[go: up one dir, main page]

CN107354190A - 利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法 - Google Patents

利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107354190A
CN107354190A CN201710608545.4A CN201710608545A CN107354190A CN 107354190 A CN107354190 A CN 107354190A CN 201710608545 A CN201710608545 A CN 201710608545A CN 107354190 A CN107354190 A CN 107354190A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibacterial peptide
prepared
bacillus licheniformis
glucose
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201710608545.4A
Other languages
English (en)
Inventor
蒋顺进
方文棋
黄炜乾
唐谢芳
张文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Rongda Biological Co Ltd
Original Assignee
Guangdong Rongda Biological Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Rongda Biological Co Ltd filed Critical Guangdong Rongda Biological Co Ltd
Priority to CN201710608545.4A priority Critical patent/CN107354190A/zh
Publication of CN107354190A publication Critical patent/CN107354190A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法。本发明通过斜面菌活化、摇瓶培养、种子培养、发酵培养、发酵液预处理以及喷雾干燥、筛分和包装等生产工艺制备得到的抗菌肽具有较高的抗菌活性，并且本发明工艺成本低，能够实现抗菌肽的规模化生产。

Description

利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法。
背景技术
抗菌肽是一类生物体内经诱导产生的具有生物活性的小分子多肽，具有广谱杀菌作用。天然的抗菌肽，已发现有A、B及D等多种。这类活性多肽多具有较好的耐酸碱性、热稳定性、以及广谱抗菌等特性。抗菌肽对细菌有很强的杀伤作用，尤其是对某些耐药性病原菌具有很强的杀灭作用。与传统抗生素相比，抗菌肽最大的特点在于其杀菌机理是其疏水性端螺旋直接插入细菌菌胞膜内而形成孔道，将细菌内容物泄出胞外而造成细菌死亡，具有作用迅速、对耐药菌有效且细菌不易产生耐药性的优良特点。
芽孢杆菌是一类需氧或兼性厌氧G+(目前也发现有G-)，在一定条件下能产生抗逆性内生孢子的化能异养菌。在自然界分布非常广泛，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。它可产生多种抗生素，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类物质，对多种动、植物及人类病原菌起到很好的抑制作用。而且芽孢杆菌还具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性。因此，芽孢杆菌被广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业。地衣芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，在生长代谢过程中能够产生多种抗菌物质，包括非核糖体合成的脂肽类抗生素、核糖体合成的羊毛硫抗生素和抗菌蛋白。这些抗菌物质在抑制细菌、真菌和酵母污染方面具有重要应用。在食品、医药、化工和防治植物病害等方面也有重要的应用价值。中国专利(CN103772490B)公开了一种地衣芽孢杆菌分泌的抗菌肽及其制备方法和应用。所述的抗菌肽氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示，分子量为1290.4道尔顿，等电点5.23。其制备方法是：硫酸铵沉淀培养基中地衣芽孢杆菌分泌的的抗菌肽，利用阴离子交换、分子筛层析和反向高效液相色谱法纯化抗菌肽。该抗菌肽具有显著的抗菌活性，且不会对猪的红细胞产生溶血作用，可用于开发制备饲用抗菌药物。
但利用地衣芽孢杆菌大规模发酵生产抗菌肽的报道较少，且抗菌活性低，甚至无抗菌活性。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法。本发明通过斜面菌活化、摇瓶培养、种子培养、发酵培养、发酵液预处理以及喷雾干燥、筛分和包装等生产工艺制备得到的抗菌肽具有较高的抗菌活性，并且本发明工艺成本低，能够实现抗菌肽的规模化生产。
本发明通过以下技术方案实现：
一种利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，包括如下步骤：
S1.斜面菌活化：取抗菌肽生产菌株地衣芽孢杆菌接种在斜面培养基上，25℃～40℃条件下培养10～30h；
S2.摇瓶培养：向步骤S1培养好的斜面培养基中加入1～10mL无菌水制备菌悬液，取1～3mL菌悬液接种至含有50mL的YPD培养基的摇瓶中，25℃～35℃、250r/min培养15～25h；YPD培养基，以质量百分比计，配方为：1～8％酵母粉，1～8％蛋白胨，1～8％葡萄糖，pH自然；
S3.种子培养：将一级种子罐培养基灭菌后，接种步骤S2中所制备的种子液；在接种量为0.1％～2％，发酵温度为20℃～40℃，搅拌转速180-220转/min，通风量为10～20L/min，溶氧为10～50％，发酵液pH值为6.0培养条件下培养10～30h，当种子罐发酵液中残糖量为0.1～2.0％时流加50％葡萄糖；
S4.发酵培养：以4～8％体积比的接种量接种步骤S3所制备的一级种子罐培养液于含20L发酵培养基的50L发酵罐中，在发酵温度为20℃～50℃，罐压为0.001～1Mpa，搅拌转速为100～400r/min，通风量为10～30L/min，溶氧为10～50％，pH3.0～8.0的条件下发酵80～100h，当发酵罐发酵液中残糖量为0.01～3.0％时，流加50％葡萄糖溶液；
S5.发酵液预处理：调节步骤S4发酵液pH值至6.0～6.7并将发酵液加热至40～60℃，加入50～100mg/L壳聚糖，待絮凝体产生后，50r/min搅拌5min，静置30～50min后将上清液首先通过截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，待料液浓缩8～10倍后，收集得到的滤液再经截留分子量为1000Da的超滤膜超滤浓缩，得浓缩液；
S6.喷雾干燥：将步骤S5制得的浓缩滤液进行喷雾干燥，得抗菌肽粉剂；
S7.将步骤S6制得的抗菌肽粉剂进行筛分包装，即得。
优选地，所述利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，包括如下步骤：
S1.斜面菌活化：取抗菌肽生产菌株地衣芽孢杆菌接种在斜面培养基上，35℃条件下培养18h；
S2.摇瓶培养：向步骤S1培养好的斜面培养基中加入5mL无菌水制备菌悬液，取2.5mL菌悬液接种至含有50mL的YPD培养基的摇瓶中，35℃、250r/min培养20h；YPD培养基，以质量百分比计，配方为：5％酵母粉，5％蛋白胨，4％葡萄糖，pH自然；
S3.种子培养：将一级种子罐培养基灭菌后，接种步骤S2中所制备的种子液；在接种量为0.8％，发酵温度为35℃，搅拌转速200转/min，通风量为15L/min，溶氧为20％，发酵液pH值为6.0培养条件下培养20h，当种子罐发酵液中残糖量为1.2％时流加50％葡萄糖；
S4.发酵培养：以5％体积比的接种量接种步骤S3所制备的一级种子罐培养液于含20L发酵培养基的50L发酵罐中，在发酵温度为36℃，罐压为0.8Mpa，搅拌转速为360r/min，通风量为25L/min，溶氧为30％，pH5.5的条件下发酵96h，当发酵罐发酵液中残糖量为1.5％时，流加50％葡萄糖溶液；
S5.发酵液预处理：调节步骤S4发酵液pH值至6.5并将发酵液加热至55℃，加入85mg/L壳聚糖，待絮凝体产生后，50r/min搅拌5min，静置45min后将上清液首先通过截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，待料液浓缩9倍后，收集得到的滤液再经截留分子量为1000Da的超滤膜超滤浓缩，得浓缩液；
S6.喷雾干燥：将步骤S5制得的浓缩滤液进行喷雾干燥，得抗菌肽粉剂；
S7.将步骤S6制得的抗菌肽粉剂进行筛分包装，即得。
优选地，步骤S1所述斜面培养基，以质量百分比计，配方为：酵母粉1～8％，蛋白胨1～8％，葡萄糖1～8％，琼脂粉1～8％，pH自然。
进一步地，步骤S1所述斜面培养基，以质量百分比计，配方为：酵母粉4.5％，蛋白胨5％，葡萄糖6％，琼脂粉2％，pH自然。
优选地，所述YPD培养基中还含有100μg/mL的zeocin。
优选地，所述步骤S4发酵培养基配方为葡萄糖1～5g/dL，蛋白胨0.5～4g/dL，酵母粉0.1～2g/dL，NH4H2PO4 1～10g/dL，K2SO4 1～10g/dL，MgSO4 7H2O 0.5～5g/dL，KH2PO4 0.1～3g/dL，CaSO4 0.001～0.5g/dL，KOH 0.5～3g/dL，PTM1 0.01～2g/dL。
进一步地，所述步骤S4发酵培养基配方为葡萄糖3g/dL，蛋白胨2.5g/dL，酵母粉1.5g/dL，NH4H2PO4 4g/dL，K2SO4 6g/dL，MgSO4 7H2O 3.5g/dL，KH2PO4 0.8g/dL，CaSO40.15g/dL，KOH 2.5g/dL，PTM1 0.25g/dL。
优选地，步骤S4流加50％葡萄糖溶液中还含有含1.2％的PTM1。
与现有技术相比，本发明的主要技术优势为：
(1)本发明通过优化培养基构成，有效促进了地衣芽孢杆菌分泌抗菌肽，实现了抗菌肽的规模化、产业化生产；
(2)本发明工艺生产得到的抗菌肽抑菌效果好，性质稳定，为抗菌肽的推广应用奠定了基础。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
Zeocin购于上海前尘生物科技有限公司；PTM1购于南京森贝伽生物科技有限公司。
实施例1一种利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法
所述利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，包括如下步骤：
S1.斜面菌活化：取抗菌肽生产菌株地衣芽孢杆菌接种在斜面培养基上，35℃条件下培养18h；所述斜面培养基，以质量百分比计，配方为：酵母粉4.5％，蛋白胨5％，葡萄糖6％，琼脂粉2％，pH自然；
S2.摇瓶培养：向步骤S1培养好的斜面培养基加入5mL无菌水制备菌悬液，取2.5mL菌悬液接种至含有50mL的YPD培养基的摇瓶中，35℃、250r/min培养20h；YPD培养基，以质量百分比计，配方为：5％酵母粉，5％蛋白胨，4％葡萄糖，pH自然；所述YPD培养基中还含有100μg/mL的zeocin；
S3.种子培养：将一级种子罐培养基灭菌后，接种步骤S2中所制备的种子液；在接种量为0.8％，发酵温度为35℃，搅拌转速200转/min，通风量为15L/min，溶氧为20％，发酵液pH值为6.0培养条件下培养20h，当种子罐发酵液中残糖量为1.2％时流加50％葡萄糖；
S4.发酵培养：以5％体积比的接种量接种步骤S3所制备的一级种子罐培养液于含20L发酵培养基的50L发酵罐中，在发酵温度为36℃，罐压为0.8Mpa，搅拌转速为360r/min，通风量为25L/min，溶氧为30％，pH5.5的条件下发酵96h，当发酵罐发酵液中残糖量为1.5％时，流加50％且含有1.2％PTM1的葡萄糖溶液；发酵培养基配方为葡萄糖3g/dL，蛋白胨2.5g/dL，酵母粉1.5g/dL，NH4H2PO4 4g/dL，K2SO4 6g/dL，MgSO4 7H2O 3.5g/dL，KH2PO4 0.8g/dL，CaSO4 0.15g/dL，KOH 2.5g/dL，PTM1 0.25g/dL。
S5.发酵液预处理：调节步骤S4发酵液pH值至6.5并将发酵液加热至55℃，加入85mg/L壳聚糖，待絮凝体产生后，50r/min搅拌5min，静置45min后将上清液首先通过截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，待料液浓缩9倍后，收集得到的滤液再经截留分子量为1000Da的超滤膜超滤浓缩，得浓缩液；
S6.喷雾干燥：将步骤S5制得的浓缩液进行喷雾干燥，得抗菌肽粉剂；
S7.将步骤S6制得的抗菌肽粉剂进行筛分包装，即得。
实施例2一种利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法
所述利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，包括如下步骤：
S1.斜面菌活化：取抗菌肽生产菌株地衣芽孢杆菌接种在斜面培养基上，25℃条件下培养10h；所述斜面培养基，以质量百分比计，配方为：酵母粉1％，蛋白胨8％，葡萄糖8％，琼脂粉1％，pH自然；
S2.摇瓶培养：向步骤S1培养好的斜面培养基加入1mL无菌水制备菌悬液，取1mL菌悬液接种至含有50mL的YPD培养基的摇瓶中，25℃、250r/min培养15h；YPD培养基，以质量百分比计，配方为：1％酵母粉，8％蛋白胨，8％葡萄糖，pH自然；所述YPD培养基中还含有100μg/mL的zeocin；
S3.种子培养：将一级种子罐培养基灭菌后，接种步骤S2中所制备的种子液；在接种量为0.1％，发酵温度为20℃，搅拌转速180转/min，通风量为10L/min，溶氧为10％，发酵液pH值为6.0培养条件下培养10h，当种子罐发酵液中残糖量为0.1％时流加50％葡萄糖；
S4.发酵培养：以4％体积比的接种量接种步骤S3所制备的一级种子罐培养液于含20L发酵培养基的50L发酵罐中，在发酵温度为20℃，罐压为0.001Mpa，搅拌转速为100r/min，通风量为10L/min，溶氧为10％，pH3.0的条件下发酵80h，当发酵罐发酵液中残糖量为0.01％时，流加50％且含有1.2％PTM1的葡萄糖溶液；发酵培养基配方为葡萄糖1g/dL，蛋白胨4g/dL，酵母粉0.1g/dL，NH4H2PO4 10g/dL，K2SO4 1～g/dL，MgSO4 7H2O 0.5g/dL，KH2PO43g/dL，CaSO4 0.001g/dL，KOH 3g/dL，PTM1 0.01g/dL；
S5.发酵液预处理：调节步骤S4发酵液pH值至6.0并将发酵液加热至40℃，加入50mg/L壳聚糖，待絮凝体产生后，50r/min搅拌5min，静置30min后将上清液首先通过截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，待料液浓缩8倍后，收集得到的滤液再经截留分子量为1000Da的超滤膜超滤浓缩，得浓缩液；
S6.喷雾干燥：将步骤S5制得的浓缩滤液进行喷雾干燥，得抗菌肽粉剂；
S7.将步骤S6制得的抗菌肽粉剂进行筛分包装，即得。
实施例3一种利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法
一种利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，包括如下步骤：
S1.斜面菌活化：取抗菌肽生产菌株地衣芽孢杆菌接种在斜面培养基上，40℃条件下培养30h；所述斜面培养基，以质量百分比计，配方为：酵母粉8％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，琼脂粉1％，pH自然；
S2.摇瓶培养：向步骤S1培养好的斜面培养基中加入10mL无菌水制备菌悬液，取3mL菌悬液接种至含有50mL的YPD培养基的摇瓶中，35℃、250r/min培养25h；YPD培养基，以质量百分比计，配方为：8％酵母粉，1％蛋白胨，8％葡萄糖，pH自然；所述YPD培养基中还含有100μg/mL的zeocin；
S3.种子培养：将一级种子罐培养基灭菌后，接种步骤S2中所制备的种子液；在接种量为2％，发酵温度为40℃，搅拌转速220转/min，通风量为20L/min，溶氧为50％，发酵液pH值为6.0培养条件下培养30h，当种子罐发酵液中残糖量为2.0％时流加50％葡萄糖；
S4.发酵培养：以8％体积比的接种量接种步骤S3所制备的一级种子罐培养液于含20L发酵培养基的50L发酵罐中，在发酵温度为50℃，罐压为1Mpa，搅拌转速为400r/min，通风量为30L/min，溶氧为50％，pH8.0的条件下发酵100h，当发酵罐发酵液中残糖量为3.0％时，流加50％且含有1.2％PTM1的葡萄糖溶液；发酵培养基配方为葡萄糖5g/dL，蛋白胨0.5g/dL，酵母粉2g/dL，NH4H2PO4 1g/dL，K2SO4 10g/dL，MgSO4 7H2O 5g/dL，KH2PO4 0.1g/dL，CaSO4 0.5g/dL，KOH 0.5g/dL，PTM1 2g/dL；
S5.发酵液预处理：调节步骤S4发酵液pH值至6.7并将发酵液加热至60℃，加入100mg/L壳聚糖，待絮凝体产生后，50r/min搅拌5min，静置50min后将上清液首先通过截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，待料液浓缩8～10倍后，收集得到的滤液再经截留分子量为1000Da的超滤膜超滤浓缩，得浓缩液；
S6.喷雾干燥：将步骤S5制得的浓缩滤液进行喷雾干燥，得抗菌肽粉剂；
S7.将步骤S6制得的抗菌肽粉剂进行筛分包装，即得。
对比例1一种利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法
与实施例1的区别在于，步骤S4发酵培养基为LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L；其它步骤均与实施例1类似。
对比例2一种利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法
与实施例1的区别在于，所述步骤S4中溶氧为60％，其它步骤均与实施例1类似。
试验例1抗菌肽抗菌活性测定
(1)试验对象：分别利用实施例1～3及对比例1～2工艺方法制备得到的抗菌肽；
(2)试验方法：
抗菌活性的测定采用最小抑菌浓度(MIC)法，分别检测抗菌肽对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的抗菌活性，方法如下：先向无菌96孔圆底板中加入90μL制备好的菌悬液，再逐一加入10μL相应浓度的抗菌肽稀释液，待测肽的终浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL；另外设阳性对照孔为不加抗菌物质，只加100μL菌悬液，阴性对照孔加100μLMH肉汤培养基；将96孔板置于37℃生化培养箱中保湿静置培养18-24小时；每种抗菌物质做三次重复；培养完后观察各孔底部是否有细菌沉淀产生，无肉眼可见细菌沉淀的最小浓度可判定为抗菌物质的MIC，
(3)试验结果：试验如下表1所示；
表1微量肉汤稀释法测定不同抗菌肽的最小抑菌浓度
由表1可知，本发明实施例1～3工艺方法加工制得的抗菌肽的抑菌效果均优于对比例1和对比例2。
试验例2抗菌肽的稳定性检测
(一)抗菌肽的热稳定性检测
(1)试验对象：分别利用实施例1～3及对比例1～2工艺方法制备得到的抗菌肽；
(2)试验方法：分别称取1g抗菌肽产品，分别溶解在50mL水中，不同温度梯度水浴中保温20分钟后，测定其抗菌活性。
(3)试验结果：如表2所示。
表2不同温度下抗菌肽活力
由表2可知，本发明实施例1～3制备得到的抗菌肽具有较好的热稳定性，在温度100℃水浴20min后，抑菌活力均在90％以上。
(二)抗菌肽的酶稳定性检测
(1)试验对象：分别利用实施例1～3及对比例1～2工艺方法制备得到的抗菌肽；
(2)试验方法：分别称取1g抗菌肽产品，在pH＝3.0、、37℃条件下，模拟动物肠胃内酶的浓度水平，分别采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶酶解处理抗菌肽2h，然后测定抗菌肽的抑菌效价。测定过程中，以清水处理作为对照分别溶解在50mL水中，不同温度梯度水浴中保温20分钟后，测定其抗菌活性。
(3)试验结果：如表3所示。
表3不同酶处理后抗菌肽活性
由表3可知，本发明实施例1～3制备得到的抗菌肽活性在经消化酶处理后，酶活下降并不明显，由此说明本发明抗菌肽具有较好的酶稳定性。

Claims (8)

1.一种利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.斜面菌活化：取抗菌肽生产菌株地衣芽孢杆菌接种在斜面培养基上，25℃～40℃条件下培养10～30h；
S2.摇瓶培养：向步骤S1培养好的斜面培养基中加入1～10mL无菌水制备菌悬液，取1～3mL菌悬液接种至含有50mL的YPD培养基的摇瓶中，25℃～35℃、250r/min培养15～25h；YPD培养基，以质量百分比计，配方为：1～8％酵母粉，1～8％蛋白胨，1～8％葡萄糖，pH自然；
S3.种子培养：将一级种子罐培养基灭菌后，接种步骤S2中所制备的种子液；在接种量为0.1％～2％，发酵温度为20℃～40℃，搅拌转速180-220转/min，通风量为10～20L/min，溶氧为10～50％，发酵液pH值为6.0培养条件下培养10～30h，当种子罐发酵液中残糖量为0.1～2.0％时流加50％葡萄糖；
S4.发酵培养：以4～8％体积比的接种量接种步骤S3所制备的一级种子罐培养液于含20L发酵培养基的50L发酵罐中，在发酵温度为20℃～50℃，罐压为0.001～1Mpa，搅拌转速为100～400r/min，通风量为10～30L/min，溶氧为10～50％，pH3.0～8.0的条件下发酵80～100h，当发酵罐发酵液中残糖量为0.01～3.0％时，流加50％葡萄糖溶液；
S5.发酵液预处理：调节步骤S4发酵液pH值至6.0～6.7并将发酵液加热至40～60℃，加入50～100mg/L壳聚糖，待絮凝体产生后，50r/min搅拌5min，静置30～50min后将上清液首先通过截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，待料液浓缩8～10倍后，收集得到的滤液再经截留分子量为1000Da的超滤膜超滤浓缩，得浓缩液；
S6.喷雾干燥：将步骤S5制得的浓缩滤液进行喷雾干燥，得抗菌肽粉剂；
S7.将步骤S6制得的抗菌肽粉剂进行筛分包装，即得。
2.根据权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.斜面菌活化：取抗菌肽生产菌株地衣芽孢杆菌接种在斜面培养基上，35℃条件下培养18h；
S2.摇瓶培养：向步骤S1培养好的斜面培养基中加入5mL无菌水制备菌悬液，取2.5mL菌悬液接种至含有50mL的YPD培养基的摇瓶中，35℃、250r/min培养20h；YPD培养基，以质量百分比计，配方为：5％酵母粉，5％蛋白胨，4％葡萄糖，pH自然；
S3.种子培养：将一级种子罐培养基灭菌后，接种步骤S2中所制备的种子液；在接种量为0.8％，发酵温度为35℃，搅拌转速200转/min，通风量为15L/min，溶氧为20％，发酵液pH值为6.0培养条件下培养20h，当种子罐发酵液中残糖量为1.2％时流加50％葡萄糖；
S4.发酵培养：以5％体积比的接种量接种步骤S3所制备的一级种子罐培养液于含20L发酵培养基的50L发酵罐中，在发酵温度为36℃，罐压为0.8Mpa，搅拌转速为360r/min，通风量为25L/min，溶氧为30％，pH5.5的条件下发酵96h，当发酵罐发酵液中残糖量为1.5％时，流加50％葡萄糖溶液；
S5.发酵液预处理：调节步骤S4发酵液pH值至6.5并将发酵液加热至55℃，加入85mg/L壳聚糖，待絮凝体产生后，50r/min搅拌5min，静置45min后将上清液首先通过截留分子量为2kDa的超滤膜超滤，待料液浓缩9倍后，收集得到的滤液再经截留分子量为1000Da的超滤膜超滤浓缩，得浓缩液；
S6.喷雾干燥：将步骤S5制得的浓缩滤液进行喷雾干燥，得抗菌肽粉剂；
S7.将步骤S6制得的抗菌肽粉剂进行筛分包装，即得。
3.根据权利要求1或2所述利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，步骤S1所述斜面培养基，以质量百分比计，配方为：酵母粉1～8％，蛋白胨1～8％，葡萄糖1～8％，琼脂粉1～8％，pH自然。
4.根据权利要求3所述利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，步骤S1所述斜面培养基，以质量百分比计，配方为：酵母粉4.5％，蛋白胨5％，葡萄糖6％，琼脂粉2％，pH自然。
5.根据权利要求1或2所述利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，所述YPD培养基中还含有100μg/mL的zeocin。
6.根据权利要求1或2所述利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，所述步骤S4发酵培养基配方为葡萄糖1～5g/dL，蛋白胨0.5～4g/dL，酵母粉0.1～2g/dL，NH4H2PO4 1～10g/dL，K2SO4 1～10g/dL，MgSO4 7H2O 0.5～5g/dL，KH2PO4 0.1～3g/dL，CaSO40.001～0.5g/dL，KOH 0.5～3g/dL，PTM1 0.01～2g/dL。
7.根据权利要求6所述利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，所述步骤S4发酵培养基配方为葡萄糖3g/dL，蛋白胨2.5g/dL，酵母粉1.5g/dL，NH4H2PO4 4g/dL，K2SO4 6g/dL，MgSO4 7H2O 3.5g/dL，KH2PO4 0.8g/dL，CaSO4 0.15g/dL，KOH 2.5g/dL，PTM10.25g/dL。
8.根据权利要求1或2所述利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，步骤S4流加50％葡萄糖溶液中还含有含1.2％的PTM1。
CN201710608545.4A 2017-07-24 2017-07-24 利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法 Withdrawn CN107354190A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710608545.4A CN107354190A (zh) 2017-07-24 2017-07-24 利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710608545.4A CN107354190A (zh) 2017-07-24 2017-07-24 利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107354190A true CN107354190A (zh) 2017-11-17

Family

ID=60285032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710608545.4A Withdrawn CN107354190A (zh) 2017-07-24 2017-07-24 利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107354190A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107412732A (zh) * 2017-07-24 2017-12-01 广东容大生物股份有限公司 一种抗菌肽在制备疤痕修复药物中的应用
CN108998486A (zh) * 2018-08-02 2018-12-14 江南大学 一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法
CN113481267A (zh) * 2021-07-05 2021-10-08 武汉华扬天乐动物保健品有限公司 一种抗菌肽发酵工艺
CN114478721A (zh) * 2022-02-09 2022-05-13 安杰利(重庆)生物科技有限公司 一种规模化生产套索肽21的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102899375A (zh) * 2012-09-20 2013-01-30 天津科技大学 一种利用氧载体提高发酵液中杆菌肽效价的方法
CN103772490A (zh) * 2014-01-18 2014-05-07 浙江大学 一种地衣芽孢杆菌分泌的抗菌肽及其制备方法和应用
CN104928202A (zh) * 2014-03-21 2015-09-23 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种芽孢杆菌的发酵培养方法
CN105483064A (zh) * 2016-02-23 2016-04-13 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种发酵生产杆菌肽的方法
CN106282276A (zh) * 2015-05-18 2017-01-04 北京伟嘉人生物技术有限公司 一种芽孢杆菌抗菌肽的制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102899375A (zh) * 2012-09-20 2013-01-30 天津科技大学 一种利用氧载体提高发酵液中杆菌肽效价的方法
CN103772490A (zh) * 2014-01-18 2014-05-07 浙江大学 一种地衣芽孢杆菌分泌的抗菌肽及其制备方法和应用
CN104928202A (zh) * 2014-03-21 2015-09-23 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种芽孢杆菌的发酵培养方法
CN106282276A (zh) * 2015-05-18 2017-01-04 北京伟嘉人生物技术有限公司 一种芽孢杆菌抗菌肽的制备方法和应用
CN105483064A (zh) * 2016-02-23 2016-04-13 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种发酵生产杆菌肽的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
喻钢等: "枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化及质谱检测", 《药物分析杂志》 *
崔京春等: "地衣芽孢杆菌发酵过程的优化", 《饲料博览》 *
邓坤等: "溶氧对地衣芽孢杆菌DW2合成杆菌肽的影响", 《中国抗生素杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107412732A (zh) * 2017-07-24 2017-12-01 广东容大生物股份有限公司 一种抗菌肽在制备疤痕修复药物中的应用
CN108998486A (zh) * 2018-08-02 2018-12-14 江南大学 一种木糖诱导型地衣芽孢杆菌产蛋白的诱导方法
CN113481267A (zh) * 2021-07-05 2021-10-08 武汉华扬天乐动物保健品有限公司 一种抗菌肽发酵工艺
CN114478721A (zh) * 2022-02-09 2022-05-13 安杰利(重庆)生物科技有限公司 一种规模化生产套索肽21的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100588624C (zh) 水环境微生物修复剂及其制备方法
CN107354190A (zh) 利用地衣芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法
CN108841749B (zh) 一株耐盐耐碱的具有广抑菌谱的枯草芽孢杆菌
CN103421715A (zh) 一种鼠李糖乳杆菌及其应用
CN109549024A (zh) 一种鱼用饲料添加剂及其制备方法
CN109593679A (zh) 一种纳米硒微生物菌剂及其制备方法与应用
CN109549025A (zh) 一种虾用饲料添加剂及其制备方法
CN113667620A (zh) 枯草芽孢杆菌Bs1218m及其应用
CN109468259A (zh) 一种促进芽孢生成的培养基
CN101884394A (zh) 一种雏鸡用复合微生物饲料添加剂及其制备方法
CN104046576A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌的培养方法及用途
CN107937301B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用
CN109810916A (zh) 一株解淀粉芽胞杆菌、其微生态制剂及其制备方法
CN102102095A (zh) 一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法
CN105018395B (zh) 一株短小芽孢杆菌及其在防治苹果斑点落叶病中的应用
RU2475535C1 (ru) Способ получения пробиотического препарата лактоамиловорина
CN101525584B (zh) 一种氟磺胺草醚农药残留降解菌及其生产的菌剂
CN103652329A (zh) 一种复合有益菌生物制剂
CN116622547A (zh) 一株莫海威芽孢杆菌yl-78及其应用
CN109988811A (zh) 一种微生物快速检测培养基及其制备方法和应用
RU2366448C2 (ru) Способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма животных и способ лечения радиационных поражений организма животных
RU2103353C1 (ru) Штамм бактерий lactobacillus acidophilus, используемый для коррекции дисбактериоза при желудочно-кишечных заболеваниях и у больных раком толстой кишки
CN107828704A (zh) 一种可酶解抗生素的复合菌剂及其应用
CN106754522A (zh) 一种枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法
CN100368528C (zh) 一种拟除虫菊酯类农药残留降解菌及其生产的菌剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20171117

WW01 Invention patent application withdrawn after publication