CN109963867B

CN109963867B - 通过噬菌体展示技术与痤疮细菌特异性结合的人抗体及其用途

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Publication number: CN109963867B
Application number: CN201780050100.7A
Authority: CN
Inventors: 徐经薰; 蔡淳基; 姜恩惠; 郑钟焕; 李基世; 高善基; 徐尚沃; 林东佑; 崔成灿
Original assignee: E&s Healthcare Co ltd
Current assignee: E&s Healthcare Co ltd
Priority date: 2016-06-13
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2037-06-13
Also published as: JP2019521678A; EP3476862A4; US11141369B2; CN109963867A; EP3476862B1; EP3476862A1; KR20170140784A; KR101992292B1; JP6916216B2; US20190224101A1; BR112018076013A2; ES3008279T3

Abstract

本发明涉及使用噬菌体展示技术的特异性结合痤疮细菌的人抗体及其用途，更具体地，涉及特异性结合(抗原)的抗体；包含其的人抗体；使用其的噬菌体展示技术；以及使用其的化妆品组合物和药物组合物。

Description

通过噬菌体展示技术与痤疮细菌特异性结合的人抗体及其用途

技术领域

本发明涉及通过使用噬菌体展示技术与痤疮细菌特异性结合的人抗体及其用途，更具体地，涉及与痤疮丙酸杆菌(Propioni-bacterium acnes:P.acnes)特异性结合的抗体，以及使用该抗体的化妆品组合物和药物组合物。

背景技术

虽然痤疮的产生原因尚未明确，但它是一种局限性慢性炎症性皮肤病，是由于面部、颈部、胸部、背部、肩部等部位皮脂分泌增加、毛囊角化异常、形成诱发痤疮的痤疮丙酸杆菌的群落等多种原因引起的炎症反应所导致的。

痤疮是可在皮肤上观察到的常见皮肤病，发生率在十几岁的青少年和成年人中分别为85％和11％，通常发生在青少年10岁初期，成年后减少，但是也存在成年后才发生或者更加严重的情况。虽然青春期痤疮更常发生于男性中，但成人痤疮则更常发生在女性中，这是由于女性荷尔蒙的变化，女性在月经前随着与着床相关的黄体酮分泌量的增多，会刺激男性荷尔蒙的分泌，从而导致成人痤疮症状恶化的情况较多。引起痤疮的痤疮丙酸杆菌(P.acnes)为兼性厌氧菌，其已被发现存在于大部分健康的成人皮肤中,痤疮丙酸杆菌(P.acnes)为不会在正常人中引发疾病的机会感染性病原体，以痤疮为主，与假体关节感染,心内膜炎,结节病,内眼球炎,菌血症等多种炎症疾病有关。

痤疮丙酸杆菌通过在毛孔中的厌氧条件下分泌各种酶，将毛囊中皮脂的脂肪酸(Fatty acid)和甘油三酯(Triglyceride)分解成短链脂肪酸(Short chain fatty acid)和丙酸(Propionic acid)以获得养分，痤疮丙酸杆菌(P.acnes)在毛孔中形成群落，对周围细胞造成损伤，并分解皮脂，所产生的各种副产物阻塞毛孔，从而引起人体免疫系统炎症反应，引发痤疮。

因此，为了治疗痤疮已经尝试过如局部涂抹和口服抗生素(克林霉素、红霉素等)或激素(维甲酸类)、外科手术切除、紫外线治疗等多种方法,但目前还没有成功的治疗方法，长期使用抗生素或激素会引发严重的副作用，如耐药性、肝毒性、消化性溃疡和畸形等，局部涂抹剂具有引起皮肤刺激及发红,皮肤炎症等副作用,还存在患处渗透不畅的问题。另外,外科手术切除存在因切开皮肤造成损伤并留下瘢痕的问题,紫外线治疗会对皮肤造成损伤，以及具有需要特殊设备的局限性.

由此，噬菌体展示技术最初是由英国医学研究理事会(Medical ResearchCouncil)于1990年开发，是通过制备人源抗体文库(library)，并以抗体片段(Fab，ScFv)的形式表达在噬菌体表面上，从而筛选特异性抗原的抗体克隆技术。已经提出了可以从单pot抗体文库系统中筛选出几乎所有与抗原发生特异性反应的重组人单克隆抗体可能性，因此，当使用噬菌体展示抗体技术时，能获得可应用于体内诊断或治疗的各种抗体片段(Fab或ScFv)。

发明内容

技术问题

本发明的一个目的在于，提供一种与痤疮丙酸杆菌(Propioni-bacterium acnes:P.acnes)特异性结合的单克隆抗体。

本发明的另一个目的在于，提供所述单克隆抗体的用途。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供一种与痤疮丙酸杆菌(Propioni-bacteriumacnes:P.acnes)特异性结合的单克隆抗体。

此外，本发明还提供一种包含用于编码所述单克隆抗体的多核苷酸的表达载体。

此外，本发明还提供一种转化成所述表达载体的转化体。

在本发明的一个优选实施例中，所述单克隆抗体可以是选自以下(a)至(d)中的任意一种抗体：

(a)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链CDR2和SEQ ID NO:3所示的重链CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3；

(b)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的重链CDR1、SEQ ID NO:8所示的重链CDR2和SEQ ID NO:9所示的重链CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:11所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:12所示的轻链CDR3；

(c)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:13所示的重链CDR1、SEQ ID NO:14所示的重链CDR2和SEQ ID NO:15所示的重链CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:17所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:18所示的轻链CDR3；以及

(d)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:19所示的重链CDR1、SEQ ID NO:20所示的重链CDR2和SEQ ID NO:21所示的重链CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:23所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:24所示的轻链CDR3。

(a)包含SEQ ID NO:25所示的重链可变区和SEQ ID NO:26所示的轻链可变区的抗体；

(b)包含SEQ ID NO:27所示的重链可变区和SEQ ID NO:28所示的轻链可变区的抗体

(c)包含SEQ ID NO:29所示的重链可变区和SEQ ID NO:30所示的轻链可变区的抗体；(d)包含SEQ ID NO:31所示的重链可变区和SEQ ID NO:32所示的轻链可变区的抗体。

在本发明的一个优选实施例中，所述单克隆抗体可以是人抗体。

此外，本发明提供用于预防或改善痤疮的化妆品组合物，其包含作为有效成分的所述单克隆抗体。

此外，本发明提供用于预防或治疗痤疮的药物组合物，其包含作为有效成分的所述单克隆抗体。

有益效果

根据本发明的单克隆抗体可以特异性地识别痤疮细菌并之结合。因此，通过使用对痤疮细菌具有抗菌活性的化合物或酶标抗体，预期可以减轻或消除痤疮症状，并且没有副作用。

因此，本发明提供用于改善痤疮的化妆品组合物和的药物组合物的单克隆抗体，该单克隆抗体作为原料即使长期使用也不会产生耐受性和副作用。

附图说明

图1示出了根据本发明一个实施例的在强化梭菌培养基(Reinforcedclostridial medium,RCM)中培养的痤疮丙酸杆菌的照片。

图2示出了根据本发明的实施例的噬菌体展示技术的图片。

图3示出了根据本发明的一个实施例的痤疮丙酸杆菌的第三次淘选滴定的照片。

图4示出了根据本发明的一个实施例的Poly-scFv-噬菌体酶联免疫吸附实验(ELISA)的结果图。

图5示出了根据本发明的一个实施例的Mono-scFv-噬菌体酶联免疫吸附实验(ELISA)的结果图。

图6示出了根据本发明的一个实施例的用于转化为IgG形式的方法的图片。

图7示出了根据本发明一个实施例的人抗体表达和纯化的实验数据。

图8示出了根据本发明一个实施例的人抗体与痤疮丙酸杆菌之间的酶联免疫吸附实验(ELISA)的结果图。

图9示出了根据本发明的一个实施例的通过酶联免疫吸附实验(ELISA)分析人抗体与痤疮丙酸杆菌之间的亲和力的结果图。

图10为示出了根据本发明的一个实施例的确认所产生的人抗体对痤疮丙酸杆菌生长的抑制效果的结果图。

具体实施方式

以下，将对本发明使用的术语进行说明。

本发明中使用的术语“抗体”包括在与特定抗原有免疫反应性的免疫球蛋白分子，包括所有多克隆抗体和单克隆抗体。另外，所述术语还包括嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)及异源结合抗体(例如双特异性抗体)等通过遗传工程所生产的形态。所述术语进一步包括具有对FcRn具有结合功能的单链抗体、scAb、抗体恒定区的衍生物、以及基于蛋白质支架的人工抗体。

本发明中使用的术语“单克隆抗体”为本领域公知术语，是指针对单个抗原位点的高度特异性的抗体。通常，与含有针对不同表位(抗原决定簇)的不同抗体的多克隆抗体不同，单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。单克隆抗体具有提高利用抗原-抗体结合的诊断和测定的选择性和特异性的优点，并且由于其是通过杂交瘤细胞系培养而成的，因此也具有不会被其他免疫球蛋白污染的优点。

通常，免疫球蛋白具有重链和轻链，并且每条重链和轻链分别包含恒定区和可变区(所述区域也称为“结构域(domain)”)。轻链和重链的可变区包含三个叫作“互补决定区”(complementarity determining region，以下称为“CDR”)的可变区和四个“骨架区”(framework region)。所述“CDR”主要用于与抗原的表位(epitope)相结合。通常，每条链的CDR从N-末端开始，按顺序被称为CDR1、CDR2、CDR3，并由特定的CDR所在的链依次识别。

本发明中使用的术语“可变”用于统称抗体之间的特定区域具有明显不同的序列且针对特定抗原显示分别由特定抗体进行特异性结合。抗体的可变性集中于CDR中，而不是均匀分布在抗体的整个可变结构域中。单克隆抗体的重链和轻链分别具有三个CDR，该区域通过识别痤疮细菌的表面抗原而形成抗原-抗体复合体。对这些CDR而言，每个单克隆抗体具有特征序列，并且其六个CDR中的部分或全部可以进行相互作用，以使一个单克隆抗体能够识别特定表位。

本发明中使用的术语“噬菌体展示技术”是指，通过用噬菌体文库来筛选与靶抗原有显著的结合性的噬菌体，从而筛选出具有与抗原具的结合性的scFv的技术。上述技术中，“淘选(panning)”是指，从在噬菌体的外壳上展示肽的噬菌体文库中，只筛选与靶分子(抗体、酶、细胞表面受体)具有结合性的肽表达于表面的噬菌体的过程。重复该过程3至10次，可以选筛选出对靶抗原展示明显的结合性的scFv，最后可将筛选出的scFv制备成人源化单克隆抗体。

以下，将对本发明进行详细的说明。

本发明提供一种特异性结合痤疮丙酸杆菌(Propioni-bacterium acnes:P.acnes)的单克隆抗体。

具体地，所述单克隆抗体可以为选自下列(a)至(d)中的任何一种抗体：

更具体地，所述单克隆抗体优选为选自下列(a)至(d)中的任何一种抗体:

(b)包含SEQ ID NO:27所示的重链可变区和SEQ ID NO:28所示的轻链可变区的抗体；

(c)包含SEQ ID NO:29所示的重链可变区和SEQ ID NO:30所示的轻链可变区的抗体；

(d)包含SEQ ID NO:31所示的重链可变区和SEQ ID NO:32所示的轻链可变区的抗体。

更具体地，单克隆抗体的重链可变区可包含选自SEQ ID NOS：25、27、29和31中的至少一种氨基酸序列，或包含CDR区的与这些序列的同一性达80％或以上，优选为达90％或以上，最优选为达95％或以上的序列；和/或其轻链可变区可以包含选自SEQ ID NOS：26、28、30和32中的至少一种氨基酸序列，或包含CDR区的与这些序列的同一性达80％或以上，优选为达90％或以上，最优选为达95％或以上的序列。

本发明的单克隆抗体可用于通过与生物样品反应并检测出抗原-抗体复合体的形成，来检测痤疮丙酸杆菌(Propioni-bacterium acnes:P.acnes)。

所述“抗原-抗体复合体”是指，样品中的痤疮丙酸杆菌蛋白质抗原与能将其识别的本发明的单克隆抗体的结合物，所述抗原-抗体复合体可以通过选自比色法(colormetric method)、电化学法(electrochemical method)、荧光法(fluorimetricmethod)、发光测定法(luminometry)、粒子计数法(particle counting method)、视觉评价法(visual assessment)和闪烁计数法(scintillation counting method)中的任意一种方法检测而得。然而，可以有多种的应用，不仅限于此。

在本发明中，可通过使用各种标记物来检测抗原-抗体复合体。具体地，例如，可选自酶、荧光物、配体、发光物、微粒和放射性同位素中的一种，但不限于此。优选地，可以通过使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)来检测抗原-抗体复合体。酶联免疫吸附测定法(ELISA)包括各种ELISA法，如通过使用标记抗体来识别附着于固体支持物上的抗原的直接ELISA、通过使用标记二抗将捕获抗体从能识别附着于固体支持物上的抗原的抗体复合体中识别出来的间接ELISA、通过使用另一种标记抗体来识别附着于固体支持物上的抗原与抗体的复合体中的抗原的直接夹心ELISA、通过使用标记二抗来与用于识别附着在固体支持物上的抗原与抗体的复合体中的抗原的另一种抗体进行反应来识别出该抗体的间接夹心ELISA，等等。所述单克隆抗体可以具有检测标记，当没有检测标记时，则可以通过使用用于捕获这些单克隆抗体且具有检测标记的另一种抗体来进行处理并确认即可。

另外，本发明还提供一种包含用于编码本发明的单克隆抗体的多核苷酸的表达载体。另外，本发明还提供一种被转化成所述表达载体的转化体。

本领域的技术人员需要理解的是，用于编码本发明的抗体的多核苷酸，由于密码子的简并性或考虑到要表达上述抗体的生物中所优选的密码子，可以在不改变编码区所表达的抗体的氨基酸序列的范围内对编码区进行各种改变，在不影响基因表达的范围内除编码区以外的部分也可以进行各种改变或修饰，而这些修饰基因也包括在本发明的范围内。也就是说，本发明的多核苷酸只要能编码具有与其相同活性的蛋白质，其中一个或多个核酸碱基可通过取代、缺失、插入或其组合而进行突变，并且这些也包括在本发明的范围内。该多核苷酸的序列可以是短链或双链，并且可以是DNA分子或RNA(mRNA)分子。

在制备所述表达载体时，可根据产生所述抗体的宿主细胞的种类，对例如启动子(promoter)、止子(terminator)、增强子(inhancer)等的表达控制序列、用于膜靶向或分泌的序列，等作适当的选择，根据目的进行各种组合。

本发明的表达载体包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体和病毒载体，但不限于此。除了如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号和增强子等表达控制因子外，合适的表达载体还包括用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列，根据目的通过各种方法制备而成。表达载体的启动子可以是组成型或诱导型启动子。当宿主为埃希氏菌(Escherichia sp.)时，所述信号序列可使用PhoA信号序列、OmpA信号序列等；当宿主为芽孢杆菌(Bacillus sp.)时，所述信号序列可使用α-淀粉酶信号序列、草杆菌蛋白酶信号序列等；当宿主为酵母时，所述信号序列可使用MFa信号序列、SUC2信号序列等；当宿主为动物细胞时，所述信号序列可以使用胰岛素信号序列、α-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等，但不限于此。另外，表达载体还可以包含用于选择含有载体的宿主细胞的选择标记，当表达载体可复制时，还包含复制起点。

此外，本发明还提供一种用于制备单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：

1)在培养基中接种并培养所述转化体；和

2)从所述步骤1)中所培养的培养液中纯化与痤疮丙酸杆菌特异性结合的单克隆抗体。

根据本发明的抗体可以为，通过将本发明的上述表达载体导入到如大肠杆菌或酵母细胞等合适的宿主细胞中，再通过培养经转化的宿主细胞来大量生产而成。根据宿主细胞的种类，本领域技术人员可以基于公知技术容易地选择适当的培养方法和培养基条件等。所述宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。此外，所述宿主细胞也可以为源自如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞中的真核细胞。更优选地，所述动物细胞可以为人源细胞系。将表达载体导入于所述宿主细胞的导入方法可以使用本领域技术人员已知的任何方法。

另外，本发明还提供用于预防或改善痤疮的化妆品组合物，其包含作为有效活性成分的本发明的与痤疮丙酸杆菌特异性结合的单克隆抗体。

另外，本发明还提供所述单克隆抗体在用于预防或改善痤疮的化妆品组合物中的用途。

除了上述人抗体之外，本发明的化妆品组合物还包含常用于化妆品组合物的成分，包括例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和香料等常规佐剂，以及载体。

在本发明的化妆品组合物中，相对于常规含有的化妆品组合物，本发明的单克隆抗体的含量可以为0.1-50重量％，优选为1-10重量％。

本发明的化妆品组成物可制备成所属领域中通常制造的任何制剂，例如，溶液、悬浮液、乳化液、糊剂、凝胶、霜、乳液、粉末、皂、含界面活性剂的清洁剂、油、粉末状粉底、乳化粉底、蜡质粉底和喷雾，但不限于此。更具体地说，可以制备成以下制剂，如柔肤化妆水(柔肤水)、营养化妆水(乳液)、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、洁面霜、洁面泡沫、洁面水、面膜、喷雾或粉末。

当本发明的制剂为糊剂、霜或凝胶时，作为载体成分可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅胶、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。当所述制剂为粉末或喷雾时，作为载体成分可以使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末。尤其，当所述制剂为喷雾时，还可包含如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等推进剂。

当本发明的制剂为乳液或乳化液时，作为载体成分可使用溶剂、增溶剂或乳化剂，例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。

当本发明的制剂为悬浮液时，作为载体成分可以用如水、乙醇或丙二醇的液体稀释剂、如乙氧基化异硬脂、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂的悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。

当本发明的制剂是含有界面活性剂的洁面剂时，作为载体成分可以使用如脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸钠、咪唑烷衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

另外，本发明还提供用于预防或治疗痤疮的药物组合物，所述药物组合物包含作为有效成分的根据本发明的与痤疮丙酸杆菌特异性结合的单克隆抗体。

另外，本发明还提供用于预防或治疗痤疮的药物组合物的用途，该药用组合物包含所述单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体在临床给药时可采用肠胃外给药，一般可以药物制剂的形式使用。肠胃外给药的方法可以是静脉内给药、肌肉内给药、动脉内给药、髓内给药、鞘内、心内给药、经皮给药、皮下给药、腹腔内给药、鼻腔内给药、肠道给药、局部

给药、舌下给药或直肠给药，但不限于此。

当肠胃外给药时，本发明的药物组合物可以按照本领域公知的方法与合适的非口服载体一起制备成注射剂、经皮给药剂和鼻吸入剂。当制成所述注射剂时，必须经过灭菌，以防止受到微生物如细菌和真菌的污染。当制成注射剂时，作为合适的载体可以为，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、包含它们的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质，但不限于此。更优选地，可以使用Hank’s溶液、林格氏液、含有三乙醇胺的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或无菌注射用水、如10％乙醇，40％丙二醇和5％葡萄糖等的等渗液等。为了保护所述注射剂免受微生物污染，可以进一步包括各种抗菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。此外，所述注射剂在大多数情况下可进一步包含例如糖或氯化钠等的等渗剂。

当制成经皮给药剂时，包括软膏剂、霜剂、乳液剂、凝胶剂、外用溶液剂、糊剂、搽剂和气雾剂等。本文所用的“经皮给药”是指，将药物组合物局部给药于皮肤，由此将药物组合物中含有的有效量的活性成分被递送到皮肤中。

当制成吸入式给药剂时，可以使用推进剂，例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，作为适合于根据本发明使用的化合物，可以通过加压喷雾器或喷雾器以气溶胶喷雾的形式方便地进行输送。当制成加压喷雾剂时，给药单位是根据用于控制计量递送量的阀门来确定。例如，可以将用于吸入器或吹入器的明胶胶囊和药筒配制成含有化合物，以及例如乳糖或淀粉等合适的粉末基质的粉末混合物。用于肠胃外给药的制剂记载于所有化学制药中所公知得处方文献(Remington's PharmaceuticalScience,15th Edition,1975.Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania 18042,Chapter 87:Bla？g,Seymour)中。

当本发明的药物组合物含有有效量的根据本发明的单克隆抗体时，可提供有效的预防或治疗痤疮的效果。本说明书中，术语“有效量”是指，表现出优于阴性对照组的反应的量，优选的，是指表现出足以具有杀死痤疮丙酸杆菌或减少痤疮的效果的量。本发明的药物组合物中可以含有0.01至99.99％的根据本发明的单克隆抗体，并且余量可以被药学上可接受的载体所占。本发明药物组合物中所含有的本发明单克隆抗体的有效量根据制备的组合物的形式而变化。

本发明的药物组合物的总有效量可以单剂量向患者给药，也可以多剂量方式按长期分次治疗方法进行给药。根据疾病的程度，本发明的药物组合物的活性成分含量可以不同。肠胃外给药时，基于根据本发明的单克隆抗体，优选的以每天每千克体重按0.01-50mg的量，更优选的按0.1至30mg的量一次性或分多次给药，经口给药时，基于根据本发明的单克隆抗体，优选的以每天每千克体重按0.01至100mg，更优选的按0.01至10mg的量一次性或分多次给药。然而，由于根据本发明的单克隆抗体的含量不仅要考虑到药物组合物的给药方式和治疗次数，还需要考虑年龄、体重、健康状态、性别、疾病严重程度、饮食和排泄率等多种因素，针对患者来决定有效的给药量，因此鉴于这一点，本领域普通技术人员可以根据预防或治疗痤疮的具体用途来确定根据本发明的单克隆抗体的合适的有效剂量。根据本发明的药物组合物只是表现本发明的效果，其制剂，给药途径和给药方法并不受特别限制。

本发明的药物组合物可以单独使用，也可以与手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法或使用生物反应调节剂的方法等一起使用。

本发明的药物组合物还可以以含有根据本发明的单克隆抗体作为活性成分的外用剂的制剂的形式提供。

当本发明的药物组合物为皮肤外用剂时，它还可以进一步含有皮肤科学领域常用的佐剂，例如脂肪物质、有机溶剂、增溶剂、增稠剂和胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foaming agent)、香料、表面活性剂、水、离子乳化剂、非离子乳化剂、填充剂、金属离子螯合剂、螯合剂、防腐剂、维生素、封闭剂、润湿剂、精油、染料、颜料、亲水活性剂、亲脂性活性剂或如脂质囊泡等通常用于皮肤外用剂的任何其他成分。此外，所述成分也可以按照皮肤科学领域中的常用的量投入。

当本发明的药物组合物为皮肤外用剂时，制剂可以为软膏、贴剂、凝胶、霜或喷雾剂等，但不限于此。

实施例

以下，将参考实施例对本发明进行更加详细的说明。本领域技术人员应该理解的是，这些实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。

[实施例1]痤疮丙酸杆菌(Propioni-bacterium acnes:P.acnes)的培养

通过培养引起痤疮的痤疮丙酸杆菌(P.acnes)，作为用于生产本发明的单克隆抗体的抗原菌，进行准备。痤疮丙酸杆菌为革兰氏阳性细菌，在细胞膜上存在大量的特异性抗原，通过使用痤疮丙酸杆菌来制备一种能够特异性识别病原体本身并与之结合的人抗体。

为了在固体培养基中进行继代培养，将痤疮丙酸杆菌涂布于强化梭菌培养基(RCM培养基)上，然后加入厌氧培养基或AnaeroPackTM-Anaero(A-04，MGC)后，放入密封箱，在37℃下培养五天(图1A)。

为了在液体培养基中进行培养，向试管中加入1.5ml的强化梭菌肉汤(RCM液体培养基)后，接种经继代培养的痤疮丙酸杆菌的菌落，然后在37℃下静置培养5天。通过离心分离培养基，获得菌株，在装有50ml的RCM液体培养基的离心管(centrifuge tube)中分散所获的菌株，然后在37℃下再进行静止培养5天(图1B)。

[实施例2]与痤疮丙酸杆菌特异性结合的单克隆抗体的制备

<2-1>通过使用噬菌体展示技术的痤疮丙酸杆菌结合抗体的候选组的制备

为了制备与痤疮丙酸杆菌特异性结合的单克隆抗体，首先通过图2的示意图中所示的噬菌体展示(phage display)技术来制备痤疮丙酸杆菌结合抗体的候选组。

具体地，将1ml的2.7x10¹⁰具有多样性的人源scFv文库噬菌体与2ml的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)进行反应2小时，先将也有可能与皮肤的无害细菌结合的ScFv-噬菌体进行除去(步骤1)。去除后，剩余的scFv-噬菌体与痤疮丙酸杆菌反应2小时，通过洗脱与痤疮丙酸杆菌特异性结合的scFv-噬菌体，得到poly-scFv-噬菌体(步骤2)。通过获得的Poly-scFv-噬菌体感染XL1-Blue并进行扩增，通过用经扩增的poly-scFv-噬菌体重复进行上述的步骤1和步骤2共三次，来有选择地扩增亲和性好的噬菌体(淘选步骤:panning step)。稀释最终获得的poly-scFv-噬菌体，分析滴定(titration)，确认扩增水平。

在每个淘选步骤中所扩增的噬菌体候选物的水平如下[表1]所示。在与痤疮丙酸杆菌反应之前，1ml反应溶液中含有的scFv-噬菌体的数量分别为1×10¹³,1.6×10¹³和5×10¹²，通过与痤疮丙酸杆菌反应而获得的scFv-噬菌体的数量分别为2×10⁴,8×10⁴和1×10⁵(图3)。

【表1】

痤疮诱发菌	第一次	第二次	第三次
				加入	1×10<sup>13</sup>/ml	1.6×10<sup>13</sup>/ml	5×10<sup>12</sup>/ml
去除	2×10<sup>4</sup>/ml	8×10<sup>4</sup>/ml	1×10<sup>5</sup>/ml

在每个淘选步骤中对poly-scFv-噬菌体进行ELISA分析，以确认筛选出的poly-scFv-噬菌体对痤疮丙酸杆菌是否具有亲和性。

为了ELISA分析，首先，培养痤疮丙酸杆菌或对照组细胞(表皮葡萄球菌(S.epidermidis))，并用PBS洗涤后进行准备，然后稀释至吸光度为0.5,在96孔板的每孔中各分装100μl，并通过在4℃下培养16小时以上来进行包被。然后，去除所有孔中的反应溶液，向每个孔中各分装100μl的PBSA，在4℃下培养2小时并进行阻断，然后除去PBSA。之后，在每孔中各分装100μl的含有poly-scFv-噬菌体的溶液，并在4℃下反应1小时。然后，去除所有孔中的反应溶液，将在每孔中各分装200μl的经稀释的PBST，并重复进行两次洗涤。洗涤后，每孔中各分装100μl的以1：4000比例稀释的hFc-HRP，并在室温下的暗室中反应10分钟，以诱导显色。在每孔中各分装100μl的终止溶液，以终止变为蓝色的显色反应，当反应物的颜色变为黄色时，通过使用酶标仪，在450nm波长下各测量每个孔的吸光度。

如[表2]和图4所示，结果证明随着淘选操作次数的增加，poly-scFv-phage和痤疮丙酸杆菌之间的结合性增加，然而确认并没有与对照细胞结合。

【表2】

<2-2>从与痤疮丙酸杆菌结合的抗体候选组中筛选具有高结合性的单个噬菌体

从在上述步骤<2-1>中获得的痤疮丙酸杆菌结合poly-scFv-噬菌体中，筛选10个具有高亲和性的单个噬菌体。对筛选的单个噬菌体再次进行ELISA分析，以确认与痤疮丙酸杆菌的结合性(图5)。

【表3】

<2-3>筛选的单个噬菌体的序列分析

分析所获得的10个单-scFv-噬菌体(Mono-scFv-phage)的序列，并根据序列同源性进行分组。结果如[表4]所示，3、6、7、8、9和10号克隆具有不重叠且互不相同的CDR3。通过ELISA分析，确认了3、6、8和10号的共4个克隆与P.acies的结合性最为优秀。

【表4】

[实施例3]对痤疮丙酸杆菌特异性的人单克隆抗体的表达和纯化

将重链和轻链分别克隆到动物细胞表达载体pNATVH和pNATVL中(图6)，以将对痤疮丙酸杆菌展示高亲和性的四个克隆从scFv形式转化为人抗体的IgG形式。将克隆的表达载体导入到大肠杆菌(E.coli)中并扩增载体。分别将8个经扩增的质粒共转染到HEK293F细胞中，并培养6天，然后通过蛋白A亲和层析法(Protein A affinity chromatography)，纯化并回收经表达的抗体。通过SDS-PAGE，确认经纯化的抗体蛋白的分子量与纯种分离度(图7A)。然后，通过使用抗-Fc-HRP抗体作为二抗进行Western印迹法，来验证人源化单克隆抗体的产生(图7B)。

制备的单克隆抗体的轻链和重链CDR区序列、轻链和重链可变区序列如下[表5]所示。

【表5】

[实施例4]人单克隆抗体对痤疮丙酸杆菌的亲和性的确认

通过ELISA分析，证实本发明中制备的单克隆抗体对痤疮丙酸杆菌的亲和性。

如下[表6]、图8和9中所示，结果证实与对照细胞相比，共四种抗体(3F，6F，8F和10F)均与痤疮丙酸杆菌的结合展示出亲和性，特别是6F和8F抗体为对痤疮丙酸杆菌表现出优异结合性的抗体。通过使用ELISA检测值，计算每种抗体的解离常数(K_D)，6F的K_D为2.6×10^-10,18F的K_D为1.0×10^-9，由于这些解离常数显著低于K_D＝10^-6，因此证明6F和8F抗体对痤疮丙酸杆菌具有高亲和度(图9)。

【表6】

[实施例5]人单克隆抗体对痤疮丙酸杆菌生长的抑制作用的确认

证实本发明中制备的人抗体具有显著地杀死痤疮细菌的效果。

首先，将痤疮丙酸杆菌接种在液体培养基上并培养一整夜，然后添加30μg/ml的所制备的6F抗体或8F抗体，或者添加30μg/ml的经相同比例混合的6F抗体和8F抗体，并培养24小时而进行反应。之后，在固体培养基上涂抹反应后的培养基，并再次培养一整夜后，对形成的菌落数进行计数。为了用作对照组，在同一条件下代替抗体只加入PBSD，并培养24小时来制备未处理对照组。对菌落数进行计数后，通过计算抗体处理前(0小时)的菌落数与抗体处理后(24小时)的菌落数之比，来计算出痤疮丙酸杆菌的生长率。

结果如下[表7]和图10所示。在未处理对照组中，痤疮丙酸杆菌的生长速率约为150％，而单独添加6F抗体或8F抗体的实验组分别显示为122.2％和130.8％，这与未处理对照组相比，生长速率降低效果显著。另外，在同时用6F抗体和8F抗体处理的实验组中，与0小时组相比，痤疮丙酸杆菌的生长率为83.5％，因此展示出降低16.5％的存活率，通过同时处理6F和8F抗体,表现出对痤疮丙酸杆菌的生长抑制产生协同效果,从而展示出明显地杀灭痤疮杆菌的效果。

【表7】

本发明的前述说明只是示例,本发明所属领域的技术人员在不改变本发明的技术思想或必要特征的情况下,可以轻易地将其改变为其他具体形式。因此,以上所述的实施例在所有方面都是示例性的,而不是限定性的。

以下，举例说明本发明组合物的制备实施例。[制备实施例1]化妆品的制备

<1-1>柔肤化妆水(柔肤水)

根据化妆品领域的常规方法，按照以下[表8]中所示的配比，制备含有本发明的单克隆抗体的柔肤化妆水(柔肤水)。

【表8】

<1-2>营养化妆水(乳液)

根据化妆品领域的常规方法，按照以下[表9]中所示的配比，制备含有本发明的单克隆抗体的营养化妆水。

【表9】

成分	重量
		本发明的单克隆抗体	0.1～30％
1,3-丁二醇	8.0
		甘油	5.0
角鲨烷	10.0
		聚氧乙烯脱水山梨糖醇酐单油酸酯	2.0
愈创木油	0.1～30％
		1,3-丁二醇	3.0
甘油	5.0
		聚氧乙烯(60)硬化蓖麻油	0.2
乙醇	8.0
		柠檬酸	0.02
柠檬酸钠	0.06
		防腐剂	微量
香料	微量
		精华水	加入至100

<1-3>精华素

根据化妆品领域的常规方法，按照以下[表10]中所示的配比，制备含有本发明的单克隆抗体的精华素。

【表10】

成分	含量(重量％)
		本发明的单克隆抗体	0.1～30％
谷甾醇	1.7
		聚甘油-2油酸酯	1.5
神经酰胺	0.7
		鲸蜡硬脂醇聚醚-4	1.2
胆甾醇	1.5
		二鲸蜡醇磷酸酯	0.4
浓缩甘油	5.0
		羧基乙烯聚合物	0.2
黄胶原	0.2
		防腐剂	微量
香料	微量
		纯净水	加入至100

<1-4>洁面剂(洁面泡沫)

根据化妆品领域的常规方法，按照以下[表11]中所示的配比，制备含有本发明的单克隆抗体的洁面剂(洁面泡沫)。

【表11】

<1-5>营养霜

根据化妆品领域的常规方法，按照以下[表12]中所示的配比，制备含有本发明的单克隆抗体的营养霜。

【表12】

<1-6>按摩霜

根据化妆品领域的常规方法，按照以下[表13]中所示的配比，制备含有本发明的单克隆抗体的按摩霜。

【表13】

<1-7>面膜

根据化妆品领域的常规方法，按照以下[表14]中所示的配比，制备含有本发明的单克隆抗体的面膜。

【表14】

本发明不限于上述的实施例及制造例,并且普通技术人员可以进行多种修改和变化，除此之外,还可适用于包括彩妆品的各种用途的化妆品，并根据其效用，可制备成轻薄涂抹于人体上的药剂，即软膏，这些被包括在所附权利要求中限定的本发明的精神和范围内。

序列表

<110> E&S医疗保健有限公司

<120> 通过噬菌体展示技术与痤疮细菌特异性结合的人抗体及其用途

<130> PCT5036818

<150> KR 10-2016-0073186

<151> 2016-06-13

<150> KR 10-2017-0074010

<151> 2017-06-13

<160> 32

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 OF 3F ANTIBODY

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH2 OF 3F ANTIBODY

<400> 2

Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ala Pro

1 5

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 OF 3F ANTIBODY

<400> 3

Val Lys Gly Leu Glu His Ala Ala Gly Ser Ala Ile Phe Asp Arg

1 5 10 15

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL1 OF 3F ANTIBODY

<400> 4

Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser His Phe

1 5

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<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL2 OF 3F ANTIBODY

<400> 5

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1

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 OF 3F ANTIBODY

<400> 6

Ala Leu Ser Met Gly Ser Gly Ile Trp Val

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<211> 8

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<213> Artificial

<220>

<223> CDRH1 OF 6F ANTIBODY

<400> 7

Gly Phe Thr Phe Asp Asp His Gly

1 5

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<220>

<223> CDRH2 OF 6F ANTIBODY

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Ile Asn Leu Asn Gly Gly Ser Thr

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRH3 OF 6F ANTIBODY

<400> 9

Ser Thr Arg His Leu His His

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<223> CDRL1 OF 6F ANTIBODY

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Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr

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<213> Artificial

<220>

<223> CDRL2 OF 6F ANTIBODY

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1

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<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 OF 6F ANTIBODY

<400> 12

Val Gln Ala Lys Gln Phe Pro Leu Thr

1 5

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<220>

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Gly Phe Ser Phe Asn Asp Tyr Ala

1 5

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<220>

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Ile Ser Trp Asn Ser Arg Ser Thr

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<213> Artificial

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<220>

<223> CDRH3 OF 10F ANTIBODY

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<213> Artificial

<220>

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDRL3 OF 10F ANTIBODY

<400> 24

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Leu Ile

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 3F HEAVY CHAIN VARIABLE REGION(VH)

<400> 25

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Ala Pro Glu Phe Ala Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Ser Met Thr Arg Asp Ala Ser Ile Asn Thr Thr Tyr

65 70 75 80

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100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 3F LIGHT CHAIN VARIABLE REGION(VL)

<400> 26

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Thr Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Ser Met Gly Ser

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<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp His

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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Thr Ile Asn Leu Asn Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val

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<213> Artificial

<220>

<223> 6F LIGHT CHAIN VARIABLE REGION(VL)

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Pro Arg Leu Leu Ile His Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

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65 70 75 80

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<213> Artificial

<220>

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Ser Ile Ser Trp Asn Ser Arg Ser Thr Val Tyr Ala Ala Ser Val

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Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ala Thr Phe Gln Ile

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<213> Artificial

<220>

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<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

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20 25 30

Phe Met Ser Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

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115 120

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<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 10F LIGHT CHAIN VARIABLE REGION(VL)

<400> 32

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ala Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Asn Ile Ile Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Thr Lys Tyr Val

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Asn Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Thr

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Ala Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His

85 90 95

Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

Claims

1.与痤疮丙酸杆菌（Propioni- bacterium acnes: P. acnes）特异性结合的单克隆抗体,其中所述单克隆抗体选自以下（a）和（b）中的任意一种抗体：

(a)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的重链CDR1、SEQ ID NO:8所示的重链CDR2和 SEQ ID NO:9所示的重链CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:11所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:12所示的轻链CDR3；和

(b)包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:13所示的重链CDR1、SEQ ID NO:14所示的重链CDR2和SEQ ID NO:15所示的重链CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16所示的轻链CDR1、SEQ ID NO:17所示的轻链CDR2和SEQ ID NO:18所示的轻链CDR3。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体为选自以下（a）和（b）中的任意一种抗体：

(a)包含SEQ ID NO:27所示的重链可变区和SEQ ID NO:28所示的轻链可变的抗体；和

(b) 包含SEQ ID NO:29所示的重链可变区和SEQ ID NO:30所示的轻链可变的抗体。

3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为人抗体。

4.表达载体，其包含用于编码根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体的多核苷酸。

5.转化体，所述转化体用根据权利要求4所述的表达载体进行了转化。

6.用于预防或改善痤疮的化妆品组合物，其特征在于，所述化妆品组合物包含作为有效成分的根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体。

7.用于预防或治疗痤疮的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含作为有效成分的根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体在制备用于预防或改善痤疮的化妆品组合物中的用途。

9.根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体在制备用于预防或治疗痤疮的药物组合物的用途。