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CN109647298B - 聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料及应用 - Google Patents

聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种聚乙烯‑氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料及应用，本发明的聚乙烯‑氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料是将聚乙烯微球浸入醋酸锌溶液中，待表面沾有醋酸锌后，取出微球，通过氧等离子清洗机打氧处理，使微球表面结合氧化锌。将表面带有氧化锌的聚乙烯微球置于硝酸锌与六甲基四胺混合液中，在80‑100℃恒温水浴下搅拌，待反应完全后，洗涤、干燥，即得。该微球结构稳定、尺寸均一、直径为150‑400μm，氧化锌纳米棒长度为10‑50nm。将人脂肪间充质干细胞接种在该微球上，可以促进干细胞的增殖，并维持干细胞的干性。

Description

聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料及应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料及其在维持干细胞干性中的应用。
背景技术
干细胞治疗技术在基因治疗、自身免疫性疾病、脑部和神经系统疾病治疗、心血管疾病治疗中显示出巨大的临床应用前景。其中，自体成体干细胞移植的优势尤为突出。
成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，产生各种特异的细胞类型。与胚胎干细胞相比，成体干细胞具有诸多的优势，例如：(1)由于每个个体的主要组织相容性复合体(MHC)不同，同种异体胚胎干细胞及其分化组织细胞用于临床会引起免疫排斥，因而限制了其临床应用；而成体干细胞可从患者自身获得，而不存在组织相容性的问题，治疗时可避免长期使用免疫抑制剂对患者的伤害。(2)虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但这种分化是“非定位性”的，目前尚不能控制胚胎干细胞在特定的部位分化成相应的细胞，当前的做法容易导致畸胎瘤；而成体干细胞在应用时不存在上述问题。然而成体干细胞在机体中数量有限，需要体外扩增以满足临床需求。传统的平皿培养存在接触抑制现象，细胞增殖率低，且极易分化或老化，严重影响了干细胞的数量和质量。因此，开发一种新型的维持成体干细胞干性的培养方法迫在眉睫。
微球是指由天然或合成的高分子材料(如明胶、壳聚糖、聚乳酸等)制成，粒径在1-1000微米之间。微球的制备方法主要有乳化/溶剂挥发法、喷雾干燥法、超临界二氧化碳法以及微流控法等。制备方法的不同导致制备得到的微球的形貌、结构、性能等都存在差异。
聚乙烯(PE)是由乙烯聚合而成的聚合物，具有优良的耐低温性能，化学稳定性好，被广泛应用于制造薄膜、中空制品、纤维和日用杂品等。纳米氧化锌具有优异的表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等，同时具有光化学效应和较好的遮蔽紫外线性能，具有广阔的应用前景。但由于纳米氧化锌具有比表面积大和比表面积能大等特点，自身易团聚；另一方面，纳米氧化锌表面极性较强，在有机介质中不易均匀分散，这就极大的限制了其纳米效应的发挥。目前还未见有将聚乙烯和纳米氧化锌复合制成微球的形式。
另外，目前微球主要用于药物缓释、细胞支架和细胞注射等领域，还未有利用微球促进成体干细胞增殖、并维持成体干细胞干性的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料。本发明创新性的将聚乙烯和氧化锌复合制成微球材料，在微米级的聚乙烯微球表面包被有氧化锌纳米结构，形成微米纳米多级结构复合微球材料。
本发明的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料具有良好的细胞相容性，能够促进成体干细胞增殖，细胞存活率在98％以上，且能维持成体干细胞的干性，采用本发明的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料扩增后的成体干细胞具有良好的分化潜能，可以分化为成骨、脂肪以及软骨细胞。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯微球浸入醋酸锌溶液中，于20-30℃恒温水浴反应4-24h，取出聚乙烯微球，利用氧等离子清洗机对聚乙烯微球进行处理(真空度50Pa，处理功率100W，处理10分钟)，使聚乙烯微球表面覆盖氧化锌层；
(2)将表面覆盖氧化锌层的聚乙烯微球置于硝酸锌-六次甲基四胺混合液中，于80-100℃恒温水浴下搅拌，反应1-4天，收获微球，洗涤，干燥，即得聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料。
步骤(1)中，所述聚乙烯微球的直径为150-400μm。所述聚乙烯微球为市售的聚乙烯微球；或者根据现有技术的方法制备的聚乙烯微球。只要聚乙烯微球的直径在150-400μm之间均可用于本发明。
步骤(1)中，所述醋酸锌溶液的浓度为0.01mol/L-0.25mol/L。
步骤(2)中，所述硝酸锌-六次甲基四胺混合液中，硝酸锌和六次甲基四胺的质量比为1:1，硝酸锌的终浓度为0.01mol/L-0.2mol/L。
步骤(2)中，搅拌的速度为100rpm-1000rpm。
本发明的第二方面，提供上述方法制备的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料。所述聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料的直径为150-400μm，氧化锌纳米棒长度为10-50nm。
本发明的第三方面，提供上述聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料在如下1)-3)至少一项中的应用：
1)促进成体干细胞增殖、并维持成体干细胞干性；
2)成体干细胞的体外扩增；
3)制备促进成体干细胞增殖、并维持成体干细胞干性的培养基。
本发明的第四方面，提供一种能够促进成体干细胞增殖、并维持成体干细胞干性的培养基，所述培养基以上述的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料为有效成分。
本发明的第五方面，提供一种体外扩增成体干细胞的方法，包括以下步骤：将成体干细胞接种至上述培养基中，进行扩增培养。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次以聚乙烯微球为基础单位，在其表面合成氧化锌纳米结构，制备的复合微球材料粒径均一、形态可控。
(2)本发明的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料具有良好的细胞相容性，能够促进成体干细胞增殖，且能维持成体干细胞的干性，采用本发明的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料扩增后的成体干细胞具有良好的分化潜能，可以分化为成骨、脂肪以及软骨细胞。
附图说明：
图1：本发明的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料的制备流程图。
图2：本发明的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料的结构示意图。
图3：CCK8活性检测显示人源脂肪间充质干细胞的增殖率。其中，正常组为生长在培养皿中的细胞；材料组1-3分别为生长在实施例1-3获得的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球的细胞。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，现有的成体干细胞体外扩增方法，其细胞繁殖率低，且在增殖培养的过程中极易分化或老化，严重影响成体干细胞的数量和质量。
基于此，本发明的目的是提供一种新型的能够促进成体干细胞增殖、且能维持干细胞干性的培养方法。
传统的微球一般是用于药物缓释、细胞支架和细胞注射等领域，特别是作为药物的载体，目前还未有关于微球在干细胞增殖和干细胞干性维持中的报道。不同方法制备得到的微球的形貌、结构、性能等都会存在较大差异，将聚乙烯和氧化锌复合制备的微球目前还未见有报道。
本发明首次将聚乙烯和氧化锌制备得到表面包被有氧化锌纳米结构的微球，并意外的发现，利用特定形貌和结构组成的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料可以促进成体干细胞的增殖，并维持干细胞的干性。
在本发明的一种实施方案中，给出了聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料的制备方法(图1)，包括以下步骤：
将聚乙烯微球浸入醋酸锌溶液中，于20-30℃恒温水浴下浸泡4-24小时，收集后利用氧plasma处理，使微球表面附着氧化锌。待干燥后，将该微球置于含有硝酸锌与六次甲基四胺质量比为1:1的溶液中，在90℃恒温水浴下搅拌，反应1-4天，收获微球，用去离子水清洗三次，再用无水乙醇清洗后，真空干燥，获得表面包被氧化锌纳米结构的聚乙烯微球(图2)。
本发明的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料的制备方法中，各步骤间相辅相成，具有协同促进作用，是一个有机的整体。其中，首先将具有微米尺寸的聚乳酸微球浸入醋酸锌溶液中，并利用氧plasma处理，使微球表面附着氧化锌，此时的氧化锌还没有生长成为纳米结构，只是作为种子层，在此基础上，本发明进一步的将表面附着氧化锌的聚乙烯微球置于含有硝酸锌与六次甲基四胺的混合溶液中进行处理，在此条件下，氧化锌在聚乙烯微球表面生长成为纳米棒状结构。醋酸锌溶液浓度以及微球在硝酸锌与六次甲基四胺混合液中的反应温度和时间等因素，都会影响制备的复合微球材料的结构、形貌和性能。
经试验验证，聚乙烯微球的尺寸以及在聚乙烯微球表面生长的纳米氧化锌的尺寸会影响对成体干细胞的增殖效果，只有采用本发明方法制备的具有特定结构组成和形貌的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料才可以促进成体干细胞的增殖，并维持干细胞的干性。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料的制备
将聚乙烯微球(微球直径150μm)浸入浓度为0.15mol/L醋酸锌溶液中，于25℃恒温水浴反应12h，使聚乙烯微球表面包覆有醋酸锌；取出聚乙烯微球，利用氧等离子清洗机对聚乙烯微球进行处理(真空度50Pa，处理功率100W，处理10分钟)，使聚乙烯微球表面覆盖氧化锌层。
将表面覆盖氧化锌层的聚乙烯微球置于硝酸锌-六次甲基四胺混合液中，所述硝酸锌-六次甲基四胺混合液中，硝酸锌和六次甲基四胺的质量比为1:1，硝酸锌的终浓度为0.01mol/L，于90℃恒温水浴下搅拌，反应2天，收获微球，用去离子水清洗三次，再用无水乙醇清洗后，真空干燥，即得聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料。
实施例2：聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料的制备
将聚乙烯微球(微球直径400μm)浸入浓度为0.01mol/L醋酸锌溶液中，于30℃恒温水浴反应4h，使聚乙烯微球表面包覆有醋酸锌；取出聚乙烯微球，利用氧等离子清洗机对聚乙烯微球进行处理(真空度50Pa，处理功率100W，处理10分钟)，使聚乙烯微球表面覆盖氧化锌层。
将表面覆盖氧化锌层的聚乙烯微球置于硝酸锌-六次甲基四胺混合液中，所述硝酸锌-六次甲基四胺混合液中，硝酸锌和六次甲基四胺的质量比为1:1，硝酸锌的终浓度为0.1mol/L，于80℃恒温水浴下搅拌，反应4天，收获微球，用去离子水清洗三次，再用无水乙醇清洗后，真空干燥，即得聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料。
实施例3：聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料的制备
将聚乙烯微球(微球直径200μm)浸入浓度为0.25mol/L醋酸锌溶液中，于20℃恒温水浴反应24h，使聚乙烯微球表面包覆有醋酸锌；取出聚乙烯微球，利用氧等离子清洗机对聚乙烯微球进行处理(真空度50Pa，处理功率100W，处理10分钟)，使聚乙烯微球表面覆盖氧化锌层。
将表面覆盖氧化锌层的聚乙烯微球置于硝酸锌-六次甲基四胺混合液中，所述硝酸锌-六次甲基四胺混合液中，硝酸锌和六次甲基四胺的质量比为1:1，硝酸锌的终浓度为0.2mol/L，于100℃恒温水浴下搅拌，反应1天，收获微球，用去离子水清洗三次，再用无水乙醇清洗后，真空干燥，即得聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料。
试验例1：
将人源脂肪间充质干细胞接种在实施例1-实施例3制备的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料上，分别培养1、3、5天后，检测细胞存活率。通过CCK8染色，发现与对照材料(培养皿)相比，在微球上生长的细胞增殖率显著升高(图3)，说明材料具有很好的生物相容性，且促进干细胞的增殖。在成骨和成脂诱导液的作用下，微球上收获的脂肪间充质干细胞能够分化为成骨和脂肪细胞。
结果表明，本发明制备的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料能够促进脂肪间充质干细胞的增殖，并能够维持细胞的干性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将聚乙烯微球浸入醋酸锌溶液中，于20-30℃恒温水浴反应4-24h，取出聚乙烯微球，利用氧等离子清洗机对聚乙烯微球进行处理，使聚乙烯微球表面覆盖氧化锌层；
(2)将表面覆盖氧化锌层的聚乙烯微球置于硝酸锌-六次甲基四胺混合液中，于80-100℃恒温水浴下搅拌，反应1-4天，收获微球，洗涤，干燥，即得聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚乙烯微球的直径为30-400μm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述醋酸锌溶液的浓度为0.01mol/L-0.25mol/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述硝酸锌-六次甲基四胺混合液中，硝酸锌和六次甲基四胺的质量比为1:1，硝酸锌的终浓度为0.01mol/L-0.2mol/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，搅拌的速度为100rpm-1000rpm。
6.权利要求1-5任一项所述的方法制备的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料。
7.根据权利要求6所述的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料，其特征在于，所述聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料的直径为150-400μm，氧化锌纳米棒长度为10-50nm。
8.权利要求6或7所述的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料在如下1)-3)至少一项中的应用：
1)促进成体干细胞增殖、并维持成体干细胞干性；
2)成体干细胞的体外扩增；
3)制备促进成体干细胞增殖、并维持成体干细胞干性的培养体系。
9.一种能够促进成体干细胞增殖、并维持成体干细胞干性的培养体系，其特征在于，所述培养体系以权利要求6或7所述的聚乙烯-氧化锌微米纳米多级结构复合微球材料为有效成分。
10.一种体外扩增成体干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将成体干细胞接种至权利要求9所述的培养体系中，进行扩增培养。
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