CN109735605A - 转基因玉米mon89034品系定量检测试剂盒及数字pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了转基因玉米MON89034品系定量检测试剂盒及数字PCR检测方法，具体地本发明提供了基于数字PCR法获得了转基因玉米MON89034品系的定量数字PCR检测方法，该方法中使用品系特异引物探针组和内源基因特异引物探针组进行双重数字PCR检测，实验结果表明本发明的方法检测灵敏度可达到0.1％，线性范围为0.1％‑100％，符合转基因定量检测的需要。

Description

转基因玉米MON89034品系定量检测试剂盒及数字PCR检测 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种转基因玉米MON89034品系定量检测试剂盒及数字PCR检测方法。

背景技术

转基因检测通常是针对外源DNA或外源蛋白的检测。核酸在生物细胞中含量相对稳定，在产品加工中也相对不容易被破坏，而且核酸检测方法灵敏度高、操作简便，成为主流方法。常用的核酸检测手段包括等温扩增、普通PCR、双重PCR、实时荧光定量PCR(Real-time Fluoresence Quantitative,qPCR)、数字PCR(digital PCR，dPCR)等。

qPCR可以筛选转基因特异DNA片段，但大多数的qPCR在转基因检测方法的应用还停留在定性阶段，主要是因为，1)对于转基因产品中低丰度转基因成分定量检测，qPCR方法容易受到食品饲料中PCR抑制物影响，降低qPCR扩增效率，因此qPCR方法的重复性差,灵敏度较低；2)更重要的是作为一种相对定量方法，qPCR依赖标准品和标准曲线进行定量，但是目前可获得的国家有证DNA标准物质非常缺乏，导致实际检测中标准曲线可溯源性和可靠性有待提高；3)qPCR方法标准依据也以定性为主，如SN/T 1204-2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》，SN/T 2668-2010《转基因植物品系特异性检测方法》，SN/T 1196-2012《转基因成分检测玉米检测方法》等，仅有《GB/T 19495.5-2004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》是定量方法标准。

dPCR的核心原理是样品极限分配和单分子扩增反应，首先利用微珠液滴或者高通量微量芯片，将样品极致分配，直到每一个样品单元含有的阳性模板商量为1或者0，然后经过PCR扩展之后，对阳性样品单元进行检测和数据统计，根据泊松分布理论，得到DNA浓度定量结果。随着近年来dPCR的迅速发展，其在转基因成分定量检测领域表现出了巨大的潜能。

dPCR定量检测转基因产品的灵敏度高，特异性好，但目前国内外dPCR玉米转基因定量检测的方法研究较少。因此，本领域技术人员致力于开发灵敏度高、特异性好，使用简单、方便的转基因数字PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因玉米MON89034品系定量检测试剂盒及数字PCR检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于转基因玉米MON89034品系定量检测数字PCR法的引物对组，所述引物对组包括第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:2所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对组还包括第二引物对，所述第二引物对包括如SEQID NO.:7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:8所示的反向引物。

本发明的第二方面，提供了一种用于转基因玉米MON89034品系定量检测的探针组，所述探针组包括：如SEQ ID NO.:3所示的针对转基因玉米MON89034品系特异基因序列的探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:9所示的针对内源基因Adh-1保守序列的特异性的探针。

本发明的第三方面，提供了一种用于转基因玉米MON89034品系定量检测的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的PCR引物对组。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括dPCR反应液，所述dPCR反应液包括选自下组的一种或多种组分：

热启动Taq酶、镁离子和dNTPs。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括阳性质控品。

本发明的第四方面，提供了一种转基因玉米MON89034品系数字PCR定量检测的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测样本，所述样本中含有转基因玉米DNA；

(2)制备dPCR反应体系，进行扩增反应；

其中，所述dPCR反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组。

在另一优选例中，所述dPCR反应体系中各引物浓度为300nM-800nM；优选地为400nM-600nM。

在另一优选例中，所述dPCR反应体系中各探针浓度为50nM-150nM；优选地为80nM-120nM。

在另一优选例中，所述步骤(2)中的扩增反应为微滴数字PCR扩增反应；并且，扩增反应中退火温度为55-58℃，优选地为56℃。

在另一优选例中，所述步骤(2)中的扩增反应为芯片3D数字PCR扩增反应；，并且，扩增反应中退火温度为58-62℃，优选地为60℃。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于转基因玉米MON89034品系数字PCR定量检测。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.转基因玉米MON89034品系特异基因及内源基因双重扩增芯片图。

图2.扩增点图。

图3.退火温度优化结果。

图4.检测线性范围和灵敏度检测结果。

图5.转基因玉米MON89034测试方法的精密度检测荧光图。

图6. 25％玉米MIR162+50％玉米MON89034混合样品检测荧光图。

图7.品系特异引物探针组2和内源基因zein特异引物探针组的组合检测结果

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，基于数字PCR法获得了转基因玉米MON89034品系的定量数字PCR检测方法，该方法中使用品系特异引物探针组和内源基因特异引物探针组进行双重数字PCR检测，实验结果表明本发明的方法检测灵敏度可达到0.1％，线性范围为0.1％-100％，符合国家转基因定量检测的需要。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

本项目将针对进出口贸易中涉及最多的转基因植物品系设计引物探针进行dPCR定量检测，从引物与模板的结合特异性、最佳浓度、退火温度、PCR反应体系的最佳浓度配比、PCR反应过程的时间、温度、循环数等方面进行研究，筛选出转基因植物特异的dPCR最佳反应条件，从而建立转基因植物dPCR定量检测方法标准，为规范我国转基因标识制度提供强有力的技术支撑。为此，建立转基因植物品系定量检测数字PCR法是非常必要的。

如引物探针浓度、探针的不同荧光标记、退火温度、PCR循环次数、单重检测与双重检测等，并与传统的qPCR结果进行了对比，结果显示采用dPCR进行GMO成分分析，在无需标准物质的情况下采用绝对定量得到的结果更加准确。

我国各省、直辖市出入境和国家科研院所也积极开展dPCR法定量转基因的研究，中国检科院付伟开展了dPCR定性筛选转基因植物的检测研究，主要针对CaMV35s和NOS两个常见的外源插入元件和玉米内源基因zSSIIb，其检测方法的灵敏度可达到0.1％。广东检验检疫技术中心刘津建立了转基因大豆MON89788品系双重dPCR定量检测方法,在一个体系内同时进行内外源基因的定量检测,适用于微滴式dPCR和芯片式dPCR平台,并通过了FAPAS国际能力验证项目的盲样检测评价，对转基因大豆MON89788品系相对定量检测低限为0.1％。

双重PCR(duplex PCR)，又称双重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对引物，同时扩增出两个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

影响双重PCR反应的因素有很多，比如：

(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。

(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。

(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。

(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。

虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的方法检测灵敏度可达到0.1％，线性范围为0.1％-100％，符合国家转基因定量检测的需要。

(2)本发明可以在同一数字PCR反应体系中实现外源品系特异基因和内源基因的同时扩增，直接给出两者的拷贝数浓度，从而一步实验给出转基因的含量。

(3)本发明的方法检测结果精密度为3.6％，检测精密度良好。

(4)本发明的方法检测定量结果的误差小于25％，符合转基因定量检测的需要。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

1.试剂和材料

植物基因组DNA提取试剂盒(货号：DP305；购自天根公司)。

数字PCR预混液：含有镁离子、dNTPs和具有5’-3’外切活性的热启动Taq DNA聚合酶的数字PCR专用预混试剂。

引物及探针：引物探针序列具体信息见表1。

数字PCR微反应体系生成联排管或芯片。

96孔荧光定量PCR反应板和封膜。

0.2mL和1.5mL离心管。

移液枪头，量程0.5μL-10μL；量程10μL-100μL；量程100μL-1000μL。

2.仪器与设备

实验室常规设备及下列各项：

数字PCR系统：包括PCR仪、微反应体系发生器或其它具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其它具有同样功能的仪器。

分析天平：感量0.1mg。

生物安全柜。

核酸定量仪：Nanodrop2000或Qbit3.0检测仪或其他核酸定量检测仪。

涡旋震荡仪。

移液枪：量程0.1μL－2.5μL；量程0.5μL－10μL；量程10μL－100μL；量程100μL－1000μL。

3.转基因样品

结合国内现有检测机构的检测能力和2002-2016年国家进口用作加工原料的农业转基因生物审批情况，选用国际上已有的转基因植物标准物质，进行方法的验证。转基因标准物质：转基因玉米MON89034(AOCS 0906-E，转基因含量100％)

实施例1反应体系及反应程序优化

转基因玉米同时进行品系特异基因和内源基因同时扩增，不同靶基因的扩增体系会有相互干扰，这就需要对引物探针体系进行优化，或者选择多个内源基因和外源插入品系特异性基因进行配对，选出两者都能正常扩增且两种荧光信号彼此不干扰的扩增体系。

对数字PCR的体系优化主要集中在引物探针设计、应用比例和PCR反应程序方面。首先设计了MON89034品系特异基因的引物探针，并对设计出的数十组引物探针进行筛选优化，典型序列如表1中的品系特异引物探针组1至4所示。将各玉米内源基因特异性引物探针组和各MON89034品系特异基因引物探针组进行配对，验证其是否能同时进行双重PCR反应，实验结果表明品系特异引物探针组1和内源基因Adh-1的引物探针组进行组合，双重检测的效果最佳。其余各组合，在灵敏度和特异性上无法满足dPCR的定量要求，比如品系特异引物探针组2和内源基因zein特异引物探针组的组合检测结果如图7所示，用VIC标记的内源基因zein无法扩增且用FAM标记的品系特异引物探针扩增时对阴阳性信号不能明显区分。第二步，PCR反应体系中，探针的成本较高，为了节约成本，我们让探针的浓度从50nM，100nM，150nM，200nM，400nM浓度依次升高，引物的浓度维持500nM不变，结果表明引物浓度500nM，探针浓度为100nM效果最佳。确定引物探针序列和浓度后，实验验证两种引物探针体系的扩增情况，表1的PCR反应体系分别对应PCR扩增芯片图(图1)和荧光信号图(图2)反应程序中的退火温度需要优化，否则会影响荧光信号的采集。芯片数字PCR系统需按照仪器说明书推荐的固定程序进行反应，而微滴PCR系统可以根据引物探针情况对退火温度进行优化，见表2。使用微滴PCR，退火温度从60℃优化为56℃，则阴阳性信号能明显区分，见图3。

表1.转基因玉米MON89034品系特异基因及内源基因的引物和探针序列

图1.转基因玉米MON89034品系特异基因及内源基因双重扩增芯片图；图2扩增点图。

表2.微滴数字PCR的反应程序

表3.芯片3D数字PCR反应参数

注：不同芯片平台可根据说明书对步骤中的温度和时间做相应调整，但不能对步骤2中的退火温度做调整。

图3显示了退火温度优化结果(微滴PCR)，图中，A和B分别为转基因玉米MON89034品系的外源基因在60℃和56℃的扩增图；C和D分别为转基因玉米MON89034品系的内源基因在60℃和56℃的扩增图。结果表明，MON89034品系的外源基因在60℃退火温度下阴性和阳性反应孔之间的信号不能完全区分开，会导致结果的误判，从而影响最终给出的模板DNA的拷贝数浓度。

实施例2.检测限和线性范围验证

将转基因含量为100％的转基因玉米MON89034品系与阴性的玉米进行混合，制成10％、5％、1％、0.5％、0.1％的样品，验证其转基因含量检测的准确性和线性范围。提取基因组并进行数字PCR的扩增。

扩增结果显示，本标准方法在转基因含量为0.1％及以上的样品中可以产生稳定扩增。实验结果表明(数据见表4，检测线性范围和灵敏度检测结果见附图4，图中，A-F图依次分别是转基因含量为100％，10％，5％，1％，0.5％，0.1％的转基因玉米MON89034样品检测荧光图。)，本方法检测灵敏度可达到0.1％，线性范围为0.1％-100％，符合国家转基因定量检测的需要。

依据泊松分布原理，最低上样浓度为1500拷贝/反应，能保证每次实验必然能取样到转基因核酸片段，这样即使0.1％转基因含量的样本也不会出现转基因片段漏取样的情况。同时，由于目前市售数字PCR的微反应体系数量都至少高于10000，根据泊松分布原则，当微滴数位10000时，数字PCR最多可以定量到50000拷贝的目的基因，故为保证定量结果的准确性，应将样品DNA溶液作适度稀释，选择的模板浓度应保证上样前体系中总模板数在1500-50000个拷贝。

表4.检测限结果

实施例3.方法精密度

用100％转基因玉米MON89034测试精密度，连续测量8次，检测结果见表5，检测结果精密度为3.6％。8次检测结果的荧光图见图5。图5.转基因玉米MON89034测试方法的精密度检测荧光图,图中，1-8分别是8次dPCR平行检测的荧光图.

表5.转基因玉米测试方法的精密度

实施例4.实际样品的检测

本方法在样品验证阶段采用双盲样验证法，由实验室其他人配置盲样(25％玉米MIR162+50％玉米MON89034混合样品)并用本方法进行检测，并将检测结果与实际结果进行比对确定本方法的准确度(表6)。表6中样品的检测结果荧光图见图6。图6.25％玉米MIR162+50％玉米MON89034混合样品检测荧光图；图中，A为25％转基因玉米MIR162的检测荧光图，B为50％转基因玉米MON89034的检测荧光图。

实验结果表明，本方法可以准确的鉴定不同盲样中的转基因成分，25％玉米MIR162混合样品的定量结果为19.6％，50％玉米MON89034混合样品的定量结果为66.7％，定量结果的误差均小于25％，符合国家转基因定量检测的需要。

表6. 25％玉米MIR162+50％玉米MON89034混合样品检测结果

按照公式(1)计算测试样品的转基因成分含量：

式中：

m——转基因植物品系的转基因含量(％)；

A——转基因植物品系外源基因拷贝数；

B——转基因植物内源基因拷贝数；

注：由于利用杂交优势，一般情况下，转基因产品产品多为F1代杂交种子的F2代分离群体。如F1代杂交种子为转基因杂合子，则F2后代25％为转基因纯合子，50％为转基因杂合子，25％为非转基因纯合子。测定结果显示转基因含量为50％，但杂合子中品系特异序列只有纯合子的一半，且两者均定义为转基因成分，因而转基因含量被低估25％。如F1代种子为转基因纯合子，F2后代100％为转基因纯合子，转基因含量为100％，未被低估。在本案中所用的转基因玉米MON89034，玉米MIR162均为杂合子。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市计量测试技术研究院

<120> 转基因玉米MON89034品系定量检测试剂盒及数字PCR检测方法

<130> 000000

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

tgtctacatt cacgtccaaa tgg 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gcttccactc gaccaagctt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cttagatgag aaacttcacg 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ctcccaatcc tttgacatct gc 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tcgatttctc tcttggtgac agg 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

agcaaagtca gagcgctgca atgc 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

cgtcgtttcc catctcttcc tcc 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

ccactccgag accctcagtc 20

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

aatcagggct cattttctcg ctcctca 27

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

tgaacccatg catgcagt 18

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

ggcaagacca ttggtga 17

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

tggcgtgtcc gtccctgatg c 21

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

gatccgtcgt atttataggc gaaa 24

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

gcttccactc gaccaagctt 20

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

agaaacttca cgatttggcg cgcc 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

gtgtctacat tcacgtccaa atgg 24

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

ccactcgacc aagcttt 17

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

aaacttcacg atttggcgc 19

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

ttctccatat tgaccatcat actcatt 27

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

cggtatctat aataccgtgg tttttaaa 28

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

atccccggaa atatgtt 17

Claims (10)

1.一种用于转基因玉米MON89034品系定量检测的PCR引物对组，其特征在于，所述引物对组包括第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:2所示的反向引物。

2.如权利要求1所述的用于转基因玉米MON89034品系定量检测的PCR引物对组，其特征在于，所述引物对组还包括第二引物对，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.:7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:8所示的反向引物。

3.一种用于转基因玉米MON89034品系定量检测的探针组，其特征在于，所述探针组包括：如SEQ ID NO.:3所示的针对转基因玉米MON89034品系特异基因序列的探针。

4.如权利要求3所述的用于转基因玉米MON89034品系定量检测的探针组，其特征在于，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:9所示的针对内源基因Adh-1保守序列的特异性的探针。

5.一种用于转基因玉米MON89034品系定量检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的PCR引物对组。

6.如权利要求5所述的用于转基因玉米MON89034品系定量检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求3所述的探针组。

7.如权利要求5所述的用于转基因玉米MON89034品系定量检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dPCR反应液，所述dPCR反应液包括选自下组的一种或多种组分：

热启动Taq酶、镁离子和dNTPs。

8.一种转基因玉米MON89034品系定量检测数字PCR方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测样本，所述样本中含有转基因玉米DNA；

(2)制备dPCR反应体系，进行扩增反应；

其中，所述dPCR反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、权利要求1所述的引物对组、和权利要求3所述的探针组。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述dPCR反应体系中各引物浓度为300nM-800nM；优选地为400nM-600nM。

10.权利要求1所述的引物对组、和权利要求3所述的探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于转基因玉米MON89034品系定量检测。