CN109777808A - 一种多肽及其在细胞核和叶绿体中定位表达外源蛋白的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种多肽及其在细胞核和叶绿体中定位表达外源蛋白的应用，属于分子遗传学领域，提供了一种编码多肽的DNA序列及其可在细胞核和叶绿体中定位表达外源蛋白的应用和相关方法。具体涉及一段来自毛竹基因组的序列，它所编码的一段多肽可以将外源蛋白表达在叶绿体和细胞核，可作为一个叶绿体和细胞核共定位的标记基因，为亚细胞定位的提供了一种可靠的比对方法。本发明首先克隆了一段毛竹基因的序列，将其连接在C端的黄色荧光蛋白导入了叶绿体和细胞核。将转运肽与荧光蛋白融合，能够进行活细胞中观察，省时省力，是研究蛋白功能的基础方法。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，提供了一种编码多肽的DNA序列及其可在细胞核和叶绿体中定位表达外源蛋白的应用和相关方法。
背景技术
叶绿体是植物细胞中的一种质体，其类囊体位于含有水的基质中，具有光合作用活性，被双层膜包围。除了叶绿体基质外，还包含另外两个腔：双膜外包膜和内包膜之间的膜间空间，以及由类囊体包围的腔。存在于植物和藻类细胞中的叶绿体来自原始的蓝细菌内共生体。在从自由生活的蓝藻祖先发展成高度专业化的细胞器的过程中，叶绿体失去了自主权。这一适应过程的一个关键因素是基因转移到细胞核所导致的遗传物质的丧失。这就是为什么现今叶绿体中的绝大多数蛋白质由细胞核编码并需要N末端前序列(转运肽)将其靶向叶绿体一些叶绿体定位的蛋白质由叶绿体基因组编码。然而，大多数(约95％) 由核基因组编码，在细胞质中加工，然后转移到叶绿体[1]。这些蛋白质通过两个易位子(称为TOC和TIC)分别穿过外部和内部包膜转运至基质，主要由可切割的转运肽辅助[2]。然而，一些特别的蛋白质可能在没有转运肽的情况下进入叶绿体。进入叶绿体后，蛋白质进一步靶向特定的亚区室。类囊体靶向蛋白通过四种途径之一从基质转移：分泌(Sec)途径，信号识别颗粒(SRP)途径，双精氨酸易位(Tat)途径或自发途径。穿过类囊体膜进入腔的蛋白质使用Sec或 Tat途径，而整合的类囊体膜蛋白使用SRP或自发途径[3]，[4]。除了自发通路的蛋白所有这些途径都是需要能量的。
有关叶绿体转运肽已有许多研究，N-末端叶绿体转运肽具有高度可变的长度，含有极少的带负电荷的残基，并且高度富集羟基化氨基酸。许多类囊体蛋白具有复合靶向信号，具有典型的转运肽，随后是类囊体靶向信号。后者通常与分泌蛋白上发现的信号肽非常相似，核定位信号由蛋白质链中的一个(单分子)或一对(双分子)短带正电荷的序列组成。单分子核定位信号具有短的保守序列K(K/R)X(K/R)，并且与输入蛋白α受体表面上的口袋结合。在二分核定位信号中，单分子基序与第二个小的碱性残基簇组合，第一个是N末端的10-12个残基[5]。
现有技术存在的问题：蛋白的定位往往与蛋白的功能相关，目前还不能完全根据蛋白的序列来确定蛋白所表达的位置，对于同时定位在多个亚细胞器结构的蛋白，就更难确切的预测表达位置。所以在亚细胞定位时通常需要一些亚细胞定位的marker来做对照，本研究报导了一段来自毛竹基因组的序列，它所编码的一段多肽可以将外源蛋白表达在叶绿体和细胞核，可用于叶绿体和细胞核共表达的marker基因。
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发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供了一段来自毛竹基因组的序列，它所编码的一段多肽可以将外源蛋白表达在叶绿体和细胞核，并通过N端连接的YFP 融合蛋白的黄色荧光信号进行证明。
为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种信号肽及其编码序列，其序列如下：
1.BBRG22 DNA序列：
ATGGCCATCCACCACGGCCAGTACTACCCGCTCCCGGACCCCGCCCAC GTCTACCCCACCTTCGCTGACTACCCCCATCACCACCGCTTCGCCGCCGTG CCGCCGCCGCCGCCGCACTACCCCTCGTGGGCAGGCGCCAGGTACTACAA CGGGCCCGGGTCCATCTCGCAGCCGATCAACGGCAGCCCGGTGACGCCCG GGCTATGGCAGGTCCCTGCCGGCGTTGGCGTGGGGACGCCGCTGGCCGCG CGACGTCAAGAACCGCCGGCGCCCCCTCCGTCGTTGCTCAGAGGCGAGGA GCCAGTGGTGGTGGGAGGACCTGGCTCGACGTCGTTCTCGCCGTCGACCT CCTCCTCGTCATCGTCCGCTTCGCCGCATGAGCGCCGCGCCCGGCCGGAGC ATAAAGAGAATGTGAGTTTGGATCTGAGCTTGTAG
2.BBRG22氨基酸序列
MAIHHGQYYPLPDPAHVYPTFADYPHHHRFAAVPPPPPHYPSWAGARYY NGPGSISQPINGSPVTPGLWQVPAGVGVGTPLAARRQEPPAPPPSLLRGEEPVV VGGPGSTSFSPSTSSSSSSASPHERRARPEHKENVSLDLSL
一种外源蛋白在细胞核和叶绿体中定位表达的方法：包括如下步骤：
1.信号肽C端连接YFP黄色荧光的载体的构建BBRG22-YFP
克隆BBRG22：在BambooGDB数据库(http://www.bamboogdb.org/)中搜索PH01001993G0350序列,将其命名为BBRG22。根据毛竹中BBRG22序列的开放阅读框(ORF)设计设计引物BBRG22-F： 5'-ATGGCCATCCACCACGGCCA-3'和BBRG22-R： 5'-CAAGCTCAGATCCAAACTCA-3'。使用总RNA提取试剂盒(TiangenBiotech Co.，Ltd.，Beijing，China)根据制造商的方案制备来自Moso竹叶的总RNA。
使用GoScript TM逆转录系统(Promega Biotech，Co.，Ltd.，Beijing，China)，用1μg总RNA合成第一链cDNA。将cDNA用作PCR的模板，使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TakaraBiotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)用引物BBRG22-F 和BBRG22-R进行扩增。然后将PCR片段克隆到pEntry中，随后通过测序 (BioSune Biotech，Co.，Ltd.，Shanghai，China)确认。
进一步地，所述植物总RNA提取，采用试剂盒(Tiangen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China)，根据制造商的方案制备来自Moso竹叶的总RNA。提取步骤如下：(1)匀浆处理:50-100mg毛竹叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μlRL(操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1％，如1mlRL中加入10μlβ -巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。)，涡旋剧烈震荡混匀。(2)将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心 2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。(3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(通常为225μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1， 12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(5)DNaseI工作液的配制：取10μlDNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀。(6)向吸附柱CR3 中央加入80μl的DNaseI工作液，室温放置15min。(7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(8)向吸附柱CR3中加入500μ l漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000 rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(9)重复步骤8。(10)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(11) 将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μlRNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心 2min，得到RNA溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA样品请在-70℃中保存。掉收集管中的废液，将吸附柱CR3 放回收集管中。
进一步地，采用GoScript TM逆转录系统(Promega Biotech，Co.，Ltd.，Beijing，China)用1μg总RNA合成第一链cDNA。具体如下：(1)使用前将每种组分混合并短暂离心。混合以下内容：
(2)在70℃加热5分钟。立即将冰水冷却至少5分钟。在微量离心机中离心10秒钟。存放在冰上直至添加逆转录混合物。
(3)制备逆转录反应混合物，每个cDNA反应15μl；按照顺序在冰上添加。
(4)将15μl逆转录混合物与5μl RNA和引物混合物混合。
(5)在25℃的加热块中退火5分钟。
(6)在42℃的加热块中延伸长达一小时。
(7)在70℃的加热块中逆转录酶15分钟。
进一步地，将合成的cDNA用作PCR的模板，使用PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶(Takara Biotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)用引物BBRG22-F和BBRG22-R 进行扩增。
(1)PCR反应液的配制
(2)PCR反应条件
预变性：98℃30sec；变性：98℃10sec，退火：55℃15sec，延伸： 68℃10sec，30Cycles；终延伸：68℃10min。
进一步地，加A反应在PCR产物中加入1μl TaKaRa r Taq酶72℃处理30 min。将PCR连接到pEntry(Gateway entry vector)载体中，随后通过测序确认，测序公司博尚(中国福州)。
进一步地，pEntry-T载体使用方法如下：
(1)用XcmI限制性内切酶消化pEntry-T质粒，(2)电泳胶回收，(3) 用T4DNA连接酶PCR加A后的产物和步骤2的产物，(4)转化Dh5α感受态细胞，(5)LB培养基培养18小时后挑单克隆，(6)提取质粒，(7)PCR 鉴定并测序。
进一步地，质粒提取采用天根质粒小提试剂盒步骤，操作步骤如下：
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl 的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)。
(2)取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
(4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
(5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。注意： P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(7)可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm (～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。
(8)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(9)重复操作步骤8。
(10)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
(11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。
2.构建表达载体
通过TA反应将PCR片段克隆到pEntry中，然后通过LR反应与目的载体pEarleyGate101载体(35S：C-YFP)(Earley等，2006)重组(Invitrogen) 获得pEarleyGate101-BBRG22质粒(35S∷BBRG22-YFP)。将所有构建体转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101中。
进一步地，根癌农杆菌转化采用100μl农杆菌细胞加小于1μl的质粒，混匀后加入电击杯中，冰上放置5分钟，擦干电击杯外部的水分，放入电击转化仪中(BTX，Model ECM630)。
进一步地，电击转化条件为：模式：2.5kV/RESISTANCE High Voltage(HV)；电击杯类型：BTX Disposable Cuvette P/N 610(1mmgap)；电容：50μF；电阻：125Ω；电压：1.4kV；额定场强(供参考)：14.4kV/cm；额定脉冲长度(供参考)： 5.0msec；转化后的菌液加入1ml的无抗LB在28℃摇床培养2小时，40000g 离心2分钟，弃部分上清混匀后涂在含有kana抗性的培养基上，置于28℃培养 48h。
3.重组质粒烟草瞬时表达
(1)用5ml的LB液体培养基28℃培养12小时左右。(2)室温5000g 离心10min，弃上清，沉淀用3ml MgCL2(10mM)液悬浮。(3)测浓度，用 OD600。(4)用10mM MgCL2稀释农杆菌悬浮液至，10ml总体积，每个菌的浓度为OD600＝0.5。(5)加150μM乙酰丁香酮。(6)注射器注射至烟草背面， 24后可观察荧光。(7)用倒置的Leica TCS SP8X DLS显微镜进行观察和成像。对于DAPI，YFP和叶绿素(Chlorophyll)自发荧光的激发，分别使用364、488 和594nm激光。检测发射波长为380-388(DAPI)，520-580(YFP)，和680-750 (Chlorophyll)。
附图说明
图1为本发明烟草叶表皮细胞轮廓图。
图2为本发明烟草叶表皮细胞中BBRG22定位在叶绿体和细胞核效果图。其中，图中较亮处在显微镜下为黄色信号。
图3为本发明叶绿体自发荧光信号。其中，图中较亮处在显微镜下为红色信号。
图4为本发明DAPI染色细胞核定位信号。其中，图中较亮处在显微镜下为蓝色信号。
图5为本发明叠加图层。其中，图5为图2-4的叠加图。
图6为本发明BBRG22 PCR扩增条带。
具体实施方式
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
该实施例提供一种信号肽及其编码序列，其序列如下：
1.BBRG22 DNA序列：
ATGGCCATCCACCACGGCCAGTACTACCCGCTCCCGGACCCCGCCCAC GTCTACCCCACCTTCGCTGACTACCCCCATCACCACCGCTTCGCCGCCGTG CCGCCGCCGCCGCCGCACTACCCCTCGTGGGCAGGCGCCAGGTACTACAA CGGGCCCGGGTCCATCTCGCAGCCGATCAACGGCAGCCCGGTGACGCCCG GGCTATGGCAGGTCCCTGCCGGCGTTGGCGTGGGGACGCCGCTGGCCGCG CGACGTCAAGAACCGCCGGCGCCCCCTCCGTCGTTGCTCAGAGGCGAGGA GCCAGTGGTGGTGGGAGGACCTGGCTCGACGTCGTTCTCGCCGTCGACCT CCTCCTCGTCATCGTCCGCTTCGCCGCATGAGCGCCGCGCCCGGCCGGAGC ATAAAGAGAATGTGAGTTTGGATCTGAGCTTGTAG
2.BBRG22氨基酸序列
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实施例2
该实施例提供一种外源蛋白在细胞核和叶绿体中定位表达的方法：包括如下步骤：
1.信号肽C端连接YFP黄色荧光的载体的构建BBRG22-YFP
克隆BBRG22：在BambooGDB数据库(http://www.bamboogdb.org/)中搜索PH01001993G0350序列,将其命名为BBRG22。根据毛竹中BBRG22序列的开放阅读框(ORF)设计设计引物BBRG22-F： 5'-ATGGCCATCCACCACGGCCA-3'和BBRG22-R： 5'-CAAGCTCAGATCCAAACTCA-3'。使用总RNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China)根据制造商的方案制备来自Moso竹叶的总RNA。
使用GoScript TM逆转录系统(Promega Biotech，Co.，Ltd.，Beijing，China)，用1μg总RNA合成第一链cDNA。将cDNA用作PCR的模板，使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TakaraBiotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)用引物BBRG22-F 和BBRG22-R进行扩增。然后将PCR片段克隆到pEntry中，随后通过测序 (BioSune Biotech，Co.，Ltd.，Shanghai，China)确认。
进一步地，所述植物总RNA提取，采用试剂盒(Tiangen Biotech Co.，Ltd.，Beijing，China)，根据制造商的方案制备来自Moso竹叶的总RNA。提取步骤如下：(1)匀浆处理:50-100mg毛竹叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μ lRL(操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1％，如1mlRL中加入10μlβ -巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。)，涡旋剧烈震荡混匀。(2)将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心 2-5min，小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。(3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(通常为225μl)，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1， 12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(5)DNase I工作液的配制：取10μlDNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀。(6)向吸附柱CR3 中央加入80μl的DNaseI工作液，室温放置15min。(7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(8)向吸附柱CR3中加入500μ l漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000 rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(9)重复步骤8。(10)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(11) 将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μlRNase-Free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心 2min，得到RNA溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率。RNA样品请在-70℃中保存。掉收集管中的废液，将吸附柱CR3 放回收集管中。
进一步地，采用GoScript TM逆转录系统(Promega Biotech，Co.，Ltd.， Beijing，China)用1μg总RNA合成第一链cDNA。具体如下：(1)使用前将每种组分混合并短暂离心。混合以下内容：
(2)在70℃加热5分钟。立即将冰水冷却至少5分钟。在微量离心机中离心10秒钟。存放在冰上直至添加逆转录混合物。
(3)制备逆转录反应混合物，每个cDNA反应15μl。按照顺序在冰上添加。
(4)将15μl逆转录混合物与5μl RNA和引物混合物混合。
(5)在25℃的加热块中退火5分钟。
(6)在42℃的加热块中延伸长达一小时。
(7)在70℃的加热块中逆转录酶15分钟。
进一步地，将合成的cDNA用作PCR的模板，使用PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶(Takara Biotech，Co.，Ltd.，Dalian，China)用引物BBRG22-F和BBRG22-R 进行扩增。
(1)PCR反应液的配制
(2)PCR反应条件
预变性：98℃30sec；变性：98℃10sec，退火：55℃15sec，延伸： 68℃10sec，30Cycles；终延伸：68℃10min。
进一步地，加A反应在PCR产物中加入1μl TaKaRa r Taq酶72℃处理30 min。将PCR连接到pEntry(Gateway entry vector)载体中，随后通过测序确认，测序公司博尚(中国福州)。
进一步地，pEntry-TccDB载体使用方法如下：
(1)用XcmI限制性内切酶消化pEntry-T质粒，(2)电泳胶回收，(3) 用T4DNA连接酶PCR加A后的产物和步骤2的产物，(4)转化Dh5α感受态细胞，(5)LB培养基培养18小时后挑单克隆，(6)提取质粒，(7)PCR 鉴定并测序。
进一步地，质粒提取采用天根质粒小提试剂盒步骤，操作步骤如下：
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl 的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)。
(2)取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
(4)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
(5)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心10min。注意： P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(7)可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm (～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。
(8)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(9)重复操作步骤8。
(10)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
(11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。
2.构建表达载体
通过TA反应将PCR片段克隆到pEntry中，然后通过LR反应与目的载体pEarleyGate101载体(35S：C-YFP)(Earley等，2006)重组(Invitrogen) 获得pEarleyGate101-BBRG22质粒(35S∷BBRG22-YFP)。将所有构建体转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101中。
进一步地，根癌农杆菌转化采用100μl农杆菌细胞加小于1μl的质粒，混匀后加入电击杯中，冰上放置5分钟，擦干电击杯外部的水分，放入电击转化仪中(BTX，Model ECM630)。
进一步地，电击转化条件为：模式：2.5kV/RESISTANCE High Voltage(HV)；电击杯类型：BTX Disposable Cuvette P/N610(1mmgap)；电容：50μF；电阻： 125Ω；电压：1.4kV；额定场强(供参考)：14.4kV/cm；额定脉冲长度(供参考)： 5.0msec；转化后的菌液加入1ml的无抗LB在28℃摇床培养2小时，40000g 离心2分钟，弃部分上清混匀后涂在含有kana抗性的培养基上，置于28℃培养 48h。
3.重组质粒烟草瞬时表达
(1)用5ml的LB液体培养基28℃培养12小时左右。(2)室温5000g 离心10min，弃上清，沉淀用3ml MgCL2(10mM)液悬浮。(3)测浓度，用OD600。(4)用10mM MgCL2稀释农杆菌悬浮液至，10ml总体积，每个菌的浓度为OD600＝0.5。(5)加150μM乙酰丁香酮。(6)注射器注射至烟草背面，24后可观察荧光。(7)用倒置的Leica TCS SP8X DLS显微镜进行观察和成像。对于DAPI，YFP和叶绿素(Chlorophyll)自发荧光的激发，分别使用364、 488和594nm激光。检测发射波长为380-388(DAPI)，520-580(YFP)，和 680-750(Chlorophyll)，其结果如附图1-5所示。
实施例3
信号肽BBRG22的DNA序列和氨基酸序列在细胞核和叶绿体中定位表达外源蛋白的应用。
有益效果：通过氨基酸序列预测的蛋白质的亚细胞定位信息目前还没有很高准确性,对于多个细胞结构共同定位的蛋白质更是难以预测，最终确定需要通过实验去证实；而大规模的蛋白质组学方法由于较难分离低丰度蛋白质,在制备蛋白样品是避免不了污染,也存在一定的局限性。本研究克隆了一段毛竹基因的序列，将其构建到表达载体上，并转化农杆菌后在烟草叶片表皮细胞瞬时表达，使用激光共聚焦显微镜观察发现BBRG22荧光信号分别与叶绿体自发荧光和细胞核染色信号重合，说明BBRG22可以将连接在C端的黄色荧光蛋白导入叶绿体和细胞核。类似的将转运肽与荧光素蛋白融合,能够进行活细胞中观察,省时省力，是研究蛋白功能的最基础的方法。同时，本研究的给出的 BBRG22-YFP融合蛋白可作为一个叶绿体和细胞核共定位的标记基因，为亚细胞定位的提供了一种可靠的比对方法。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
<110> 福建农林大学
<120> 一种多肽及其在细胞核和叶绿体中定位表达外源蛋白的应用
<140>201811512218.X
<141>2018-12-12
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211>435
<212> DNA
<213> 毛竹（Phyllostachys edulis）
<400> 1
ATGGCCATCCACCACGGCCAGTACTACCCGCTCCCGGACCCCGCCCACGTCTACCCCACCTTCGCTGACTACCCCCATCACCACCGCTTCGCCGCCGTGCCGCCGCCGCCGCCGCACTACCCCTCGTGGGCAGGCGCCAGGTACTACAACGGGCCCGGGTCCATCTCGCAGCCGATCAACGGCAGCCCGGTGACGCCCGGGCTATGGCAGGTCCCTGCCGGCGTTGGCGTGGGGACGCCGCTGGCCGCGCGACGTCAAGAACCGCCGGCGCCCCCTCCGTCGTTGCTCAGAGGCGAGGAGCCAGTGGTGGTGGGAGGACCTGGCTCGACGTCGTTCTCGCCGTCGACCTCCTCCTCGTCATCGTCCGCTTCGCCGCATGAGCGCCGCGCCCGGCCGGAGCATAAAGAGAATGTGAGTTTGGATCTGAGCTTGTAG
<210> 2
<211>144
<212> PRT
<213> 毛竹（Phyllostachys edulis）
<400> 2
MAIHHGQYYPLPDPAHVYPTFADYPHHHRFAAVPPPPPHYPSWAGARYYNGPGSISQPINGSPVTPGLWQVPAGVGVGTPLAARRQEPPAPPPSLLRGEEPVVVGGPGSTSFSPSTSSSSSSASPHERRARPEHKENVSLDLSL
Claims (6)
1.信号肽BBRG22的DNA序列，其特征在于，所述信号肽BBRG22的DNA序列如序列表SEQID NO：1所示。
2.信号肽BBRG22的DNA序列和氨基酸序列在细胞核和叶绿体中定位表达外源蛋白的应用。
3.一种将外源蛋白定位到细胞核和叶绿体中的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)信号肽C端连接YFP黄色荧光蛋白的载体的构建BBRG22-YFP；(2)构建表达载体；(3)重组质粒烟草瞬时表达。
4.根据权利要求1所述的一种将外源蛋白定位到细胞核和叶绿体中的方法，其特征在于，步骤1信号肽C端连接YFP黄色荧光的载体的构建BBRG22-YFP包括、克隆BBRG22、总RNA提取、合成第一链cDNA、BBRG22-R扩增、PCR片段克隆到pEntry载体。
5.根据权利要求1所述的一种将外源蛋白定位到细胞核和叶绿体中的方法，其特征在于，步骤2构建表达载体包括：通过TA反应将PCR片段克隆到pEntry中，然后通过LR反应与目的载体pEarleyGate 101载体(35S：C-YFP)重组获得pEarleyGate 101-BBRG22质粒(35S∷BBRG22-YFP)；将所有构建体转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101中。
6.根据权利要求1所述的一种将外源蛋白定位到细胞核和叶绿体中的方法，其特征在于，步骤3重组质粒烟草瞬时表达包括：(1)用5ml的LB液体培养基28℃培养12小时左右；(2)室温5000g离心10min，弃上清，沉淀用3ml MgCl2(10mM)液悬浮；(3)测浓度，用OD600；(4)用10mM MgCl2稀释农杆菌悬浮液至，10ml总体积，每个菌的浓度为OD600＝0.5；(5)加150μM乙酰丁香酮；(6)注射器注射至烟草背面，24后可观察荧光；(7)用倒置的Leica TCS SP8X DLS显微镜进行观察和成像；对于DAPI，YFP和叶绿素(Chlorophyll)自发荧光的激发，分别使用364，488和594nm激光；检测发射波长为380-388(DAPI)，520-580(YFP)，和680-750(Chlorophyll)。
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