CN109865135A - 一种银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌联合灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌病二联灭活疫苗，其中美人鱼发光杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16907。本发明制备的银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌病二联灭活疫苗制备工艺简单、产量稳定，成本低，可大量获得具有较高免疫效果的灭活疫苗。使用该方法制备的灭活疫苗的免疫保护率达92.5％，该疫苗为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和对环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制银鲳美人鱼发光杆菌病和灿烂弧菌病的发生和流行，为大规模制备银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌病二联灭活疫苗提供了技术支持。

Description

一种银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌联合灭活疫苗

技术领域

本发明属于微生物疫苗制备领域，具体涉及一种银鲳美人鱼发光 杆菌和灿烂弧菌二联灭活疫苗。

背景技术

银鲳(Pampus argenteus)隶属于鲈形目(Perciformes)、鲳科 (Stromateidae)、鲳属(Pampus)，不仅是我国沿海主要的经济鱼类之 一，深受消费者喜爱,而且在印度、科威特、伊朗等国家的渔业经济 中也占了较大的比重。近20年来，由于过度捕捞和环境污染，野生 银鲳资源不断萎缩，渔获银鲳体型趋于小型化。因此，开展银鲳人工 养殖和育苗就显得尤为重要。由于国内养殖银鲳起步较晚，虽已经突 破人工繁殖瓶颈，但距离产业化还有很长的路。尤其是成鱼养殖阶段 容易感染美人鱼发光杆菌，肉眼观察除摄食减少，活动能力下降外无 明显症状，短时间内即可发病导致全军覆没。

弧菌病(Vibriosis)是水产养殖中最常见的细菌性疾病。弧菌病 的主要致病菌之一是灿烂弧菌(V.splendidus)。具有流行广泛、发病 率以及死亡率超高等特点，给银鲳的人工养殖以及产业化带来毁灭性 打击。

目前银鲳细菌性疾病的治疗主要依赖于抗生素，虽然有一定效 果，但是并不能从根本上控制疾病。目前水产上使用的都是光谱性抗 生素，长期用药会导致微生物出现抗药性，药物往往会滞留在鱼体内， 对人类健康造成危害，且长期用药会带来环境污染。

由于银鲳体型侧扁，游动迅速，且对于外界刺激应激强烈，现有 的注射型疫苗效果不佳，且单苗使用多次多剂量，会给银鲳带来不必 要的应激。因此，从银鲳自身筛选具有免疫性的病原微生物来制备疫 苗就成为银鲳养殖行业的研究重点之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌病二 联灭活疫苗，以替代抗生素治疗银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌病， 用以解决治疗产生的药物残留和微生物耐药性的产生以及减少银鲳 应激刺激等问题，弥补现有技术的不足。

本发明所提供的二联灭活疫苗，包括抗原和疫苗佐剂，其中抗原 为灭活的美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌；

其中美人鱼发光杆菌，为美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)ZM504株，于2018年12月07日保藏在位于北京市朝阳 区北辰西路1号院的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏编号为CGMCC NO.16907。

上述的疫苗，其中灭活菌体的浓度分别为10⁷-10¹⁰CFU/ml。

作为优选，所述的疫苗佐剂为苍术浸出液，是取苍术用蒸馏水浸 泡后煎煮，过滤，浓缩后制成的。

本发明制备的银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌病二联灭活疫苗 制备工艺简单、产量稳定，成本低，可大量获得具有较高免疫效果的 灭活疫苗。使用该方法制备的灭活疫苗的免疫保护率达92.5％，该疫 苗为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和对 环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制银鲳美人鱼发光杆菌病和 灿烂弧菌病的发生和流行，为大规模制备银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂 弧菌病二联灭活疫苗提供了技术支持。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1:筛选美人鱼发光杆菌

1、样品的采集及处理

发病银鲳取自浙江省宁波市象山县港湾水产育苗公司，用灭菌后 的解剖工具剪开银鲳腹部，取出肠道，用PBS缓冲液将肠道外壁上的 脂肪、血液等冲洗干净。慢慢地将胃肠道内含物挤出，随后用灭菌眼 科剪将胃肠道纵向剪开，使用PBS缓冲液清洗几次，去掉残留肠道内 含物。之后使用橡胶刮刀将肠道内壁粘膜慢慢刮下来。将分离的内溶 物和粘膜混合在一起，放入含有PBS缓冲液的10mL离心管中，混合 均匀。用接种环蘸取少量肠道内溶物混浊液接种于LB琼脂培养基， 28℃恒温培养24h后，挑取形态特征一致的优势菌落进行分离纯化， 将纯化4次后的菌株进行常规生理生化和16S rDNA基因序列测定， 确定优势菌株为美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae subsp.damselae)。

2、银鲳肠道微生物的培养

所使用的培养基为LB培养基(纯水1000mL、蛋白胨10g、酵母 粉5g、NaCl 10g、琼脂15g/L、pH 7.4～7.6)。

3、形态特征

在营养琼脂培养基上菌落为圆形，表面光滑湿润，边缘光滑，菌 落直径1-2mm。革兰氏染色阴性，菌体椭圆状，有1-2根鞭毛侧极生， 可运动，不产芽孢。

4、生理生化特征

菌株的生理生化特性如下：葡萄糖阳性、蔗糖阴性、麦芽糖阴 性、甘露醇阴性、纤维二糖阴性、鼠李糖阴性、氧化酶阳性、淀粉酶 阳性、接触酶阳性、β-半乳糖苷酶阴性、a-葡萄糖苷酶阴性。

5、筛选的菌株的致病性检测

从养殖场挑取日龄60、平均体长(2.0±1.1)cm的健康银鲳，饲 养于10L海水的整理箱中，每组20尾，实验期间连续充气，水温26 -29℃，每天投饵、换水，暂养7d后，将分离纯化的美人鱼发光杆 菌于LB培养基，28℃培养24-48h后，离心，用无菌海水重悬得菌悬 液，设定细菌浓度梯度，进行腹腔注射感染，定时观察记录，取人 工感染后发病濒死银鲳脾脏、肾脏组织涂布于营养琼脂培养基平板 上，均可分离到大量菌落形态高度一致的细菌，其菌落形态、大小以 及生理生化特征均与美人鱼发光杆菌相同，以确定实验鱼均死于分离 出的致病菌株。

表1：人工筛选的银鲳美人鱼发光杆菌致病性检测

最终筛选获得的美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae) ZM504株，于2018年12月07日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1 号院的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO.16907。

二、制备灭活疫苗

1、美人鱼发光杆菌灭活疫苗的制备

首先将本发明筛选到的美人鱼发光杆菌接种于500mL LB培养基 (蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、pH 7.4～7.6)，28℃震 荡培养24小时，血球计数板检测菌液浓度达10⁹CFU/ml，或OD600值 达到0.6以上时终止培养，获得美人鱼发光杆菌的扩大培养液；

而后按体积比0.5％加入25ml甲醛溶液，对菌株的扩大培养液于 室温灭活24-48小时，期间震荡8-10次；得到美人鱼发光杆菌的灭 活菌液；取苍术用蒸馏水浸泡60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为 原药1g/mL，得苍术浸出液；

将两种灭活菌体与苍术浸出液按1：1混合，制得水剂型苍术佐 剂银鲳美人鱼发光杆菌灭活疫苗；疫苗中美人鱼发光杆菌免疫原为 10⁹CFU/ml，苍术浸出液为1g/mL。

对该灭活疫苗进行无菌检测：取上述二联灭活疫苗80μl涂布于 LB固体培养基，涂布均匀后，28℃培养48小时后未见菌落长出，合 格者即为美人鱼发光杆菌灭活疫苗；

2、美人鱼发光杆菌灭活疫苗的效果检测

随机选取30-60日龄的健康银鲳，转移到实施例1中制备的灭 活疫苗中浸泡10-20分钟，取出实验银鲳，正常饲喂饵料，并以未经 疫苗浸泡处理的健康银鲳为对照。28天后将灭活疫苗浸泡及未经过 浸泡处理的银鲳，以1×10⁸CFU/mL浓度的美人鱼发光杆菌活菌进行 攻毒试验，每天换水补充菌液，定时观察记录各组银鲳发病和死亡情 况，结果表明对照组银鲳在感染后第3天出现死亡，第8天时全部死 亡，免疫保护率为0％，而灭活疫苗浸泡组的免疫保护力为100％。 结果表明本发明制备的灭活疫苗能有效的对银鲳进行抗菌性免疫。

考虑到银鲳应激反应强烈，养殖过程中常常会因为操作不当或者 外界刺激导致鱼体受伤，造成一定的死亡率。因此，灭活疫苗对鱼体 应激能力的影响也成为衡量疫苗品质的重要因素。

用本发明的CGMCC NO.16907美人鱼发光杆菌与订购的ATCC 33539美人鱼发光杆菌美人鱼亚种冻干粉分别作为免疫原制成灭活疫 苗，检测二者对银鲳的应急刺激。考虑到鱼类遭受应激源刺激时，皮 质醇含量会显著升高，进而促进血糖含量增加，血糖的增加为肌肉和 神经提供更多能量，使得鱼类适应应激环境。因此血清中血糖和皮质 醇是评价鱼类抗应激能力的重要指标。

对注射疫苗后银鲳血清中血糖和皮质醇的含量进行检测，选用当 年人工孵化的同一批银鲳，体重6.8±0.78g，作为试验用鱼。经1周 的驯养后，挑选出体格健壮、规格一致的银鲳，分为2组进行试验。 每组设3个平行，每个平行为500L的塑料桶，每个塑料桶放养40尾 试验用银鲳，2个组分别用于8％的NaCl溶液中浸泡5分钟，然后 按体积比1：5用水稀释银鲳美人鱼发光杆菌疫苗1、2得银鲳美人鱼 发光杆菌疫苗溶液，再将银鲳放于银鲳美人鱼发光杆菌疫苗溶液中充 气浸泡1h。养殖实验结束后取两组实验鱼血样进行应激实验。

测定两个处理组两种疫苗应激后银鲳血清中皮质醇、葡萄糖的含 量，从而反映不同免疫原制成的美人鱼发光杆菌灭活疫苗对银鲳应激 刺激的影响。葡萄糖的测定选用己糖激酶法，使用仪器为日立 Hitachi7600；皮质醇的测定选用放射免疫法。

表2：两种疫苗对银鲳应激能力的影响

结果表明，用银鲳肠道中分离的美人鱼发光杆菌CGMCC NO.16907 制成的灭活疫苗1对银鲳的应急刺激小于用购置的美人鱼发光杆菌 冻干粉制成灭活疫苗2(表2)；或许是因为所分离的美人鱼发光杆 菌分离自银鲳肠道组织，属于自体分离的菌株，因此不会使银鲳产生 强烈的应激反应。

实施例2：美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌混合菌株制备灭活疫苗

一、灭活疫苗的制备

首先将本发明筛选到的美人鱼发光杆菌与灿烂弧菌(购自中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，菌株保藏编号1.6382)分别接种于500mL LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、 NaCl 10g/L、pH 7.4～7.6)，28℃震荡培养24小时，血球计数板检测菌液浓度达10⁹CFU/ml，或OD600值达到0.6以上时终止培养，获 得美人鱼发光杆菌与灿烂弧菌的扩大培养液；

然后按体积比0.5％加入25ml甲醛溶液，对灿烂弧菌的扩大培养 液于室温灭活48小时，期间震荡5-8次，得到菌株的灭活菌液；

取苍术用蒸馏水浸泡60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药 1g/mL，得苍术浸出液；

将两种灭活菌体与苍术浸出液按1：1：1混合，制得水剂型苍术 佐剂银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌二联疫苗；疫苗中美人鱼发光杆 菌和灿烂弧菌免疫原为10⁹CFU/ml，苍术浸出液为1g/mL。

对该灭活疫苗进行无菌检测：取上述二联灭活疫苗80μl涂布于 LB固体培养基，涂布均匀后，28℃培养48小时后未见菌落长出，合 格者即为美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌的二联灭活疫苗；

对该灭活疫苗的安全性进行检测：取灭活疫苗以0.2ml/尾腹 腔注射银鲳，对照组注射同等剂量的无菌PBS。然后正常饲养观察l4 天，观察注射疫苗的银鲳全部存活，且进食及活动正常，内脏剖检未 见任何异常，表明制备的灭活疫苗安全可靠。

对灭活疫苗进行无菌检测和安全性检测后，合格者即美人鱼发光 杆菌和灿烂弧菌的二联灭活疫苗，4℃条件下保存备用。

二、灭活疫苗的效果检测

1、二联灭活疫苗的免疫保护试验

采用浸泡免疫的方法对制备的灭活疫苗的免疫效果进行检测：选 取30-60日龄的健康银鲳450尾，随机分为3组，使用具体实施例2 中制备的灭活疫苗进行浸泡免疫试验，方法如下：试验分为3组，第 1组为对照组，第2组为加强免疫组，第3组为不加强免疫组，将第2组和第3组银鲳浸泡于经1O倍稀释的灭活菌液(2×10⁸CFU/mL)中 浸泡15min。第2组银鲳10天后再按同样的方法加强免疫一次，其 他饲养条件均与未免疫银鲳一致。在免疫后第30天，对3组银鲳进 行攻毒试验，第1组银鲳全部死亡，第2组的免疫保护率达100％， 第3组的免疫保护率为91.8％。

本发明从银鲳肠道中筛选出的美人鱼发光杆菌可有效减少生产 过程中因疫苗的使用而导致银鲳食欲不振，摄食减少等问题。用本发 明制成的以苍术浸出液为佐剂的美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌二联疫 苗(疫苗1)与订购的ATCC33539美人鱼发光杆菌美人鱼亚种冻干粉 和灿烂弧菌CGMCC 1.6382作为免疫原制成的普通灭活疫苗(疫苗2)， 检测二者对银鲳摄食行为的影响。

选用当年人工孵化的同一批银鲳，体重7.12±0.54g，作为试验 用鱼。经1周的驯养后，挑选出体格健壮、规格一致的银鲳，分为2 组进行试验。每组设3个平行，每个平行为500L的塑料桶，每个塑 料桶放养40尾试验用银鲳，2个组分别用于8％的NaCl溶液中浸泡 5分钟，然后按体积比1：5用水稀释美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌二 联疫苗疫苗1、2。将银鲳放于两种二联疫苗溶液中充气浸泡1h。养 殖实验结束后对两组实验银鲳进行正常投喂，期间保证饵料充足。每 天投喂前对饵料进行称重，记为W₀，摄食完成后收集残铒，干燥后 称重，记为W₁。养殖实验共进行7天，统计两个实验组每天摄食量 并算出平均值进行对比分析，摄食量(g)＝W₁-W₀；

表2：两种疫苗对银鲳摄食率的影响

上述的实验结果表明，本发明制备的二联灭活疫苗具有高效的免 疫效果，能够有效的提高银鲳的抗病力，减少对银鲳应激刺激和摄食 能力的影响，且加强免疫一次更有助于发挥效应，具有良好的市场推 广前景。

Claims (4)

1.一种二联灭活疫苗，其特征在于，所述的二联灭活疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为灭活的美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌；所述的美人鱼发光杆菌的保藏编号为CGMCCNO.16907。

2.如权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌使用甲醛溶液进行灭活。

3.如权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌灭活菌体的的浓度分别为10⁷-10¹⁰CFU/ml。

4.如权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为苍术浸出液，是取苍术用蒸馏水浸泡后煎煮，过滤，浓缩后制成的。