CN105031639A - 一种水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗及其制备方法与应用，属于生物工程技术领域。本发明所提供的水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗主要由水貂犬瘟热活疫苗和水貂细小病毒灭活疫苗、疫苗佐剂和保护剂组成，其中，水貂犬瘟热活疫苗和水貂细小病毒灭活疫苗是按照每头份1：1的比例组成。同时本发明还提供了水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗的制备和使用方法。本发明的二联疫苗安全高效，可节省劳动力，降低养殖成本。

Description

一种水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗及其制备方法与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

水貂病毒性肠炎是由细小病毒引起水貂一种急性、烈性和高度接触性传染病，主要以剧烈腹泻为主要特征，1949年由加拿大学者Schofield发现本病，1952年Will证明本病的病原为细小病毒，此后蔓延到世界各国。1981年姜廷秀等报道了我国发生水貂病毒性肠炎；1984年高云等报道山东发生水貂病毒性肠炎。以后该病逐渐蔓延全国，给养貂业带来巨大的经济损失。

犬瘟热是由副粘病毒科犬瘟热病毒引起的急性、热性、传染性极强的高度接触性传染病。水貂、狐狸、貉等毛皮动物对该病毒易感染，本病已广泛存在于包括中国在内的所有毛皮动物养殖国家，对毛皮动物养殖业威胁极大。

随着养貂业的发展，国内目前用于预防水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎的疫苗主要是水貂犬瘟热活疫苗和水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗，对于规模化养殖场，单苗的使用给免疫接种带来了很大工作量。而直接用水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗稀释水貂犬瘟热活疫苗会造成犬瘟热病毒的失活，导致犬瘟热的免疫失败。一方面，要制备出水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗-水貂犬瘟热活疫苗二联苗需要选择合适的水貂细小病毒性灭活方法，既使其丧失活性，同时保持病毒免疫原性，又要避免灭活后残留的灭活剂影响犬瘟热病毒活疫苗活性。另一方面，还要保证两种疫苗在同时免疫时不发生免疫抑制或产生免疫干扰。基于以上两点，目前尚没有水貂犬瘟热活疫苗和水貂细小病毒肠炎灭活疫苗的二联疫苗。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗及其制备方法和应用，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗，该疫苗主要由水貂犬瘟热活疫苗和水貂细小病毒灭活疫苗、疫苗佐剂和保护剂组成；其中，水貂犬瘟热活疫苗和水貂细小病毒灭活疫苗是按照每头份1：1的比例组成。

优选地，所述水貂犬瘟热活疫苗，抗原为犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)全病毒、经改良或嵌合的CDV病毒，CDV基因缺乏病毒或弱毒病毒的一种或任意几种的组合；所述水貂细小病毒灭活疫苗抗原为水貂细小病毒和/或含MEV免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位。

更优选地，所述犬瘟热病毒全病毒，为CDV3-CL毒株，于2015年6月10日保藏在位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.10768；所述细小病毒，为MEVB毒株。

优选地，所述水貂犬瘟热病毒抗原含量为10^3.5～10^6.0TCID₅₀/头份，所述水貂细小病毒抗原的含量为10^5.0～10^7.0TCID₅₀/头份。

优选地，所述疫苗佐剂为水貂细小病毒灭活疫苗组分中的成份，主要化学成分为氢氧化铝胶；所述保护剂为水貂犬瘟热活疫苗组分中的成份，为NZ胺，谷氨酸单钾盐，水解乳蛋白，蔗糖或明胶的一种或几种的组合物。

更优选地，所述保护剂为耐热保护剂，是由如下质量百分比浓度的物质：15％～25％蔗糖、1％～5％明胶、1％～3％水解乳蛋白、0.1％～0.3％谷氨酸单钾盐、1％～5％NZ胺，余量为注射用水，通过高压灭菌、微孔滤芯过滤除菌、混合制备而成。该保护剂能保证犬瘟热冻干苗在2～8℃保存期在15个月以上。

本发明的另一目的在于提供一种所述疫苗的制备方法，该方法的步骤如下：

1)利用胰酶-EDTA细胞分散液对Vero细胞进行消化处理，再按1传3～5的比例进行传代，分别加含有8-10％小牛血清的细胞生长液，在37℃下培养至形成细胞层，再将犬瘟热病毒CDV3-CL毒株用细胞维持液进行3-5倍稀释，按照1-1.5％的比例接种在上述Vero单层细胞中，37℃吸附1h，弃掉吸附液，加入细胞生长液置于37℃下培养，当80％以上细胞出现典型细胞病变(CPE)时，收获作为生产用毒种；弃去已长满的Vero细胞的培养液，利用PBS清洗2次后将上述生产用毒种利用MEM细胞维持液做5倍的稀释后，再按照5％的比例接种在单层Vero细胞转瓶中，37℃下吸附1h后加入细胞维持液，在35-37℃下连续培养4d，当细胞CPE达到70％以上时，置于-20℃冻结，再融化后收获培养物，获得制苗毒液，在将制苗毒液与保护剂按4:1的比例混合均匀后冻干，检验合格后，获得犬瘟热活疫苗，在2-8℃以下保存,有效期达15个月以上；

2)利用胰酶-EDTA细胞分散液对CRFK细胞进行消化处理，再按1传3～5进行传代，分别加含有8-10％小牛血清的细胞生长液，在37℃下培养至形成细胞层，再将细小病毒MEVB毒株用细胞维持液进行稀释后，按照2％的比例同步接种于CRFK细胞悬液中，置于37℃下培养3-4d后，80％以上细胞出现典型CPE时收获，-20℃保存作为生产用毒种；将所得的生产用毒种按1-2％的比例接种到CRFK细胞悬液中在35-37℃下旋转培养4d后，70％以上细胞出现典型CPE时，置于-20℃冻结，再融化后收获细胞培养物，获得制苗毒液，检验合格后，将制苗毒液进行灭活处理，处理后再进行中和处理，将所得的灭活毒苗与铝胶佐剂按9:1的比例混合均匀，检验合格后在2-8℃保存，获得细小病毒灭活疫苗；所述制苗毒液的灭活处理，是采用BEI处理或甲醛处理；所述BEI处理，处理条件为：BEI浓度1-3mM，灭活时间48h，灭活温度37℃；所述甲醛处理，处理条件为：甲醛溶液浓度0.08-0.12％，灭活时间48h，灭活温度37℃；所述中和处理，在采用BEI灭活的情况下，中和剂为1M硫代硫酸钠，使用剂量为BEI使用量的10％，中和时间为24h；采用甲醛进行灭活处理时，采用生理盐水进行稀释，使甲醛浓度降低至0.05％以下；

3)将步骤1)冷藏的犬瘟热活疫苗和步骤2)冷藏的细小病毒灭活疫苗取出置于室温，并细小病毒灭活疫苗摇晃均匀，再按照头份数1:1的比例将细小病毒灭活疫苗与犬瘟热活疫苗混合均匀，获得水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联疫苗。

所述任一疫苗用于水貂和狐狸的犬瘟热和细小病毒性肠炎的免疫。

本发明的另一目的在于提供一种所述疫苗的使用方法，该方法的步骤如下：

1)将2～8℃保存的水貂犬瘟热活疫苗和在2-8℃冷藏的水貂细小病毒性肠炎活疫苗取出置于室温，并将水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗导入水貂犬瘟热活疫苗瓶内，混合均匀；

2)将水貂犬瘟热活疫苗与水貂细小病毒性肠炎活疫苗按照每头份1:1的比例混合均匀，获得二联疫苗；

3)在2h内将步骤2)所得二联疫苗免疫接种到水貂体内，接种量为1.0ml/只水貂。

本发明的另一目的在于提供一种利用所疫苗制备的试剂盒。

本发明获得的有益效果如下：

一方面本发明选择的灭活方法，既保证了水貂细小病毒丧失活性，同时保持病毒免疫原性，又避免灭活后残留的灭活剂影响犬瘟热病毒。另一方面，本发明所制备的二联疫苗保证了两种疫苗在同时免疫时不发生免疫抑制或产生免疫干扰。另外，本发明所制备的二联疫苗的保存条件均为2～8℃下冷藏，其中水貂犬瘟热活疫苗部分在2～8℃下有效期可达15个月以上。在使用上，本发明制备的二联疫苗将灭活苗部分同时作为活疫苗的稀释液，采用稀释针头，利用冻干苗的真空负压状态，快速、便捷实现两种疫苗的联合和冻干苗的稀释双重效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊声明，均为本领域中常规材料、试剂、方法和仪器，均可以通过商业渠道获得。

所用犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)全病毒，为CDV3-CL毒株，于2015年6月10日保藏在位于北京朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCCNO.10768。

实施例1水貂犬瘟热活疫苗的制备：

1.制苗用细胞的传代与培养：将生产水貂犬瘟热病毒用Vero细胞经胰酶—EDTA细胞分散液消化，按1：3进行传代；分别加含8％～10％小牛血清的细胞生长液于37℃培养，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种病毒。

2.细胞毒种的繁殖：将水貂犬瘟热活疫苗CDV3-CL株毒种用细胞维持液进行3～5倍稀释，按1％～1.5％的比例接种于生长良好的Vero单层细胞，37℃吸附1小时，弃掉吸附液，加入细胞生长液置37℃培养，当80％以上细胞出现典型CPE时，即可收获，作为生产用毒种。

3.毒种鉴定：按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长，应无外源病毒污染。毒种每毫升病毒含量应≥10^5.00TCID₅₀。

4.制苗毒液的繁殖：取已长满单层的Vero细胞，弃去细胞培养液，用PBS洗2次，将生产用毒种用MEM细胞维持液作5倍稀释，按5％的比例接种于长成良好的单层Vero细胞转瓶，37℃吸附1小时，加入细胞维持液。将细胞培养转瓶置35～37℃条件下旋转培养，连续观察4日。废弃污染或细胞生长异常的转瓶。每日观察细胞CPE，当细胞CPE达到70％以上时即可收获，置-20℃冻结，再融化后收获细胞培养物于灭菌容器内，若干瓶为1组并留样。-20℃以下冻存。

5.制苗毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无菌生长，每毫升病毒含量应≥10^5.70TCID₅₀。

6.保护剂制备：将保护剂各组分按照质量百分比15％～25％蔗糖、1％～5％明胶、1％～3％水解乳蛋白、0.1％～0.3％谷氨酸单钾盐、1％～5％NZ胺，余量为注射用水，通过高压灭菌、微孔滤芯过滤除菌、混合制备而成。

7.配苗、分装及冻干：将制苗毒液与保护剂按3:2的比例混合均匀后定量分装至管制玻璃瓶内，置冻干机内，经预冷、升华、干燥过程冻干疫苗，疫苗冻干后进行无菌检验，安全检验和效力检验等。

成品检验：

1.性状呈微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

2.无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

3.支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。

4.外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。

5.鉴别检验每批疫苗随机取1瓶，用灭菌注射用水溶解后，用灭菌PBS将疫苗稀释成200TCID₅₀/0.1ml，取该稀释液与犬瘟热病毒特异性阳性血清(中和抗体效价应不低于1∶256)等量混合，在37℃下中和1小时，接种24孔细胞培养板4孔，每孔0.1ml，补充Vero细胞悬液0.9ml。同时设正常细胞对照、病毒对照和阴性血清对照各4孔，置37℃细胞培养箱中培养观察5日，病毒对照孔和阴性血清对照孔应全部出现CPE，阳性血清中和孔和正常细胞孔均应不出现CPE。

6安全检验

6.1每批疫苗随机取若干瓶，按瓶签注明头份用灭菌注射用水溶解后混合，皮下接种2～10月龄健康易感(中和抗体效价不高于1∶4)水貂5只，每只10头份，分5点注射，连续观察14日，所有接种水貂的精神、食欲、体温、粪便均应正常。

6.2每批疫苗随机取若干瓶，按瓶签注明头份用灭菌注射用水溶解后混合，皮下接种2～10月龄健康易感(中和抗体效价不高于1∶4)狐狸5只，每只30头份，分5点注射，连续观察14日，所有接种狐狸的精神、食欲、体温、粪便均应正常。

7.效力检验下列方法任择其一。

7.1病毒含量测定每批疫苗随机取1瓶，按瓶签注明头份用灭菌注射用水溶解成1ml/头份后，用灭菌PBS作10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-54个稀释度，接种24孔细胞板，每个稀释度接种4孔，每孔0.1ml，各孔补充Vero细胞悬液0.9ml，置37℃下培养并观察5日，记录细胞病变，按Reed-Muench法计算病毒含量。每头份病毒含量应≥10^3.50TCID₅₀。

7.2中和抗体效价测定

7.2.1每批疫苗随机抽取1瓶，按瓶签注明头份加灭菌注射用水溶解，皮下注射2～10月龄健康易感(中和抗体效价不高于1∶4)水貂5只，每只注射疫苗1头份，同时设立不接种疫苗的对照水貂3只，免疫后21日分别采血，测定血清犬瘟热病毒中和抗体效价。对照水貂中和抗体效价均应不高于1∶4，免疫水貂中和抗体效价均应不低于1∶46。

7.2.2每批疫苗随机抽取1瓶，按瓶签注明头份加灭菌注射用水溶解，皮下注射2～10月龄健康易感(中和抗体效价不高于1∶4)狐狸5只，每只注射疫苗3头份，同时设立不接种疫苗的对照狐狸3只，免疫后21日分别采血，测定血清犬瘟热病毒中和抗体效价。对照狐狸中和抗体效价均应不高于1∶4，免疫狐狸中和抗体效价均应不低于1∶46。

8.剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。

9.真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。

实施例2水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备

1.制苗用细胞的传代与培养：将生产水貂细小病毒用CRFK细胞经胰酶—EDTA细胞分散液消化，按1:3进行传代；分别加含8％～10％小牛血清的细胞生长液，于37℃培养继续传代或接种病毒。

2.细胞毒种的繁殖：将水貂细小病毒MEVB株毒种用细胞维持液进行适当稀释，按2％的比例同步接种于CRFK细胞悬液中，置37℃培养3～4日，80％以上细胞出现典型CPE时，即可收获，-20℃保存，作为生产用毒种。

3.毒种鉴定：按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长，应无外源病毒污染。毒种每毫升病毒含量应≥10^6.50TCID₅₀。

4.制苗毒液的繁殖：按1％～2％的比例接种于制备好的CRFK细胞悬液转瓶中。将细胞培养转瓶置35～37℃条件下旋转培养，连续观察4日。废弃污染或细胞生长异常的转瓶。每日观察细胞CPE，当细胞CPE达到70％以上时即可收获，置-20℃冻结，再融化后收获细胞培养物于灭菌容器内，若干瓶为1组并留样。-20℃以下冻存。

5.制苗毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，应无菌生长，每毫升病毒含量应≥10^6.00TCID₅₀。

6.制苗毒液的灭活：将检验合格的病毒液融化后，按制苗毒液中终浓度3mM/L加入BEI灭活剂，灭活时间为48小时。灭活后加入BEI使用量的10％的1mol/L硫代硫酸钠进行中和24小时。

7.配苗、分装：将制苗毒液与铝胶佐剂按9:1的比例混合均匀后定量分装，疫苗分装后进行无菌检验，安全检验和效力检验等。

8.本实施例制备的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗，经性状、无菌、安检、效检等检验均合格。

9.成品检验：

9.1物理性状粉红色均匀混悬液，静置后，上层为粉红色澄清液体，下层为淡粉红色沉淀，摇匀后呈均匀混悬液。

9.2无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无细菌、霉菌生长。

9.3安全检验用2～10月龄健康易感水貂(水貂细小病毒HI抗体效价≤1∶4)5只，各肌肉接种疫苗5ml(5个免疫剂量)，分4点注射，观察10日，精神、食欲、体温与粪便应无异常变化。

9.4效力检验

血清抗体测定用2～10月龄健康易感水貂(水貂细小病毒HI抗体效价≤1∶4)5只，各肌肉接种疫苗1ml，21日后，连同对照水貂5只，分别采血，测定HI抗体效价，免疫组水貂抗体效价均应≥1∶32，对照组水貂抗体效价均应≤1∶4。

9.5.甲醛、硫柳汞残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

实施例3水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗与水貂犬瘟热活疫苗二联疫苗的制备

1.将冷冻保存的水貂犬瘟热活疫苗和冷藏的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗取出置室温，将水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗摇晃均匀；

2.按1：1的比例抽取相应毫升数水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗注入水貂犬瘟热活疫苗瓶中，混匀后接种动物；疫苗应于混合后两小时内免疫接种，每只水貂1.0mL。

实施例4水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗稀释水貂犬瘟热活疫苗对水貂犬瘟热病毒的影响

取规格为90ml/瓶的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗和规格为90头份/瓶的水貂犬瘟热活疫苗各若干瓶，将水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗充分混匀，用冻干疫苗稀释针头插入水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗中，将该疫苗瓶倒置，将稀释针头另一头插入水貂犬瘟热活疫苗，1瓶水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗稀释1瓶水貂犬瘟热活疫苗，另取疫苗专用稀释液稀释水貂犬瘟热活疫苗作为对照组，阴凉处分别放置0h，1h，2h，3h，4h，测定两种不同稀释方法稀释后的犬瘟热病毒含量。

结果：水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗稀释组与专用稀释液稀释组的犬瘟热病毒含量在4h放置时间之内均无明显差异，两组放置5h分别下降10^0.20个TCID₅₀和10^0.13个TCID₅₀，实验结果显示，用水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗稀释犬瘟热活疫苗在阴凉处放置4h之内对犬瘟热病毒无显著影响。

实施例5水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗稀释水貂犬瘟热活疫苗联用安全性评价

取水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗稀释水貂犬瘟热活疫苗，稀释后分别于0，1，2小时10倍免疫剂量接种水貂，每组接种5只水貂，接种后观察水貂体温、精神、食欲情况及接种部位有无反应。结果显示，5组水貂均未出现因疫苗引起的不良反应。

实施例6水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗稀释水貂犬瘟热活疫苗联用效力评价

取水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗稀释水貂犬瘟热活疫苗，稀释后分别于0，1，2小时接种水貂，每只接种1mL(内含水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗和水貂犬瘟热活疫苗各一头份)，每组接种5只水貂，另设单免水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗组和用疫苗专用稀释液稀释犬瘟冻干苗组作为对照，21天后测定采血分离血清，测定水貂犬瘟热病毒中和抗体和水貂细小病毒HI抗体。结果：水貂犬瘟热中和抗体转阳率(≥1:45)：联用组和水貂犬瘟热活疫苗单苗组分别放置0、1、2小时水貂犬瘟热中和抗体转阳率均为100％，且联用组和水貂犬瘟热活疫苗单苗组的水貂犬瘟热病毒中和抗体水平无显著差异，联用组和水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗单免组的水貂细小病毒HI抗体转阳率均为100％(≥1:32)，且联用组和水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗单苗组的水貂细小病毒HI抗体无显著差异。

实施例7

本实施例根据实施例1-3所述方法制备了相同的二份疫苗，不同的是，一种使用了保护剂，所用的保护剂具体组成为：15％蔗糖、3％明胶、2％水解乳蛋白、0.2％谷氨酸单钾盐、4％NZ胺，余量为注射用水，通过高压灭菌、微孔滤芯过滤除菌、混合制备而成。第二种使用一种常见的普通保护剂：保护剂组成为：3％明胶，5％蔗糖。

在制备好两种疫苗后，在2～8℃避光的条件下储藏，定期取样对样品进行保存期试验。结果如表1所示：

表1本实施例保护剂和普通保护剂冻干前后犬瘟热病毒含量(TCID₅₀/头份)变化

组别	冻干前(TCID50/头份)	冻干后(TCID50/头份)
			实例例7疫苗组	104.80	104.60
普通保护剂疫苗组	104.70	104.50

表2本实施例冻干样品2～8℃保存不同时间性状、真空度、剩余水分、效价检测结果

从表1可以看出，在2～8℃条件下储藏，加本发明保护剂的样品在冻干前后犬瘟热病毒的含量均高于使用普通保护剂的样品。同时，从表2可以看出，加本发明保护剂的样品在15月后依然有效，但普通保护剂的疫苗在5月后，10个月之前就失效了。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗，其特征在于，主要由水貂犬瘟热活疫苗和水貂细小病毒灭活疫苗、疫苗佐剂和保护剂组成；所述水貂犬瘟热活疫苗和水貂细小病毒灭活疫苗是按照每头份1：1的比例组成。

2.权利要求1所述疫苗，其特征在于，所述水貂犬瘟热活疫苗，抗原为犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)全病毒、经改良或嵌合的CDV病毒，CDV基因缺乏病毒或弱毒病毒的一种或任意几种的组合；所述水貂细小病毒灭活疫苗抗原为水貂细小病毒和/或含MEV免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位。

3.权利要求2所述疫苗，其特征在于，所述犬瘟热病毒全病毒，为CDV3-CL毒株，保藏于位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.10768；所述细小病毒，为MEVB毒株。

4.权利要求1所述疫苗，其特征在于，所述水貂犬瘟热病毒抗原含量为10^3.5～10^6.0TCID₅₀/头份，所述水貂细小病毒抗原的含量为10^5.0～10^7.0TCID₅₀/头份。

5.权利要求1所述疫苗，其特征在于，所述疫苗佐剂为水貂细小病毒灭活疫苗组分中的成份，主要化学成分为氢氧化铝胶；所述保护剂为水貂犬瘟热活疫苗组分中的成份，为NZ胺，谷氨酸单钾盐，水解乳蛋白，蔗糖或明胶的一种或几种的组合物。

6.权利要求5所述疫苗，其特征在于，所述保护剂为耐热保护剂，是由如下质量百分比浓度的物质：15％～25％蔗糖、1％～5％明胶、1％～3％水解乳蛋白、0.1％～0.3％谷氨酸单钾盐、1％～5％NZ胺，余量为注射用水，通过高压灭菌、微孔滤芯过滤除菌、混合制备而成。

7.一种权利要求1所述疫苗的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)利用胰酶-EDTA细胞分散液对Vero细胞进行消化处理，再按1传3～5的比例进行传代，分别加含有8-10％小牛血清的细胞生长液，在37℃下培养至形成细胞层，再将犬瘟热病毒CDV3-CL毒株用细胞维持液进行3-5倍稀释，按照1-1.5％的比例接种在上述Vero单层细胞中，37℃吸附1h，弃掉吸附液，加入细胞生长液置于37℃下培养，当80％以上细胞出现典型细胞病变时，收获作为生产用毒种；弃去已长满的Vero细胞的培养液，利用PBS清洗2次后将上述生产用毒种；利用MEM细胞维持液做5倍的稀释后，再按照5％的比例接种在单层Vero细胞转瓶中，37℃下吸附1h后加入细胞维持液，在35-37℃下连续培养4d，当细胞CPE达到70％以上时，置于-20℃冻结，再融化后收获培养物，获得制苗毒液，在将制苗毒液与保护剂按4:1的比例混合均匀后冻干，检验合格后，在2～8℃以下保存，获得犬瘟热活疫苗；

2)利用胰酶-EDTA细胞分散液对CRFK细胞进行消化处理，再按1传3～5的比例进行传代，分别加含有8-10％小牛血清的细胞生长液，在37℃下培养至形成细胞层，再将细小病毒MEVB毒株用细胞维持液进行稀释后，按照2％的比例同步接种于CRFK细胞悬液中，置于37℃下培养3-4d后，80％以上细胞出现典型CPE时收获，-20℃保存作为生产用毒种；将所得的生产用毒种按1-2％的比例接种到CRFK细胞悬液中在35-37℃下旋转培养4d后，70％以上细胞出现典型CPE时，置于-20℃冻结，再融化后收获细胞培养物，获得制苗毒液，检验合格后，将制苗毒液进行灭活处理，处理后再进行中和处理，将所得的灭活毒苗与疫苗佐剂按9:1的比例混合均匀，检验合格后在2-8℃保存，获得细小病毒灭活疫苗；所述制苗毒液的灭活处理，是采用BEI处理或甲醛处理；其中，BEI处理的处理条件为：BEI浓度1-3mM，灭活时间48h，灭活温度37℃；甲醛处理的处理条件为：甲醛溶液浓度0.08-0.12％，灭活时间48h，灭活温度37℃；所述中和处理，在采用BEI灭活的情况下，中和剂为1M硫代硫酸钠，使用剂量为BEI使用量的10％，中和时间为24h；采用甲醛进行灭活处理时，采用生理盐水进行稀释，使甲醛浓度降低至0.05％以下；

3)将步骤1)冷藏的犬瘟热活疫苗和步骤2)冷藏的细小病毒灭活疫苗取出置于室温，并细小病毒灭活疫苗摇晃均匀，再按照头份数1:1的比例将细小病毒灭活疫苗与犬瘟热活疫苗混合均匀，获得水貂犬瘟热-细小病毒性肠炎二联疫苗。

8.权利要求1-6所述任一疫苗，其特征在于，应用于预防水貂和狐狸犬瘟热和细小病毒性肠炎。

9.权利要求8所述应用，其特征在于，步骤如下：

1)将2～8℃保存的水貂犬瘟热活疫苗和在2-8℃冷藏的水貂细小病毒性肠炎活疫苗取出置于室温，并将水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗导入水貂犬瘟热活疫苗瓶内，混合均匀；

2)将水貂犬瘟热活疫苗与水貂细小病毒性肠炎活疫苗按照每头份1:1的比例混合均匀，获得二联疫苗；

3)在2h内将步骤2)所得二联疫苗免疫接种到水貂体内，接种量为1.0ml/只水貂。

10.利用要求1-6所任一疫苗制备的试剂盒。