为H，或Ry和Rz与其相连的碳一起形成3-6元碳环；n为1、2、3或4；
W表示碱金属。
2.根据权利要求1所述的一种新型双模态小分子造影剂，其特征在于：
所述碘化有机分子为芳香族含碘化合物，结构为其中，Rc1、Rc2、Rc3、Rc4和Rc5中至少一个为I，其余选自I、-COOH、-NH2、-CONH2或-CONHCH3；
所述中，M和N为-NH-或-O-；m为0、2或3；m’为2、3或4；
所述中，R1、R3、R4和R6相同，选自氢原子；R2和R5相同，选自羧基；当Ry和Rz为H时，Rx为H；当Ry和Rz与其相连的碳一起形成3-6元碳环时，Rx为卤素，选自F、Cl、Br或I；n为2或3；
W选自Na或K。
3.根据权利要求2所述的一种新型双模态小分子造影剂，其特征在于：
所述CT的结构为
所述Linker的结构为
所述NIR的结构为
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种新型双模态小分子造影剂，其特征在于：所述造影剂选自如下结构的化合物中的任一种：
5.一种权利要求1所述的新型双模态小分子造影剂的制备方法，其特征在于：所述造影剂是在碱和缩合剂的作用下，将连接Linker的有机碘化分子与NIR在室温下进行缩合反应得到，反应如下所示：
CT-Linker+NIR→CT-Linker-NIR-Linker-CT·W+
(I)，
所述NIR与连接Linker的有机碘化分子的摩尔比为1∶(2.3-2.5)；NIR与碱的摩尔比为1∶(3-3.5)；NIR与缩合剂的摩尔比为1∶(3-3.5)；
其中，CT表示碘化有机分子；
Linker表示连接链，结构为M选自-COO-、-CO-、-NH-或-O-；N选自-COO-、-CO-、-NH-或-O-；X为-O-；m为0、1、2、3、4、5或6；m’为2、3、4、5或6；
NIR表示菁类染料衍生物，结构为R1、R2、R3、R4、R5和R6相同或不同，彼此独立地选自羧基、氨基、羟基、磺酸基或氢原子；Y选自羧酸阴离子、磺酸阴离子或磷酸阴离子；Rx为H或卤素；Ry和Rz为H，或Ry和Rz与其相连的碳一起形成3-6元碳环；n为1、2、3或4；
W表示碱金属。
6.根据权利要求5所述的新型双模态小分子造影剂的制备方法，其特征在于：所述反应所用的溶剂为酰胺类溶剂、酮类溶剂、腈类溶剂和亚砜类溶剂中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的新型双模态小分子造影剂的制备方法，其特征在于：所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙腈和二甲基亚砜中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的新型双模态小分子造影剂的制备方法，其特征在于：所述碱为无机碱或有机碱；所述的无机碱选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸钾中的一种或多种；所述的有机碱选自三乙胺、二异丙基乙胺和吡啶中的一种或多种。
9.根据权利要求5所述的新型双模态小分子造影剂的制备方法，其特征在于：所述缩合剂为环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐中的一种或多种。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的造影剂在近红外/CT成像中的应用。
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