CN109897832A

CN109897832A - 一株猪圆环病毒3型病毒毒株及其应用

Info

Publication number: CN109897832A
Application number: CN201910248151.1A
Authority: CN
Inventors: 张文亮; 栗利芳; 刘新月; 李鹏宇; 肖进; 齐鹏; 宋芳; 李玲; 杨祎
Original assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2039-03-29
Also published as: CN109897832B

Abstract

本发明公开了一株猪圆环病毒3型病毒毒株及其应用。本发明的猪圆环病毒毒株名称为猪圆环病毒3型ZM‑PCV3‑14，保藏编号为CGMCC No.17290。该毒株是中国境内新近爆发流行该病的猪群中分离得到的，代表目前国内流行优势毒株，具有良好的毒株背景，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种，为后续的相关实验研究提供了材料，奠定了物质基础。

Description

一株猪圆环病毒3型病毒毒株及其应用

技术领域

本发明涉及病原微生物领域，属于兽用生物制品领域，涉及一种猪圆环病毒3型病毒的分离鉴定及在灭活疫苗中的应用。

背景技术

2015年6月，美国北卡罗莱纳州的一个养猪场暴发了猪繁殖障碍、猪皮炎肾病综合征(PDNS)，经研究表明该病是由一种新型病毒感染引起的，即猪圆环病毒3型-PCV3，猪圆环病毒3型(Porcine cirovirus 3，PCV3)。进一步研究表明，PCV3广泛分布于美国、韩国、意大利、波兰等国各大养殖场。

猪圆环病毒3型(Porcine cirovirus 3，PCV3)属于圆环病毒科，圆环病毒属，形态呈正十二面体形，无囊膜。对PCV3进行基因分析可知，PCV3基因组全长2000bp，基因组结构与PCV1、PCV2相似，主要包括ORF1、ORF2、ORF3三个开放阅读框，ORF1主要编码Rep蛋白；ORF2主要编码Cap蛋白，PCV3Cap基因编码214个氨基酸残基，PCV2Cap基因编码194或195个氨基酸残基，PCV3与PCV2的Cap基因相比少了19～20个氨基酸。根据抗原性分析和结构预测，PCV2和PCV3Cap蛋白间的氨基酸同源性低于40％，因此推测PCV2和PCV3不具有免疫交叉保护的特性。环状病毒具有遗传多样性，感染宿主广泛，并能跨种群传播。研究表明PCV3与犬圆环病毒之间的进化关系最为密切，但也有研究报道PCV3与蝙蝠圆环病毒之间的进化关系较为密切。

2016年我国也相继在猪体内检测到PCV3，华中农业大学对采自我国11个省市35个猪场的222个样本进行了检测，发现PCV3感染猪场阳性率高达68.6％，说明PCV3已普遍存在我国猪场，并存在与其他病原体混合感染的情况。同时，还有报道指出PCV3感染可能造成PCV2的疫苗免疫失败，因此针对PCV3的检测和疫苗研究，对于PCV3的防控工作非常必要。

发明内容

本发明目的之一是提供一株新分离的猪圆环病毒3型(Porcinecirovirus 3，PCV3)病毒流行毒株。

本发明的另一目的是针对现有猪圆环病毒生物制品的不足，提供一种有效安全的猪用猪圆环病毒3型(Porcine cirovirus 3，PCV3)疫苗以及该灭活疫苗的制备方法；

该灭活疫苗所采用的制备方法简单安全，疫苗免疫效果良好。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供一株猪圆环病毒3型(Porcine cirovirus 3，PCV3)病毒，该病毒分离自猪，名称为猪圆环病毒3型(Porcine cirovirus 3)ZM-PCV3-14CGMCC No.17290。国际病毒分类委员会将其分类为：Porcine circovirus，PCV，属于圆环病毒科圆环病毒属，本发明的猪圆环病毒(Porcine cirovirus 3)ZM-PCV3-14CGMCC No.17290株分离自广东省内发生猪圆环3型病毒感染的猪场。已于2019年1月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.17290。

上述猪圆环病毒3型的分离培养方法，具体步骤如下：

采集猪圆环病毒3型感染患猪淋巴结样品，剪碎后用含有100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的无菌PBS制成1:5的悬液，研磨，涡旋振荡混匀，反复冻融3次，10000g离心10min，上清用0.22μm的滤器过滤除菌，分装冻存于-70℃，备用；

将1×10⁶个PK-15细胞接种于六孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用PBS洗涤两次；将1ml过滤的猪圆环病毒3型处理液接种PK-15细胞，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％CO₂培养箱中吸附2h后，弃去接种物，加入2ml含有2％胎牛血清的DMEM维持液，37℃培养24h，用300mM的D-氨基葡萄糖盐酸盐处理，37℃培养48h，继续传代3次，传至第3代后，进行间接免疫荧光试验(IFA)验证。

间接免疫荧光试验(IFA)验证方法为：

将分离病毒液接种于96孔细胞板PK15细胞单层，2孔/样品，200μl/孔，同时设定空白细胞对照，在5％CO₂、37℃培养24h，用300mM的D-氨基葡萄糖处理，继续培养48h；弃去维持液，用PBS缓冲液(0.01M pH7.0)洗涤细胞3次；加入冷丙酮(80％丙酮，20％双蒸水)，150μl/孔，4℃固定30分钟；弃丙酮，在室温下干燥，用PBS缓冲液洗涤1次；加入1:200稀释的PCV3阳性血清，50μl/孔，37℃孵育1h；移去孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次；加入1:200稀释的FITC标记兔抗猪二抗，50μl/孔，37℃孵育1h；移去孔内液体，用PBS缓冲液洗涤5次；于荧光显微镜下观察，细胞对照孔应无荧光出现，而病毒接种细胞孔细胞胞浆内应有大量绿色荧光物质着染。见图1。图1中，阳性结果为分离的猪圆环病毒的结果。

本发明还提供了上述病毒的疫苗制备方法，该制备方法包括以下步骤：

1)病毒培养：将猪圆环病毒ZM-PCV3-14CGMCC No.17290接种至PK-15细胞进行培养，收获病毒培养物；

2)病毒培养物的灭活，病毒培养物经反复冻融三次，离心，收取上清，加入灭活剂，将病毒灭活，得到灭活的病毒液；

3)按比例混合灭活的猪圆环病毒3型病毒液和佐剂，乳化，制备猪圆环病毒3型灭活疫苗。

根据上述疫苗组合物的制备方法，其中，步骤1)的具体过程为：用含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的低糖DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养箱贴壁培养PK-15细胞；待其融合度达到80％左右时，弃去培养液，接种猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14CGMCCNo.17290株，然后用含有2％胎牛血清、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的低糖DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养24h，用300mM的D-氨基葡萄糖盐酸盐处理，37℃继续培养48h，收获病毒培养物；

步骤2)所述灭活剂为二乙烯亚胺，病毒液中加入二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/L，灭活条件为30℃灭活28h；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/ml。灭活效果接种PK-15盲传3代未出现病变为灭活合格。

步骤3)所述的佐剂为ISA206或ISA201，灭活病毒液与佐剂的体积比例为1:1。

本发明的积极有益效果：

本发明分离的猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14CGMCC No.17290株是中国境内新近爆发流行该病的猪群中分离得到的，代表目前国内流行优势毒株，具有良好的毒株背景，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种，为后续的相关实验研究提供了材料，奠定了物质基础。

本发明的疫苗组合物有良好的免疫原性，免疫后能够诱导动物产生较强的中和抗体，对相应毒株攻毒有较高的保护率。由于国内外市场上尚无该类病原的疫苗相关的生物制品，该疫苗组合物具备了较强的产品竞争优势，可有效的预防PCV3在猪群中的流行与传播，降低该病造成的经济损失，具有广阔的应用前景。

本发明的疫苗所采用的制备方法快速、简单、安全。

附图说明

图1为猪圆环病毒IFA免疫荧光图片(阳性和阴性)。

图2为组织病料中猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14CGMCC No.17290的DNA的PCR图；泳道1为猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14 CGMCC No.17290的DNA，泳道2为阴性结果，泳道M为分子量marker。

图3为猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14CGMCC No.17290特异性目的片段。泳道1为猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14CGMCC No.17290的特异性片段，泳道2和泳道3为阴性结果，泳道M为分子量marker。

图4为猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14CGMCC No.17290感染引起明显的细胞空泡化。

具体实施方式

实施例1：猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14CGMCC No.17290的分离鉴定。

1.1实验材料

实验中所用的病料样本来源于广东省内发生猪圆环病的猪场，采集时间为2018年1月；猪肾细胞系(Porcine Kidney，PK-15)购自美国菌种中心ATCC。

1.2引物设计

参照GenBank中发表的PCV3KY965242.1基因系列，使用Primier 5设计了2对特异性引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所述特异性引物的核苷酸序列如下：

PCV3-F-1:5′-TAGTATTACCCGGCACCTC-3′；

PCV3-R-1:5′-GCCCGGCACCAAAATGAGAC-3′；

PCV3-F-2：5′-TTAGAGAACGGACTTGTAAC-3′；

PCV3-R-2：5′-ACAGCTGGCACATACTACAC-3′；

1.3病料的采集与处理

采集患猪圆环病的淋巴结样本，剪碎后用含有100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的无菌PBS制成1:5的悬液，使用研钵研磨至匀浆，涡旋振荡混匀，反复冻融3次，10000×g离心10min留取上清，用0.22μm的滤器过滤除菌，分装冻存于-70℃，备用；

1.4组织病料中PCV的DNA检测

用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA，按产品说明书进行操作。

PCR扩增总反应体系25μl，其中含上游引物PCV3-F-1 1μl，下游引物PCV3-R-1 1μl，PCR酶MIX 12.5μl，无菌蒸馏水9.5μl，模板DNA1μl。循环反应参数：94℃预变性3分钟；94℃变性45秒，54℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共34个循环；最后72℃延伸10分钟。

PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳检测(结果见图2)。由图2可见，扩增出一条约2000bp的条带，与预期扩增片段大小相符。

将上述PCR产物用胶回收纯化试剂盒回收目的片段，克隆至pMD-18T载体上，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。序列如序列表中序列1所示，测序结果通过手工校对、序列拼接，并利用Blast程序在NCBI数据库中进行相似性比对，发现该段序列基因与PCV3已知序列同源性最高，存在98～99％的相似性，结果证实该病料中PCV3核酸阳性。

1.5病毒的分离与培养

将1×10⁶个PK-15细胞接种于六孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用PBS洗涤两次；将步骤1.3中冻存备用的猪圆环病毒3型病毒过滤液接种PK-15细胞，接种量为1ml，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％CO2培养箱中吸附2h后，弃去接种物，加入2ml含有2％胎牛血清的DMEM维持液，37℃培养24h，用300mM的D-氨基葡萄糖盐酸盐处理，37℃培养48h，继续传代3次，传至第3代后，进行间接免疫荧光试验(IFA)验证。PCV3接种细胞孔有大量绿色荧光物质着染，阴性对照细胞应无荧光出现。

间接免疫荧光试验(IFA)验证方法为：

同时利用猪圆环病毒3型病毒特异性引物PCV3-F-2和PCV3-R-2对细胞培养物进行PCR扩增，PCV3接种细胞能够检测出明显的PCV3特异性目的片段(见图3)，而未接种的PK-15细胞阴性对照组未扩增出相应的核酸片段。表明该病毒已经适应PK-15细胞并且能够在该细胞上稳定增殖，分离得到一株可稳定传代的PCV3毒株。

将该毒株命名为猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14CGMCC No.17290。该毒株已于2019年1月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.17290。

1.6动物回归试验

选择10头21～28日龄PCV2、PCV3ELISA抗体和PCV2、PCV3抗原阴性断奶仔猪，随机分成2组，5头/组，其中第一组用猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14株(10^6.0TCID₅₀/ml)攻击，每头猪滴鼻1ml、肌肉注射2ml，第二组相同方法接种细胞培养液。攻毒后临床观察25日，期间可见攻毒组仔猪全部出现少食、皮肤发绀、3-11天连续体温升高现象；血清病毒载量检测表明PCV3病毒载量明显升高且死亡1只。攻毒25日后将所有猪进行剖检，可见攻毒组猪出现多处淋巴结和脾脏充血、肿胀等现象，肺脏存在不同程度的充血、肉变、水肿等现象，肾脏发黄且存在出血点或坏死灶等现象。具体情况见表1。

表1猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14株动物回归试验结果

实施例2：猪圆环病毒3型病毒株ZM-PCV3-14病毒滴度的测定

将分离的病毒液接种于PK15-B1细胞单层，37℃吸附30分钟，加入含2％犊牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养60h，继续传代至第20代，-20℃保存。用DMEM细胞维持液对PCV3作10^-1～10^-8连续稀释，接种于96孔板PK15-B1细胞单层，每个稀释度接种4个孔，每孔接种100μl。同时设立阴性对照，放入CO2温箱中37℃培养12h，用300mM的D-氨基葡萄糖盐酸盐处理，37℃继续培养48h。无水乙醇固定细胞，用IFA法测定每个稀释度含有绿色荧光物质细胞的孔数，最后按Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。结果表明猪圆环病毒3型病毒ZM-PCV3-14株的毒价为10^6.0TCID₅₀/ml。

实施例3：猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14株灭活疫苗的制备

3.1病毒培养

用含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的低糖DMEM培养基，T225cm²细胞培养瓶，37℃、5％CO₂培养箱贴壁培养PK-15细胞；待其融合度达到80％左右时，弃去培养液，接种猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14株，然后用含有2％胎牛血清、100U/ml青霉素、100g/ml链霉素的低糖DMEM培养基，37℃、5％CO2培养12h，用300mM的D-氨基葡萄糖盐酸盐处理，37℃继续培养48h，收获病毒培养物；反复冻融3次，10000×g离心10min，去除细胞碎片，收取上清，得到猪圆环病毒3型病毒液，置于-80℃，备用。

3.2病毒液的灭活及灭活检验

在病毒含量合格的病毒液中(优选≥10^6.0TCID₅₀/ml)加入灭活剂二乙烯亚胺，使二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/L，置于30℃恒温摇床，80rpm，灭活28h；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/ml。将1×10⁶个PK-15细胞接种于六孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用PBS洗涤两次；将灭活后的病毒液用维持液做10倍稀释，接种量为500μl，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％CO₂培养箱中吸附2h后，弃去接种物，加入2ml维持液，继续培养4～5d，每天观察细胞状态。盲传3代，对每一代细胞培养物提取样品DNA，按照步骤1.4进行PCR检测细胞中猪圆环病毒3型病毒核酸。如果结果均为阴性，表明病毒液灭活完全。按照步骤1.5进行IFA检测，有绿色荧光判为阳性，无绿色荧光判为阴性。如果结果均为阴性，表明病毒液灭活完全。

3.3制备含圆环病毒3型病毒ZM-PCV3-14株的疫苗组合物

将灭活完全的ZM-PCV3-14病毒液与ISA 206佐剂按照体积比1:1混合，将油相和水相进行乳化，条件为30℃恒温摇床，120rpm，15min。待混合完全后，即得疫苗组合物，疫苗乳化质量能够达到国家规定的质量标准。

实施例4：圆环病毒3型ZM-PCV3-14株灭活疫苗的免疫原性试验

4.1圆环病毒3型ZM-PCV3-14灭活疫苗免疫情况

通过实施例1的步骤1.4的方法和包被大肠杆菌表达的PCV3Cap蛋白(基因序列是序列表中序列2，氨基酸序列如序列3所示)对5～6周龄仔猪进行抗原抗体阴性筛选，选取10头抗原抗体阴性仔猪进行圆环病毒3型病毒ZM-PCV3-14株灭活疫苗的免疫原性评价试验。分组情况：随机选取5头仔实施例3制备的猪免疫圆环病毒3型ZM-PCV3-14株灭活疫苗组合物，每头1ml疫苗组合物；对照组5头，每头颈部肌肉注射PBS 1ml。免疫第0～7d每天测定体温；连续14d观察猪群食欲、精神状态；观察、触摸注射部位局部是否存在肿块。

猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14灭活疫苗免疫仔猪后没有出现明显的体温升高现象(表2)，且猪群采食正常、精神状态良好；疫苗注射部位在免疫后5d触摸无痛感，无肿块。说明该疫苗对免疫仔猪安全性良好。

表2灭活疫苗免疫后动物体温监测表

4.2圆环病毒3型ZM-PCV3-14株灭活疫苗诱导抗体的测定

为评估ZM-PCV3-14株灭活疫苗免疫效果，在免疫后14、21、28、35d采集血清，用包被大肠杆菌表达的PCV3Cap蛋白(基因序列是序列表中序列2，氨基酸序列如序列3所示)和中和试验检测评价血清中猪圆环病毒ELISA抗体和中和抗体产生状态，评估ZM-PCV3-14株灭活疫苗的免疫原性。

4.2.1包被大肠杆菌表达的PCV3Cap蛋白进行ELISA抗体检测，检测结果可见疫苗免疫后14日，即可检测到PCV3抗体；之后抗体水平逐渐升高，首免后35日，免疫组ELISA抗体算术平均效价达1:3520，对照组未检出抗体，结果见表3。

表3猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14株诱导仔猪产生抗体的动态变化

4.2.2为进一步评估ZM-PCV3-14株灭活疫苗诱导仔猪产生抗体的效价，利用中和试验技术检测该灭活疫苗诱导免疫仔猪产生抗体水平。具体步骤如下：

1)待检血清56℃加热30分钟，10000r/min离心5分钟，小心吸出上清，用10％的DMEM培养基做1:4稀释后进行2倍比稀释。

2)分别与等量1000TCID₅₀ZM-PCV3-14株病毒液混合，37℃孵育1小时，接种于含PK15-B1细胞单层的96孔板内，100μl/孔，每一稀释度平行接种4孔，同时设细胞对照孔(只加100μl/孔的10％DMEM培养基)和病毒对照孔(只加100μl/孔的1000TCID₅₀PCV3病毒液)。

3)37℃，5％CO₂的恒温培养箱培养24小时，用含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液处理，再继续培养24小时。

4)无水乙醇固定细胞，50μl/孔。

5)用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数，细胞对照孔无荧光、病毒对照孔有荧光，试验成立。

6)相比病毒对照孔，以能够减少50％特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。

测定血清中和抗体效价后对数据进行整理，结果见表4。由表4可见，实施例3制备的ZM-PCV3-14株灭活疫苗组合物免疫14d后能够诱导免疫仔猪产生特异性抗体，基本达到免疫要求；35d抗体持续升高，最高抗体能够达到1:35.2。而对照组未检测到针对猪圆环病毒3型病毒的中和抗体(表4)。

表4猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14株诱导仔猪产生中和抗体的动态变化

实施例5：圆环病毒3型ZM-PCV3-14株灭活疫苗的攻毒保护试验

选择25头28～35日龄PCV2、PCV3ELISA抗体和PCV2、PCV3抗原阴性断奶仔猪，随机分成5组，5头/组，第1～3组为免疫组，其中第1组颈部肌肉注射免疫实施例3制备的ZM-PCV3-14株灭活疫苗组合物0.5ml，第2组和第3组相同方式分别免疫1ml和2ml，第4组为攻毒对照组，免疫1ml PBS，第5组为空白对照组，不免疫不攻毒。免疫2周后，用猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14(10^6.0TCID₅₀/ml)攻击，每头猪滴鼻1ml、肌肉注射2ml。攻毒后于5、15和25日分别采血，分离血清，采用Q-PCR方法测定病毒血症。攻毒后第25天宰杀，观察病理变化。

5.1临床症状观察及病理变化观察

结果见表5。攻毒后观察25天，疫苗组三个剂量灭活苗免疫猪均未见到明显临床表现，只有个别猪出现一过性体温升高(≥40℃)，持续1～2天后恢复正常；攻毒对照组猪PCV3攻击后第10～14天，4头猪出现体温升高40.2～40.8℃，持续3天以上，其中3头猪被毛杂乱，食欲稍减退，持续3天后恢复正常。经剖检检测表明，攻毒对照组4/5猪表现有淋巴结肿胀或出血，3/5猪肺脏出血，2/5猪出现脾脏出血，综合临床症状判为80％发病。第2组和第3组免疫后淋巴结组织无明显异常，综合临床症状，判为100％保护；第1组疫苗中有1/5头猪淋巴结组织中出现淋巴肿胀，综合临床症状判为80％保护。空白对照组淋巴结组织均无明显异常，综合临床症状判为无发病。

表5猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14株疫苗免疫攻毒后临床症状和病理变化

5.2攻毒后PCV3病毒血症检测

攻毒后第5、15和25日采集血清，提取DNA用PCR方法检测PCV3，结果为：空白对照猪PCR始终未检测到病毒；攻毒后不同时间检测病毒拷贝数，疫苗免疫组之间无显著差异(P>0.05)，但与攻毒对照组差异显著(P<0.05)。且在攻毒后5～25日，免疫组病毒拷贝数增长不明显，而攻毒对照组病毒拷贝数随时间显著增长。表明3组疫苗免疫后可以减少病毒的复制。结果见表6。

表6攻毒后不同时间血清中PCV3Real-time PCR检测结果

注：同一时间不同字母(a,b,c,d,e,f)表示不同组别之间差异显著(P<0.05)。

证明了本发明的猪圆环病毒3型病毒疫苗组合物能够很好的保护动物不受猪圆环病毒3型病毒的攻击，此数据为该灭活疫苗的临床使用奠定了一定的理论及实践基础。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 一株猪圆环病毒3型病毒毒株及其应用

<130> WHOI190019

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2000

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒(Porcine cirovirus)

<400> 1

tagtattacc cggcacctcg gaacccggat ccacggaggt ctgtagggag aaaaagtggt 60

atcccattat ggatgctccg caccgtgtga gtggatatac cgggcagtgg atgatgaagc 120

ggcctcgtgt tttgatgccg caggacgggg actggataac tgagtttttg tggtgctacg 180

agtgtcctga agataaggac ttttattgtc atcctatttt aggtccggag ggaaagcccg 240

aaacacaggt ggtgttttac gataaacaac tggaccccga ccgagtggga atctattgtg 300

gagtgtggag gcagtatagc gagatacctt attatcggca aagaggttgg aaaaagcggt 360

accccacact tgcaagggta cgtgaatttc aagaacaaaa ggcgactcag ctcggtgaag 420

cgcttacccg gatttggtcg ggcccatctg gagccggcga gggggagcca caaagaggcc 480

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tgcggggtga tggggttggg taaaccgcgt gattttaaaa ctgaagttta tgtttttatt 720

ggtcctccag gatgcgggaa aacccgggaa gcttgtgcgg atgcggctgc gcgggaattg 780

cagttgtatt tcaagccacg ggggccttgg tgggatggtt ataatgggga gggtgctgtt 840

attttggatg atttttatgg gtgggttcca tttgatgaat tgctgagaat tggggacagg 900

taccctctga gggttcctgt taagggtggg tttgttaatt ttgtggctaa ggtattatat 960

attactagta atgttgtacc ggaggagtgg tattcatcgg agaatattcg tggaaagttg 1020

gaggccttgt ttaggaggtt cactaaggtt gtttgttggg gggagggggg ggtaaagaaa 1080

gacatggaga cagtgtatcc aataaactat tgattttatt tgcacttgtg tacaattatt 1140

gcgttggggt gggggtattt attgggtggg tgggtgggca gccccctagc cacggcttgt 1200

cgcccccacc gaagcatgtg ggggatgggg tccccacatg cgagggcgtt tacctgtgcc 1260

cgcacccgaa gcgcagcggg agcgcgcgcg aggggacaca gcttgtcgcc accggagggg 1320

tcagatttat atttattttc acttagagaa cggacttgta acgaatccaa acttctttcg 1380

tgccgtagaa gtctgtcatt ccagtttttt ccgggacata aatgctccaa agcagtgccc 1440

cccattgaac ggtggggtca tatgtgttga gccatggggt gggtctggag aaaaagaaga 1500

ggctttgtcc tgggtgagcg ctggtagttc ccgccagaat tggtttgggg gtgaagtaac 1560

ggctgtgttt ttttttagaa gtcataactt tacgagtgga actttccgca taagggtcgt 1620

cttggagcca agtgtttgtg gtccaggcgc cgtctagatc tatggctgtg tgcccgaaca 1680

tagtttttgt ttgctgagct ggagaaatta cagggctgag tgtaactttc atctttagta 1740

tcttataata ttcaaagcta atcgcagttt cccactcgtt taggcgggta atgaagtggt 1800

tggcgtgcca gggcttgtta ttctgaggag ttccaacgga aatgacgttc atggtggagt 1860

atttctttgt gtagtatgtg ccagctgtgg gcctcctaat gaatagtctt cttctggcat 1920

agcgccttct gtggcgtcgt cgtctccttg ggcggggtct tcttctaaat atagctctgt 1980

gtctcatttt ggtgccgggc 2000

<210> 2

<211> 543

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒(Porcine cirovirus)

<400> 2

acagctggca catactacac aaagaaatac tccaccatga acgtcatttc cgttggaact 60

cctcagaata acaagccctg gcacgccaac cacttcatta cccgcctaaa cgagtgggaa 120

actgcgatta gctttgaata ttataagata ctaaagatga aagttacact cagccctgta 180

atttctccag ctcagcaaac aaaaactatg ttcgggcaca cagccataga tctagacggc 240

gcctggacca caaacacttg gctccaagac gacccttatg cggaaagttc cactcgtaaa 300

gttatgactt ctaaaaaaaa acacagccgt tacttcaccc ccaaaccaat tctggcggga 360

actaccagcg ctcacccagg acaaagcctc ttctttttct ccagacccac cccatggctc 420

aacacatatg accccaccgt tcaatggggg gcactgcttt ggagcattta tgtcccggaa 480

aaaactggaa tgacagactt ctacggcacg aaagaagttt ggattcgtta caagtccgtt 540

ctc 543

<210> 3

<211> 181

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒(Porcine cirovirus)

<400> 3

Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val Ile

1 5 10 15

Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His Phe

20 25 30

Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr Tyr

35 40 45

Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro Ala

50 55 60

Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp Gly

65 70 75 80

Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr Phe

100 105 110

Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly Gln

115 120 125

Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr Asp

130 135 140

Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro Glu

145 150 155 160

Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile Arg

165 170 175

Tyr Lys Ser Val Leu

180

Claims

1.一株猪圆环病毒3型病毒，其特征在于：该毒株名称为猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17290。

2.权利要求权利1所述猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14 CGMCC No.17290在制备防治由猪圆环病毒所致疾病的疫苗中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述防治由猪圆环病毒所致疾病的疫苗为灭活疫苗。

4.一种防治由猪圆环病毒所致疾病的疫苗，其活性成分为经灭活的猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14 CGMCC No.17290。

5.根据权利要求4所述的防治由猪圆环病毒所致疾病的疫苗，其特征在于：所述防治由猪圆环病毒所致疾病的疫苗包含经灭活的猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14 CGMCC No.17290和药学上可接受的佐剂。

6.权利要求4或5所述防治由猪圆环病毒所致疾病的疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)病毒培养：将猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14 CGMCC No.17290接种至PK-15细胞进行培养，收获病毒培养物；

3)按比例混合灭活的猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14 CGMCC No.17290病毒液和佐剂，乳化，制备猪圆环病毒灭活疫苗。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述灭活剂为二乙烯亚胺，病毒液中加入二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/L，灭活条件为30℃灭活28h；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/ml。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的佐剂为ISA206或ISA201，灭活病毒液与佐剂的体积比例为1:1。

9.猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14 CGMCC No.17290在建立猪圆环病毒病动物模型中的应用。

10.猪圆环病毒3型ZM-PCV3-14 CGMCC No.17290在制备抗猪圆环病毒病的抗体中的应用。