CN109810916A - 一株解淀粉芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一株解淀粉芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2018266，分类命名为：解淀粉芽胞杆菌BaY002。由该菌株通过相应方法制成的适用水产养殖的微生态制剂进行饲料添加、水体泼洒或腹腔注射等给药途径，对草鱼的保护率分别达到70%～80%、60%～70%和85%～90%，本发明微生态制剂的稳定性好，被鱼体吸收后，对草鱼、鲫鱼等淡水鱼类的抗嗜水气单胞菌感染防治效果尤其显著。

Description

一株解淀粉芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生态制剂领域，具体涉及一株解淀粉芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法。

背景技术

由于传统抗生素在长期的使用中导致了细菌的耐药性、对水产品农药残留和农业生态环境破坏等一系列问题，国家对水产养殖中抗生素使用的限制越来越大，对有效防治水产病害的新药物的研制面临着巨大的挑战。而水产微生态制剂以其安全有效、绿色无残留、不易产生耐药性等优点，逐渐开发成用于养殖水域中微生态的调控、净化水质、调整或维持水产动物肠道内微生态平衡以及提高鱼体免疫力、抗病力等产品，以利实施大规模水产生态健康养殖。随着人们的安全意识越来越强，对抗生素使用的警惕性越来越高，水产微生态制剂将成为今后水产养殖病害防治的主要选择之一。

水产微生态制剂常用有益微生物的种类有芽胞杆菌、乳酸菌、光合细菌、酵母菌、硝化细菌、反硝化细菌和蛭弧菌。近年来，芽胞杆菌水产微生态制剂在水产中使用最成功、效益最好，以芽胞杆菌作为鱼类病原菌拮抗菌开发出防治疾病和增进健康养殖作用的水产微生态制剂具有广阔的发展前景。

芽胞杆菌（Bacillus）属于革兰阳性菌，菌体呈直杆菌，成对或链状排列。芽胞杆菌分布广，存在于土壤、水域、空气以及动物肠道等处，在营养充足时呈对数生长，环境恶劣时停止生长转而产生芽胞。芽胞（内生芽胞）对高温、干燥、高盐以及化学物质有强大的抵抗性，因此芽胞杆菌十分利于生产、加工、运输及储藏。

芽胞杆菌能分泌丰富的胞外酶系，可直接作用于硝酸盐和亚硝酸盐，对亚硝酸盐、氨氮的去除效果明显，从而起到净化水质的作用。仝慧芳等人在《江西水产科技》（2016年第3期第37～38页）发表的“枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用及研究现状”文章介绍了芽胞杆菌分泌的胞外酶系能有效的降解水体的有机物，如浮游生物的残物、水生生物的排泄物和残饵，使这些物质矿化成为藻类生长所需的营养盐类。Kozasa 等人在《Journal of theTokyo Society of Veterinary & Zootechnical Science》（1978年第17卷第1期第55～70页）发表的“Taxonomic studies on Bacillus cereus T-7112, 3: Interrelations pi(7)-phage susceptibility and biotype.”文章提及从土壤中分离的芽胞杆菌作用经爱德华氏菌感染的鳗鲡（Anguilla anguilla），能够降低其死亡率。张庆等在《上海海洋大学学报》（1999年第1期第43～47页）发表的“复合微生物对养殖水体生态因子的影响”文章提到向罗非鱼养殖水体中添加以芽胞杆菌为主的微生物复合菌剂，证明了其能改善水质养殖条件的能力，并促进罗非鱼的生长。

解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）作为重要的生防菌和植物益生菌已有研究与应用，在水产养殖领域的应用研究也有报道。

CN 103275907B公开了一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）H6，该解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为：CCTCCNO：M2013249，并说明了该菌株在畜禽养殖饲喂中有很好的防治腹泻和促进生长效果的应用，对能否用于水产养殖未提及。

CN 107937301A公开了一种解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用，该解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillu samyloliquefaciens)NC58，保藏编号为 CGMCCNO:14009，虽然提及了在水产养殖中的应用，但对菌株的生理生化性质未提及，其稳定性并无法进行推断。

CN 103773711 B公开了一种解淀粉芽胞杆菌及微生物菌剂和它们的应用，该解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的保藏编号为CCTCC NO.M2013501。利用该解淀粉芽胞杆菌制备的微生物菌剂应用于盐碱地改良、增加植物耐旱性、防治小麦纹枯病和黄瓜枯萎病，对能否用于水产养殖未提及。

CN 103865839 B公开了一种应用于水产养殖的由花域芽胞杆菌制成的制剂，该制剂用于海参、虾、鲍鱼或鱼养殖中的预防疾病、提高饲料转化率或净化养殖水质。对能否用于淡水鱼类疾病的防治效果未提及。

现有微生态制剂在运输、使用和保存过程中易失活，稳定性差，从而降低其生物活性作用；有些菌株进入消化道后，不能有效抵抗盐酸、胆汁酸等的作用，从而无法长时间定植肠道发挥功能；微生态制剂预防效果好于治疗效果，但作用慢，需长时间连续使用，费用相应增加。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株新的解淀粉芽胞杆菌，使用该解淀粉芽胞杆菌制备的微生态制剂，稳定性好，被鱼体吸收后，能够迅速抑制鱼类病原菌的生长，对草鱼、鲫鱼等淡水鱼类的抗嗜水气单胞菌感染防治效果尤其显著。

本发明进一步要解决的技术问题是，提供一种适用于水产养殖进行鱼类疾病防治的微生态制剂及其制备方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一株解淀粉芽胞杆菌，从健康草鱼肠道中分离得到，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M2018266，分类命名为：解淀粉芽胞杆菌BaY002；拉丁文学名：Bacillus amyloliquefaciensBaY002。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种适用于水产养殖的微生态制剂，由菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018266的解淀粉芽胞杆菌发酵制成，其中所含抑菌活性物质，经超高效液相色谱分离纯化、质谱鉴定，其相对分子量为1045.29。

本发明所述解淀粉芽胞杆菌BaY002发酵制成的微生态制剂中的抑菌活性物质能够抑制鱼类病原菌的生长，同时，该微生态制剂中的抑菌活性物质的理化性质对蛋白酶不敏感，稳定性好。

进一步，所述解淀粉芽胞杆菌BaY002微生态制剂为液体制剂或固体制剂。

进一步，所述水产养殖的动物为淡水鱼类。

进一步，所述淡水鱼类为草鱼、鲫鱼或鲤鱼。

本发明更进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）接种活化：将解淀粉芽胞杆菌BaY002保藏斜面菌种转接到活化斜面培养基上活化培养过夜，得到活化好的种子液；所述活化斜面培养基为LB摇瓶种子培养基，所述LB摇瓶种子培养基的配方：蛋白胨5～10 g/L；酵母粉1～5 g/L；氯化钠5～10 g/L；活化培养的条件：发酵温度30～40℃，装液量为容器体积的10～30％，摇床转速100～150rpm；

（2）第一次扩大培养：将步骤（1）所述活化好的种子液按1-1.5%的接种量接种到培养基装液量为70-75%的50 L发酵罐中进行第一次扩大培养，所述第一次扩大培养的发酵培养基配方：葡萄糖15～20 g/L、豆粕粉30～40 g/L、玉米粉35～50 g/L、蛋白胨 10～20 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01～0.015 g/L、KH₂PO₄ 1～5 g/L、NaCl 1～5g/L；第一次扩大培养的培养条件：整个培养过程在线监控，溶氧浓度35%～55%，温度30～40℃，培养12～15h，实时在线补加消泡剂，OD₆₀₀为3.0～5.0；

（3）第二次扩大培养：将步骤（2）所述第一次扩大培养所得种子液按8-10%接种量接种到培养基装液量为70-75%的500 L发酵罐中，第二次扩大培养的发酵培养基配方同步骤（2）所述第一次扩大培养的发酵培养基配方；第二次扩大培养的培养条件：溶氧浓度35%～55%，温度30～40℃，培养48～64 h，实时在线补加消泡剂；

（4）浓缩收集：放罐后，浓缩，收集，得到微生态液体制剂；或陶瓷膜过滤并喷雾干燥后得到微生态固体制剂。

本发明之解淀粉芽胞杆菌分离鉴定和研究方法如下：

（一）拮抗菌的细胞形态学特征观察；

（二）利用16S rRNA和gyrB基因进行鉴定；

（三）解淀粉芽胞杆菌抑菌活性物质的理化性质及分离鉴定；

（四）解淀粉芽胞杆菌BaY002菌剂的制备；

（五）解淀粉芽胞杆菌BaY002菌剂拌入饲料中投喂、或者泼洒到养殖鱼塘水体中和注射到鱼体内。

本发明者研究发现，解淀粉芽胞杆菌能定殖于宿主体内是发挥作用的关键，进入淡水鱼类体内后，在鱼体内与鱼类病原菌如鱼源强毒株嗜水气单胞菌相互作用时能够通过与病原菌抢占生态位点、生长繁殖空间和争夺营养，从而使鱼类病原菌的生长处于劣势，从而抑制病原菌的生长。其次，解淀粉芽胞杆菌抑制鱼类病原菌的主要机制为在生长过程中产生一些具有抑菌活性的次级代谢产物，从而抑制病原菌增殖。

本发明所述适用于水产养殖的微生态制剂用法：用解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生态制剂可采用饲料添加、水体泼洒和腹腔注射等方式使用。

本发明有益效果：（1）经16S rRNA基因和gyrB基因序列测定鉴定的解淀粉芽胞杆菌BaY002，对嗜水气单胞菌的拮抗效果好；（2）利用解淀粉芽胞杆菌菌株BaY002发酵制成的微生态制剂在水产养殖进行鱼类疾病防治的应用，该微生态制剂在鱼体肠道内均能较长时期定殖，且能有效抑制嗜水气单胞菌在鱼体内的生长繁殖，排除嗜水气单胞菌在鱼体肠道内生长；采用饲料添加、水体泼洒或腹腔注射等给药方式，对草鱼的保护率分别达到70%～80 %、60%～70%和85%～90%，作用鱼体后能有效对抗嗜水气单胞菌对草鱼、鲫鱼等淡水鱼类的感染。

生物材料保藏情况说明

本发明之解淀粉芽胞杆菌菌株于2018年5月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉 武汉大学）；菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018266；分类命名为：解淀粉芽胞杆菌BaY002；拉丁文学名：Bacillus amyloliquefaciens BaY002。

附图说明

图1 是本发明解淀粉芽胞杆菌BaY002对鱼类病原菌抑菌效果观察图；

图2 是本发明解淀粉芽胞杆菌BaY002细胞形态学观察图；

图3 是本发明解淀粉芽胞杆菌BaY002菌体扫描电镜观察图；

图4 是本发明解淀粉芽胞杆菌BaY002抑菌活性物质热稳定性观察图；

图5 是本发明解淀粉芽胞杆菌BaY002抑菌活性物质酸碱耐受性观察图；

图6 是本发明解淀粉芽胞杆菌BaY002发酵液高效液相色谱分离纯化特征图；

图7 是本发明解淀粉芽胞杆菌BaY002中活性物质抑菌活性峰的确定图；

图8 是本发明解淀粉芽胞杆菌BaY002中活性物质抑菌活性峰高效液相色谱精细纯化图；

图9 是本发明解淀粉芽胞杆菌BaY002中活性物质抑菌活性物质的确定图；

图10 是本发明解淀粉芽胞杆菌BaY002中抑菌活性物质的LC-MS一级质谱分析图；

图11是本发明解淀粉芽胞杆菌BaY002中抑菌活性物质的LC-MS二级质谱分析图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”（Microbiology Culture Media Manual）的记载制备得到，所用试剂均通过常规商业途径获得。

本发明之解淀粉芽胞杆菌从健康草鱼肠道中分离得到，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018266，分类命名为：解淀粉芽胞杆菌BaY002；拉丁文学名Bacillus amyloliquefaciens BaY002。

本发明之适用于水产养殖的微生态制剂，由菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018266的解淀粉芽胞杆菌发酵制成，其中所含抑菌活性物质，经超高效液相色谱分离纯化、质谱鉴定，其相对分子量为1045.29。由解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生态制剂中的抑菌活性物质能够抑制鱼类病原菌的生长，同时，该菌株发酵液中的抑菌活性物质的理化性质对蛋白酶不敏感，稳定性好。

本发明之解淀粉芽胞杆菌分离鉴定和研究方法实施例包括以下步骤：

（一）拮抗菌的细胞形态学特征

从20份草鱼肠道样品中分离得到的105株菌，筛选其中一株拮抗效果好的优良菌株（参见图1），命名为BaY002，该菌株在LB平板上菌落呈圆形、表面湿润、边缘齐整的乳白色，菌体为产芽胞的革兰阳性细菌（参见图2），菌体细胞特征为长杆状（参见图3）。

（二）利用16S rRNA基因和gyrB基因的扩增与测序

菌株于30 ℃振荡摇床培养12 h，利用细菌基因组提取试剂盒（上海生工生物技术有限公司生产）提取细菌基因组，利用16S rRNA基因扩增引物：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

gyrB基因扩增引物序列为：

UP1：

5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′

UP2R：

5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTC

N GTCAT-3′

以上述引物扩增菌株对应的基因序列，序列预期长度分别为1500 bp和1200 bp。

PCR反应体系（20 μL）：2 μL Ex Taq Buffer（10×），1.6 μL dNTP Mixture（2.5mmol/L），上游引物0.6 μL（10 μmol/L）、下游引物 0.6 μL（10 μmol/L），模板 1 μL，0.2 μLTaKaRa Ex Taq（5 U/μL），14 μL H2O。

PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；30个循环：95 ℃，45 sec；55 ℃，45 sec；72℃，1.5 min；72 ℃，10 min。

16S rRNA基因和gyrB基因PCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测并回收。然后将纯化后的PCR产物用pMD-18T vector进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行氨苄抗性筛选，挑取阳性转化子后提取质粒送上海生工生物技术有限公司测序。

对测序结果经BLAST比对分析，发现该新菌株BaY002的16S rRNA基因和gyrB基因的碱基序列与已公布的解淀粉芽胞杆菌的序列存在差异，同源性均为99.0%。

（三）解淀粉芽胞杆菌BaY002抑菌活性物质理化性质及分离鉴定

（1）热稳定性

将解淀粉芽胞杆菌BaY002菌株 48 h发酵上清液（12000 rpm，离心30 min）分别经40℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、100 ℃处理1 h后，各取10 μL用于抑菌试验（参见图4）。

（2）酸碱耐受性

将解淀粉芽胞杆菌BaY002 48 h发酵上清液（12000 rpm，离心30 min）分别经pH梯度为1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13处理1 h后，pH调回中性之后，各取10 μL用于抑菌试验（参见图5）。

（3）抑菌活性物质分离及鉴定

取解淀粉芽胞杆菌BaY002 48 h发酵上清液（12000 rpm，离心30 min），用稀盐酸溶液调节pH至2.0，4 ℃冰箱过夜，离心收集沉淀，用甲醇抽提之后再用稀氢氧化钠溶液调节pH至7.0，然后在冷冻干燥机中冻干，之后用50%甲醇复溶，过滤之后利用超高效液相色谱（Agilent 1290 Infinity；柱子为ZORBAX SB-C18（4.6×150 mm， 5 μm））初步分离（参见图6）。流动相为ddH₂O和乙腈，流速0.5 mL/min，色谱洗脱程序为：0～20 min乙腈5%～100%，20～22 min乙腈100%，22～24 min乙腈100%～5%，24～25 min乙腈5%，检测波长分别为235nm、250 nm、275 nm。将收集到的组分在真空浓缩仪中冻干，除去乙腈，加入50%甲醇溶解，然后进行抑菌活性检测（参见图7）。

对初步分离有抑菌活性的峰（A5）在超高效液相色谱上利用修改的洗脱程序进一步分离，检测波长为275 nm，得到洗脱峰B1、B2 （参见图8）。对收集的峰冻干复溶之后进行抑菌试验（参见图9）。

超高效液相色谱仪上分离解淀粉芽胞杆菌活性峰B2，浓缩10倍，LTQ-XL质谱仪对B2进行鉴定，结果显示，该抑菌活性物质荷为1045.29[M-H]-(m/z)，可知其分子量为1045.29（参见图10）。结合二级质谱图发现B2离子峰所裂解出的碎片离子较多（参见图11），可推知B2化合物较稳定。

（四）利用解淀粉芽胞杆菌BaY002制备微生态制剂的方法，包括以下步骤：

（1）接种活化：将解淀粉芽胞杆菌BaY002保藏斜面菌种转接到活化斜面培养基上活化培养过夜，得到活化好的种子液；所述活化斜面培养基为LB摇瓶种子培养基，所述LB摇瓶种子培养基的配方为：蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；氯化钠10 g/L，活化培养条件：发酵温度30℃，装液量为容器体积的15％，摇床转速125rpm；

（2）第一次扩大培养：将步骤（1）所述活化好的种子液按1%的接种量接种到装液量为70%的50 L发酵罐中进行第一次扩大培养，所述第一次扩大培养的发酵培养基配方为：葡萄糖15 g/L、豆粕粉30 g/L、玉米粉35 g/L、蛋白胨 10g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L、KH₂PO₄ 1g/L、NaCl 1g/L；第一次扩大培养的培养条件：整个培养过程在线监控，溶氧浓度为50%，温度为30 ℃，培养12h，实时在线补加消泡剂，OD₆₀₀为4.0；

（3）第二次扩大培养：将步骤（2）所述扩大培养所得种子液按10%接种量接种到装液量为70%的500 L发酵罐中进行第二次扩大培养，第二次扩大培养发酵培养基配方同步骤（2）第一次扩大培养发酵培养基配方；第二次扩大培养的培养条件：溶氧浓度为50%，温度为30℃，培养48 h，实时在线补加消泡剂；

（4）浓缩收集：放罐后，浓缩，收集，即得到微生态液体制剂。

（五）通过上述实施例所得到的解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生物制剂在水产养殖应用领域效果分析

应用实例1：将上述实施例所得到的解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生物制剂经饲料添加的给药方式对鱼类嗜水气单胞菌病的防治效果分析，包括以下步骤：

（1）将健康草鱼（体重48±13g）随机分成三组，每组50条。试验采用曝气72 h的自来水，水温控制在20 ℃～23 ℃，试验开始前暂养草鱼停食48 h。从市场上购买的膨化鱼饲料（大北农）进行灭菌烘干后，按1×10⁹ cfu/g、1×10¹⁰ cfu/g添加到饲料中，试验采用饲料添加的方式使解淀粉芽胞杆菌进入鱼体，饲料饲喂量按照鱼体重1%进行投喂，每天投喂2次。

（2）试验设计为：第一组：喂食灭菌的鱼饲料，第二组：喂食添加了1×10⁹ cfu/g的饲料，第三组：喂食添加了1×10¹⁰ cfu/g的饲料；喂养30 d后，向与体内注射2.2×10⁸ cfu/mL的嗜水气单胞菌，每尾0.2 mL，

（3）结果分析：观察统计鱼死亡数（表1），从表1可知通过上述实施例所得到的解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生物制剂在对草鱼的保护率达到70%～80%，被鱼体吸收后能够快速抑制病原菌的繁殖。

表1 解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生物制剂经饲料添加的给药方式对草鱼的保护力结果

注：表格中数据为累计死亡率。

应用实例2：将上述实施例所得到的解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生物制剂经水体泼洒方式对鱼类嗜水气单胞菌病的防治效果分析，包括以下步骤：

（1）将试验用的健康草鱼（体重35±8g）随机分四组，每组50条。试验采用曝气72 h的自来水，水温控制在20 ℃～23 ℃，试验开始前暂养草鱼停食48 h，试验采用养殖水体泼洒的方式使解淀粉芽胞杆菌进入鱼体，每天泼洒两次。

第一组：将解淀粉芽胞杆菌BaY002稀释，然后添加到养殖水体中，使终浓度控制在1×10⁷ cfu/mL，泼洒周期为6天，第7天时向草鱼体内注射浓度为8.6×10⁸ cfu/mL的嗜水气单胞菌，注射剂量为0.2 mL /尾。第二组：将解淀粉芽胞杆菌BaY002稀释到一定浓度，然后添加到养殖水体中，使终浓度控制在1×10⁷ cfu/mL，泼洒周期为7天。第三组：前6天不做任何处理，第7天向草鱼体内注射浓度为8.6×10⁸ cfu/mL的嗜水气单胞菌，注射剂量为0.2mL /尾。第四组：前6天不做任何处理，第7天向草鱼体内注射浓度为0.65 %的生理盐水，注射剂量为0.2 mL /尾，

连续观察数天并统计鱼死亡数（表2），从表2可知通过上述实施例所得到的解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生物制剂对草鱼的保护率达到60%～70%，被鱼体吸收后能够快速抑制病原菌的繁殖。

表2 解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生物制剂经水体泼洒的给药方式对草鱼的保护力结果

注：1、2、3、4、5、6、7代表时间（天）。

应用实例3：将上述实施例所得到的解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生物制剂解淀粉芽胞杆菌通过腹腔注射方式对鱼类嗜水气单胞菌病的防治效果分析，包括以下步骤：

（1）将健康草鱼（体重52±18 g）随机分成四组，每组50条。试验采用曝气72 h的自来水，水温控制在20 ℃～23 ℃，试验开始前暂养草鱼停食48 h，试验采用注射的方式使解淀粉芽胞杆菌进入鱼体，每天注射一次。

（2）第一组：将浓度为5×108 cfu/mL的解淀粉芽胞杆菌菌体注射到草鱼体内，注射3天，注射剂量为0.2 mL /尾。第4天将浓度为2.2×10⁸ cfu/mL的嗜水气单胞菌注射到草鱼体内，注射剂量为0.2 mL /尾。第二组：将浓度为5×10⁸ cfu/mL的解淀粉芽胞杆菌菌株注射到草鱼体内，注射4天，注射剂量为0.2 mL /尾。第三组：前3天注射0.65 % 生理盐水，注射剂量为0.2 mL /尾，第四天向草鱼体内注射浓度为2.2×10⁸ cfu/mL的嗜水气单胞菌，注射剂量为0.2 mL /尾。第四组：向草鱼体内注射浓度为0.65 %的生理盐水，注射4天，注射剂量为0.2 mL /尾，

（3）连续观察4天，统计结果见表3，从表3可知通过上述实施例所得到的解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生物制剂对草鱼的保护率达到80%～90%，被鱼体吸收后能够快速抑制病原菌的繁殖。

表3 解淀粉芽胞杆菌BaY002制备的微生物制剂腹腔注射方式对草鱼的保护力结果

注：注射剂量均为200 μL，1、2、3、4代表时间（天）。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一株解淀粉芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> 解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )

<400> 1

gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag 60

gcccgggaac gtattcaccg cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt ccagcttcac 120

gcagtcgagt tgcagactgc gatccgaact gagaacagat ttgtgggatt ggcttaacct 180

cgcggtttcg ctgccctttg ttctgtccat tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg 240

ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag 300

agtgcccaac tgaatgctgg caactaagat caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc 360

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cgatcaccct ctcaggtcgg ctacgcatcg tcgccttggt gagccgttac ctcaccaact 1200

agctaatgcg ccgcgggtcc atctgtaagt ggtagccgaa gccacctttt atgtctgaac 1260

catgcggttc aaacaaccat ccggtattag ccccggtttc ccggagttat cccagtctta 1320

caggcaggtt acccacgtgt tactcacccg tccgccgcta acatcaggga gcaagctccc 1380

atctgtccgc tcgact 1396

<210> 2

<211> 1409

<212> DNA

<213> 解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )

<400> 2

gtaaaagaat tgggacgtat tacgactcac tatagggcga catatgatcg atgatatccc 60

atgggcggcc gcctgcagac caggtctgaa gtcatcatga ccgttctgca tgccggaggt 120

aagttcgacg gaagcggata taaagtatcc ggcggtcttc acggtgtagg ggcgtccgtc 180

gtaaacgcct tgtcgaccac tcttgacgtt acggttcatc gtgacggaaa aatccattat 240

caggcgtacg agcgcggtgt acctgtggcc gatcttgaag tgatcggcga aactgataag 300

accggaacga ttacgcactt cgttccggac ccggaaattt tcaaagaaac aactgtatat 360

gactatgatc tgctttcaaa ccgtgtccgg gaattggcct tcctgacaaa aggcgtaaac 420

atcacgattg aagacaaacg tgaaggacaa gaacggaaaa acgagtacca ctacgaaggc 480

ggaatcaaaa gctatgttga gtacttaaac cgttccaaag aagtcgttca tgaagagccg 540

atttatatcg aaggcgagaa agacggcata acggttgaag ttgcattgca atacgacgac 600

agctatacaa gcaatattta ttctttcaca aataatatca acacatacga aggcggcacg 660

cacgaggccg gatttaaaac cggtctgacc cgtgtcataa acgactatgc aagaagaaaa 720

gggattttca aagaaaatga tccgaattta agcggggatg atgtgagaga agggctgact 780

gccattattt caattaagca ccctgatccg caattcgaag ggcagacgaa aacgaagctc 840

ggcaactccg aagcgagaac gatcactgat acgctgtttt cttctgcgct ggaaacattc 900

cttcttgaaa atccggactc agcccgcaaa atcgttgaaa aaggtttaat ggccgcaaga 960

gcgcggatgg cagcgaaaaa agcccgggaa ttgacccgcc gcaaaagtgc gcttgagatt 1020

tccaatctgc cgggcaaact ggcggactgt tcttctaaag atccgagcat ttccgagctg 1080

tatatcgtag agggtgactc tgcgggcgga tcagcgaaac agggacggga ccgtcatttc 1140

caagccattc tgccgctgcg cggtaagatt ctgaacgttg agaaagccag acttgataag 1200

attctctcaa acaatgaggt cagatcaatg atcacggccc tcggaacagg aatcggagaa 1260

gattttaatc ttgaaaaagc gcgttatcat aaagtggtca tcatgaccga cgctgacgtc 1320

gatggctcgc acatccgtac cctgctaaga ctggagatct ggatccctcg agtctagagt 1380

cgacctgcag gccttgccag ggaataccc 1409

Claims (6)

1.一株解淀粉芽胞杆菌，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018266，分类命名为：解淀粉芽胞杆菌BaY002；拉丁文学名Bacillus amyloliquefaciens BaY002。

2.一种适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，由权利要求1所述菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018266的解淀粉芽胞杆菌BaY002发酵制成，所述微生态制剂中的抑菌活性物质的相对分子量为1045.29。

3.根据权利要求2所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂为液体制剂或固体制剂。

4.根据权利要求2或3所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述水产养殖的动物为淡水鱼类。

5.根据权利要求4所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述淡水鱼为草鱼、鲫鱼或鲤鱼。

6.一种如权利要求2或3所述适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）接种活化：将解淀粉芽胞杆菌BaY002保藏斜面菌种转接到活化斜面培养基上活化培养过夜，得到活化好的种子液；所述活化斜面培养基为LB摇瓶种子培养基，所述LB摇瓶种子培养基的配方：蛋白胨5～10 g/L；酵母粉1～5 g/L；氯化钠5～10 g/L；活化培养的条件：发酵温度30～40℃，装液量为容器体积的10～30％，摇床转速100～150rpm；

（2）第一次扩大培养：将步骤（1）所述活化好的种子液按1～1.5%的接种量接种到培养基装液量为70～75%的50 L发酵罐中进行第一次扩大培养，所述第一次扩大培养的发酵培养基配方：葡萄糖15～20 g/L、豆粕粉30～40 g/L、玉米粉35～50 g/L、蛋白胨 10～20 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01～0.015 g/L、KH₂PO₄ 1～5 g/L、NaCl 1～5 g/L；第一次扩大培养的培养条件：整个培养过程在线监控，溶氧浓度35%～55%，温度30～40℃，培养12～15h，实时在线补加消泡剂，OD₆₀₀为3.0～5.0；

（3）第二次扩大培养：将步骤（2）所述第一次扩大培养所得种子液按8～10%接种量接种到培养基装液量为70～75%的500 L发酵罐中，第二次扩大培养的发酵培养基配方同步骤（2）所述第一次扩大培养的发酵培养基配方；第二次扩大培养的培养条件：溶氧浓度35%～55%，温度30～40℃，培养48～64 h，实时在线补加消泡剂；

（4）浓缩收集：放罐后，浓缩，收集，得到微生态液体制剂；或陶瓷膜过滤并喷雾干燥，得到微生态固体制剂。