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CN106755572A - I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量pcr方法 - Google Patents

I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量pcr方法 Download PDF

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CN106755572A
CN106755572A CN201611080993.3A CN201611080993A CN106755572A CN 106755572 A CN106755572 A CN 106755572A CN 201611080993 A CN201611080993 A CN 201611080993A CN 106755572 A CN106755572 A CN 106755572A
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CN
China
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quantitative pcr
dhv
fluorescent quantitative
duck
double fluorescent
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Pending
Application number
CN201611080993.3A
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赵丽丽
陈洪岩
韩凌霞
张圆圆
陆涛峰
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Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
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Publication date
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Priority to CN201611080993.3A priority Critical patent/CN106755572A/zh
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    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
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Abstract

本发明提供一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法，分别设计了一对针对I型鸭肝炎病毒的特异性检测引物DHV‑I‑F、DHV‑I‑R及一条荧光探针DHV‑I‑P，一对针对鸭瘟病毒的特异性检测引物DPV‑F、DPV‑R及一条荧光探针DPV‑P，并确定了针对I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的双重荧光定量PCR方法的特异性引物及荧光探针的浓度。本发明提供的双重荧光定量PCR方法可以同时检测和鉴别I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒两种病毒，具有操作简单、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，不仅可以节约成本、还可以为疫情监测和疫情控制争取到宝贵的时间，并且为这两种病毒所引起的传染性鸭病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。

Description

I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎是一种以肝炎为主要特征的急性、烈性、高传染性及高致死性的病毒性传染病，病原为鸭肝炎病毒(DHV)，主要引起3周龄以下的雏鸭发病。鸭肝炎病毒主要有3个血清型，分别为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，这三个血清型相互独立，在我国流行的主要是Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-I)。Ⅰ型鸭肝炎病毒在春季3-4月份最易流行，3周龄以下的雏鸭染病后的死亡率极高，一周龄以内的小鸭死亡率可达80％以上，2-3周龄也达到50％左右，严重危害了我国各地养鸭业的健康发展。
鸭瘟是由鸭瘟病毒(DPV)引起的急性、高度死亡率的传染病，又称为鸭病毒性肠炎，俗称“大头瘟”。鸭瘟病毒是疱疹病毒，病毒粒子呈球形，各种年龄和品种的鸭均可感染，在全年各季均可发生，但以春夏之交和秋季最易流行。本病主要通过消化道传播，也可通过交配、眼结膜和呼吸道传播，病鸭及被其排泄物污染的用具、运输工具乃至与疫区或疫场人员的来往都可能造成鸭瘟的传播，鸭瘟流行时，成年鸭的发病和死亡较为严重，1月龄以下的雏鸭发病较少，往往给养鸭业带来巨大的经济损失。
目前，Ⅰ型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的检测方法主要是分离培养、血清学检测、常规PCR和实时荧光定量PCR检测。分离培养对培养环境、营养条件、分离操作均有较高的要求，且耗时较长；血清学检测存在结果判读存在主观因素、灵敏度和特异性均不高、易与衣原体等其他微生物出现交叉反应等问题；常规PCR检测存在引物结合缺乏特异性、实验室污染和临床样品中PCR抑制物存在造成假阴性等问题，在基因扩增后还需电泳测序来验证，相对耗时，成本也比较高；实时荧光探针PCR方法依据序列特异性探针区别物种，提高了检测的特异性和灵敏度，如CN200810198528.9公开了一种Ⅰ型鸭肝炎病毒的分子生物学鉴别方法，采用荧光定量PCR方法鉴定Ⅰ型鸭肝炎病毒，但该方法只能检测Ⅰ型鸭肝炎病毒，不能同时对Ⅰ型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒进行检测而及时进行准确地分辨，容易耽误疫情监测和疫情控制。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法，所述方法中：
设计检测I型鸭肝炎病毒的特异性引物及探针的序列分别为：
上游引物DHV-I-F：5’-TGGGATACCCAGGAGTACACGTA-3’(如SEQ ID No.1所示)；
下游引物DHV-I-R：5’-TGTTAAGCTGGGAGGTGTCTTGT-3’(如SEQ ID No.2所示)；
荧光探针DHV-I-P：
5’-VIC-CACCCACTGGCTTTGGAGCTGTGC-TAMRA-3’(如SEQ ID No.3所示)；
设计检测鸭瘟病毒的特异性引物及探针的序列分别为：
上游引物DPV-F：5’-CGGTTTTGGGAAGGCTTTCG-3’(如SEQ ID No.4所示)；
下游引物DPV-R：5’-ACCCTAACGGCTCCTGTAG-3’(如SEQ ID No.5所示)；
荧光探针DPV-P：
5’-FAM-TCCACTGGCATTTGCTTGATTTCCGC-TAMRA-3’(如SEQ ID No.6所示)。
进一步的，所述方法包括：
(1)设计及合成引物和探针；
(2)制备阳性质粒标准品；
(3)进行双重荧光定量PCR反应条件的优化，建立双重荧光定量PCR检测体系；
(4)采用双重荧光定量PCR检测体系对病毒进行检测。
进一步的，制备阳性质粒标准品的具体过程包括：
A.合成用于制备阳性质粒标准品的引物；
DHV引物：
上游引物P1：5’-GTTTTGGAAGGGAAGATACAGTGGT-3’；
下游引物P2：5’-GTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAAA-3’；
扩增目的片段为516bp；
DPV引物：
上游引物P3：5’-GCAGGGCATTTGTTAGACGATA-3’；
下游引物P4：5’-TGCCGCCAATTTGTAAAG-3’；
扩增目的片段为337bp；
B.用商品化试剂盒分别提取I型鸭肝炎病毒RNA和鸭瘟病毒DNA，在-70℃条件下保存备用；
C.对I型鸭肝炎病毒的RNA进行反转录反应获得cDNA，反应体系为含有0.2-1000ng/μL模板RNA、0.5μM下游引物P2、1mM dNTP、1U/μL Rnase Inhibition(反转录酶抑制剂)、200U Prime Script反转录酶的5×Primescript Buffer(5倍的反转录缓冲液)和DEPC水的混合液，其中5×Primescript Buffer表示其在混合液中的体积分数为20％；
具体步骤为：将RNA模板、下游引物P2放入65℃下水浴10min，然后冰浴5min，短暂离心后加入dNTP、Rnase Inhibition、Prime Script反转录酶、5×Primescript Buffer和DEPC水，42℃下水浴1h，70℃下水浴10min，冰浴5min，-20℃保存备用；
D.分别以I型鸭肝炎病毒的cDNA和鸭瘟病毒的DNA为模板进行PCR扩增反应，然后回收纯化扩增产物；
其中，I型鸭肝炎病毒的cDNA的PCR扩增反应的反应体系为含有0.5-1000ng/μL模板cDNA、0.4μM上游引物P1、0.4μM下游引物P2、0.8mM dNTP、1.6mM MgCl2、0.1U/μL Ex Taq的10×Buffer(10倍的缓冲液)和ddH2O的混合液，其中10×Buffer表示其在混合液中的体积分数为10％；
扩增反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，51.8℃40s，72℃60s，30个循环，72℃延伸10min；
鸭瘟病毒DNA为模板的PCR扩增反应的反应体系为含有0.2-1000ng/μL模板DNA、0.4μM上游引物P3、0.4μM下游引物P4、0.8mM dNTP、1.6mM MgCl2、0.1U/μL Ex Taq的10×Buffer和ddH2O的混合液，其中10×Buffer表示其在混合液中的体积分数为10％；
扩增反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，51.8℃40s，72℃60s，30个循环，72℃延伸10min；
E.将纯化后的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的PCR产物分别连接到载体pMD18-T上；再将连接后载体导入大肠杆菌感受态细胞，进行转化和涂板；最后进行提取获得阳性标准品质粒。
进一步的，所述双重荧光定量PCR检测体系具体包括：常规方法提取待测样品的RNA和DNA，并对RNA进行反转录反应获得cDNA；再以cDNA和DNA为模板进行双重荧光定量PCR反应。
进一步的，所述反转录反应的反应体系为含有0.2-1000ng/μL模板RNA、0.5μM随机引物、1mM dNTP、1U/μL Rnase Inhibition、200U Prime Script反转录酶的5×Primescript Buffer和DEPC水的混合液，其中5×Primescript Buffer表示其在混合液中的体积分数为20％。
进一步的，所述反转录反应的反应条件为：42℃水浴1h，70℃水浴10min，冰浴5min，获得病毒cDNA。
进一步的，所述双重荧光定量PCR反应的反应体系为含有0.5-1000ng/μL模板cDNA、0.2-1000ng/μL模板DNA、0.28μM上游引物DHV-I-F、0.28μM下游引物DHV-I-R、0.36μM荧光探针DHV-I-P、0.28μM上游引物DPV-F、0.28μM下游引物DPV-R、0.36μM荧光探针DPV-P的2×Premix Ex Taq和DEPC水的混合液，其中2×Premix Ex Taq表示其在混合液中的体积分数为50％。
进一步的，所述双重荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃30s；95℃5s、60℃50s，40个循环。
进一步的，所述双重荧光定量PCR反应条件的优化包括：
a.退火温度优化：以质粒为模板，在53℃-61℃进行梯度定量PCR，根据扩增反应Ct、扩增曲线的荧光信号强度和熔解曲线筛选最佳退火温度；
b.引物、探针浓度的优化：以质粒为模板，引物和探针的浓度为0.04-0.4μM，进行荧光定量PCR，确定引物和探针的最佳浓度。
本发明建立的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法可以同时检测和鉴别I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒两种病毒，具有操作简单、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，不仅可以节约成本、还可以为疫情监测和疫情控制争取到宝贵的时间，并且为这两种病毒所引起的传染性鸭病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。
附图说明
图1为本发明具体实施方式的I型鸭肝炎病毒的双重荧光定量PCR方法的标准曲线；
图2为本发明具体实施方式的鸭瘟病毒的双重荧光定量PCR方法的标准曲线；
图3为本发明具体实施方式的I型鸭肝炎病毒的双重荧光定量PCR方法的敏感性分析的扩增曲线；
图4为本发明具体实施方式的鸭瘟病毒的双重荧光定量PCR方法的敏感性分析的扩增曲线；
图5为本发明具体实施方式的I型鸭肝炎病毒的双重荧光定量PCR方法的特异性分析的扩增曲线；
图6为本发明具体实施方式的鸭瘟病毒的双重荧光定量PCR方法的特异性分析的扩增曲线。
具体实施方式
本发明具体实施方式中所采用的商品化试剂主要包括：
RNA体外提取试剂盒Total RNA kit(R6934)购自OMEGA公司；
DNA virus kit(D3809-01)购自OMEGA公司；
Ex taq酶购自TAKARA公司；
RNA反转录试剂盒Prime script RT Kit(RR047)购自TAKARA公司；
DNA片段回收试剂盒(08214RE1)购自AXY公司；
质粒小量提取试剂盒(06313KA1)购自AXY公司；
荧光定量Premix Ex Taq酶(RR390A)购自TAKARA公司。
若未特别指明，下列具体实施方式均按照常规实验条件。
一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法，包括：
(1)设计和合成引物和探针；
参考NCBI中I型鸭肝炎病毒的基因序列，采用Primer 5软件，设计合成一对扩增目的片段为516bp的引物，其扩增产物用于制备标准品，在该标准品序列中选取一段保守序列，应用Beacon designer 7.5软件设计合成一对能扩增78bp的荧光定量PCR引物和TaqMan荧光探针，设计的检测I型鸭肝炎病毒的特异性引物及探针的序列分别为：
上游引物DHV-I-F：5’-TGGGATACCCAGGAGTACACGTA-3’；
下游引物DHV-I-R：5’-TGTTAAGCTGGGAGGTGTCTTGT-3’；
荧光探针DHV-I-P：
5’-VIC-CACCCACTGGCTTTGGAGCTGTGC-TAMRA-3’；
参照鸭瘟病毒的UL6和UL7中的保守序列，采用Primer 5软件，设计合成一对扩增目的片段为337bp的引物，其扩增产物用于制备标准品，以该标准品为模板，应用Beacondesigner 7.5软件设计合成一对能扩增78bp的荧光定量PCR引物和TaqMan荧光探针，设计的检测鸭瘟病毒的特异性引物及探针的序列分别为：
上游引物DPV-F：5’-CGGTTTTGGGAAGGCTTTCG-3’；
下游引物DPV-R：5’-ACCCTAACGGCTCCTGTAG-3’；
荧光探针DPV-P：
5’-FAM-TCCACTGGCATTTGCTTGATTTCCGC-TAMRA-3’；
(2)制备阳性质粒标准品；
A.合成用于制备阳性质粒标准品的引物；
DHV引物：
上游引物P1：5’-GTTTTGGAAGGGAAGATACAGTGGT-3’；
下游引物P2：5’-GTAGGGTAGGGAATAGTAAAGTAAA-3’；
扩增目的片段为516bp；
DPV引物：
上游引物P3：5’-GCAGGGCATTTGTTAGACGATA-3’；
下游引物P4：5’-TGCCGCCAATTTGTAAAG-3’；
扩增目的片段为337bp；
B.用商品化试剂盒分别提取I型鸭肝炎病毒RNA和鸭瘟病毒DNA，在-70℃条件下保存备用；
C.对I型鸭肝炎病毒的RNA进行反转录反应获得cDNA，反应体系为含有20ng/μL模板RNA、0.5μM下游引物P2、1mM dNTP、1U/μL Rnase Inhibition、200U Prime Script反转录酶的5×Primescript Buffer和DEPC水的混合液；
具体步骤为：将RNA模板、下游引物P2放入65℃下水浴10min，然后冰浴5min，短暂离心后加入dNTP、Rnase Inhibition、Prime Script反转录酶、5×Primescript Buffer和DEPC水，42℃下水浴1h，70℃下水浴10min，冰浴5min，-20℃保存备用；
D.分别以I型鸭肝炎病毒的cDNA和鸭瘟病毒的DNA为模板进行PCR扩增反应，然后回收纯化扩增产物；
其中，I型鸭肝炎病毒的cDNA的PCR扩增反应的反应体系为含有20ng/μL模板cDNA、0.4μM上游引物P1、0.4μM下游引物P2、0.8mMdNTP、1.6mM MgCl2、0.1U/μL Ex Taq的10×Buffer和ddH2O的混合液；
扩增反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，51.8℃40s，72℃60s，30个循环，72℃延伸10min；
鸭瘟病毒DNA为模板的PCR扩增反应的反应体系为含有20ng/μL模板DNA、0.4μM上游引物P3、0.4μM下游引物P4、0.8mM dNTP、1.6mM MgCl2、0.1U/μL Ex Taq的10×Buffer和ddH2O的混合液；
扩增反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，51.8℃40s，72℃60s，30个循环，72℃延伸10min；
回收纯化扩增产物使用Axygen的DNA柱式胶回收试剂盒进行胶回收；
E.制备阳性标准品质粒，具体包括：将纯化后的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的PCR产物分别连接到载体pMD18-T上；再将连接后载体导入大肠杆菌感受态细胞，进行转化和涂板；最后进行提取获得阳性标准品质粒；
(3)进行双重荧光定量PCR反应条件的优化，建立双重荧光定量PCR检测体系；
S1.双重荧光定量PCR检测体系标准曲线的制作
以108-102copies/μL的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的质粒分别作为模板进行PCR扩增反应，得到I型鸭肝炎病毒的双重荧光定量PCR方法的标准曲线(图1)和鸭瘟病毒的双重荧光定量PCR方法的标准曲线(图2)，由图可知每个反应体系中模板拷贝数在108-102copies/μL的范围内有很好的线性关系，相关系数为0.999，I型鸭肝炎病毒的扩增效率为E＝100.8％，鸭瘟病毒的扩增效率为E＝95.7％；
S2.双重荧光定量PCR反应条件的优化
a.退火温度优化：以标准品质粒为模板，在53℃-61℃进行梯度定量PCR，根据扩增反应Ct、扩增曲线的荧光信号强度和熔解曲线筛选最佳退火温度；
b.引物、探针浓度的优化：以标准品质粒为模板，引物和探针的浓度为0.04-0.4μM，进行荧光定量PCR，确定引物和探针的最佳浓度；
经试验摸索表明，I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的引物的终浓度均为0.28μM，I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的探针的终浓度均为0.36μM，最佳退火温度为60℃；
S3.建立双重荧光定量PCR检测体系，检测体系具体包括：
①采用商业试剂盒，使用常规方法提取待测品的RNA和DNA，并对RNA进行反转录反应获得cDNA，所述反转录反应的反应体系为含有0.2-1000ng/μL模板RNA、0.5μM随机引物、1mM dNTP、1U/μL Rnase Inhibition、200U Prime Script反转录酶的5×PrimescriptBuffer和DEPC水的混合液；
反转录反应的反应体系中的随机引物、dNTP、Rnase Inhibition、Prime Script反转录酶、5×Primescript Buffer、DEPC水均来自RNA反转录试剂盒Prime script RT Kit(RR047)；
反应条件：42℃水浴1h，70℃水浴10min，冰浴5min，获得病毒cDNA；
②以cDNA和DNA为模板进行双重荧光定量PCR反应，反应体系为含有0.5-1000ng/μL模板cDNA、0.2-1000ng/μL模板DNA、0.28μM上游引物DHV-I-F、0.28μM下游引物DHV-I-R、0.36μM荧光探针DHV-I-P、0.28μM上游引物DPV-F、0.28μM下游引物DPV-R、0.36μM荧光探针DPV-P的2×Premix Ex Taq和DEPC水的混合液；
反应条件为：95℃ 30s；95℃5s、60℃50s(收集荧光信号)，40个循环；
S4.对已经建立的双重荧光定量PCR检测体系进行检验
①双重荧光定量PCR检测方法的敏感性分析
将质粒标准品进行10倍倍比稀释，取1×108-1×102copies/μL标准质粒各2μL作为混合模板进行双重荧光定量PCR检测，确定最低检出量并设立阴性对照；
设置7组试验，分别以10倍倍比稀释的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的质粒(1×108-1×102copies/μL)作为模板进行PCR扩增，试验组号与质粒浓度的对应关系如表1所示：
表1试验组号与质粒浓度的对应关系
试验组号 质粒浓度(copies/μL)
1 1×108
2 1×107
3 1×106
4 1×105
5 1×104
6 1×103
7 1×102
敏感性结果分别见图3和图4，由图可知，采用1×102copies/μL的质粒作为模板对I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒进行PCR检测仍然都有荧光曲线，表明该检测方法敏感度为100copies/μL；
②双重荧光定量PCR检测方法的特异性分析
应用本发明提供的双重荧光定量PCR检测体系，分别对包括I型鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒在内的多种病毒样品进行检测，验证I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法的特异性；
应用本发明提供的双重荧光定量PCR检测方法对12组病毒样品进行检测，各组病毒样品中所含病毒种类如表2所示：
表2各组病毒样品中所含病毒种类
特异性结果如图5和图6所示，由图可知，只有I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒有扩增荧光曲线，其他病原核酸检测均无扩增荧光曲线，因此该检测方法特异性较好；
③双重荧光定量PCR检测方法的重复性分析
重复性试验分为组内重复试验和组间重复试验，
组内重复试验：在同一试验中用106copies/μL的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的质粒标准品混合模板做5个平行的反应，计算各浓度荧光Ct值的标准差和变异系数，验证I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法的稳定性；
组内重复试验结果如表3所示，对同一样品做5个平行的反应，I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法的组内重复性良好；
表3双重荧光定量PCR组内重复性试验
组间重复试验：对上述同一混合模板以相同的反应条件在3d和7d后重复进行试验，计算其Ct值的标准差和变异系数，验证I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法的稳定性；
组间重复试验结果如表4所示，采用相同的核酸模板，以相同的检测条件，3d和7d后重复进行试验，I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的Ct值平均变异系数分别为0.30％和1.2％，I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法的组间重复性良好；
表4双重荧光定量PCR组间重复性试验
(4)采用双重荧光定量PCR检测体系对病毒进行检测；
利用建立的双重荧光定量PCR检测体系对江苏徐州地区鸭群收集的166份肛拭子进行检测，结果检出Ⅰ型鸭肝炎病毒13份(阳性率7.8％)，鸭瘟病毒75份(阳性率45％)。
最后应说明的是，以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120> I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
TGGGATACCC AGGAGTACAC GTA 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
TGTTAAGCTG GGAGGTGTCT TGT 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
CACCCACTGG CTTTGGAGCT GTGC 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
CGGTTTTGGG AAGGCTTTCG 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ACCCTAACGG CTCCTGTAG 19
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
TCCACTGGCA TTTGCTTGAT TTCCGC 26

Claims (7)

1.一种I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法，其特征在于，所述方法中：
设计检测I型鸭肝炎病毒的特异性引物及探针的序列分别为：
上游引物DHV-I-F：5’-TGGGATACCCAGGAGTACACGTA-3’；
下游引物DHV-I-R：5’-TGTTAAGCTGGGAGGTGTCTTGT-3’；
荧光探针DHV-I-P：
5’-VIC-CACCCACTGGCTTTGGAGCTGTGC-TAMRA-3’；
设计检测鸭瘟病毒的特异性引物及探针的序列分别为：
上游引物DPV-F：5’-CGGTTTTGGGAAGGCTTTCG-3’；
下游引物DPV-R：5’-ACCCTAACGGCTCCTGTAG-3’；
荧光探针DPV-P：
5’-FAM-TCCACTGGCATTTGCTTGATTTCCGC-TAMRA-3’。
2.根据权利要求1所述的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)设计及合成引物和探针；
(2)制备阳性质粒标准品；
(3)进行双重荧光定量PCR反应条件的优化，建立双重荧光定量PCR检测体系；
(4)采用双重荧光定量PCR检测体系对病毒进行检测。
3.根据权利要求2所述的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法，其特征在于，所述双重荧光定量PCR检测体系具体包括：常规方法提取待测样品的RNA和DNA，并对RNA进行反转录反应获得cDNA；再以cDNA和DNA为模板进行双重荧光定量PCR反应。
4.根据权利要求3所述的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法，其特征在于，所述反转录反应的反应体系为含有0.2-1000ng/μL模板RNA、0.5μM随机引物、1mM dNTP、1U/μL Rnase Inhibition、200U Prime Script反转录酶的5×Primescript Buffer和DEPC水的混合液。
5.根据权利要求4所述的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法，其特征在于，所述反转录反应的反应条件为：42℃水浴1h，70℃水浴10min，冰浴5min，获得病毒cDNA。
6.根据权利要求3所述的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法，其特征在于，所述双重荧光定量PCR反应的反应体系为含有0.5-1000ng/μL模板cDNA、0.2-1000ng/μL模板DNA、0.28μM上游引物DHV-I-F、0.28μM下游引物DHV-I-R、0.36μM荧光探针DHV-I-P、0.28μM上游引物DPV-F、0.28μM下游引物DPV-R、0.36μM荧光探针DPV-P的2×Premix Ex Taq和DEPC水的混合液。
7.根据权利要求6所述的I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量PCR方法，其特征在于，所述双重荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃30s；95℃5s、60℃50s，40个循环。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107287352A (zh) * 2017-08-02 2017-10-24 山东省农业科学院家禽研究所 鸭肠炎病毒和鸭肝炎病毒快速检测的探针引物组及其方法
CN107475452A (zh) * 2017-09-21 2017-12-15 四川农业大学 一种检测鸭瘟病毒icp4基因的引物以及rt‑pcr和荧光定量pcr检测方法
CN107475453A (zh) * 2017-09-21 2017-12-15 四川农业大学 一种检测鸭瘟病毒ul48基因的引物以及rt‑pcr和荧光定量pcr检测方法
CN108531652A (zh) * 2018-04-20 2018-09-14 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心） 一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103773899A (zh) * 2014-01-26 2014-05-07 广西壮族自治区兽医研究所 鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103773899A (zh) * 2014-01-26 2014-05-07 广西壮族自治区兽医研究所 鉴别11种鸭病毒病的GeXP检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘海燕等: "I型鸭肝炎病毒 TaqMan 荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用", 《中国比较医学杂志》 *
石建平等: "实时荧光定量PCR快速检测鸭病毒性肠炎标准方法的建立", 《中国兽医学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107287352A (zh) * 2017-08-02 2017-10-24 山东省农业科学院家禽研究所 鸭肠炎病毒和鸭肝炎病毒快速检测的探针引物组及其方法
CN107475452A (zh) * 2017-09-21 2017-12-15 四川农业大学 一种检测鸭瘟病毒icp4基因的引物以及rt‑pcr和荧光定量pcr检测方法
CN107475453A (zh) * 2017-09-21 2017-12-15 四川农业大学 一种检测鸭瘟病毒ul48基因的引物以及rt‑pcr和荧光定量pcr检测方法
CN107475452B (zh) * 2017-09-21 2021-03-23 四川农业大学 一种检测鸭瘟病毒icp4基因的引物以及rt-pcr和荧光定量pcr检测方法
CN108531652A (zh) * 2018-04-20 2018-09-14 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心） 一种水禽重要疫病定量检测标准品的制备方法及应用

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