CN109971766A

CN109971766A - 一种与植物耐逆相关蛋白PwRBP1及其编码基因与应用

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Publication number: CN109971766A
Application number: CN201910244335.0A
Authority: CN
Inventors: 张凌云; 崔潇月; 张鹤华
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2039-03-28
Also published as: CN109971766B

Abstract

本发明公开了一种与植物耐逆性相关的RNA结合蛋白PwRBP1及其编码基因与应用。本发明将从木本植物中发现的PwRBP1编码基因导入拟南芥中得到转PwRBP1拟南芥植株。实验证明，相比于受体植株，转PwRBP1拟南芥植株的耐旱性和耐盐性得到显著提高，表明PwRBP1及其编码基因具备耐逆性，适于推广应用。

Description

一种与植物耐逆相关蛋白PwRBP1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物耐逆性相关的RNA结合蛋白PwRBP1及其编码基因与应用。

背景技术

干旱胁迫与盐胁迫是两种主要的非生物环境胁迫，其会导致植物产生诸如渗透伤害、离子伤害、活性氧和有毒物质的积累等，从而严重影响植物种子的萌发、光合作用、植物生长发育等各项生理和生长过程。而植物在长期进化过程中会形成一系列有效的作用机制，其中包括调控胁迫相关基因的表达以应对外界不良环境。

RBP蛋白是一种RNA结合蛋白，其在真核生物中具有结合RNA能力的蛋白， RNA结合蛋白在转录后水平调控的过程中起关键作用，它们可以协调相关mRNA的翻译，很大程度上与DNA结合蛋白协调相关DNA序列表达的方式相同。植物中的 RBP蛋白相对于其他组织中的研究较少，原因是主要缺乏用来研究转录后水平调控的体外培养系统。RNA结合蛋白在生物体的生长发育、应对低温、水淹、干旱高盐、高温等胁迫中均能发挥重要的作用，目前在模式植物如拟南芥和水稻中的RBP基因与植物抗逆性相关研究已经取得了重要进展，但木本植物中RBP基因的功能研究报道较少。基于此，提出本发明。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物抗逆性相关蛋白。

本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白的名称为PwRBP1，来源于青杄(Piceawilsonii Mast.)，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白：

a)包含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白；在一些实施例中，是如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白；

b)在SEQ ID NO.2所示的蛋白质蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

c)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白；

d)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白。

其中，SEQ ID NO.2由430个氨基酸残基组成。

上述b)中标签可以是表1所述序列标签，该标签为了使a)中的蛋白便于纯化，可连接在在序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白的氨基末端或羧基末端。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白PwRBP1，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白PwRBP1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白PwRBP1的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和 /或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明又提供了与PwRBP1蛋白相关的生物材料。

本发明提供的与PwRBP1蛋白相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码PwRBP1蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子，在一些实施例中所述DNA分子是cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PwRBP1蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码PwRBP1蛋白的cDNA 分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO.1由1293个核苷酸组成，编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本领域相关技术人员能够通过使用已知的如定向进化和点突变等实验方法，对本发明的编码PwRBP1的核苷酸序列进行突变。凡是经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的PwRBP1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PwRBP1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码PwRBP1的核酸分子的表达盒(PwRBP1 基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PwRBP1的DNA，该DNA不但可包括启动PwRBP1转录的启动子，还可包括终止PwRBP1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述PwRBP1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1205、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、 pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司) 等。使用PwRBP1基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP 基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素、氯霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

扩增上述PwRBP1基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明的实施例中，所述重组载体具体可为在pCAMBIA1205载体的BamHI和SmaI位点间插入上述PwRBP1基因(SEQ ID NO.1)得到的重组表达载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。在本发明的实施例中，采用的农杆菌为GV3101。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供PwRBP1蛋白或上述生物材料的新用途。

本发明提供了PwRBP1蛋白或上述生物材料在调控植物耐逆性中的应用。

本发明还提供了PwRBP1蛋白或上述生物材料在培育耐逆性提高或降低的转基因植物中的应用。

本发明还提供了PwRBP1蛋白或上述生物材料在植物育种中的应用。

上述应用中，所述耐逆为耐盐性和/或耐旱性。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

为解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性改善的转基因植物的方法；在一些实施例中，所述改善为提高；在另一些实施例中，所述改善为降低。

本发明提供的培育提高抗逆性的转基因植物的方法包括提高受体植物中PwRBP1蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的对于高盐和干旱的耐受能力均高于所述受体植物。

上述方法中，所述提高受体植物中PwRBP1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中表达或过表达PwRBP1蛋白。

上述方法中，所述表达或过表达的方法为将PwRBP1蛋白质的编码基因导入受体植物；所述PwRBP1蛋白的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。

在本发明的一个试验方法中，PwRBP1蛋白的编码基因(即SEQ ID NO.1所示的核苷酸)通过含有PwRBP1蛋白的编码基因的表达盒的重组载体pCAMBIA1205- PwRBP1导入农杆菌GV3101中。所述重组载体pCAMBIA1205-PwRBP1为将序列表中SEQ ID NO.1所示的PwRBP1插入表达载体pCAMBIA1205的BamHI和SmaI酶切位点间，且保持pCAMBIA1205载体的其他序列不变后得到的载体。所述重组载体 pCAMBIA1205-PwRBP1表达PwRBP1蛋白。

上述方法中所述转基因植物的抗逆性高于所述野生型受体植物的具体表现为在逆境胁迫下产生如下方式：所述转基因植物在高浓度盐或高浓度甘露醇的胁迫下种子萌发率和/或幼苗根长和/或存活率大于所述所述受体植物。示例性的，上述高盐环境具体可以是100mM、200mM的NaCl水溶液引起的环境；上述干旱环境具体可以是200mM、 300mM的甘露醇水溶液模拟得到的干旱环境，也可以是停止浇水11天的干旱处理环境。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述PwRBP1基因导入受体植物得到的第一代转基因植物同时包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0)。

本发明首先发现了新基因PwRBP1，然后将其导入拟南芥中得到转PwRBP1拟南芥，并发现转PwRBP1拟南芥对于高盐和干旱的耐受能力均高于原受体植株。其具体表现如下：在100mM浓度的NaCl胁迫下，转基因植株的种子萌发率、根长均显著高于原野生型植株，其中萌发率提高了45.82％，根长则比野生型对照组提高了43.32％。在浇灌200mM浓度的NaCl溶液胁迫下，处理11天后转基因幼苗的存活率比原野生型植株的存活率提高了53.39％；并且本发明获得的转PwRBP1拟南芥的种子在200mM 浓度的甘露醇培养基胁迫下其种子萌发率、根长均显著高于原野生型植株，其中萌发率为野生型的1.41倍，根长则比野生型对照组提高了18.13％。在培养基质中停止浇水11天，又复水3天后转基因幼苗的存活率比原野生型植株提高了1.55倍。上述结果表明，PwRBP1或其编码的蛋白具备提高植物耐旱性和耐盐性的功能。

附图说明

图1为PwRBP1基因在青杄各组织中的表达情况。

图2为转PwRBP1拟南芥分子检测结果。

图3为转PwRBP1拟南芥和野生型拟南芥种子在100mM的NaCl处理下萌发8 天的观测结果。

图4为转PwRBP1拟南芥和野生型拟南芥种子在100mM的NaCl处理下萌发率测定结果。

图5为转PwRBP1拟南芥和野生型拟南芥种子在200mM的甘露醇处理下萌发8 天的观测结果。

图6为转PwRBP1拟南芥和野生型拟南芥种子在200mM的甘露醇处理下萌发率测定结果。

图7为转PwRBP1拟南芥和野生型拟南芥种子萌发后转入含不同浓度NaCl和甘露醇的平板生长8天的根长观察结果。

图8为转PwRBP1拟南芥和野生型拟南芥种子萌发后转入含不同浓度NaCl和甘露醇的平板生长8天的根长的数值统计。

图9为转PwRBP1拟南芥和野生型拟南芥幼苗在200mM的NaCl处理11天后的观测结果。

图10为转PwRBP1拟南芥和野生型拟南芥幼苗在干旱处理11天，复水3天后的观测结果。

图11为转PwRBP1拟南芥和野生型拟南芥幼苗在盐处理和干旱处理后存活率测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pCAMBIA1205载体可从申请人(北京林业大学)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、PwRBP1及其编码基因的获得

一、PwRBP1及其编码基因的获得

本以由英潍捷基(上海)公司完成的采用Gateway方法构建的青杄cDNA文库为模板，采用5’-CTGATGAATATCGACTTTGGAAAGTC-3’和 5’-ATGATGCAACCCACAGCAGG-3’，进行PCR扩增，获得阳性cDNA序列，并进行测序。

测序结果表明：cDNA核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，由1293个核苷酸组成，将该基因命名为PwRBP1，PwRBP1编码的蛋白命名为PwRBP1，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2，由431个氨基酸组成。

上述cDNA可以通过人工合成获得。

二、荧光定量PCR分析PwRBP1基因的组织表达情况

提取青杄花粉、根、茎、针叶、种子组织的RNA，反转录合成cDNA；分别以上述各组织cDNA为模板，以5’-TATGGGTTTGTGAGGTTTGGCG-3’和5’-T ATGAGATCCGCCATTGCCTG-3’为检测引物，PCR扩增，检测PwRBP1基因在青杄不同组织中表达情况。同时以EF1-α基因为内参，扩增EF1-α基因的5’引物为：5’–AACTGGAGAAGGAACCCAAG-3’，3’引物为：5’-AACGACCCAATGGAGGATAC -3’。RT-qPCR反应条件：95℃预变性15min；95℃20sec，56℃28sec，72℃50sec，共33个循环；再72℃延伸5min。

PwRBP1基因在各组织中的表达情况如图1所示。结果表明，PwRBP1在所有组织中均有表达其中，根中表达量最高，针叶中表达量较低。

实施例2、PwRBP1基因在提高植物耐逆性中的应用

一、转PwRBP1拟南芥的构建

1、PwRBP1基因的获得

制备下述扩增引物对：

引物1：5’-ATGATGCAACCCACAGCAGG-3’；

引物2：5’-CTGATGAATATCGACTTTGGAAAGTC-3’。

以青杄的cDNA为模板，用上述引物1和2进行PCR扩增，得到大小为1293bp 的PCR产物，并将上述PCR产物与pEASY-T1载体相连接后其进行测序。

测序结果表明：PCR产物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1，可编码序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白PwRBP1。

2、重组表达载体的获得

制备下述引物对：

引物1：5’-CGCGGATCCATGATGCAACCCACAGCAGG-3’；

引物2：5’-TCCCCCGGGCTGATGAATATCGACTTTGGAAAGTC-3’。

以上述连接有PwRBP1序列的pEASY-T1的质粒为模板进行PCR扩增，将PCR 产物用限制性内切酶BamHI和SmaI进行双酶切，得到酶切产物。酶切产物与经相同酶切的pCAMBIA1205载体相连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布在含有35ug/ml氯霉素的LB平板上培养过夜。挑取白色单菌落于含有35ug/ml氯霉素的LB液体培养基中培养过夜并进行菌落PCR鉴定；同时碱法提取质粒DNA进行序列测定。

测序结果表明，质粒为将序列表中SEQ ID NO.1所示的PwRBP1插入表达载体pCAMBIA1205的BamHI和SmaI酶切位点间得到的重组载体，将其命名为 pCAMBIA1205-PwRBP1。

3、转PwRBP1拟南芥的获得

1)转PwRBP1拟南芥的获得

将上述步骤2制备的重组载体pCAMBIA1205-PwRBP1转化农杆菌GV3101的感受态细胞(购置于上海唯地生物技术公司)，得到重组菌GV3101/pCAMBIA1205- PwRBP1(提取质粒送去测序，为重组载体pCAMBIA1205-PwRBP1)。

将重组菌GV3101/pCAMBIA1205-PwRBP1单克隆接种于含35mg/L氯霉素的 YEB液体培养基中，28℃振荡培养两天。将培养液3000rpm/min离心5分钟，所得农杆菌沉淀用含5％蔗糖和0.03％SilwetL-77的侵染液悬浮。

采用花絮浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-0)(购自ABRC)，收获当代转基因拟南芥植株所接的种子(T1代)，在含有40μg/ml潮霉素(Hygromycin B) 和40μg/ml羧苄青霉素(Carbenicllin)的MS培养基筛选萌发的种子。将在上述培养基上萌发的T1代幼苗移到培养土中，收获种子(T2代)，然后经相同的筛选过程得到纯合的转PwRBP1拟南芥植株(T4代)种子。最后将转PwRBP1拟南芥植株(T4代) 种子直接播种到培养土中，长出的PwRBP1拟南芥植株(T4代)在长日照条件下生长两周左右开花。

2)转PwRBP1拟南芥的分子检测

提取转PwRBP1拟南芥植株(T4代)的总蛋白，以其为模板，经SDS-PAGE跑胶、转膜、封闭后以GFP标签为抗体进行检测，并以野生型拟南芥为对照，检测结果如图2所示，转PwRBP1拟南芥植株(T4代)经GFP抗体结合后有明显条带，而野生型拟南芥则没有检测到条带，证明该T4代株系中PwRBP1的表达量明显提高。

采用同样的方法，将空载体pCAMBIA1205转入野生型拟南芥中，得到转空载体拟南芥，播种、传代，得到空载体过表达拟南芥植株(T4代)。

二、转PwRBP1拟南芥功能研究

1、种子萌发试验

1)耐盐性研究

在含有100mM的NaCl的MS培养基上进行种子萌发实验，实验中取转PwRBP1 拟南芥植株(T4代)、转空载体拟南芥植株(T4代)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光强为300-400μmol m^-2s^-1，光照下的室温为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的室温为18-20℃，相对湿度大于90％。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

实验进行第8天统计各类种子的萌发率结果如图3、4所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwRBP1拟南芥植株T4代)。在100mM的NaCl处理下，野生型对照和转Pw RBP1株系的种子均能在第4天萌发，但转Pw RBP1株系的种子在第1天的萌发率比野生型高45.82％，该表明结果表明在100mM NaCl胁迫处理下，转PwRBP1 拟南芥的种子萌发率显著高于野生型，具有更好的耐盐能力。

野生型拟南芥(WT)和空载体过表达拟南芥植株(T4代)的结果无显著差异。

2)耐旱性研究

在含有200mM的甘露醇的MS培养基上进行种子萌发实验，实验中取转PwRBP1 拟南芥植株(T4代)、转空载体拟南芥植株(T4代)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光强为300-400μmol m^-2s^-1，光照下的室温为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的室温为18-20℃，相对湿度大于90％。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

实验进行第8天统计各类种子的萌发率结果如图5、6所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwRBP1拟南芥植株T4代)。在200mM甘露醇胁迫处理下，野生型和转PwRBP1株系的种子在胁迫处理第1天时均未萌发，但均能在第5天时萌发，转Pw RBP1株系的种子在胁迫处理第2天的萌发率比野生型高1.41倍，该结果表明在200 mM甘露醇胁迫处理下，转PwRBP1拟南芥的种子萌发率显著高于野生型，具有更好的抵御干旱胁迫的能力。

2、根长测量耐盐性和耐旱性试验

实验中取转PwRBP1拟南芥植株(T4代)、转空载体拟南芥植株(T4代)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光强为 300-400μmol m^-2s^-1，光照下的室温为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的室温为18-20℃，相对湿度大于90％。待种子萌发后将萌发后的拟南芥幼苗，用镊子移到垂直平铺在含有100mM的NaCl或200mM甘露醇的MS培养基上，每个株系100 粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

实验进行第8天统计各类株系的根长，结果如图7、8所示(WT表示野生型拟南芥， T表示转PwRBP1拟南芥植株T4代)。在100mM NaCl胁迫处理下，转PwRBP1拟南芥幼苗根长比野生型植株提高了43.32％；在200mM甘露醇胁迫处理下，转PwRBP1 拟南芥幼苗根长比野生型植株提高了18.13％。该结果表明在100mM NaCl以及200 mM甘露醇胁迫处理下，转PwRBP1拟南芥幼苗的根长显著长于野生型，具有更好的耐盐和耐旱性。

上述结果表明，PwRBP1或其编码的蛋白具备耐旱性和耐盐性。

3、幼苗耐逆实验

1)耐盐性研究

实验中取转PwRBP1拟南芥植株(T4代)、转空载体拟南芥植株(T4代)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光强为 300-400μmol m^-2s^-1，光照下的室温为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的室温为18-20℃，相对湿度大于90％。待种子萌发后将萌发后的拟南芥幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中，在培养基质中生长12天后，浇以200mM NaCl溶液，每两天浇一次，11天后统计存活率。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

其实验结果如图9、11所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwRBP1拟南芥植株T4代)，转PwRBP1拟南芥植株(T4代)的幼苗在200mM NaCl处理后的存活率比野生型拟南芥的幼苗的存活率提高了53.39％，具有更强的耐盐能力。

2)耐旱性研究

实验中取转PwRBP1拟南芥植株(T4代)、转空载体拟南芥植株(T4代)以及野生型拟南芥(WT)种子进行播种，其培养条件为光照16小时，黑暗8小时，光强为 300-400μmol m^-2s^-1，光照下的室温为22-24℃，相对湿度为70-90％；黑暗条件下的室温为18-20℃，相对湿度大于90％。待种子萌发后将萌发后的拟南芥幼苗移至培养基质(营养土：蛭石为1:1)中，在培养基质中生长12天后，停止浇水11天，复水3 天后统计存活率。每个株系100粒种子，实验重复3次，结果取平均值。

其实验结果如图10、11所示(WT表示野生型拟南芥，T表示转PwRBP1拟南芥植株T4代)，转PwRBP1拟南芥植株(T4代)的幼苗在干旱处理11天，复水3天后的存活率是野生型拟南芥的幼苗的1.55倍，显著高于野生型幼苗的存活率，表明转 PwRBP1拟南芥植株具有更好的耐旱能力。

上述结果表明，PwRBP1或其编码的蛋白具备耐旱性和耐盐性。

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 一种与植物耐逆相关蛋白PwRBP1及其编码基因与应用

<130> 20190124

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1293

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgatgcaac ccacagcagg cgtcggccct ccttttgcaa accctaatca aaaccagcag 60

cggcagcaat ggcttcaaca gcagcagcag atggcgatgg cgatgcagca gcaacagcag 120

ccgcctcagc aacaggcgaa ccaggccatg gcgatgcagc aacaacaagc cccaatgatg 180

gctcagcagt actatgcaca gcagcctcaa tatcagcagc agcagctacc aatggtgatg 240

cagcaacatc agccgcagtc gagtgacgag gttaagactc tctgggtggg tgatttgcag 300

ttctggatgg acgagggcta tttgcacacc tgtttttccc acactggaga gcttgtttct 360

gccaagataa tccgtaataa gtatactgga cagtcagagg gttatggctt tatggagttc 420

ataacacgta cagctgctga gaagattatg caaacttata atgggacgct aatgcccaac 480

actgaacaag ttttcagaat gaattgggca acttttagca tgggagaaag gcgtctagat 540

ggaggcccag atttttctat ttttgtggga gatttggatt cagatgtctc agatttggtc 600

ttgcaggaga ctttccaaag tcgacattca tcagtgaaag ctgctaaggt tgtcatggat 660

gcaaacacag ggcgctcaaa aggttatggg tttgtgaggt ttggcgagga gagtgagagg 720

gcccgagcca tgacagaaat gaatggtgta tattgttcta ctagacctat gcgaatcagt 780

gcagccaccc caaggaagtc tgcaggggtt cagcaccagt attcaggaag agcaggcaat 840

ggcggatctc atgcccaagg attcccgtca gacaatgatt taaacaatac aactatattt 900

gtaggccggc tagacccaaa tgcgacagat gaagatctga gacaagtctt tggccagtat 960

ggagagcttg tgtctgtaaa aatacctgtt ggtaaaggtt gtggatttgt ccagtttggt 1020

aacagggctt ctgctgagga agccttgcaa aggcttcatg gtactgttat tcgtcagcaa 1080

actgtacgtc tttcttgggg tcgaagccct gcaaacaagc agcaacccca gccccagggg 1140

caacagcctc aatctgatcc aaatcaatgg aatggtgctt actatgggca aggatatgaa 1200

agctatggtt atgctccccc tcctcaagat cctgcaatgt atgcctatgg tggctaccct 1260

ggatatggga attataatca acaggtaagc tag 1293

<210> 2

<211> 430

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Met Gln Pro Thr Ala Gly Val Gly Pro Pro Phe Ala Asn Pro Asn

1 5 10 15

Gln Asn Gln Gln Arg Gln Gln Trp Leu Gln Gln Gln Gln Gln Met Ala

20 25 30

Met Ala Met Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Gln Gln Gln Ala Asn Gln

35 40 45

Ala Met Ala Met Gln Gln Gln Gln Ala Pro Met Met Ala Gln Gln Tyr

50 55 60

Tyr Ala Gln Gln Pro Gln Tyr Gln Gln Gln Gln Leu Pro Met Val Met

65 70 75 80

Gln Gln His Gln Pro Gln Ser Ser Asp Glu Val Lys Thr Leu Trp Val

85 90 95

Gly Asp Leu Gln Phe Trp Met Asp Glu Gly Tyr Leu His Thr Cys Phe

100 105 110

Ser His Thr Gly Glu Leu Val Ser Ala Lys Ile Ile Arg Asn Lys Tyr

115 120 125

Thr Gly Gln Ser Glu Gly Tyr Gly Phe Met Glu Phe Ile Thr Arg Thr

130 135 140

Ala Ala Glu Lys Ile Met Gln Thr Tyr Asn Gly Thr Leu Met Pro Asn

145 150 155 160

Thr Glu Gln Val Phe Arg Met Asn Trp Ala Thr Phe Ser Met Gly Glu

165 170 175

Arg Arg Leu Asp Gly Gly Pro Asp Phe Ser Ile Phe Val Gly Asp Leu

180 185 190

Asp Ser Asp Val Ser Asp Leu Val Leu Gln Glu Thr Phe Gln Ser Arg

195 200 205

His Ser Ser Val Lys Ala Ala Lys Val Val Met Asp Ala Asn Thr Gly

210 215 220

Arg Ser Lys Gly Tyr Gly Phe Val Arg Phe Gly Glu Glu Ser Glu Arg

225 230 235 240

Ala Arg Ala Met Thr Glu Met Asn Gly Val Tyr Cys Ser Thr Arg Pro

245 250 255

Met Arg Ile Ser Ala Ala Thr Pro Arg Lys Ser Ala Gly Val Gln His

260 265 270

Gln Tyr Ser Gly Arg Ala Gly Asn Gly Gly Ser His Ala Gln Gly Phe

275 280 285

Pro Ser Asp Asn Asp Leu Asn Asn Thr Thr Ile Phe Val Gly Arg Leu

290 295 300

Asp Pro Asn Ala Thr Asp Glu Asp Leu Arg Gln Val Phe Gly Gln Tyr

305 310 315 320

Gly Glu Leu Val Ser Val Lys Ile Pro Val Gly Lys Gly Cys Gly Phe

325 330 335

Val Gln Phe Gly Asn Arg Ala Ser Ala Glu Glu Ala Leu Gln Arg Leu

340 345 350

His Gly Thr Val Ile Arg Gln Gln Thr Val Arg Leu Ser Trp Gly Arg

355 360 365

Ser Pro Ala Asn Lys Gln Gln Pro Gln Pro Gln Gly Gln Gln Pro Gln

370 375 380

Ser Asp Pro Asn Gln Trp Asn Gly Ala Tyr Tyr Gly Gln Gly Tyr Glu

385 390 395 400

Ser Tyr Gly Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Asp Pro Ala Met Tyr Ala Tyr

405 410 415

Gly Gly Tyr Pro Gly Tyr Gly Asn Tyr Asn Gln Gln Val Ser

420 425 430

Claims

1.一种蛋白，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白：

a)包含SEQ ID NO.2所示序列的蛋白，优选的，如SEQ ID NO.2所示序列的蛋白；

b)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的末端连接标签序列的融合蛋白；

2.与权利要求1所述的蛋白相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子，优选的，所述DNA分子为cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子，优选的，所述具有75％或75％以上同一性为80％、85％、90％或95％以上的同一性；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的相关生物材料在植物育种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

6.一种培育耐逆性改善的转基因植物的方法，包括调节受体植物中权利要求1所述的蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述改善为提高或降低，优选为提高；所述调节为提高或降低，优选为提高；所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述改善为提高，所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(3)中任一种：

(1)转基因植物的种子萌发率高于受体植物；

(2)转基因植物的根长长于受体植物；

(3)转基因植物的存活率高于受体植物。

9.根据权利要求7-8中任一所述的方法，其特征在于：

所述提高受体植物中权利要求1所述的蛋白的表达量和/或活性的方法为在受体植物中表达或过表达权利要求1所述的蛋白；

或，所述表达或过表达的方法为将权利要求1所述的蛋白的编码基因导入受体植物；

或，所述蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的DNA分子。

10.根据权利要求4或5所述的应用或根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。