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CN109642235B - 用于植物中的基因组修饰的方法和组合物 - Google Patents

用于植物中的基因组修饰的方法和组合物 Download PDF

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CN109642235B CN201780051254.8A CN201780051254A CN109642235B CN 109642235 B CN109642235 B CN 109642235B CN 201780051254 A CN201780051254 A CN 201780051254A CN 109642235 B CN109642235 B CN 109642235B
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Abstract

本公开涉及植物转化的领域。本公开提供了用于提高植物中目标序列的定点整合速率的方法。本公开还提供了用于提高根瘤菌目介导的植物转化效率的方法。

Description

用于植物中的基因组修饰的方法和组合物
优先权声明和序列表的并入
本申请要求于2016年6月28日提交的美国临时专利申请第62/355,715号的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。序列表的计算机可读形式与本申请一起通过电子提交方式提交，并且通过引用整体并入本申请。包含在名为“P34339WO00_SEQ.txt”的文件中的序列表(其大小为12,613字节(在中测量的)并于2017年6月26日创建)，以电子方式随同提交，并通过引用整体并入。
发明领域
本公开涉及植物转化领域。提供了用于从土壤杆菌属(Agrobacterium)质粒转移DNA的T链的方法和组合物。还提供了使用土壤杆菌属介导的DNA的T链转移以促进转基因的模板化基因编辑和定点整合的方法和组合物。还提供了用于提高土壤杆菌属介导的转化的效率的方法。还提供了非土壤杆菌属介导的转化方法和组合物。
背景技术
土壤杆菌属介导的转化利用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将从重组质粒合成的单链DNA转移至植物细胞。植物细胞的转化通常需要与根癌土壤杆菌共培养。将目标DNA序列整合到特别构建的DNA质粒中，其中目标DNA序列侧接有土壤杆菌属肿瘤诱导(Ti)质粒右边界DNA区域和左边界DNA区域。当内切核酸酶VirD2在右边界和左边界区域中使DNA质粒产生切口以释放单链转移DNA(也称为T-链)时，土壤杆菌属介导的转化过程开始。T链将位于右边界与左边界之间的转基因转移到靶向的植物细胞中，其中T链可以整合到基因组中(参见，例如，美国专利第5,034,322号；Pitzschke和Hirt.The EMBO Journal(2010)29:1021-1032)。右边界，而非左边界，对植物细胞的成功转化是必需的(参见Wang等，Cell(1984)38:455-462；和van Haaren等Plant Molecular Biology(1987)8:95-104)。通过土壤杆菌属介导的转化已经转化的植物细胞可被操作来再生成整个可育植物。
成功的土壤杆菌属介导的植物细胞转化通常导致植物基因组中的随机整合。如果转基因插入必需的内源基因，此类随机整合可对植物细胞产生有害影响。类似地，由于插入转基因的染色体的位置效应，此类随机整合可能对转基因的表达具有有害影响。本领域需要用于植物细胞的土壤杆菌属介导的转化方法，所述方法促进转基因的模板化基因编辑和定点整合。
发明内容
在一个方面，本公开提供了转化植物细胞的方法，包括使植物细胞与能够转化植物细胞的根瘤菌目(Rhizobiales)细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成在T链的至少一部分中是基本上互补的两条T链的载体。在另一方面，所述至少一种载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，并且RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在另一替代方面，所述至少一种载体包含RB1、RB2、目标序列、第一左边界DNA序列(LB1)和第二左边界DNA序列(LB2)，其中所述载体被配置成使得RB1与位于所述载体中的LB1配对以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于所述第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2与位于所述载体中的LB2配对以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在另一替代方面，所述载体包含第一目标序列和第二目标序列，其中第一目标序列与第二目标序列基本相同，其中所述载体还包含位于所述载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向，并且所述载体还包含位于所述载体中的RB2和LB2以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第二目标序列相对于第一T链中的第一目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列和第二目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在另一替代方面，根瘤菌目(Rhizobiales)细胞包含至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且其中第二载体包含位于第二载体中的RB2和LB2)，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在另一个替代方面，载体包含第一目标序列、与第一目标序列不同的第二目标序列、至少两个RB DNA序列和一个或多个任选的LB DNA序列，其中第一RB DNA序列(RB1)和第一LB DNA序列(LB1)位于所述载体中以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第二RB DNA序列(RB2)和第二LB DNA序列(LB2)，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第一目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的，并且其中载体构型还包含位于所述载体中的第三RB DNA序列(RB3)和第三LBDNA序列(LB3)，以启动(RB3)和终止(LB3)第三T链的合成，使得第二目标序列处于第三T链的5’端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第四RB DNA序列(RB4)和第四LB DNA序列(LB4)，以启动(RB4)和终止(LB4)第四T链的合成，使得第二目标序列处于第四T链的5’端至3’端的反义方向，并且由RB3和RB4处的启动产生的两条T链在第二目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。在一些实施方案中，RB1在LB2的5’。在一些实施方案中，RB1在LB2的3’。在一些实施方案中，RB2在LB1的5’。在一些实施方案中，RB2在LB1的3’。
在一个方面，本公开提供了转化植物细胞的方法，包括使植物细胞与两个或更多个能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述两个或更多个根瘤菌目细胞各自含有至少两个能够形成两个基本上互补的T-链的载体中的一种。在另一方面，每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含第一右边界DNA序列(RB1)，并且其中RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于所述载体中的第二右边界DNA序列(RB2)以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在另一替代方面，每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的RB1和第一左边界DNA(LB1)以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于第二载体中的RB2和第二左边界DNA序列(LB2)以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链的目标序列是基本上互补的。在一些实施方案中，RB1在LB2的5’。在一些实施方案中，RB1在LB2的3’。在一些实施方案中，RB2在LB1的5’。在一些实施方案中，RB2在LB1的3’。
在一个方面，本公开提供了提高目标序列的定点整合率的方法，包括使植物细胞与至少一种能够形成两条基本上互补的T链的载体接触。在另一方面，所述至少一种载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，其中RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在另一替代方面，所述至少一种载体包含RB1、RB2、目标序列、第一左边界DNA序列(LB1)和第二左边界DNA序列(LB2)，并且其中所述载体被配置成使得RB1与位于所述载体中的LB1配对以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2与位于所述载体中的LB2配对以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在另一替代方面，所述载体包含第一目标序列和第二目标序列，其中第一目标序列与第二目标序列基本相同；其中所述载体还包含位于所述载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体还包含位于所述载体中的RB2和LB2以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第二目标序列相对于第一T链中的第一目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列和第二目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在另一替代方面，根瘤菌目细胞包含至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于第二载体中的RB2和LB2，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中基本上是互补的。在另一替代方面，载体包含第一目标序列、与第一目标序列不同的第二目标序列、至少两个RB DNA序列和一个或多个任选的LB DNA序列，其中第一RB DNA序列(RB1)和第一LB DNA序列(LB1)位于所述载体中以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第二RB DNA序列(RB2)和第二LB DNA序列(LB2)，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第一目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的，并且其中载体构型还包含位于所述载体中的第三RB DNA序列(RB3)和第三LB DNA序列(LB3)，以启动(RB3)和终止(LB3)第三T链的合成，使得第二目标序列处于第三T链的5’端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第四RB DNA序列(RB4)和第四LBDNA序列(LB4)，以启动(RB4)和终止(LB4)第四T链的合成，使得第二目标序列处于第四T链的5’端至3’端的反义方向，并且由RB3和RB4处的启动产生的两条T链在第二目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。在一些实施方案中，RB1在LB2的5’。在一些实施方案中，RB1在LB2的3’。在一些实施方案中，RB2在LB1的5’。在一些实施方案中，RB2在LB1的3’。
在一个方面，本公开提供了提高目标序列的定点整合率的方法，其包括使植物细胞与两种或更多种根瘤菌目细胞接触，其中所述两种或更多种根瘤菌目细胞各自含有至少两个能够形成两个基本上互补的T-链的载体中的一种。在另一方面，每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含第一右边界DNA序列(RB1)，并且其中第一RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于所述载体中的第二右边界DNA序列(RB2)以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在另一替代方面，每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的RB1和第一左边界(LB1)以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于所述第一T链的5’端至3’端处于有义方向；并且第二载体包含位于第二载体中的RB2和第二左边界(LB2)以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列是基本上彼此互补的。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种(Agrobacterium spp.)、慢生根瘤菌属的某种(Bradyrhizobium spp.)、中生根瘤菌属的某种(Mesorhizobium spp.)、苍白杆菌属的某种(Ochrobactrum spp.)、叶杆菌属的某种(Phyllobacterium spp.)、根瘤菌属的某种(Rhizobium spp.)和中华根瘤菌属的某种(Sinorhizobium spp.)。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性(dominant-negative)Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，RB1在LB2的5’。在一些实施方案中，RB1在LB2的3’。在一些实施方案中，RB2在LB1的5’。在一些实施方案中，RB2在LB1的3’。
在一个方面，本公开提供了转化植物细胞的方法，其包括使植物细胞与能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种包含右边界DNA序列(RB)和左边界DNA序列(LB)的载体，并且其中所述载体在RB与LB之间包含：(i)相对于RB处于有义方向的第一目标序列，(ii)间隔子，和(iii)相对于RB处于反义方向的第二目标序列，其中所述第一目标序列和第二目标序列是基本上互补的并且在T链合成后退火以形成双链DNA。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
在一个方面，本公开提供了提高双链DNA至植物细胞基因组中的定点整合率的方法，其包括使植物细胞与至少一种包含右边界DNA序列(RB)和左边界DNA序列(LB)的载体接触，其中所述载体在RB与LB之间包含：(i)相对于RB处于有义方向的第一目标序列，(ii)间隔子，和(iii)相对于RB处于反义方向的第二目标序列，其中所述第一目标序列和第二目标序列是基本上互补的并且在T链合成后退火，其中双链DNA被整合到植物细胞的基因组中。
在一个方面，本公开提供了包含至少一个能够形成两个基本上互补的T链的载体的土壤杆菌属细胞。
在一个方面，本公开提供了包含至少一种载体的土壤杆菌属细胞，所述载体包含右边界DNA序列(RB)和左边界DNA序列(LB)，并且其中所述载体在RB与LB之间包含：(i)相对于RB处于有义方向的第一目标序列，(ii)间隔子，和(iii)相对于RB处于反义方向的第二目标序列，其中所述第一目标序列和第二目标序列是基本上互补的并且在T链合成后退火以形成双链DNA。
在一个方面，本公开提供了转化植物基因组的方法，其包括使至少一种植物细胞与至少一种能够转化所述植物细胞的根瘤菌目细胞在共培养基上接触至少2天，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成两个基本上互补的T链的载体。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
在一个方面，本公开提供了转化植物基因组的方法，其包括使至少一种植物细胞与至少一种能够转化所述植物细胞的根瘤菌目细胞在共培养基上接触至少2天，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种载体，所述载体包含右边界(RB)DNA序列和左边界(LB)DNA序列，并且其中所述载体还包在RB与LB DNA序列之间包含：(i)相对于RB DNA序列处于有义方向的第一目标序列，和(ii)间隔子，以及(iii)相对于RB DNA序列处于反义方向的第二目标序列，其中所述第一目标序列和第二目标序列是基本上互补的并且在T链合成后退火以形成双链DNA。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
在一个方面，本公开提供了转化植物基因组的方法，其包括使至少一种植物细胞与至少一种能够转化所述植物细胞的根瘤菌目细胞在共培养基上接触至少3天，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成两个基本上互补的T链的载体。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
在一个方面，本公开提供了转化植物基因组的方法，其包括使至少一种植物细胞与至少一种能够转化所述植物细胞的根瘤菌目细胞在共培养基上接触至少3天，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种包含右边界(RB)DNA序列和左边界(LB)DNA序列的载体，并且其中所述载体还包在RB与LB DNA序列之间包含：(i)相对于RB DNA序列处于有义方向的第一目标序列，和(ii)间隔子，以及(iii)相对于RB DNA序列处于反义方向的第二目标序列，其中所述第一目标序列和第二目标序列是基本上互补的并且在T链合成后退火以形成双链DNA。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
几个实施方案涉及向植物细胞提供目标序列的方法，其包括使植物细胞与能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成在T链的至少一部分中基本上互补的两条T链的载体，其中所述至少一种载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，并且其中RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列(insulator sequence)、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫(landingpad)、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含以下的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞(canola cell)、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
向植物细胞提供目标序列的方法，其包括使植物细胞与能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成在T链的至少一部分中基本上互补的两条T链的载体，其中所述至少一种载体包含RB1、RB2、目标序列、第一左边界DNA序列(LB1)和第二左边界DNA序列(LB2)，其中所述载体被配置成使得RB1与位于所述载体中的LB1配对以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2与位于所述载体中的LB2配对以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA (nat-siRNA)、示踪RNA (tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA (sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。
向植物细胞提供目标序列的方法，其包括使植物细胞与能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成在T链的至少一部分中基本上互补的两条T链的载体，其中所述载体包含第一目标序列和第二目标序列，其中所述第一目标序列与所述第二目标序列基本上相同；其中所述载体还包含位于所述载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体还包含位于所述载体中的RB2和LB2以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第二目标序列相对于第一T链中的第一目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列和第二目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ IDNO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA (miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA (siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
向植物细胞提供目标序列的方法，其包括使植物细胞与能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成在T链的至少一部分中基本上互补的两条T链的载体，其中根瘤菌目细胞包含至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中所述第一载体包含位于第一载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且其中所述第二载体包含位于所述载体中的RB2和LB2)以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA (ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA (nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
向植物细胞提供目标序列的方法，其包括使植物细胞与能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成在T链的至少一部分中基本上互补的两条T链的载体，其中所述至少一种载体包含第一目标序列、与第一目标序列不同的第二目标序列、至少两个RB DNA序列以及一个或多个任选的LB DNA序列，其中所述第一RB DNA序列(RB1)和第一LB DNA序列(LB1)位于所述载体中以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述第二载体构型还包含位于所述载体中的第二RB DNA序列(RB2)和第二LB DNA序列(LB2)，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第一目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的，并且其中载体构型还包含位于所述载体中的第三RB DNA序列(RB3)和第三LB DNA序列(LB3)，以启动(RB3)和终止(LB3)第三T链的合成，使得第二目标序列处于第三T链的5'端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第四RB DNA序列(RB4)和第四LBDNA序列(LB4)，以启动(RB4)和终止(LB4)第四T链的合成，使得第二目标序列处于第四T链的5’端至3’端的反义方向，并且由RB3和RB4处的启动产生的两条T链在第二目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ IDNO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。
几个实施方案涉及转化植物细胞的方法，所述方法包括使植物细胞与两种或更多种能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述两种或更多种根瘤菌目细胞各自含有至少两种能够形成两条基本上互补的T链的载体中的至少一种，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含第一右边界DNA序列(RB1)，并且其中RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于所述载体中的第二右边界DNA序列(RB2)以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。
几个实施方案涉及转化植物细胞的方法，所述方法包括使植物细胞与两种或更多种能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述两种或更多种根瘤菌目细胞各自含有至少两种能够形成两条基本上互补的T链的载体中的至少一种，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的RB1和第一左边界DNA序列(LB1)以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得所述目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于所述载体中的RB2和第二左边界DNA序列(LB2)以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列是基本上彼此互补的。在一些实施方案中，RB1与RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1与LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1与RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1与LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1与RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ IDNO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
几个实施方案涉及提高目标序列的定点整合率的方法，所述方法包括使植物细胞与至少一种能够形成两条基本上互补的T链的载体接触，其中所述至少一种载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，并且其中RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ IDNO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5'的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3'的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。
几个实施方案涉及提高目标序列的定点整合率的方法，所述方法包括使植物细胞与至少一种能够形成两条基本上互补的T链的载体接触，其中至少一种载体包含RB1、RB2、目标序列、第一左边界DNA序列(LB1)、第二左边界DNA序列(LB2)，并且其中所述载体被配置成使得RB1与位于所述载体中的LB1配对以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2与位于所述载体中的LB2配对以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列在所述目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ IDNO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。
几个实施方案涉及提高目标序列的定点整合率的方法，所述方法包括使植物细胞与至少一种能够形成两条基本上互补的T链的载体接触，其中所述载体包含第一目标序列和第二目标序列，其中所述第一目标序列与所述第二目标序列基本上相同；其中所述载体还包含位于所述载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体还包含位于所述载体中的RB2和LB2以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第二目标序列相对于第一T链中的第一目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列和第二目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。
几个实施方案涉及提高目标序列的定点整合率的方法，所述方法包括使植物细胞与至少一种能够形成两条基本上互补的T链的载体接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于所述载体中的RB2和LB2以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和RB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。
几个实施方案涉及提高目标序列的定点整合率的方法，所述方法包括使植物细胞与至少一种能够形成两条基本上互补的T链的载体接触，其中所述至少一种载体包含第一目标序列、与第一目标序列不同的第二目标序列、至少两个RB DNA序列以及一个或多个任选的LB DNA序列，其中所述第一RB DNA序列(RB1)和第一LB DNA序列(LB1)位于所述载体中以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体构型还包含位于所述载体中的第二RB DNA序列(RB2)和第二LBDNA序列(LB2)，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第一目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的，并且其中载体构型还包含位于所述载体中的第三RB DNA序列(RB3)和第三LB DNA序列(LB3)，以启动(RB3)和终止(LB3)第三T链的合成，使得第二目标序列处于第三T链的5’端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第四RB DNA序列(RB4)和第四LB DNA序列(LB4)，以启动(RB4)和终止(LB4)第四T链的合成，使得第二目标序列处于第四T链的5’端至3’端的反义方向，并且由RB3和RB4处的启动产生的两条T链在第二目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。
几个实施方案涉及转化植物细胞的方法，所述方法包括使植物细胞与能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种包含右边界DNA序列(RB)和左边界DNA序列(LB)的载体，并且其中所述载体在RB与LB之间包含：(i)相对于RB处于有义方向的第一目标序列，(ii)间隔子，和(iii)相对于RB处于反义方向的第二目标序列，其中所述第一目标序列和第二目标序列是基本上互补的并且在T链合成后退火以形成双链DNA。在一些实施方案中，第一目标序列还包含第一左同源臂DNA序列和第一右同源DNA臂序列，并且第二目标序列还包含第二左同源臂DNA序列和第二右同源DNA臂序列。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，RB1和RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1和LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。
几个实施方案涉及提高双链DNA至植物细胞基因组中的定点整合率的方法，所述方法包括使植物细胞与至少一种包含右边界DNA序列(RB)和左边界DNA序列(LB)的载体接触，其中所述载体在RB与LB之间包含：(i)相对于RB处于有义方向的第一目标序列，(ii)间隔子，和(iii)相对于RB处于反义方向的第二目标序列，其中所述第一目标序列和第二目标序列是基本上互补的并且在T链合成后退火以形成双链DNA。在一些实施方案中，第一目标序列还包含第一左同源臂DNA序列和第一右同源DNA臂序列，并且第二目标序列还包含第二左同源臂DNA序列和第二右同源壁DNA序列。在一些实施方案中，RB1与RB2是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1与LB2是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1与RB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，LB1与LB2不是基本上同源的。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列包含编码表达盒5’的位点特异性酶靶位点的序列和编码表达盒3’的位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和ii)不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间的第二序列。在一些实施方案中，目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，其中左和右同源臂序列位于编码位点特异性酶靶位点的两个序列之间，和ii)编码位点特异性酶的第二序列，其中所述第二序列不位于编码位点特异性酶靶位点的序列之间。在一些实施方案中，至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是基因序列。在一些实施方案中，植物基因组中的靶序列是非基因序列。在一些实施方案中，侧接有同源臂的目标序列包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，所述至少一个位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过同源重组整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，所述目标序列的至少一部分通过非同源末端连接整合到植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。在一些实施方案中，植物细胞已包含位点特异性酶。在一些实施方案中，植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞或甘蔗细胞。在一些实施方案中，编码位点特异性酶的核苷酸序列被稳定地转化到植物细胞中。
几种实施方案涉及包含至少一种能够形成两个基本上互补的T链的载体的土壤杆菌属细胞。在一些实施方案中，土壤杆菌属细胞包含至少一种载体，其包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，并且其中RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，土壤杆菌属细胞包含至少一种载体，其包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)、目标序列、第一左边界DNA序列(LB1)和第二左边界DNA序列(LB2)，其中所述载体被配置成使得RB1与位于所述载体中的LB1配对以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2与位于所述载体中的LB2配对以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，土壤杆菌属细胞包含至少一种载体，其包含第一目标序列和第二目标序列，其中第一目标序列与第二目标序列基本相同；其中所述载体还包含位于所述载体中的第一右边界DNA序列(RB1)和第一左边界DNA序列(LB1)以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体还包含位于所述载体中的第二右边界DNA序列(RB2)和第二左边界DNA序列(LB2)以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第二目标序列相对于第一T链中的第一目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列和第二目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，土壤杆菌属细胞包含至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的第一右边界DNA序列(RB1)和第一左边界DNA序列(LB1)以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且其中第二载体包含位于第二载体中的第二右边界DNA序列(RB2)和第二左边界DNA序列(LB2)以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，土壤杆菌属细胞包含基本上同源的RB1和RB2。在一些实施方案中，土壤杆菌属细胞包含基本上同源的LB1和LB2序列。在一些实施方案中，土壤杆菌属细胞包含不是基本上同源的RB1和RB2序列。在一些实施方案中，土壤杆菌属细胞包含不是基本上同源的LB1和LB2序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:1-13的序列。在一些实施方案中，RB1和RB2中的至少一种包含与选自SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:14-20的序列。在一些实施方案中，LB1和LB2中的至少一种包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的至少一种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、包含编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列的表达盒、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，所述目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含i)位于左同源臂DNA序列与右同源臂DNA序列之间的第一序列，和ii)不位于包含左同源臂DNA序列的区域与包含右同源臂DNA序列的区域之间的第二序列。在一些实施方案中，所述至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述目标序列包含非蛋白质编码RNA。在一些实施方案中，所述非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。在一些实施方案中，表达盒包含与天然植物基因具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，表达盒包含与天然植物序列不同源的核酸序列。在一些实施方案中，至少一个表达盒包含选自以下的序列：杀虫抗性基因、除草剂耐受性基因、氮素利用效率基因、水利用效率基因、营养品质基因、DNA结合基因、可选择标记基因、RNAi构建体、位点特异性核酸酶基因、引导RNA及其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性酶选自内切核酸酶、重组酶、转座酶及其任何组合。在一些实施方案中，内切核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute、Cas9核酸酶、CasX核酸酶、CasY核酸酶和Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas9核酸酶选自包含Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3和Csf4核酸酶的组。在一些实施方案中，重组酶是附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶，或附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一些实施方案中，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在一些实施方案中，转座酶是附接于DNA结合结构域的DNA转座酶。在一些实施方案中，所述目标序列还包含至少一个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，至少一个位点特异性酶靶位点选自由以下组成的组：Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。在一些实施方案中，所述目标序列包含编码至少一种参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
几个实施方案涉及包含至少一种载体的土壤杆菌属细胞，所述载体包含右边界DNA序列(RB)和左边界DNA序列(LB)，并且其中所述载体在RB与LB之间包含：(i)相对于RB处于有义方向的第一目标序列，(ii)间隔子，和(iii)相对于RB处于反义方向的第二目标序列，其中所述第一目标序列和第二目标序列是基本上互补的并且在T链合成后退火以形成双链DNA。在一些实施方案中，土壤杆菌属细胞包含含有左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列第一目标序列以及含有左同源臂序列DNA序列和右同源臂DNA序列的第二目标序列在一些实施方案中，RB包含土壤杆菌属Ti质粒的右边界共有DNA序列。在一些实施方案中，右边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，RB选自SEQ ID NO:1-13。在一些实施方案中，RB包含与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，LB包含土壤杆菌属Ti质粒的左边界共有DNA序列。在一些实施方案中，所述左边界共有DNA序列选自SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，LB选自SEQ ID NO:14-20。在一些实施方案中，LB包含与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，目标序列包含一个或多个表达盒。在一些实施方案中，目标序列包含选自以下的至少一种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、包含编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列的基因表达盒、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。在一些实施方案中，目标序列不包含同源臂DNA序列。在一些实施方案中，目标序列还包含至少一个同源臂DNA序列。
几个实施方案涉及转化植物基因组的方法，其包括使至少一种植物细胞与至少一种能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞在共培养基上接触至少24-48小时、至少24-30小时、至少30-36小时、至少36-42小时、至少42-48小时、至少48-54小时、至少54-60小时、至少60-66小时、至少66-72小时、至少72-78小时、至少78-84小时、至少84-90小时、至少90-96小时、至少96-102小时、至少102-108小时、至少108-114小时、至少114-120小时、至少120-126小时或至少126-132小时，在一些实施方案中，根瘤菌目细胞包含在至少一种能够形成两条基本上互补的T链的载体。在一些实施方案中，植物细胞是玉米未成熟胚细胞、玉米成熟胚细胞、玉米种子细胞、大豆未成熟胚细胞、大豆成熟胚细胞、大豆种子细胞、油菜未成熟胚细胞、油菜成熟胚细胞、油菜种子细胞、棉花未成熟胚细胞、棉花成熟胚细胞、棉花种子细胞、小麦未成熟胚细胞、小麦成熟胚细胞、小麦种子细胞、甘蔗未成熟胚细胞、甘蔗成熟胚细胞或甘蔗种子细胞。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞包含至少一种载体，其包含第一右边界(RB1)DNA序列、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，并且其中RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞包含至少一种本文公开的载体，其包含RB1、RB2和目标序列，并且还包含第一左边界DNA序列(LB1)和第二左边界DNA序列(LB2)，并且其中所述载体被配置成使得RB1与位于所述载体中的LB1配对以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2与位于所述载体中的LB2配对以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞包含载体，所述载体包含第一目标序列和第二目标序列，其中第一目标序列与第二目标序列基本上相同；并且所述载体还包含位于所述载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体还包含位于所述载体中的RB2和LB2以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第二目标序列相对于第一T链中的第一目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列在第一目标序列和第二目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞包含至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体构型包含位于第一载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且其中第二载体构型包含位于第二载体中的RB2和LB2以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞包含至少一种载体，其包含第一目标序列、与第一目标序列不同的第二目标序列、至少两个RB DNA序列和一个或多个任选的LB DNA序列，其中第一RB DNA序列(RB1)和第一LB DNA序列(LB1)位于所述载体中以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第二RB DNA序列(RB2)和第二LB DNA序列(LB2)，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第一目标序列处于第二T链的5’端至3'端的反义方向，其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的，并且其中载体构型还包含位于所述载体中的第三RB DNA序列(RB3)和第三LB DNA序列(LB3)，以启动(RB3)和终止(LB3)第三T链的合成，使得第二目标序列处于第三T链的5’端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第四RB DNA序列(RB4)和第四LB DNA序列(LB4)，以启动(RB4)和终止(LB4)第四T链的合成，使得第二目标序列处于第四T链的5’端至3’端的反义方向，并且由RB3和RB4处的启动产生的两条T链在第二目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。在一些实施方案中，所述方法包括使植物细胞与第一根瘤菌目细胞和第二根瘤菌目细胞接触，其中每种根瘤菌目细胞含有两种载体中的至少一种，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含RB1，并且其中RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于所述载体中的RB2以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。在一些实施方案中，所述方法包括使植物细胞与第一根瘤菌目细胞和第二根瘤菌目细胞接触，其中每种根瘤菌目细胞含有两种载体中的至少一种，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的RB1和LB1以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于所述第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于第二载体中的RB2和LB2以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列是基本上彼此互补的。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，土壤杆菌属的某种的细胞选自由以下组成的组：根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)细胞和发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)细胞。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述方法导致目标序列的至少一个片段通过同源重组整合到植物基因组中。在一些实施方案中，所述方法导致目标序列的至少一个片段通过非同源末端连接整合到植物基因组中。在一些实施方案中，所述方法还包括检测载体的目标序列的至少一个片段在至少一个植物细胞中的整合。在一些实施方案中，所述方法还包括基于整合到植物基因组中的目标序列的至少一个片段的存在来选择植物细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括从选择的植物细胞再生转基因植物。
几个实施方案涉及转化植物基因组的方法，其包括使至少一种植物细胞与至少一种能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞在共培养基上接触至少24-48小时、至少24-30小时、至少30-36小时、至少36-42小时、至少42-48小时、至少48-54小时、至少54-60小时、至少60-66小时、至少66-72小时、至少72-78小时、至少78-84小时、至少84-90小时、至少90-96小时、至少96-102小时、至少102-108小时、至少108-114小时、至少114-120小时、至少120-126小时或至少126-132小时，其中根瘤菌目细胞包含至少一种载体，所述载体包含右边界(RB)DNA序列和左边界(LB)DNA序列，并且其中所述载体在RB与LB DNA序列之间还包含：(i)相对于RB DNA序列处于有义方向的第一目标序列，和(ii)间隔子，以及(iii)相对于RB DNA序列处于反义方向的第二目标序列，其中所述第一目标序列和第二目标序列是基本上互补的并且在T链合成后退火以形成双链DNA。在一些实施方案中，所述第一目标序列还包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列，并且所述第二目标序列还包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在一些实施方案中，土壤杆菌属的某种的细胞选自由以下组成的组：根癌土壤杆菌属细胞和发根土壤杆菌属细胞。在一些实施方案中，根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。在一些实施方案中，所述方法导致目标序列的至少一个片段通过同源重组整合到植物基因组中。在一些实施方案中，所述方法导致目标序列的至少一个片段通过非同源末端连接整合到植物基因组中。在一些实施方案中，所述方法还包括检测载体的目标序列的至少一个片段在至少一个植物细胞中的整合。在一些实施方案中，所述方法还包括基于整合到植物基因组中的目标序列的至少一个片段的存在来选择植物细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括从选择的植物细胞再生转基因植物。
附图说明
包含在本说明书中并形成本说明书的一部分的附图显示了本公开的各方面，并与说明书一起用于解释本公开中描述的实施方案。在附图中：
图1A和1B显示两种对照载体的构型，其中目标序列在5’端侧接有右边界(RB)DNA序列，并且在3’端侧接有左边界(LB)DNA序列(图1A)；或可选地，在5’端侧接有一个RB DNA序列(图1B)。
图1C显示包含两个RB DNA序列的载体构型，其中第一RB DNA序列(RB1)位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二RB DNA序列(RB2)位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向。由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
图1D显示包含任选的LB DNA序列的载体构型。在显示的载体构型中，第一RB DNA序列(RB1)与位于所述载体中的第一LB DNA序列(LB1)配对，以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二RB DNA序列(RB2)与位于所述载体中的第二左边界DNA序列(LB2)配对，以启动第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向。由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
图2A显示包含第一目标序列和第二目标序列的载体构型，其中第一目标序列与第二目标序列基本上相同；并且所述载体构型还包含位于所述载体中的第一RB DNA序列(RB1)和任选的第一LB DNA序列(LB1)以启动(RB1)和任选地终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体构型还包含位于所述载体中的第二RB DNA序列(RB2)和任选的第二LB DNA序列(LB2)以启动(RB2)和任选地终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向。由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列是基本上彼此互补的。
图2B显示应用于共转化的载体构型，其中两个基本上相同的目标序列位于由一个或多个细菌细胞所拥有的单独载体上，并且其中第一载体构型包含位于第一载体中的第一RB DNA序列(RB1)和任选的第一LB DNA序列(LB1)，以启动(RB1)和任选地终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体构型包含位于第二载体中的第二RB DNA序列(RB2)和任选的第二LB DNA序列(LB2)，以启动(RB2)和任选地终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向。由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列是基本上彼此互补的。
图2C显示包含第一目标序列、与第一目标序列不同的第二目标序列、两个或更多个RB DNA序列以及一个或多个任选的LB DNA序列的载体。显示的构建体是一个非限制性实例，其中载体构型包含位于所述载体中的第一RB DNA序列(RB1)和任选的第一LB DNA序列(LB1)以启动(RB1)和任选地终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第二RB DNA序列(RB2)和任选的第二LB DNA序列(LB2)以启动(RB2)和任选地终止(LB2)第二T链的合成，使得第一目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向。由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。载体构型还包含位于所述载体中的第三RB DNA序列(RB3)和任选的第三LB DNA序列(LB3)以启动(RB3)和任选地终止(LB3)第三T链的合成，使得第二目标序列处于第三T链的5’端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第四RB DNA序列(RB4)和任选的第四LB DNA序列(LB4)以启动(RB4)和任选地终止(LB4)第四T链的合成，使得第二目标序列处于第四T链的5’端至3’端的反义方向。由RB3和RB4处的启动产生的两条T链在第二目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
图3A显示载体构型，其中所述载体包含RB DNA序列和LB DNA序列，并且其中所述载体在RB与LB DNA序列之间还包含：(i)相对于RB DNA序列处于有义方向的第一目标序列，(ii)间隔子，和(iii)相对于RB DNA序列处于反义方向的第二目标序列。两个目标序列是基本上互补的，并且在T链合成后，发夹结构可形成。图3B和3C显示至少两个盒(S-o-I 1和S-o-I 2)相对于目标序列内的两个同源臂的位置的可能变化。图3B显示位于两个同源臂(HA)之间的第一盒和位于同源臂(HA)之一外部的第二盒。图3C显示位于两个同源臂(HA)之间的第一盒和第二盒。
图4A显示实施例9中使用的载体A的对照载体构型的示意图。
图4B显示实施例9中使用的载体C的载体构型的示意图。
图4C显示实施例9中使用的载体D的载体构型的示意图。
图5显示用于实施例9中的靶向DNA序列，其包含左同源臂(HA-L)、可选择标记基因(CP4-EPSPS)和右同源臂(HA-R)。图5还显示实施例9中使用的PCR引物和DNA印迹探针的位置。
图6A显示实施例12中使用的对照载体A的构型的示意图。载体A包含第一目标序列，其包含编码位于第一RB DNA序列(RB1)与第一LB DNA序列(LB1)之间的CP4-EPSPS的表达盒。载体还包含第二目标序列，其包含两个各自编码位于第二RB DNA序列(RB2)与第二LBDNA序列(LB2)之间的TALEN对的一半的表达盒。
图6B显示实施例12中使用的载体B的构型的示意图。载体包含第一目标序列，其包含编码位于两个RB DNA序列和两个LB DNA序列之间的CP4-EPSPS的表达盒。载体还包含第二目标序列，其包含两个各自编码TALEN对的一半的表达盒。
图7A显示实施例13中使用的载体A的构型的示意图。载体包含第一目标序列，其包含编码CP4-EPSPS的表达盒，其中TALEN靶位点(TS)位于CP4-EPSPS盒的5’。另外，第一目标序列侧接有第一RB DNA序列(RB1)和第二RB DNA序列(RB2)。载体还包含第二目标序列，其包含两个各自编码位于第三RB DNA序列(RB3)附近的TALEN对的一半的表达盒。
图7B显示实施例13中使用的载体B的构型的示意图。载体包含第一目标序列，其包含编码侧接有TALEN靶位点的CP4-EPSPS的表达盒。另外，第一目标序列还侧接有第一RBDNA序列(RB1)和第二RB DNA序列(RB2)。载体还包含第二目标序列，其包含两个各自编码位于第三RB DNA序列(RB3)附近的TALEN对的一半的表达盒。
图7C显示实施例13中使用的载体C的构型的示意图。载体包含第一目标序列，其包含编码位于左同源臂与右同源臂之间的CP4-EPSPS的表达盒。另外，第一目标序列位于第一RB DNA序列(RB1)与第二RB DNA序列(RB2)之间。载体还包含第二目标序列，其包含两个各自编码位于第三RB DNA序列(RB3)附近的TALEN对的一半的表达盒。
具体实施方式
除非另外定义，否则所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在以单数提供术语的情况下，本发明人还考虑了由该术语的复数描述的本公开的各方面。如果通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义存在差异，则本申请中使用的术语应具有本文给出的定义。如由各种技术专业词典(例如“The American Science Dictionary”(the American HeritageDictionaries的编辑，2011,Houghton Mifflin Harcourt,Boston and New York),“McGraw-Hill Dictionary of Scientific and Technical Terms”(第6版，2002,McGraw-Hill,New York)或“Oxford Dictionary of Biology”(第6版，2008,Oxford UniversityPress,Oxford and New York))举例说明的，所使用的其它技术术语在其中使用它们的领域中具有它们的普通含义。本发明人无意局限于一种作用机制或方式。针对其的参考文献被提供来仅用于说明目的。
除非另有说明，否则本公开的实践包括生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和生物技术的常规技术，所述技术在本领域的技术范围内。参见Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版(2012)；CurrentProtocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，(1987))；丛书Methods InEnzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))；Harlow和Lane，编辑(1988)Antibodies,ALaboratory Manual；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编辑(1987))；RecombinantProtein Purification:Principles And Methods,18-1142-75,GE Healthcare LifeSciences；C.N.Stewart,A.Touraev,V.Citovsky,T.Tzfira编辑.(2011)PlantTransformation Technologies(Wiley-Blackwell)；以及R.H.Smith(2013)Plant TissueCulture:Techniques and Experiments(Academic Press,Inc.)。
本文引用的所有参考文献通过引用整体并入。
如本文中所用，除非内容另有明确说明，否则以单数和单数形式的术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”表示的术语例如包括复数指示物。因此，例如，提及“植物”、“该(the)植物”或“一株植物”也包括多株植物；此外，根据上下文，术语“植物”的使用还可包括该植物的遗传上相似或相同的后代；术语“核酸”的使用任选地实际上包括该核酸分子的许多拷贝；类似地，术语“探针”任选地(并且通常)包括许多相似或相同的探针分子。
如本文中所用，“植物”是指整株植物。源自植物的细胞或组织培养物可包含任何植物组分或植物器官(例如，叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或其后代。后代植物可以来自任何子代，例如F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7等。植物细胞是植物的生物细胞，取自植物或从取自植物的细胞培养得到。
如本文中所用，“转基因的”是指其基因组已通过外源DNA的稳定整合而改变的植物细胞、植物、植物部分或种子。转基因品系包括从最初转化的植物细胞再生的植物和来自后代或转化植物的杂交的后代转基因植物。
如本文中所用，“稳定转化的”定义为允许靶细胞将转移的DNA传递给下一代的DNA至靶细胞的基因组DNA中的转移。在一些实施方案中，将转移的DNA整合到生殖细胞的基因组DNA中。在一些实施方案中，将转移的DNA整合到体细胞的基因组DNA中。如本文中所用，“瞬时转化的”定义为未整合到转化细胞的基因组DNA中的DNA至细胞中的转移。
如本文中所用，“植物基因组”是指植物细胞的核基因组、线粒体基因组或质体(例如，叶绿体)基因组。
在一个方面，本公开提供了根瘤菌目细胞，其包含至少一种能够形成至少两条T链的载体，所述T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。另一方面，本公开提供了根瘤菌目细胞，其包含至少一种能够形成至少两条T链的载体，所述T链与载体主链的至少一部分是基本上互补的。另一方面，本公开提供了包含至少一种能够形成两条T链的载体的根瘤菌目细胞，所述两条T链在至少25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1,000个、1,100个、1,200个、1,300个、1,400个、1,500个、1,600个、1,700个、1,800个、1,900个、2,000个、2,100个、2,200个、2,300个、2,400个、2,500个、2,600个、2,700个、2,800个、2,900个、3,000个、3,100个、3,200个、3,300个、3,400个、3,500个、3,600个、3,700个、3,800个、3,900个、4,000个、4,100个、4,200个、4,300个、4,400个、4,500个、4,600个、4,700个、4,800个、4,900个、5,000个、5,100个、5,200个、5,300个、5,400个、5,500个、5,600个、5,700个、5,800个、5,900个、6,000个、6,100个、6,200个、6,300个、6,400个、6,500个、6,600个、6,700个、6,800个、6,900个、7,000个、7,100个、7,200个、7,300个、7,400个、7,500个、7,600个、7,700个、7,800个、7,900个、8,000个、8,100个、8,200个、8,300个、8,400个、8,500个、8,600个、8,700个、8,800个、8,900个、9,000个、9,100个、9,200个、9,300个、9,400个、9,500个、9,600个、9,700个、9,800个、9,900个、10,000个或更多个碱基对上是基本上互补的。在一些方面，本文提供的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种载体位于单个根瘤菌目细胞内。
另一方面，本公开提供了包含至少第一载体和第二载体的根瘤菌目细胞，其中第一载体被配置成产生包含目标序列的第一T链，并且第二载体被配置成产生包含目标序列的第二T链，所述目标序列的定向使得第一和第二T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。另一方面，本公开提供了根瘤菌目细胞，其包含至少一种第一载体和第二载体，所述载体能够产生在载体主链的至少一部分中是基本上互补的第一T链和第二T链。另一方面，本公开提供了包含至少一种能够产生第一T链和第二T链的第一载体和第二载体，所述两条T链在至少25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1,000个、1,100个、1,200个、1,300个、1,400个、1,500个、1,600个、1,700个、1,800个、1,900个、2,000个、2,100个、2,200个、2,300个、2,400个、2,500个、2,600个、2,700个、2,800个、2,900个、3,000个、3,100个、3,200个、3,300个、3,400个、3,500个、3,600个、3,700个、3,800个、3,900个、4,000个、4,100个、4,200个、4,300个、4,400个、4,500个、4,600个、4,700个、4,800个、4,900个、5,000个、5,100个、5,200个、5,300个、5,400个、5,500个、5,600个、5,700个、5,800个、5,900个、6,000个、6,100个、6,200个、6,300个、6,400个、6,500个、6,600个、6,700个、6,800个、6,900个、7,000个、7,100个、7,200个、7,300个、7,400个、7,500个、7,600个、7,700个、7,800个、7,900个、8,000个、8,100个、8,200个、8,300个、8,400个、8,500个、8,600个、8,700个、8,800个、8,900个、9,000个、9,100个、9,200个、9,300个、9,400个、9,500个、9,600个、9,700个、9,800个、9,900个、10,000个或更多个碱基对上是基本上互补的。在一些方面，本文提供的3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种载体位于单个根瘤菌目细胞内。
如本文中所用，术语“根瘤菌目”是指能够转化植物细胞的细菌根瘤菌目的成员。在一些方面，本文提供的根瘤菌目可以指土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。在其它方面，本文提供的根瘤菌目可以指根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌。在一些方面，本文提供的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种载体位于单个根瘤菌目细胞内。在其它方面，本文提供的2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种或更多种不同的载体位于2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个不同的根瘤菌目细胞内。
如本文所用，术语“重组”是指两个核酸分子之间的核苷酸交换。术语“同源重组”(HR)是指在两个核酸分子共有的保守区域处的核苷酸的交换。HR包括对称同源重组和不对称同源重组。不对称同源重组还可意指不对等的重组。如本文中所用，“非同源末端连接”(NHEJ)是指在不需要同源序列来指导连接的情况下的双链DNA的两个末端的连接。如本文中所用，“微同源”是指在不同核酸分子中存在相同的短的碱基序列(1至10bp)碱基。在一些实施方案中，核酸分子中的至少一个是基因组DNA，并且核酸分子中的至少一个包含在目标序列的至少一部分中是基本上互补的两条T链。
检测HR和NHEJ的方法包括但不限于1)表型筛选，2)分子标记技术，诸如的单核苷酸多态性(SNP)分析或Illumina/Infinium技术，3)DNA印迹，和4)测序(例如，Sanger、454,Pac-Bio,Ion TorrentTM)。用于鉴定两个亲本染色体之间的重组的方法的一个实例是反向PCR(iPCR)。在该方法中，在两个亲本染色体的每一个上鉴定了靶向基因侧接的限制性核酸酶位点。这些限制性核酸酶位点可以相同或不同。设计了对第一亲本染色体特异的PCR引物和对第二亲本染色体特异的另一PCR引物。诱导的双链断裂促进两个亲本染色体之间的重组，使得限制性内切核酸酶位点和引物结合位点在同一重组染色体上。仅在发生重组的情况下观察PCR产物。在一个方面，可以通过PCR检测同源重组的发生，其中专门针对T链插入物设计的引物与专门针对靶序列的侧翼序列(在同源区域的外部)设计的引物配对。例如，当上游侧翼引物与下游插入物特异性引物配对时，仅在发生重组时才观察到PCR产物。
如本文中所用，术语“载体”或“质粒”可互换使用，并且是指与染色体DNA物理分离的环状双链DNA分子。在一个方面，本文使用的质粒或载体能够在体内复制。在几个实施方案中，载体能够转化植物细胞。在一个方面，本文提供的质粒是细菌质粒。另一方面，本文提供的质粒是土壤杆菌Ti质粒或源自土壤杆菌Ti质粒。
在一个方面，本文提供的质粒或载体是重组载体。如本文中所用，术语“重组载体”是指通过遗传重组的实验室方法(诸如分子克隆)形成的载体。在一个方面，本文提供的载体或质粒是合成质粒。如本文中所用，“合成质粒”是人工产生的质粒，其能够发挥与天然质粒(例如Ti质粒)一样的功能(例如，复制)。不受限制，本领域技术人员可以通过由单个核苷酸合成质粒从头产生合成质粒，或通过将来自不同的预先存在的质粒的核酸分子拼接在一起来产生合成质粒。
如本文中所用，当与核酸结合使用时，术语“同源性”和“同一性”描述了两个或更多个核苷酸序列之间的相似性程度。通过以下方式来确定两个序列之间的“序列同一性”的百分比：在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列，使得比较窗口中的序列的部分可以相较于参考序列(其不包含添加或缺失)包含添加或缺失(缺口)以进行两个序列的最佳比对。通过以下方式计算百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。与参考序列相比在每个位置相同的序列被认为与参考序列相同，反之亦然。可以使用任何合适的计算机程序来执行两个或更多个序列的比对。例如，用于进行序列比对的广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson等(1994)Nucl.Acids Res.,22:4673-4680)。
如本文中所用，关于核酸分子的术语“互补”是指核苷酸碱基的配对，使得A与T(或U)互补，并且G与C互补。两个互补核酸分子能够彼此杂交。例如，双链DNA的两条链彼此互补。
如本文中所用，术语“基本上同源的”或“基本上相同的”意指两个核苷酸序列彼此具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
如本文中所用，术语“基本上互补的”意指两个核苷酸序列彼此具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列互补性。
如本文中所用，核酸分子的“部分”是指其总长度的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或至少5个、10个、15个、20个、25个、30个、25个、40个、45个、50个、75个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个或更多个连续核苷酸。
如本文中所用，术语“多核苷酸”是指含有多个核苷酸的核酸分子，并且通常包含至少2个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少1500个、至少2000个、至少2500个、至少3000个、至少5000个、至少10,000个或更多个核苷酸碱基。作为实例，本文中提供的多核苷酸可以是质粒。长度为18-25个核苷酸的特定多核苷酸可称为“寡核苷酸”。本文提供的核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)及其功能类似物，诸如互补DNA(cDNA)。本文提供的核酸分子可以是单链或双链的。核酸分子包含核苷酸碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)。尿嘧啶(U)在RNA分子中替代胸腺嘧啶。符号“N”可用于表示任何核苷酸碱基(例如，A、G、C、T或U)。符号“K”可用于表示G或T/U核苷酸碱基。
如本文所用，“物理连接的”意指物理连接的核酸序列位于同一核酸分子上。物理键联可以是相邻的或近端的。在一个方面，本文提供的核酸序列与另一核酸序列相邻。在另一方面，本文提供的第一核酸分子与本文提供的第二核酸分子物理连接。如本文所用，“侧接的”是指在一侧或两侧与另一核酸序列连接的核酸序列，包括与目标序列连接，或与LBDNA序列或RB DNA序列连接。在一个方面，侧翼序列在目标序列之前。在另一方面，侧翼序列在目标序列之后。在一个方面，目标序列侧接有另一个目标序列。在另一方面，侧翼序列位于目标序列的5’端或上游末端。在另一方面，侧翼序列位于目标序列的3’端或上游末端。在一些实施方案中，侧翼序列与目标序列邻接。在一些实施方案中，在侧翼序列和目的序列之间存在一个或多个核苷酸。
如本文中所用，“可操作地连接的”是指可操作连接的核酸序列表现出其所需功能。例如，在本公开的一个方面，提供的DNA启动子序列可以启动可操作地连接的DNA序列转录成RNA。本文提供的核酸序列可以在物理或可操作地连接的核酸序列的上游或下游。在一个方面，本文提供的第一核酸分子与本文提供的第二核酸分子物理连接并可操作地连接。在另一方面，本文提供的第一核酸分子既不与本文提供的第二核酸分子物理连接也不与其可操作地连接。如本文中所用，“上游”意指核酸序列位于连接的核酸序列的5’端之前。如本文中所用，“下游”意指核酸序列位于连接的核酸序列的3’端之后。
如本文中所用，“间隔子”或“接头”是指能够形成长度为至少4个核苷酸的环结构的任何多核苷酸序列。不受限制，本文提供的间隔子可包含非编码序列或编码序列。
右边界和左边界
如本文中所用，术语“T链”是指当从载体的RB DNA序列开始转录时制备的DNA的单链拷贝。在天然存在的Ti质粒中，转移DNA(T-DNA)的合成在被称为“右边界”(RB)的25-碱基-对共有DNA序列处开始，并且T链合成终止发生在称为“左边界”(LB)的25bp共有DNA序列处。25bp RB共有DNA序列(SEQ ID NO:21)和25bp LB共有DNA序列(SEQ ID NO:23)来自胭脂碱型根癌土壤杆菌菌株C58。25bp RB共有DNA序列(SEQ ID NO:22)和25bp LB共有DNA序列(SEQ ID NO:24)来自章鱼碱型根癌土壤杆菌菌株A6。在一些实施方案中，RB共有DNA序列选自SEQ ID NO:21和23。在一些实施方案中，LB共有DNA序列选自SEQ ID NO:22和24。
在一个方面，本文提供的RB DNA序列或LB DNA序列包含至少25bp Ti质粒RB或LB(分别地)共有DNA序列，并且额外地包含含有至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少350个核苷酸、至少400个核苷酸、至少450个核苷酸、至少500个核苷酸或至少600个核苷酸的核酸序列。在一个方面，本文提供的RB DNA序列或LB DNA序列可具有使得DNA区段能够通过土壤杆菌属或其它根瘤菌目介导的方法转化植物组织的任何长度(参见，美国专利第5,731,179号和第6,265,638号；和美国专利申请公开US2003/110532、US2005/0183170和US2007/0271627)。
如本申请中所用，RB DNA序列以SEQ ID NO:1–13表示，并且为长度为162nt至505nt并且包含胭脂碱RB共有DNA序列(SEQ ID NO:21)或章鱼碱RB共有DNA序列(SEQ IDNO:22)的根癌土壤杆菌Ti质粒序列的变体。类似地，如本申请中所用，LB DNA序列以SEQ IDNO:14–20表示，并且为长度为220nt至443nt并且包含胭脂碱LB共有DNA序列(SEQ ID NO:23)或章鱼碱LB共有DNA序列(SEQ ID NO:24)的根癌土壤杆菌Ti质粒序列的变体。表1包含本文提供的RB和LB DNA序列的SEQ ID NO中每一种，其中位置标示于胭脂碱或章鱼碱25bp共有序列的每个SEQ ID NO内。考虑了其它RB和LB序列。
表1.公开的右边界(RB)和左边界(LB)DNA序列的SEQ ID NO
在一个方面，本文提供的载体可包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个RB DNA序列。在载体的一个方面，所述RB DNA序列包含章鱼碱型土壤杆菌属Ti质粒的25bp RB DNA共有序列。在载体的另一方面，所述RB DNA序列包含胭脂碱型土壤杆菌属Ti质粒的25bp RB DNA共有序列。在另一方面，在具有两个或更多个RB DNA序列的载体构型中，所述RB DNA序列可以是基本上同源的或所述RB DNA序列可以不是基本上同源的。在另一方面，所述一个或多个RB DNA序列包含与选自SEQ ID NO:1-13的序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的序列。在另一个实施方案中，第一RB(RB1)DNA序列或第二RB(RB2)DNA序列包含选自包含SEQID NO:1-13的组的序列。在一些实施方案中，所述RB1 DNA序列包含与选自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:12的序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的序列；并且所述RB2 DNA序列包含与选自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:12的序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的序列。
在一个方面，所述至少一种本文公开的载体不包含LB DNA序列。在另一个方面，至少一种本文公开的载体可包含至少一个、至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个RB DNA序列。在另一方面，在具有两个或更多LB DNA序列的载体构型中，所述LB DNA序列可以是基本上同源的或所述LB DNA序列可以不是基本上同源的。在另一方面，所述LB DNA序列包含章鱼碱型土壤杆菌属Ti质粒的25bp LBDNA共有序列。在另一方面，所述LB DNA序列包含胭脂碱型土壤杆菌属Ti质粒的25bp LBDNA共有序列。在一个方面，所述LB DNA序列中的一个或多个选自包含SEQ ID NO:14-20的组。在另一方面，所述两个或更多个LB DNA序列包含与选自SEQ ID NO:14-20的序列具有至少80％、至少81％、至少81％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的序列。在一个方面，所述LB DNA序列包含与SEQ ID NO:19具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的序列。
目标序列
如本文中所用，术语“目标序列”是指载体中形成T链的部分的多核苷酸序列。在一个方面，本文提供的载体包含0个、至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个或更多个目标序列。如本文中所用，本文公开的载体中的目标序列不包括RB或LB DNA序列，并且不包括载体主链序列。在一个方面，在载体构型中，两个目标序列位于两个RB DNA序列之间，使得从两个RB DNA序列合成的两条T链中的目标序列是基本上互补的。在一些实施方案中，两个目标序列的核苷酸序列可以相同，或核苷酸序列可具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在一些方面，本文提供的目标序列包含0个、至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个或更多个表达盒。在一些方面，本文中提供的目标序列包含在盒堆叠(cassette stack)中物理地和/或可操作地连接的一个或多个表达盒。在一些方面，目标序列包含与左同源臂DNA序列、右同源臂DNA序列相邻，或与左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列相邻的表达盒。在一些方面，目标序列包含侧接有同源臂DNA序列的表达盒。在一些方面，目标序列包含一个或多个未侧接有同源臂的表达盒。在一些方面，目标序列包含一个或多个侧接有一个或多个位点特异性酶靶位点的表达盒。在一些方面，目标序列包含一个或多个侧接有一个或多个重组酶识别位点的表达盒。在另一个方面，本文提供的目标序列包含内源多核苷酸序列。在一些实施方案中，内源多核苷酸序列包含基因间序列、天然基因或突变基因。在另一个方面，本文提供的目标序列包含外源多核苷酸序列。
在一个方面，本文公开的载体中的目标序列的至少一部分通过HR整合到植物基因组中。在另一方面，本文公开的载体中的目标序列的至少一部分通过NHEJ整合到植物基因组中。
在一个方面，目标序列侧接有至少两个同源臂DNA序列并且包含与植物细胞的天然基因具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述至少两种同源性是侧接有一个或多个位点特异性酶靶位点的序列。在一些实施方案中，所述至少两种同源性是侧接有一个或多个重组酶识别位点的序列。
同源臂
在一个方面，本文提供的目标序列包含0个、至少1个或至少2个同源臂DNA序列。当本文提供的目标序列包含至少两个同源臂DNA序列时，可通过将它们称为“左同源臂DNA序列”和“右同源臂DNA序列”来区分所述至少两个同源臂DNA序列。在一个方面，本文提供的目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。在一个方面，本文提供的右同源臂DNA序列和左同源臂DNA序列与植物或植物细胞中的靶向基因组DNA序列同源。在一个方面，右同源臂DNA序列和左同源臂DNA序列彼此不基本上同源。在另一个方面，右同源臂DNA序列和左同源臂DNA序列彼此基本上同源。在一个方面，目标序列包含位于右同源臂DNA序列与左同源臂DNA序列之间的一个或多个表达盒。在一个方面，目标序列包含位于右同源臂DNA序列与左同源臂DNA序列之间的用于模板化基因组编辑的序列。在另一个方面，本文提供的目标序列的至少一部分在包含左同源臂DNA序列、右同源臂DNA序列和一个或多个盒的区域外。在另一个方面，本文提供的目标序列的至少一部分在包含左同源臂DNA序列、右同源臂DNA序列和用于模板化基因组编辑的序列的区域内。
在一个方面，本文提供的目标序列包含位于左同源臂DNA序列与右同源DNA臂序列之间的第一序列，和不位于左同源臂DNA序列与右同源壁DNA序列之间的第二序列。在另一方面，本文提供的载体包含第一目标序列(其还包含第一左同源臂DNA序列和第一右同源臂DNA序列)和第二目标序列(其还包含第二左同源臂DNA序列和第二右同源臂DNA序列)。
在一个方面，本文提供的目标序列以其整体整合到植物基因组中。在一个方面，本文提供的目标序列的至少一部分整合到植物基因组中。在另一方面，只有右同源臂DNA序列与左同源臂DNA序列之间的目标序列整合到植物基因组中。在另一方面，本文提供的目标序列通过HR整合到植物基因组中。在一个方面，HR可在本文提供的一个或两个同源臂DNA序列与植物基因组之间发生。在另一方面，本文提供的目标序列通过NHEJ整合到植物基因组中。在另一方面，本文提供的目标序列通过微同源介导的末端连接整合到植物基因组中。在另一方面，本文提供的目标序列通过土壤杆菌属介导的T链整合而随机地整合到植物基因组中。
在一个方面，本文提供的至少部分目标序列的整合导致一个或多个点突变、一个或多个插入、一个或多个缺失、倒位、增加的内源基因座的转录、减少的内源基因座的转录或其任何组合。在一个方面，本文提供的目标序列的至少一部分的整合导致改变的蛋白质活性、改变的RNAi多核苷酸的产生、改变的RNAi靶位点的序列、改变的RNAi途径活性、增加的目标序列的转录、整合的目标序列的沉默或其任何组合。沉默技术包括但不限于反义-、共抑制-介导的机制和RNAi技术，诸如miRNA(例如，美国专利申请公开2006/0200878)。在另一个方面，目标序列的至少一部分的整合引起存在于基因组中的转基因核酸序列的靶向转录、减少的转录、增强的转录或模板化编辑。
如本文中所用，术语“同源臂”或“同源臂DNA序列”是指与植物或植物细胞中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列。同源臂可包含至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少500个、至少550、至少600个、至少650个、至少700、至少750个、至少800个、至少850个、至少900个、至少950个、至少1000个或至少2500个核苷酸。在一些实施方案中，所述靶序列包含蛋白质编码序列。在一些实施方案中，所述靶序列是基因序列。如本文中所用，“基因”序列是编码蛋白质或非蛋白质编码RNA的核酸序列。基因序列可包括一个或多个内含子。在另一方面，所述靶序列是非基因序列。如本文中所用，“非基因”序列是不为基因序列的核酸序列。在另一方面，所述靶序列是非编码序列。在另一方面，所述靶序列包含蛋白质编码序列和非编码序列。在另一方面，所述靶序列不包含基因或基因的一部分。在一些实施方案中，将所述靶序列与目标基因连接。在一些实施方案中，靶序列与整合在植物或植物细胞的基因组中的转基因连接。
如本文中所用，术语“靶序列”是指被选择用于目标序列的靶向整合的基因组基因座。在一些实施方案中，目标序列通过HR或NHEJ整合到靶序列中。根据情况，术语靶序列可以指被靶向以进行切割和重组的基因组基因座的全长核苷酸序列，或被靶向以进行切割和重组的基因组基因座的一部分的核苷酸序列。靶序列可以是内源基因组基因座或转基因。在一个方面，靶序列是基因序列。在另一方面，靶序列是非基因序列。
如本文中所用，“位点特异性重组位点”或“位点特异性靶位点”可互换使用，指其中通过HR或通过非同源重组插入外源DNA的核酸序列。
如本文中所用，“位点特异性酶靶位点”是指被核酸酶切割，从而将双链断裂引入核酸主链中的位点。双链断裂的位点可以是用于引入目标序列的靶位点。
如本文中所用，“内源的”是指天然存在于细胞基因组中的核酸序列。在一个方面，本文提供的方法用于修饰内源基因座，使得经修饰的基因座与未经修饰的内源基因座相比共有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％序列同一性。在一个方面，内源核酸分子进行“模板编辑”。模板编辑可以在双链断裂于靶序列中或其附近发生后，通过靶序列与供体模板之间的HR发生。如本文中所用，“供体模板”是与靶序列的至少一部分共有至少60％、至少60％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％序列同一性的核酸序列。在一个方面，本文提供的供体模板包含目标序列。模板编辑可将一个或多个点突变、缺失或插入引入靶序列。在一个方面，整个供体模板、供体模板的一部分、供体模板的拷贝或供体模板的一部分拷贝整合到靶序列中。本领域普通技术人员将认识到，此类模板编辑类似于内源基因组的直系同源核酸序列、旁系同源核酸序列、同基因核酸序列或顺化基因(cisgenic)核酸序列。
如本文中所用，“外源的”是指通常不存在于细胞中但可通过一种或多种遗传学、生物化学或其他方法引入细胞的核酸序列。在一些实施方案中，外源核酸序列可与内源分子同源。
盒
如本文中所用，术语“盒”或“表达盒”是指可以与或可以不与一种或多种表达元件(诸如增强子、启动子、前导序列、内含子、5’非翻译区(UTR)、3’UTR或转录终止序列)可操作地连接的核酸序列。在一个方面，盒包含与内源核酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。在另一方面，所述盒包含外源核酸序列。
在一个方面中，本文公开的载体中的盒包含选自以下的至少一个序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、转录终止序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA的序列、编码非蛋白编码RNA(npcRNA)的序列、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点(例如，lox位点或flp位点)的序列、编码Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)Argonaute(TtAgo)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAgo)，其同源物或其经修饰的形式)的序列、编码DNA引导的序列、编码RNA引导的内切核酸酶(RNA引导的核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY，其同源物或其经修饰的形式)的序列、编码CRISPR RNA的序列、编码tracrRNA的序列，编码融合引导RNA的序列、编码锌指核酸酶的序列、编码TALEN的序列、着陆垫、编辑模板、转基因、编码位点特异性酶的序列、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、接头、间隔子、限制酶切位点、用于模板化基因组编辑的序列，及其任何组合。在一些实施方案中，盒位于第一右边界(RB1)与第二右边界(RB2)之间，使得在RB1和RB2处的启动产生的两条T链在盒的至少一部分中是基本上彼此互补的。在一些实施方案中，盒位于至少一个LB DNA序列的附近。在一些实施方案中，盒不位于RB DNA序列之间。在一些实施方案中，盒不位于RB DNA序列与LB DNA序列之间。如本文中所用，术语“着陆垫”是指被设计为位点特异性重组的基因座的核酸基因座。在一些实施方案中，着陆垫可包含与宿主生物的天然序列不同源的一种或多种核酸序列。在一些实施方案中，着陆垫可包含内切核酸酶、重组酶或转座酶中的任何种酶的一个或多个识别位点。在一些实施方案中，着陆垫可包含内切核酸酶、重组酶或转座酶的任何种酶的一个或多个识别位点，所述识别位点侧接一个或多个与宿主生物体的基因组大体上不存在同源性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个识别位点是DNA结合结构域(例如，锌指蛋白(ZFP)、大范围核酸酶或亮氨酸拉链)的结合位点。在一些实例中，着陆垫可包含与任何经测序的靶植物基因组的区域大体上没有同源性的核苷酸序列。在一些实施方案中，着陆垫可包含一个或多个锌指核酸酶识别位点、一个或多个大范围核酸酶识别位点、一个或多个靶向核酸内切酶识别位点、一个或多个TALEN识别位点、一个或多个重组酶识别位点或一个或多个转座酶识别位点的任何组合。如本文所用，术语“编辑模板”是指可用于与靶序列重组的核酸序列。在一个方面，编辑模板包含至与靶序列的至少一部分具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，编辑模板包含与靶序列相比的一个或多个核酸变化。
如本文中所用，术语“盒堆叠”是指在载体中物理连接的两个或更多个表达盒。在一些实施例中，盒堆叠中的两个或更多个盒可操作地连接。在一些实施例中，盒堆叠中的两个或更多个盒是不可操作地连接。在一些实施例中，盒堆叠中的两个或更多个盒侧接有一个或多个重组酶识别位点。在一些实施例中，盒堆叠中的两个或更多个盒侧接有一个或多个位点特异性酶靶位点。在一些实施方案中，盒堆叠中的两个或更多个盒可由间隔子序列、绝缘子序列、多克隆位点序列、一个或多个重组酶识别位点、编码位点特异性酶靶位点的序列、着陆垫、同源臂、RB DNA序列或LB DNA序列间隔开。在一些实施方案中，盒堆叠位于第一右边界(RB1)与第二右边界(RB2)之间，使得由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在盒堆叠的至少一部分中是基本上彼此互补的。在一些实施方案中，盒堆叠位于至少一个LB DNA序列的附近。在一些实施方案中，盒堆叠不位于RB DNA序列之间。在一些实施方案中，盒堆叠不位于RB DNA序列与LB DNA序列之间。
如本文中所用，术语“基因组基因座”是指对应于遗传单位的基因组序列的可定位区域。基因组基因座可以包含一个或多个调控区诸如启动子、增强子、5’UTR、内含子区域、3’UTR、转录区和可以作为植物或哺乳动物基因组中的天然基因或转基因存在的其它功能序列区。
如本文中所用，“基因”是指编码蛋白质的序列，或编码非蛋白质编码RNA的序列。如本文中所用，“蛋白质编码”是指编码多肽的氨基酸的多核苷酸。如本文中所用，“编码”是指可通过转录和/或翻译产生功能单元(不限于，例如，蛋白质、微小RNA、转移RNA、核糖体RNA、小干扰RNA、引导RNA、示踪RNA、单引导RNA)的多核苷酸。一系列三个核苷酸碱基编码一种氨基酸。如本文所用，“表达(expressed)”、“表达(expression)”或“表达(expressing)”是指RNA从DNA分子的转录。在另一方面，本文提供的目标序列包含蛋白质编码序列。
如本文中所用，术语“npcRNA”是指非蛋白质编码RNA。非蛋白质编码RNA的非限制性实例包括微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、小RNA(长度为22-26nt)和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)。在另一方面，本文提供的目标序列包含非蛋白质编码RNA。
在一个方面，表达盒包含至少一种选自具有农艺学益处的基因、DNA结合基因、可选择标记基因、RNAi构建体、位点特异性核酸酶基因、RNA引导的核酸酶(RNA引导的核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、其同源物或其经修饰的形式)的重组引导RNA、Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌Argonaute(TtAgo)、激烈火球菌Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo)、其同源物或其经修饰的形式)、用于Argonaute蛋白的DNA引导及其任何组合的基因。在一个方面，本文提供的基因包含启动子。在另一方面，本文提供的基因不包含启动子。
本公开所设想的具有农艺学益处的合适基因的实例包括但不限于疾病、昆虫或害虫耐受性(例如，病毒耐受性、细菌耐受性、真菌耐受性、线虫耐受性、节肢动物耐受性、腹足动物耐受性)、除草剂耐受性的基因、用于质量改善的基因，所述质量改善是诸如产量、营养增强、环境或胁迫耐受性或植物生理学、生长、发育、形态学或一种或多种植物产品的任何所需变化，所述植物产品的变化包括淀粉产量(美国专利第6,538,181号、第6,538,179号、第6,538,178号、第5,750,876号、第6,476,295号)、改性油产量(美国专利第6,444,876号、第6,426,447号、第6,380,462号)、高产油量(美国专利第6,495,739号、第5,608,149号、第6,483,008号、第6,476,295号)、改性脂肪酸含量(美国专利第6,828,475号、第6,822,141号、第6,770,465号、第6,706,950号、第6,660,849号、第6,596,538号、第6,589,767号、第6,537,750号、第6,489,461号、第6,459,018号)、高蛋白质产量(美国专利第6,380,466号)、果实成熟(美国专利第5,512,466号)、增强的动物和人营养(美国专利第6,723,837号、第6,653,530号、第6,541,259号、第5,985,605号、第6,171,640号)、生物聚合物(美国专利第Re37,543号、第6,228,623号、第5,958,745号和美国专利公开第US20030028917号)。还有环境胁迫抗性(美国专利第6,072,103号)、药物肽和可分泌的肽(美国专利第6,812,379号、第6,774,283号、第6,140,075号、第6,080,560号)、改进的加工性状(美国专利第6,476,295号)、改善的消化率(美国专利第6,531,648号)、低棉子糖(美国专利第6,166,292号)、工业酶生产(美国专利第5,543,576号)、改进的风味(美国专利第6,011,199号)、固氮(美国专利第5,229,114号)、混合种子生产(美国专利第5,689,041号)、纤维生产(美国专利第6,576,818号、第6,271,443号、第5,981,834号、第5,869,720号)和生物燃料生产(美国专利第5,998,700号)。鉴于本公开，如本领域技术人员将理解的，这些或其它遗传元件、方法和转基因中的任何一种都可以与本公开一起使用。
在一个方面，本文提供的表达盒包含选自以下的核酸序列：杀虫抗性基因、除草剂耐受性基因、氮素利用效率基因、水利用效率基因、营养品质基因、DNA结合基因、可选择标记基因、RNAi构建体、位点特异性核酸酶基因、引导RNA及其任何组合。
基因还可以包括编码其它多核苷酸序列诸如信使RNA(mRNA)的多核苷酸序列。由本公开的核酸分子产生的mRNA可含有5’-UTR前导序列。该序列可以源自被选择用于表达基因的启动子，并且可以被特异性修饰以增加或减少mRNA的翻译。5’-UTR也可以从病毒RNA、合适的真核基因或合成的基因序列中获得。可能需要此类“增强子”序列来增加或改变所得mRNA的翻译效率。本公开不限于其中非翻译区衍生自伴随启动子序列的5’-UTR的构建体。相反，5’-UTR序列可以衍生自不相关的启动子或基因(参见，例如美国专利第5,362,865)。非翻译前导序列的实例包括玉米矮牵牛热激蛋白前导序列(美国专利第5,362,865号)、植物病毒衣壳蛋白前导序列、植物rubisco前导序列、GmHsp(美国专利第5,659,122号)、PhDnaK(美国专利第5,362,865号)、AtAnt1、TEV(Carrington和Freed,Journal ofVirology,(1990)64:1590-1597)以及AGRtu.nos(GenBank登录号V00087；Bevan等，NucleicAcids Research(1983)11:369-385)。还将用于增强表达或影响基因转录或翻译的其它遗传组分设想为遗传组分。
基因还可包含3’-UTR。所提供的3’-UTR可含有转录终止子或具有等同功能的元件，以及在植物中起作用以使多腺苷酸化核苷酸添加到RNA分子的3’端的多腺苷酸化信号。合适的3’区域的实例是(1)3’转录的非翻译区，其含有土壤杆菌属Ti质粒基因诸如胭脂碱合酶(NOS；Fraley等，Proceedings of the National Academy of Sciences,USA(1983)80:4803-4807)基因的多腺苷酸化信号，和(2)植物基因诸如大豆贮藏蛋白基因和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亚基基因。3’区域的一个例子是来自豌豆的ssRUBISCOE9基因的3’区域(欧洲专利申请0385 962)。
在一个方面，本文提供的表达盒或目标序列可包含编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
在一个方面，本文提供的表达盒包含与内源植物核酸序列不基本上同源的核酸序列。在另一个方面，本文提供的表达盒包含与内源植物基因不基本上同源的核酸序列。在另一个方面，本文提供的表达盒包含与内源植物基因具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。在另一个方面，本文提供的表达盒包含与内源植物核酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。
启动子
启动子含有核苷酸碱基的序列，其发信号通知RNA聚合酶与DNA结合并使用DNA链中的一条作为模板启动至mRNA的转录成，以产生相应的RNA互补链。在一个方面，本文提供的启动子是组成型启动子。在一个方面，本文提供的启动子是可调控的启动子。在一个方面，本文提供的表达盒可包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或超过10个启动子。在一个方面，本文提供的启动子位于目标序列内。在另一个方面，本文提供的启动子不位于目标序列内。
在文献中已经描述了许多在植物细胞中有活性的启动子。此类启动子包括但不限于根癌土壤杆菌的Ti质粒上携带的胭脂碱合酶(NOS)和章鱼碱合酶(OCS)启动子、花椰菜病毒启动子诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子以及玄参花叶病毒(FMV)35S启动子和增强的CaMV35S启动子(e35S)。响应于环境、激素、化学物质和/或发育信号而被调节的多种其它植物基因启动子也可用于在植物细胞中表达异源基因，包括例如受(1)热(Callis等，Plant Physiology,(1988)88:965-968)、(2)光(例如，豌豆RbcS-3A启动子，Kuhlemeier等，Plant Cell,(1989)1:471-478；玉米RbcS启动子，Schaffner等，Plant Cell(1991)3:997-1012)；(3)激素，诸如脱落酸(Marcotte等，Plant Cell,(1989)1:969-976)、(4)创伤(例如，Siebertz等，Plant Cell,(1989)961-968)或其它信号或化学物质调控的启动子。组织特异性启动子也是已知的。
在一些实施方案中，启动子能够引起足够的表达，从而产生有效量的目标基因产物。描述此类启动子的实例包括但不限于美国专利第6,437,217号(玉米RS81启动子)、美国专利第5,641,876号(水稻肌动蛋白启动子)、美国专利第6,426,446号(玉米RS324启动子)、美国专利第6,429,362号(玉米PR-1启动子)、美国专利第6,232,526号(玉米A3启动子)、美国专利第6,177,611号(组成型玉米启动子)、美国专利第5,322,938号、第5,352,605号、第5,359,142号和第5,530,196号(35S启动子)、美国专利第6,433,252号(玉米L3油体蛋白启动子)、美国专利第6,429,357号(水稻肌动蛋白2启动子以及水稻肌动蛋白2内含子)、美国专利第5,837,848号(根特异性启动子)、美国专利第6,294,714号(光诱导型启动子)、美国专利第6,140,078号(盐诱导型启动子)、美国专利第6,252,138号(病原体诱导型启动子)、美国专利第6,175,060号(磷缺乏诱导型启动子)、美国专利第6,635,806号(γ薏苡醇溶蛋白(gamma-coixin)型启动子)和美国专利申请系列第09/757,089号(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。可以使用的另外的启动子是胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等，1987)、章鱼碱合酶(OCS)启动子(其携带在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上)、花椰菜病毒启动子诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等，Plant Molecular Biology(1987)9:315-324)、CaMV35S启动子(Odell等，Nature(1985)313:810-812)、玄参花叶病毒35S-启动子(美国专利第6,051,753号、第5,378,619号)、蔗糖合酶启动子(Yang和Russell,Proceedings of theNational Academy of Sciences,USA(1990)87:4144-4148)、R基因复合启动子(Chandler等，Plant Cell(1989)1:1175-1183)以及叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、PC1SV(美国专利第5,850,019号)和AGRtu.nos(GenBank登录号V00087；Depicker等，Journal of Molecularand Applied Genetics(1982)1:561-573；Bevan等，1983)启动子。
在一些实施方案中，可构建启动子杂交体以增强转录活性(美国专利第5,106,739号)，或组合所需转录活性、诱导能力和组织特异性或发育特异性。在植物中起作用的启动子包括但不限于可诱导的、病毒的、合成的、组成型的、受时序调控的、受空间调控的和受时空调控的启动子。组织增强的、组织特异性的或受发育调控的其它启动子也是本领域已知的，并且设想其在本公开的实践中具有实用性。
如果需要，可以修饰本公开的所提供的核酸分子和载体中使用的启动子，以影响它们的控制特征。启动子可以通过与操纵子区连接，随机或受控诱变等方法衍生。此外，可以改变启动子以包含多个“增强子序列”以帮助提高基因表达。
可选择标记
在一个方面，本文提供的目标序列可包含一个或多个可选择或可筛选标记基因。在一些实施方案中，可选择或可筛选标记基因有助于鉴定转化的植物或具有农艺用途的产物。在一些实施方案中，用作可选择或可筛选标记的DNA可在可再生的植物组织中起作用以产生可赋予植物组织对其它有毒化合物的抗性的化合物。许多可选择或可筛选标记基因是本领域已知的并且可被使用。用作可选择或可筛选标记的基因可包括但不限于β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶(LUC)、赋予对抗生素如卡那霉素(Dekeyser等，Plant Physiology(1989)90:217-223)或壮观霉素(例如壮观霉素氨基葡糖苷腺苷转移酶(aadA)；美国专利第5,217,902号)的耐受性的基因、编码赋予对如下的除草剂的耐受性的酶的基因：草甘膦(例如5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS):Della-Cioppa等，Bio/Technology(1987)5:579-584)；美国专利第5,627,061号；美国专利第5,633,435号；美国专利第6,040,497号；美国专利第5,094,945号；WO04074443和WO04009761)；草甘膦氧化还原酶(GOX；美国专利第5,463,175号)；草甘膦脱羧酶(WO05003362和美国专利公开20040177399；或草甘膦N-乙酰基转移酶(GAT):Castle等，Science(2004)304:1151-1154)；美国专利公开20030083480)、茅草枯(例如，编码赋予对2,2-二氯丙酸的耐受性的2,2-二氯丙酸脱卤素酶的dehI(Dalapon；WO9927116))、溴苯腈(赋予对溴苯腈的耐受性的卤代芳基腈水解酶(Bxn)(WO8704181A1；美国专利第4,810,648号；WO8900193A)、磺酰除草剂(例如赋予对乙酰乳酸合酶抑制剂诸如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基氧基苯甲酸酯和四氯苯酞的耐受性的乙酰羟酸合酶或乙酸乳酸合酶；(美国专利第6,225,105号、第5,767,366号、第4,761,373号、第5,633,437号、第6,613,963号、第5,013,659号、第5,141,870号、第5,378,824号、第5,605,011号)；编码ALS、GST-II)、双丙氨磷(bialaphos)或草丁膦或衍生物(例如，赋予对草丁膦或草铵膦的耐受性的草丁膦乙酰基转移酶(bar)(美国专利第5,646,024号、第5,561,236号、第5,276,268号、第5,637,489号、第5,273,894号和第EP 275,957号)、阿特拉津(编码GST-III)、麦草畏(麦草畏单加氧酶；美国专利申请公开20030115626、20030135879)或稀禾定(赋予对环己二酮(稀禾定)和芳基氧苯氧丙酸酯(吡氟氯禾灵)的耐受性的经修饰的乙酰辅酶A羧化酶(美国专利第6,414,222号)，等等。还可以实施其它选择方法，包括阳性选择机制(例如，使用大肠杆菌(Escherichia coli)的manA基因，允许在甘露糖存在的情况下生长)和双重选择(例如同时使用75-100ppm壮观霉素和3-10ppm草铵膦，或75ppm壮观霉素和0.2-0.25ppm麦草畏)并且仍然落入本公开的范围内。还考虑使用浓度为约25-1000ppm，诸如约150ppm的壮观霉素。
在一个方面，本文提供的可选择或可筛选标记是阳性选择标记。阳性选择标记赋予包含此类标记的细胞有利方面。在一个方面，本文提供的目标序列可包含一个或多个阳性选择标记。在一些实施方案中，阳性选择标记赋予抗生素抗性或除草剂抗性。在另一个方面，本文提供的可选择或可筛选标记是阴性选择标记。在一些实施方案中，本文提供的目标序列可包含一个或多个阴性选择标记。在另一个方面，本文提供的可选择或可筛选标记是阳性选择标记和阴性选择标记。本文提供的阴性选择标记可以是致死性或非致死性阴性选择标记。非致死性阴性选择标记的实例包括例如美国公开第2004-0237142号，诸如GGPP合酶、GA 2-氧化酶基因序列、异戊烯基转移酶(IPT)、CKI1(细胞分裂素非依赖性1)、ESR-2、ESR1-A、产生生长素的基因，诸如吲哚-3-乙酸(IAA)、iaaM、iaah、roLABC、导致乙烯生物合成酶过表达的基因、VP1基因、AB13基因、LEC1基因和Bas1基因。非致死性阴性选择标记基因可包含在本文提供的任何核酸分子上。本文提供的非致死性阴性选择标记基因是导致一类酶的过表达的基因，所述酶使用赤霉酸(GA)生物合成途径的底物，但不导致生物活性GA的产生。在另一个方面，本文提供的核酸分子包含非致死性阴性选择标记基因，诸如来自草生欧文氏杆菌的八氢番茄红素合酶基因(crtB)。
在一个方面，通过使用可选择或可筛选标记，可以提供或增强鉴定转化体的能力。在一些实施方案中，可选择或可筛选标记赋予表达所述标记蛋白的细胞不同的表型，并且通常提供更高效地区分此类转化细胞与不具有所述可选择或可筛选标记的细胞的手段。此类基因可编码可选择或可筛选标记，这取决于标记是否赋予可通过化学手段(诸如通过使用选择剂(例如，除草剂或抗生素))“选择”的性状，或者其是否只是可通过观察(例如，GFP的表达)或测试或“筛选”来鉴定的生状。当然，合适的标记蛋白的许多实例是本领域已知的，并且可以用于本发明的实践。
术语“可选择”或“可筛选标记”还包括编码“可分泌标记”的基因，可将所述标记的分泌作为鉴定或选择转化细胞的手段进行检测。实例包括为可通过抗体相互作用鉴定的可分泌抗原的标记，或甚至可通过其催化活性检测的可分泌酶。通过ELISA，可分泌蛋白质分为许多类别，包括可检测的小的可扩散蛋白质；或在细胞外溶液中可检测到的小的活性酶(例如，α淀粉酶、β-内酰胺酶、草丁膦乙酰基转移酶)；和被插入或捕获在细胞壁中的蛋白质(例如，包含前导序列(诸如在伸展蛋白或烟草PRS的表达单元中发现的序列)的蛋白质)。
许多可选择标记编码区是已知的并且可以使用，包括但不限于neo(Potrykus等，1985)，其提供卡那霉素抗性并且可被选择用于使用卡那霉素、G418、巴龙霉素等；bar，其赋予双丙氨膦或草丁膦抗性；赋予草甘膦抗性的突变型EPSP合酶蛋白(Hinchee等，1988)；来自鼻克雷白氏杆菌(Klebsiella ozaenae)的腈水解酶诸如bxn，其赋予对溴苯腈的抗性(Stalker等，1988)；突变型乙酰乳酸合酶(ALS)，其赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其它抑制ALS的化学物质的抗性(欧洲专利申请154,204,1985)；甲氨蝶呤抗性DHFR(Thillet等，1988)，赋予对除草剂茅草枯的抗性的茅草枯脱卤素酶；或突变的邻氨基苯甲酸合酶，其赋予对5-甲基色氨酸的抗性。
可以使用的可筛选标记的实例包括β葡糖醛酸酶(GUS)或uidA基因，其编码已知其的各种生色底物的酶；R-基因座基因，其编码调节植物组织中花青素色素(红色)的产生的产物(Dellaporta等，1988)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe，1978)，其编码已知其的各种生色底物的酶(例如，PADAC，一种生色头孢菌素)；xylE基因(Zukowsky等，1983)，其编码可以转化生色儿茶酚类的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，其编码能够将酪氨酸氧化成多巴和多巴醌的酶，所述多巴和多巴醌进而缩合形成易于检测的化合物黑色素；β-半乳糖苷酶基因，其编码存在其生色底物的酶；萤光素酶(lux)基因(Ow等，1986)，其允许生物发光检测；水母发光蛋白基因(Prasher等，1985)，其可用于钙敏感性生物发光检测；或编码绿色荧光蛋白的基因(Sheen等，1995；Haseloff等，1997；Reichel等，1996；Tian等，1997；WO 97/41228)。
位点特异性酶
在一个方面，本文提供的目标序列包含编码至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种或更多种位点特异性酶的多核苷酸。在另一个方面，本文提供的植物细胞已包含编码位点特异性酶的多核苷酸。在一个方面，本文提供的编码位点特异性酶的多核苷酸稳定地转化至植物细胞中。在一个方面，本文提供的编码位点特异性酶的多核苷酸瞬时转化至植物细胞中。在另一个方面，编码位点特异性酶的多核苷酸处于可调型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子或可用于表达位点特异性酶的任何启动子的控制之下。
在一个方面，载体以顺式包含编码位点特异性酶和目标序列的盒，使得当与植物细胞的基因组接触时，位点特异性酶使得能够进行目标序列的位点特异性整合。在一个方面，第一载体包含编码位点特异性酶并且第二载体包含目标序列，使得当与植物细胞的基因组接触时，以反式方式提供的位点特异性酶使得能够进行目标序列的位点特异性整合。
如本文中所用，术语“位点特异性酶”是指可以以位点特异性方式切割核苷酸序列的任何酶。在一个方面，本文提供的位点特异性酶选自由以下组成的组：内切核酸酶(不限于，例如，大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN))、Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌Argonaute(TtAgo)、激烈火球菌Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo)、RNA-引导的核酸酶(RNA-引导的核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、其同源物或其经修饰的形式)；重组酶(不限制，例如，附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶、附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶)；转座酶(不限于，例如，附接于DNA结合结构域的DNA转座酶)；或其任何组合。
在一个方面，本文提供的附接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下组成的组：Cre重组酶、Gin重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一个方面，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶与锌指DNA结合结构域连接。在另一个方面，本文提供的附接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。另一方面，本文提供的附接于DNA结合结构域的DNA转座酶选自由TALE-piggyBac和TALE-Mutator组成的组。
位点特异性核酸酶诸如大范围核酸酶、ZFN、TALEN、Argonaute蛋白(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌Argonaute(TtAgo)、激烈火球菌Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo)、其同源物或其经修饰的形式)、Cas9核酸酶(RNA-引导的核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、其同源物或其经修饰的形式)在基因组序列的靶位点处诱导双链DNA断裂，随后通过HR或NHEJ的天然过程修复所述序列。然后在切割位点发生序列修饰，其可包括在NHEJ的情况下导致基因破坏的缺失或插入，或通过HR进行的核酸序列的整合。
在一个方面，本文提供的载体或目的序列可包含编码锌指核酸酶的核酸序列。ZFN是合成蛋白质，其由与FokI限制性内切核酸酶的切割结构域融合的工程化锌指DNA结合结构域组成。ZFN可被设计来切割几乎任何长的双链DNA的区段，以用于修饰锌指DNA结合结构域。ZFN从单体形成二聚体，所述单体由与经工程化以结合靶DNA序列的锌指阵列融合的FokI内切核酸酶的非特异性DNA切割结构域组成。
ZFN的DNA结合结构域通常由3-4个锌指阵列组成。相对于锌指∞-螺旋的起始的位置-1、+2、+3和+6处的氨基酸(其促成与靶DNA的位点特异性结合)可被改变和定制以适合特定目标序列。其它氨基酸形成共有主链以产生具有不同序列特异性的ZFN。用于选择ZFN的靶序列的规则在本领域中是已知的。
FokI核酸酶结构域需要二聚化以切割DNA，因此需要两个具有其C末端区域的ZFN来结合切割位点的相对DNA链(间隔5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，则ZFN单体可以切割靶位点。如本文中所用，术语ZFN是宽泛的并且包括单体ZFN，所述单体ZFN可在没有另一ZFN帮助的情况下切割双链DNA。术语ZFN还用于指一对ZFN的一个或两个成员，所述ZFN经工程化以共同作用以在相同位点切割DNA。
因为锌指结构域的DNA结合特异性原则上可以使用各种方法之一进行再工程化，因此理论上可以构建定制的ZFN以靶向几乎任何基因序列。用于工程化锌指结构域的公开可用的方法包括上下文相关装配(Context-dependent Assembly)(CoDA)、寡聚化池工程(Oligomerized Pool Engineering)(OPEN)和模块化装配。
在一个方面，本文提供的载体或目标序列可包含编码转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)的核酸序列。TALEN是通过将转录激活因子样效应子(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域融合而产生的人工限制性内切酶。在一些实施方案中，核酸酶选自由以下组成的组：PvuII、MutH、TevI和FokI、AlwI、MlyI、SbfI、SdaI、StsI、CleDORF、Clo051、Pept071。当TALEN对的每个成员与侧接靶位点的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并导致靶位点处的双链DNA断裂。
如本文中所用，术语TALEN是宽泛的并且包括单体ZFN，所述单体ZFN可在没有另一TALEN帮助的情况下切割双链DNA。术语TALEN还用于指一对TALEN的一个或两个成员，所述TALEN经工程化以共同作用以在相同位点切割DNA。
可工程化转录激活因子样效应子(TALE)以实际上结合任何DNA序列。TALE蛋白质是衍生自黄单胞菌属(Xanthomonas)的各种植物细菌病原体的DNA结合结构域。X病原体在感染期间将TALE分泌到宿主植物细胞中。TALE移动至细胞核，在那里其识别并结合宿主基因组中特定基因的启动子区域中的特定DNA序列的启动子区域中的特定DNA序列。TALE具有由13-28个具有33-34个氨基酸的重复单体组成的中心DNA结合结构域。除位置12和13处的高变氨基酸残基外，每种单体的氨基酸都是高度保守的。所述两个可变氨基酸被称为重复可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可以识别连续DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来工程化特定的DNA结合结构域。
除了野生型FokI切割结构域以外，还已设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以提高切割特异性和切割活性。FokI结构域起着二聚体的作用，需要两个具有针对靶基因组中的具有适当取向和间距的位点的独特DNA结合结构域的构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数是用于实现高水平活性的参数。PvuII、MutH和TevI切割结构域是用于TALE的FokI和FokI变体的有用替代物。当与TALE偶联时，PvuII作为高度特异性的切割结构域起作用(参见Yank等2013.PLoS One.8:e82539)。MutH能够链特异性切口引入DNA(参见Gabsalilow等2013.Nucleic Acids Research.41:e83)。TevI将双链断开在靶向位点处引入DNA(参见Beurdeley等，2013.Nature Communications.4:1762)。
氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。软件程序诸如DNA Works可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其它方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle等，Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等，Nucleic Acids Research(2011).39:e82；和tale-nt.cac.cornell.edu/about。
在一个方面，本文提供的载体或目标序列可包含编大范围核酸酶的核酸序列。通常在微生物中鉴定的大范围核酸酶是具有高活性和长识别序列(>14bp)的独特酶，其导致靶DNA的位点特异性消化。天然存在的大范围核酸酶的工程化形式通常具有延长的DNA识别序列(例如，14至40bp)。
大范围核酸酶的工程比ZFN和TALEN更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和切割功能在单个结构域中交织在一起。已将诱变和高通量筛选的专门方法用于产生新型大范围核酸酶变体，其识别独特序列并具有提高的核酸酶活性。
在一个方面，本文提供的载体可包含编码Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌Argonaute(TtAgo)、激烈火球菌Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo)、其同源物或其经修饰的形式)的核酸序列和任选的编码DNA引导的序列的任何组合。
在一个方面，本文提供的载体可包含编码RNA引导的Cas9核酸酶(RNA引导的核酸酶的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、其同源物或其经修饰的形式)；和任选的靶向各自核酸酶所必需的引导RNA的任何组合。
Cas9核酸酶是细菌和古细菌的适应性免疫系统的一部分，通过以序列依赖性方式切割外源DNA来保护它们免受入侵核酸诸如病毒的侵害。通过将称为间隔子的入侵DNA的短片段整合在CRISPR基因座近端的两个相邻重复之间来获得免疫。CRISPR阵列(包括间隔子)在随后与侵入性DNA相遇期间被转录，并被加工成长度约为40nt的小干扰CRISPR RNA(crRNA)，其与反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)组合以激活和引导Cas9核酸酶。这切割了入侵DNA中称为原型间隔子的同源双链DNA序列。切割的先决条件是在靶DNA下游存在保守的原型间隔子-邻近基序(PAM)，其通常具有序列5-NGG-3但较少发生NAG。特异性由PAM上游约12个碱基的所谓“种子序列”提供，所述种子序列必须在RNA与靶DNA之间匹配。Cpf1以与Cas9类似的方式起作用，但Cpf1不需要tracrRNA。
位点特异性酶靶位点
在一个方面，本文提供的核酸分子包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个位点特异性酶靶位点。在一个方面，本文提供的载体或目标序列包含Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点、TALEN位点或其任何组合。在另一个方面，本文提供的载体或目标序列包含Cre重组酶或Flp重组系统。在一个方面，本文提供的重组系统可以顺式作用。在另一个方面，本文提供的重组系统可以反式作用。
在一个方面，本文提供的位点特异性酶靶位点为至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个或至少500个核苷酸。
Flp-FRT定点重组系统来自面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2μ质粒。在该系统中，Flp重组酶(翻转酶)重组翻转酶识别靶(FRT)位点之间的序列。FRT位点包含34个核苷酸。Flp结合于FRT位点的“臂”(一个臂处于反向)并在间插核酸序列的两个末端切割FRT位点。切割后，Flp重组两个FRT位点之间的核酸序列。
Cre-lox是源自噬菌体P1的定点重组系统，其类似于Flp-FRT重组系统。Cre-lox可用于倒转核酸序列，删除核酸序列或使核酸序列易位。在该系统中，Cre重组酶重组一对lox核酸序列。Lox位点包含34个核苷酸，其中第一个和最后13个核苷酸(臂)是回文的。在重组期间，Cre重组酶蛋白与不同核酸上的两个lox位点结合并在lox位点切割。将切割的核酸剪接在一起(相互易位)并完成重组。在另一个方面，本文提供的lox位点是loxP、lox 2272、loxN、lox 511、lox5171、lox71、lox66、M2、M3、M7或M11位点。
用于植物中的基因修饰的方法和组合物
在一个方面，本公开提供了包含至少一种能够形成两个基本上互补的T链的载体的根瘤菌目细胞。在另一个方面，本公开提供了包含至少一种能够形成两个基本上互补的T链的载体的土壤杆菌属细胞。
在一个方面，本公开提供了提高目标序列的定点整合率的方法，其包括使植物细胞与能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种载体。在一个方面，本公开提供了转化植物细胞的方法，其包括使植物细胞与能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成在T链的至少一部分中基本上互补的两条T链的载体。
在一个方面，本文公开的载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，其中RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链中的5’端至3’端的反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链是基本上彼此互补的。
在另一个实施方案中，本文提供的载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)、至少一个目标序列、第一左边界DNA序列(LB1)和第二左边界DNA序列(LB2)，其中所述载体被配置成使得RB1与位于所述载体中的LB1配对以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2与位于所述载体中的LB2配对以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。
在另一实施方案中，本文公开的载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)、至少一个目标序列和左边界DNA序列(LB)，其中载体被配置成使得RB1与位于所述载体中的LB配对以启动(RB1)和终止(LB)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。
在另一个方面，本文提供的载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)、至少一个目标序列和左边界DNA序列(LB)，其中所述载体被配置成使得RB1启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且RB2与位于所述载体中的LB配对以启动(RB2)和终止(LB)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。
在另一个实施方案中，本文公开的载体包含第一目标序列和第二目标序列，其中第一目标序列与第二目标序列基本相同；并且所述载体还包含位于所述载体中的第一右边界DNA序列(RB1)和第一左边界DNA序列(LB1)以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体还包含位于所述载体中的第二右边界DNA序列(RB2)和第二左边界DNA序列(LB2)以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第二目标序列相对于第一T链中的第一目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列和第二目标序列的至少一部分中是基本上互补的。
在另一个实施方案中，本文公开的载体包含第一目标序列和第二目标序列，其中第一目标序列与第二目标序列基本相同；并且所述载体还包含位于所述载体中的第一右边界DNA序列(RB1)和左边界DNA序列(LB)以启动(RB1)和终止(LB)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体还包含第二右边界DNA序列(RB2)，其启动(RB2)第二T链的合成，使得第二目标序列相对于第一T链中的第一目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列和第二目标序列的至少一部分中是基本上互补的。
在另一个实施方案中，本文提供的载体包含第一目标序列和第二目标序列，其中第一目标序列与第二目标序列基本上相同；并且所述载体还包含第一右边界DNA序列(RB1)，其启动第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体还包含位于所述载体中的第二右边界DNA序列(RB2)和左边界DNA序列(LB)以启动(RB2)和终止(LB)第二T链的合成，使得第二目标序列相对于第一T链中的第一目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列和第二目标序列的至少一部分中是基本上互补的。
在另一个实施方案中，本文公开的载体包含第一目标序列和第二目标序列，其中第一目标序列与第二目标序列基本上相同；并且所述载体还包含第一右边界DNA序列(RB1)以启动第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述载体还第二右边界DNA序列(RB2)，其启动第二T链的合成，使得第二目标序列相对于第一T链中的第一目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在第一目标序列和第二目标序列的至少一部分中是基本上互补的。
在另一个实施方案中，本文公开的根瘤菌目细胞包含至少第一载体和第二载体，所述载体各自包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的第一右边界DNA序列(RB1)和第一左边界DNA序列(LB1)以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于第二载体中的第二右边界DNA序列(RB2)和第二左边界DNA序列(LB2)以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
在另一个实施方案中，本文提供的根瘤菌目细胞包含至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的第一右边界DNA序列(RB1)和左边界DNA序列(LB)以启动(RB1)和终止(LB)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含第二右边界DNA序列(RB2)，其启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
在另一个实施方案中，本文提供的根瘤菌目细胞包含至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含第一右边界DNA序列(RB1)，其启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于第二载体中的第二右边界DNA序列(RB2)和左边界DNA序列(LB)以启动(RB2)和终止(LB)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
在另一个实施方案中，本文提供的根瘤菌目细胞包含至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含第一右边界DNA序列(RB1)，其启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含第二右边界DNA序列(RB2)，其启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
在一个方面，本公开提供的方法包括两种或更多种载体，其中所述两种或更多种载体存在于一种根瘤菌目细胞中。在一个方面，本公开提供的方法包括两种或更多种载体，其中所述两种或更多种载体存在于两种或更多种根瘤菌目细胞中。例如，第一根瘤菌目细胞包含第一载体，并且第二根瘤菌目细胞包含第二载体。
在一个方面，本公开提供了提高目标序列的定点整合率的方法，其包括使植物细胞与两种或更多种能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述两种或更多种根瘤菌目细胞各自含有至少两种能够形成两个基本上互补的T-链的载体中的一种。
在另一个方面，本公开提供了转化植物细胞的方法，其包括使植物细胞与两种或更多种能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述两种或更多种根瘤菌目细胞各自含有至少两种能够形成两个基本上互补的T-链的载体中的一种。在另一个方面，本公开提供了提高目标序列的定点整合率的方法，其包括使植物细胞与两种或更多种根瘤菌目细胞接触，其中所述两种或更多种根瘤菌目细胞各自含有至少两种能够形成两个基本上互补的T-链的载体中的一种。
在一方面，本文提供的第一根瘤菌目细胞和第二根瘤菌目细胞分别含有至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含第一右边界DNA序列(RB1)，并且其中RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于所述载体中的第二右边界DNA序列(RB2)以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。
在另一个实施方案中，本文提供的第一根瘤菌目细胞和第二根瘤菌目细胞分别含有至少第一载体和第二载体，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的第一右边界DNA序列(RB1)和第一左边界DNA序列(LB1)以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于第二载体中的第二右边界DNA序列(RB2)和第二左边界DNA序列(LB2)以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列是基本上彼此互补的。
在一个实施方案中，本公开提供了包括第一根瘤菌目细胞和第二根瘤菌目细胞的方法，其中每种根瘤菌目细胞含有两种载体中的至少一种，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含第一右边界DNA序列(RB1)，并且其中RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于所述载体中的第二右边界DNA序列(RB2)以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上互补的。
在另一个实施方案中，本公开提供了包括第一根瘤菌目细胞和第二根瘤菌目细胞的方法，其中每种根瘤菌目细胞含有两种载体中的至少一种，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的第一右边界DNA序列(RB1)和第一左边界DNA序列(LB1)以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于第二载体中的第二右边界DNA序列(RB2)和第二左边界DNA序列(LB2)以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列是基本上彼此互补的。
在另一个实施方案中，本公开提供了包括第一根瘤菌目细胞和第二根瘤菌目细胞的方法，其中每种根瘤菌目细胞含有两种载体中的至少一种，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含位于第一载体中的第一右边界DNA序列(RB1)和第一左边界DNA序列(LB)以启动(RB1)和终止(LB)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含第二右边界DNA序列(RB2)以启动第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列是基本上彼此互补的。
在另一个实施方案中，本公开提供了包括第一根瘤菌目细胞和第二根瘤菌目细胞的方法，其中每种根瘤菌目细胞含有两种载体中的至少一种，其中每种载体包含基本上相同的目标序列，并且其中第一载体包含第一右边界DNA序列(RB1)以启动第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体包含位于第二载体中的第二右边界DNA序列(RB2)和左边界DNA序列(LB)以启动(RB2)和终止(LB)第二T链的合成，使得目标序列处于第二T链的5’端至3’端的反义方向，并且其中由RB1和RB2处的启动产生的两条T链中的目标序列是基本上彼此互补的。
在另一个实施方案中，本文公开的至少一种载体包含RB和LB，并且其中载体在RB与LB之间还包含：(i)相对于RB处于有义方向的第一目标序列，(ii)间隔子，和(iii)相对于RB处于反义方向的第二目标序列，其中所述第一目标序列和第二目标序列是基本上互补的并且在T链合成后退火以形成双链DNA。
在一个方面，将至少部分目的序列整合到载体中导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的内源基因组基因座的转录、减少的内源基因组基因座的转录、改变的蛋白质活性、增加的目标序列的转录、减少的整合目标序列的转录或其组合。
在一个方面，载体中的目标序列还包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、第五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个位点特异性酶靶位点。位点特异性酶靶位点的实例包括但不限于Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。
在一个方面，根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种、中华根瘤菌属的某种和剑菌属的某种。在另一个方面，根瘤菌目细胞是土壤杆菌属细胞。在另一方面，根瘤菌目细胞是根癌土壤杆菌属细胞。另一方面，根瘤菌目细胞还含有载体，所述载体包含一个或多个基因表达盒，所述基因表达盒具有编码增强DNA修复功能的细胞因子的序列、一个或多个土壤杆菌Ti质粒vir基因、一个或多个可选择标记基因、复制起始点或其任何组合。
通过延长的共培养提高定点整合率的方法
在一个方面，本公开提供了增加植物基因组中目标序列的定点整合率的方法，其包括使至少一种植物细胞与能够转化植物细胞的根瘤菌目细胞在共培养基上接触至少2天、至少3天、至少4天或至少5天，其中根瘤菌目细胞包含至少一种本公开中描述的载体。
在另一个方面，本公开提供了转化植物基因组的方法，其包括使至少一种植物细胞与至少一种能够转化所述植物细胞的根瘤菌目细胞在共培养基上接触至少2天、至少3天、至少4天或至少5天，其中根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成两个基本上互补的T链的载体。
在一个方面，接触包括使植物细胞与根瘤菌目细胞共培养至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天或至少10天。在一个方面，接触包括将植物细胞与根瘤菌目细胞共培养至少48小时、至少49小时、至少50小时、至少51小时、至少52小时、至少53小时、至少54小时、至少55小时、至少56小时、至少57小时、至少58小时、至少59小时、至少60小时、至少61小时、至少62小时、至少63小时、至少64小时、至少65小时、至少66小时、至少67小时、至少68小时、至少69小时、至少70小时、至少71小时、至少72小时、至少73小时、至少74小时、至少75小时、至少76小时、至少77小时、至少78小时、至少79小时、至少80小时、至少81小时、至少82小时、至少83小时、至少84小时、至少85小时、至少86小时、至少87小时、至少88小时、至少89小时、至少90小时、至少91小时、至少92小时、至少93小时、至少94小时、至少95小时、至少96小时、至少97小时、至少98小时、至少99小时、至少100小时、至少101小时、至少102小时、至少103小时、至少104小时或至少105小时。在一个方面，根瘤菌目细胞选自由以下组成的组：土壤杆菌属的某种的细胞、慢生根瘤菌属的某种的细胞、中生根瘤菌属的某种的细胞、苍白杆菌属的某种的细胞、叶杆菌属的某种的细胞、根瘤菌属的某种的细胞和华根瘤菌属的某种的细胞。在另一个方面，土壤杆菌属的某种的细胞选自由以下组成的组：根癌土壤杆菌属细胞和发根土壤杆菌属细胞。
在一个方面，所述方法还包括检测载体的目标序列的至少一个片段在至少一个植物细胞中的整合。在一个方面，载体中的目标序列的至少一个片段通过HR整合到植物基因组中。在另一个方面，载体中的目标序列的至少一个片段通过NHEJ整合到植物基因组中。
在一个方面，所述方法还包括基于整合到植物基因组中的载体中的目标序列的至少一个片段的存在来选择植物细胞。在另一方面，所述方法还包括从选择的植物细胞再生转基因植物。
在一个方面，本文提供的用于靶核酸序列的位点特异性修饰的方法或系统涉及同源重组。在另一个方面，本文提供的用于靶核酸序列的位点特异性修饰的方法或系统涉及非同源末端连接。在另一个方面，本文提供的用于靶核酸序列的位点特异性修饰的方法或系统包括非同源末端连接，其还包括将1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个或100个或更多个核苷酸引入靶核酸序列中。
转化方法
转化植物细胞的方法是本领域普通技术人员所熟知的。例如，关于通过利用包被有重组DNA的颗粒的微粒轰击转化植物细胞的详细说明可见于美国专利5,015,580(大豆)；5,550,318(玉米)；5,538,880(玉米)；5,914,451(大豆)；6,160,208(玉米)；6,399,861(玉米)和6,153,812(小麦)；6,002,070(水稻)；7,122,722(棉花)；6,051,756(油菜属)；6,297,056(油菜属)；美国专利公开20040123342(甘蔗)，土壤杆菌属介导的转化描述于美国专利5,159,135(棉花)；5,824,877(大豆)；5,591,616(玉米)；6,384,301(大豆)；5,750,871(油菜属)；5,463,174(油菜属)；5,188,958(油菜属)，所有这些文献均通过引用并入本文。转化其它植物的方法可见于例如Compendium of Transgenic Crop Plants(2009)BlackwellPublishing中。可使用本领域技术人员已知的任何合适的方法用本文提供的任何核酸分子转化植物细胞。
在一个方面，本文提供的方法稳定地转化植物细胞。在一个方面，本文提供的方法瞬时转化植物细胞。在一个方面，本文提供的转化植物细胞的方法包括基因枪转化(biolistic transformation)或细菌介导的转化。在一个方面，本文提供的转化植物细胞的方法包括细菌介导的转化，其还包括使植物细胞与根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞能够转化植物细胞。
优选在于培养基上和受控环境中进行的组织培养中实施提供转基因植物细胞和含有稳定整合的本文中提供的核酸分子的转基因植物的转化方法。“培养基”是指用于在体外(即，在完整的活生物体外部)培养细胞的众多营养混合物。
在一个方面，本公开提供了不是繁殖材料并且不介导植物的天然繁殖的植物细胞。在一个方面，本公开提供了为繁殖材料并且介导植物的天然繁殖的植物细胞。在另一个方面，本公开提供了不能通过光合作用维持其自身的植物细胞。在另一个方面，本公开提供了植物体细胞。与生殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
用于转化的受体细胞靶标包括但不限于种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、下胚轴细胞、分生组织细胞、胚细胞、胚乳细胞、根细胞、芽细胞、干细胞、豆荚细胞、花细胞、花序细胞、茎细胞、花梗细胞、花柱细胞、柱头细胞、生殖托细胞(receptacle cell)、花瓣细胞、萼片细胞、花粉细胞、花药细胞、细丝细胞(filament cell)、卵巢细胞、胚珠细胞、果皮细胞、韧皮部细胞、芽细胞或维管组织细胞。在另一个方面，本公开提供了植物叶绿体。在另一个方面，本公开提供表皮细胞、气孔细胞、毛状体细胞、根毛细胞、储藏根细胞或块茎细胞。在另一个方面，本公开提供了叶绿体。在另一个方面，本公开提供了植物愈伤组织细胞。将可从其再生可育植物的任何细胞考虑作为用于实施本公开的有用的受体细胞。愈伤组织可起始于各种组织来源，包括但不限于未成熟胚或胚的部分、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够作为愈伤组织增殖的那些细胞可以作为转化的受体细胞。本公开的用于制备转基因植物的实际转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞，未成熟胚的转化，以及随后的可育转基因植物的再生)公开于例如美国专利6,194,636和6,232,526以及美国专利中。申请公开2004/0216189。
在一个方面，本公开提供了通过本文提供的任何方法转化的植物细胞。在一个方面，本文提供的植物细胞选自由以下组成的组：金合欢属细胞、苜蓿细胞、莳萝(aneth)细胞、苹果细胞、杏细胞、朝鲜蓟细胞、芝麻菜细胞、芦笋细胞、鳄梨细胞、香蕉细胞、大麦细胞、豆细胞、甜菜细胞、黑莓细胞、蓝莓细胞、青花菜细胞、孢子甘蓝(Brussels sprout)细胞、甘蓝细胞、油菜细胞、哈密瓜细胞、胡萝卜细胞、木薯细胞、花椰菜细胞、芹菜细胞、大白菜细胞、樱桃细胞、香菜细胞、柑橘属细胞、克莱门氏小柑橘细胞、咖啡细胞、玉米细胞、棉花细胞、黄瓜细胞、道格拉斯冷杉细胞、茄子细胞、莴苣细胞、苣荬菜(escarole)细胞、桉树细胞、茴香细胞、无花果细胞、森林树细胞、葫芦细胞、葡萄细胞、葡萄柚细胞、蜜露(honey dew)细胞、豆薯细胞、猕猴桃细胞、莴苣细胞、韭菜细胞、柠檬细胞、莱姆细胞(lime cell)、火炬松细胞、芒果细胞、枫树细胞、甜瓜细胞、蘑菇细胞、油桃细胞、坚果细胞、燕麦细胞、秋葵细胞、洋葱细胞、柑橘细胞、观赏植物细胞、木瓜细胞、欧芹细胞、豌豆细胞、桃细胞、花生细胞、梨细胞、胡椒细胞、柿子细胞、松树细胞、菠萝细胞、大蕉细胞、李子细胞、石榴细胞、杨树细胞、马铃薯细胞、南瓜细胞、榲桲(quince)细胞、辐射松细胞、菊苣细胞、萝卜细胞、油菜籽细胞、覆盆子细胞、水稻细胞、黑麦细胞、高粱细胞、南方松细胞、大豆细胞、菠菜细胞、南瓜细胞、草莓细胞、甜菜细胞、甘蔗细胞、向日葵细胞、甜玉米细胞、甘薯细胞、枫香树细胞、橘子细胞(tangerine cell)、茶细胞、烟草细胞、番茄细胞、草皮细胞、藤蔓细胞、西瓜细胞、小麦细胞、山药细胞和西葫芦细胞。在另一个方面，本文提供的植物细胞选自由以下组成的组：玉米细胞、大豆细胞、油菜细胞、棉花细胞、小麦细胞和甘蔗细胞。
在另一个方面，本文提供的植物细胞选自由以下组成的组：玉米未成熟胚细胞、玉米成熟胚细胞、玉米种子细胞、大豆未成熟胚细胞、大豆成熟胚细胞、大豆种子细胞、油菜未成熟胚细胞、油菜成熟胚细胞、油菜种子细胞、棉花未成熟胚细胞、棉花成熟胚细胞、棉花种子细胞、小麦未成熟胚细胞、小麦成熟胚细胞、小麦种子细胞、甘蔗未成熟胚细胞、甘蔗成熟胚细胞、甘蔗种子细胞。
在一个方面，植物细胞的转化通过土壤杆菌属或其它根瘤菌目介导的方法(美国专利第6,265,638号、第5,731,179号；美国专利申请公开US2005/0183170；2003110532)进行。本文提供的可被转移到植物细胞中的多核苷酸序列可存在于用于转化的一种细菌菌株中的一个重组载体上。在另一个方面，本文提供的多核苷酸序列可存在于一种细菌菌株中的单独的重组载体上。在另一个方面，本文提供的多核苷酸序列可存在于一起用于转化的单独的细菌细胞菌株中。
在本公开的方法中用于转化的DNA构建体通常还含有质粒主链DNA区段(其在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择)，例如大肠杆菌复制起始点诸如ori322、土壤杆菌属复制起始点诸如oriV或oriRi，和可选择标记(诸如Spec/Strp，其编码赋予对壮观霉素或链霉素的抗性的Tn7氨基糖苷腺苷转移酶(aadA)，或庆大霉素(Gm，Gent)可选择标记基因)。对于植物转化，宿主细菌菌株通常是携带具有表达单元转移功能的质粒的根癌土壤杆菌ABI、C58、LBA4404、AGLO、AGL1、EHA101或EHA105。植物转化领域技术人员已知的其它菌株可以在本公开中起作用。
为了确认转化细胞或基因组中存在整合的DNA，可以进行多种测定。此类测定包括，例如，分子生物学测定(例如，DNA和RNA印迹、PCRTM)；生物化学测定诸如检测蛋白质产物的存在(例如，通过免疫学手段(ELISA和免疫印迹)，或通过酶促功能(例如，GUS测定))；花粉组织化学；植物部分测定，(例如，叶或根测定)；以及还有，通过分析整个再生植物的表型。
本公开还提供了转基因植物细胞，其包含根据本文公开的方法整合到植物细胞基因组中的目标序列。还提供了通过本文公开的方法产生的转基因植物。
实施例
实施例1.对照载体的构建体
产生两种对照载体作为土壤杆菌属介导的转化的非限制性实例。两种对照载体均含有包含三个表达盒的目标序列：位于左同源臂和右同源臂之间的编码赋予对除草剂草甘膦的耐受性的基因(CP4-EPSPS)的表达盒；和两个各自编码TALEN对的一半的表达盒。TALEN获自Life Technologies。如图4A所示，第一对照载体包含RB DNA序列、包含三个表达盒的目标序列和LB DNA序列。第二对照载体除没有LB DNA序列外，与第一对照载体相同。将这两种对照载体用于下面的实施例9中。
实施例2.具有两个RB DNA序列的载体的构建体
产生包含两个RB DNA序列和零LB DNA序列的载体用于土壤杆菌属介导的转化(图4B)。构建载体以含有目标序列，所述目标序列包含3个表达盒：一个位于左同源臂与右同源臂之间的编码赋予对除草剂草甘膦的耐受性的基因(CP4-EPSPS)的表达盒；和两个各自编码TALEN对的一半的表达盒；以及两个RB DNA序列(RB1和RB2)。该载体用于下面的实施例9中。载体构型包含位于所述载体中的第一RB DNA序列(RB1)，以启动包含三个表达盒(CP4-EPSPS和两个TALEN)的第一T链的合成；并且第二RB DNA序列(RB2)位于所述载体中以启动包含三个表达盒(CP4-EPSPS和两个TALEN)的第二T链的合成，使得第二T链相对于第一T链处于反义方向。由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
实施例3.具有两个RB DNA序列和一个LB DNA序列的载体的构建体
产生包含两个RB DNA序列和一个LB DNA序列的载体用于土壤杆菌属介导的转化(图4C)。构建载体以含有目标序列，所述目标序列包含3个表达盒：一个位于左同源臂与右同源臂之间的编码赋予对除草剂草甘膦的耐受性的基因(CP4-EPSPS)的表达盒；和两个各自编码TALEN对的一半的表达盒；以及两个右边界DNA序列(RB1和RB2)和一个与第一RB DNA序列(RB1)配对的LB DNA序列(LB1)。载体构型包含位于所述载体中的第一RB DNA序列(RB1)，以启动包含三个表达盒(CP4-EPSPS和两个TALEN)的第一T链的合成并且在第一LBDAN序列(LB1)(与RB1配对)处终止合成；并且第二RB DNA序列(RB2)位于所述载体中以启动包含三个表达盒(CP4-EPSPS和两个TALEN)的第二T链的合成，使得第二T链相对于第一T链处于反义方向。将该载体用于下面的实施例9中。由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
实施例4.具有两个RB DNA序列和2个LB DNA序列的载体的构建体
产生包含至少一个目标序列、两个RB DNA序列和两个LB DNA序列的载体用于土壤杆菌属介导的转化(非限制性实例示于图1D中)。载体构型包含与位于所述载体中的第一LBDNA序列(LB1)配对的第一RB DNA序列(RB1)，以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二RB DNA序列(RB2)与位于所述载体中的第二LB DNA序列(LB2)配对，以启动第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向。由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
实施例5.具有两个RB DNA序列和2个基本上相同的目标序列的载体的构建体
产生包含两个基本上相同的目标序列、至少两个RB DNA序列和任选的一个或多个LB DNA序列的载体用于土壤杆菌属介导的转化(非限制性实例示于图2A中)。载体构型包含位于所述载体中的第一RB DNA序列(RB1)和任选的第一LB DNA序列(LB1)，以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第二RB DNA序列(RB2)和任选的第二LB DNA序列(LB2)，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第二目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向。由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
实施例6.用于共转化的两种载体的构建体
提供两种载体来利用土壤杆菌属介导的转化(非限制性实例示于图2B)共转化植物细胞。两种载体构型包含基本上相同的目标序列，其中第一载体构型包含位于第一载体中的第一RB DNA序列(RB1)和任选的第一LB DNA序列(LB1)，以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且第二载体构型包含位于第二载体中的第二RB DNA序列(RB2)和任选的第二LB DNA序列(LB2)，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向。由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。两种载体可在相同的土壤杆菌属细胞中，或者两种载体可在不同的土壤杆菌属细胞中。
实施例7.具有两种不同目标序列和三种或更多种RB DNA序列的载体的构建体
产生包含第一目标序列、与第一目标序列不同的第二目标序列、三个或更多个RBDNA序列以及任选的一个或多个LB DNA序列的载体用于土壤杆菌介导的转化。出于说明目的，载体构型的一个非限制性实例示于图2C中，其中载体构型包含位于所述载体中的第一RB DNA序列(RB1)和第一LB DNA序列(LB1)，以启动(RB1)和终止(LB1)第一T链的合成，使得第一目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第二RB DNA序列(RB2)和第二LB DNA序列(LB2)，以启动(RB2)和终止(LB2)第二T链的合成，使得第一目标序列相对于第一T链中的目标序列处于反义方向。由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。载体构型还包含位于所述载体中的第三RB DNA序列(RB3)和第三LB DNA序列(LB3)以启动(RB3)和终止(LB3)第三T链的合成，使得第二目标序列处于第三T链的5’端至3’端的有义方向；并且载体构型还包含位于所述载体中的第四RB DNA序列(RB4)和第四LB DNA序列(LB4)以启动(RB4)和终止(LB4)第四T链的合成，使得第二目标序列相对于第三T链中的目标序列处于反义方向。由RB3和RB4的启动产生的两条T链在目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
实施例8.具有RB DNA序列、LB DNA序列和通过间隔子连接的两个目标序列的载体的构建体
提供载体来用于土壤杆菌属介导的转化，其中所述载体构型包含RB DNA序列和LBDNA序列，并且其中所述载体在RB与LB DNA序列之间还包含：(i)相对于RB DNA序列处于有义方向的第一目标序列，(ii)间隔子，和(iii)相对于第一目标处于反义方向的第二目标序列。在合成T链之后，两条目标序列由于互补碱基配对而形成部分双链发夹结构。出于说明性目的，图3A中显示了此类载体构型的一个非限制性实例。
实施例9.通过土壤杆菌属介导的转化增加了定点整合的频率
被称为L7的基因座被鉴定为仅在玉米基因组中发生一次。在L7基因座内选择位点，用于在靶位点处通过定点重组插入转基因。为了促进定点重组，将一对TALEN工程化以在L7基因座内的特定位点引入双链断裂。将根据实施例1-3制备的载体(参见表2)转化到未成熟的玉米胚中。载体各自包含含有以下三个表达盒的目标序列：用于表达TALEN对中的每一个的两个表达盒和含有位于左同源臂和右同源臂之间的CP4-EPSPS转基因的表达盒。
将约3000个未成熟玉米胚与含有四种载体中的一种的土壤杆菌属共培养3天，然后移至含有0.1mM草甘膦作为选择剂的愈伤组织诱导培养基中。对于每种载体选择约300株再生植物(R0事件)，将其转移到穴盘中，并在温室中生长。在温室生长一周后从R0叶组织中提取基因组DNA，并且通过实时PCR在分子水平上评估单株植物的(a)转基因(CP4-EPSPS)拷贝数的存在，和(b)靶向序列拷贝数。将对于转基因拷贝数评分为“1”或“2”(即，在植物基因组中插入一个或两个转基因拷贝)，或者对于靶向序列拷贝数评分为“0”或“1”(即，在TALEN酶切后在基因组靶向序列中存在突变)的单株植物选择用于另外的PCR分析。
将利用来自所选R0植物的基因组DNA的PCR用于鉴定在L7靶位点处包含CP4-EPSPS盒插入的单株植物。设计PCR引物使得仅当CP4-EPSPS盒插入玉米基因组的L7靶向区域时才产生产物；一个PCR引物位于侧接靶向区域的基因组DNA中，并且一个PCR引物位于CP4-EPSPS盒内。使用两组PCR引物，一组位于CP4-EPSPS盒的5’端，一组位于CP4-EPSPS盒的3’端。图5显示了用于鉴定L7基因座中CP4-EPSPS盒插入的引物的位置。当CP4-EPSPS盒插入靶向L7基因座时，5’组的PCR引物扩增2676bp的产物；在野生型基因组DNA中未产生产物或者如果CP4-EPSPS盒未插入L7靶位点，则未产生产物。当CP4-EPSPS盒插入靶向L7基因座时，3’组的PCR引物扩增2282bp的产物；在野生型基因组DNA中未产生产物或者如果CP4-EPSPS盒未插入L7靶位点，则未产生产物。PCR后，将产物在琼脂糖凝胶上进行解析，以鉴定对于CP4-EPSPS盒的5’端和3’端具有正确大小的条带的植物。该分析的结果如表2所示。
为了进一步证实TALEN介导的定点整合，选择对于CP4-EPSPS盒的定点插入具有至少一个阳性PCR结果的植物用于DNA印迹分析。用限制性内切核酸酶KpnI消化从植物中提取的基因组DNA。当CP4-EPSPS盒整合到L7靶位点时，利用KpnI的消化产生9.6kb的片段(参见图5)。利用KpnI的消化例如在野生型非转化植物或其中CP4-EPSPS盒未整合到L7基因座中的植物中产生对应于L7基因组基因座的5.1kb的DNA片段(参见图5)。如图5所示，用“左翼探针”探测DNA印迹。显示9.6kb(靶向整合)和5.1kb(野生型/非靶向)的条带的组合的DNA印迹结果表明转基因植物对于CP4-EPSPS盒是半合子的(即，CP4-EPSPS盒是仅靶向一条玉米染色体)。显示9.6kb(靶向整合)的条带的DNA印迹结果表明转基因植物对于CP4-EPSPS盒是纯合子的(即，CP4-EPSPS盒是靶向两条玉米染色体)。使用包含两个RB DNA序列(载体C)或两个RB DNA序列和一个LB DNA序列(载体D)的土壤杆菌属载体进行的TALEN介导的定点整合(SDI)与包含一个RB DNA序列和一个LB DNA序列(载体A)或包含一个RB DNA序列(载体B)的标准土壤杆菌属载体相比，具有更优的效率。数据表明当载体包含两个经定位以产生基本上互补的T链的RB DNA序列时，意外观察到通过NHEJ或HR的定点整合的频率增加。数据进一步表明，当载体包含两个经定位以产生基本上互补的T链的RB DNA序列时，通过HR产生的事件数量增加(参见表2)。
表2.边界构型和定点整合(SDI)频率的概述。
Pos.，阳性；L，左侧；R右侧；NHEJ，非同源末端连接；HR，同源重组。
实施例10.将基因再靶向预先存在的lox位点
将具有两个RB DNA序列的载体用于促进目标序列至基因组DNA中的预先存在的重组位点(例如lox位点)中的定点整合。产生载体，其从5’至3’包含第一右RB DNA序列(RB1)、P-35S-crtB、第一lox位点、基因、第一重组位点(任选的)、选择转化体的标记基因、第二重组位点(任选的)、第二lox位点、P-DaMV-Cre和第二RB DNA序列(RB2)。RB1和RB2位于所述载体中以产生基本上互补的T链。P-35S-crtB是非致死性的、组成型表达的八氢番茄红素合成酶表达盒，其抑制其中发生非靶向重组的细胞中的芽伸长。P-DaMV-Cre是组成型表达的Cre重组酶，其促进间插DNA构建体与靶向基因组lox位点的重组。
在土壤杆菌属介导的转化过程中产生间插DNA的互补链后，间插DNA的lox位点与预先存在的基因组DNA lox位点重组并插入基因组DNA中。转化和重组后的靶标仅含有在两个lox位点之间的间插DNA构建体的区域(在该实施例中，为基因；第一重组位点；标记基因；和第二重组位点)。将任选的重组位点用于在将来的重组事件中去除标记基因。
实施例11.在土壤杆菌属介导的转化过程中延长的共培养增加了定点整合频率。
对于未成熟玉米胚的转化，通常将含有载体的土壤杆菌属与未成熟玉米胚一起孵育12-16小时。本文详述的意外观察结果是，含有载体的土壤杆菌属与未成熟玉米胚的延长的共培养导致载体中包含的目标序列的靶向整合的百分比更高，同时不显著影响转化频率。
除改变共培养时间外，使用标准方案将载体A(图4A，实施例1)用于土壤杆菌属介导的转化。将约3000个未成熟玉米胚共培养1天、2天或3天中的每一种。转化后，将转化体移至含有0.1mM草甘膦作为选择剂的愈伤组织诱导培养基中。将在草甘膦选择后存活的R0植物转移到穴盘中并在温室中生长。
如表3所示，转化频率在共培养期间没有显著变化。用于分子评估的转化植物存活的频率(1天共孵育的存活率为91.7％；2天共孵育的存活率为91.3％；3天共孵育的存活率为92.8％)表明延长的共培养不影响从愈伤组织再生后的植物健康。此外，对于1天、2天和3天的共培养期中的每一种，转化百分比和用于分子评估的存活植物的数量是相似的。
表3.土壤杆菌属介导的转化的延长共培养期的概述
在温室生长一周后，从用于分子评估的存活植物取样R0叶组织，提取基因组DNA并利用实时PCR评估转基因盒(CP4-EPSPS)的存在和拷贝数以及靶向序列的拷贝数。选择对于靶向序列拷贝数评分为“0”或“1”(即，在TALEN酶切割后在基因组靶位点处存在突变)，或对于转基因盒拷贝数评分为“1”或“2”(即，存在插入植物基因组中的转基因盒的一个或两个拷贝)的单株植物用于进一步的PCR分析。靶向位点的突变率是TALEN对在植物细胞中的效果的指标。可以通过测定R0植物中的靶向序列拷贝数来计算突变率。如表4所示，随着共培养期的延长，靶向位点处的突变率增加。
表4.每个共培养期的突变率
将实施例9中描述的PCR方案和引物与来自扩展共培养方案的选定的R0植物的基因组DNA一起使用，以鉴定包含CP4-EPSPS盒的靶向整合的单株植物。如实施例9中所述，并在图5中所说明的，使用两组PCR引物检测CP4-EPSPS盒在L7基因座处的靶向整合。为了进一步验证靶向位点处的连接序列是完美的(例如，HR)还是不完美的(例如，NHEJ)，对PCR产物进行测序。表5显示进行3天共培养存在最多数量的左侧翼、右侧翼或左侧翼和右侧翼的阳性PCR结果。
为了进一步证实PCR结果，如实施例9中所述，选择具有至少一个阳性PCR结果的R0植物用于DNA印迹分析。用限制性内切核酸酶KpnI消化从植物提取的基因组DNA，并用左侧翼探针探测DNA印迹(图5)。对于每个共培养期，检测CP4-EPSPS盒在L7基因座处的靶向整合的PCR和DNA印迹结果概述于表5中。数据表明意外观察到通过NHEJ或HR以及3天的共培养使定点整合的频率增加。该发现表明，土壤杆菌属介导的转化在具有延长的共培养期的未成熟玉米胚中诱导定点整合方面更高效。
表5.共培养实验中左侧翼和右侧翼PCR的结果、DNA印迹结果以及SDI和HR频率的百分比的概述。
NHEJ，非同源末端连接；HR，同源重组
实施例12.侧接有RB和任选的LB的目标序列的定点整合的增加的频率。
选择实施例9中描述的L7基因座内的位点用于转基因盒的定点整合。选择编码CP4-EPSPS的表达盒(CP4-EPSPS)(其赋予除草剂草甘膦的组织限制的耐受性)作为用于在L7基因座位点进行特异性整合的货物。为了促进定点整合，将一对TALEN工程化以在L7基因座内的特定位点引入双链断裂。
产生对照载体(载体6A)用于土壤杆菌属介导的转化(参见图6A)。对照载体包含第一目标序列，其包含编码位于第一RB DNA序列(RB1)与第一LB DNA序列(LB1)之间的CP4-EPSPS的表达盒，使得在RB1处启动并在LB1处终止T链合成。载体还包含第二目标序列，其包含两个各自编码位于第二RB DNA序列(RB2)与第二LB DNA序列(LB2)之间的TALEN对的一半的表达盒，使得在RB2处启动并在LB2处终止T链合成。TALEN获自Life Technologies。
产生第二载体(载体6B)用于土壤杆菌属介导的转化(参见图6B)。该载体包含第一目标序列，其包含编码位于两个RB DNA序列和两个LB DNA序列之间的CP4-EPSPS的表达盒。载体还包含第二目标序列，其包含两个各自编码TALEN对的一半的表达盒。载体构型包含与位于所述载体中的第一LB DNA序列(LB1)配对的第一RB DNA序列(RB1)，以启动(RB1)和终止(LB1)包含CP4-EPSPS的第一T链的合成，所述CP4-EPSPS处于第一T链的5’端至3’端的反义方向；并且第二RB DNA序列(RB2)与位于所述载体中的第二LB DNA序列(LB2)配对，以启动第二T链的合成，使得CP4-EPSPS处于第二T链的5’端至3’端反义方向。此外，还使RB1定位，使得LB1的通读将导致包含CP4-EPSPS盒和两个TALEN盒的T链的合成。由RB1和RB2处的启动产生的T链在第一目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。
将约3000个至5000个未成熟玉米胚与含有对照载体6A或载体6B的土壤杆菌属共培养3天，然后移至含有0.1mM草甘膦作为选择剂的愈伤组织诱导培养基中。对于载体6A选择180株再生植物(R0事件)，并对于载体6B选择371株再生植物，转移到穴盘中，并在温室中生长。
为了确认TALEN介导的定点整合，从选择的R0植物中分离基因组DNA，并进行PCR测定以鉴定在L7靶位点包含CP4-EPSPS盒插入的单株植物。设计PCR引物使得仅当CP4-EPSPS盒插入玉米基因组的L7靶区域时才产生产物。使用实施例9中描述的和图5中所示的PCR方案和引物来鉴定包含CP4-EPSPS盒的靶向整合的单株植物。PCR后，将PCR产物在琼脂糖凝胶上进行解析，以鉴定对于CP4-EPSPS盒的5’端和3’端具有正确大小的条带的植物。如表6中所列，对于对照载体6A：在通过PCR筛选的180株R0植物当中，没有一株植物对于左侧翼是阳性的，并且2株植物对右侧翼是阳性的。对于载体6B，在通过PCR筛选的371株R0植物当中，2株植物对于左侧翼是阳性的，并且10株植物对右侧翼是阳性的。数据表明，当载体包含经定位以产生基本上互补的T-DNA链(含有待插入的货物序列)的两个RB DNA序列(载体6B)时，定点整合的频率增加。
表6.边界构型和定点整合频率的概述。
实施例13.侧接有RB并且无LB的目标序列的定点整合的增加的频率。
选择实施例9中描述的L7基因座内的位点用于编码CP4-EPSPS的转基因盒(CP4-EPSPS)(其赋予对除草剂草甘膦的耐受性)的定点整合。为了促进盒的定点整合，将一对TALEN工程化以在L7基因座内的特定位点引入双链断裂。
产生第一载体(载体7A)用于土壤杆菌属介导的转化。出于说明性目的，载体构型示于图7A中。载体包含第一目标序列，其包含编码CP4-EPSPS的表达盒，其中TALEN靶位点(TS)位于所述盒的5’。另外，第一目标序列侧接有第一RB DNA序列(RB1)和第二RB DNA序列(RB2)，所述RB DNA序列经定位使得在RB1和RB2处启动T链合成，并且所得的T链在第一目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。载体还包含第二目标序列，其包含两个各自编码TALEN对的一半的表达盒，其中第二目标序列位于第三RB DNA序列(RB3)附近，以便启动包含两个TALEN盒的第三T链的合成。TALEN获自Life Technologies。
产生第二载体(载体7B)用于土壤杆菌属介导的转化。出于说明性目的，载体构型示于图7B中。载体包含第一目标序列，其包含编码侧接有TALEN靶位点(TS)的CP4-EPSPS的表达盒。另外，第一目标序列位于第一RB DNA序列(RB1)与第二RB DNA序列(RB2)之间，使得在RB1和RB2处启动T链合成，并且所得的T链在第一目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。载体还包含第二目标序列，其包含两个各自编码TALEN对的一半的表达盒，所述第二目标序列位于第三RB DNA序列(RB3)附近，以便启动包含两个TALEN盒的第三T链的合成。TALEN获自Life Technologies。
产生第三载体(载体7C)用于土壤杆菌属介导的转化。为了说明性目的，载体构型示于图7C中。载体包含第一目标序列，其包含编码位于左同源臂与右同源臂之间的CP4-EPSPS的表达盒。另外，第一目标序列定位在第一RB DNA序列(RB1)与第二RB DNA序列(RB2)之间，使得在RB1和RB2处启动T链合成，并且所得的T链在第一目标序列的至少一部分中是基本上彼此互补的。载体还包含第二目标序列，其包含两个各自编码位于第三RB DNA序列(RB3)附近的TALEN对的一半的表达盒，以便启动包含两个TALEN盒的第三T链的合成。TALEN获自Life Technologies。
将约4000个至5000个未成熟玉米胚与含有三种载体中的一种的土壤杆菌属共培养3天，然后移至含有0.1mM草甘膦作为选择剂的愈伤组织诱导培养基中。对于每种载体选择约200株再生植物(R0事件)，将其转移到穴盘中，并在温室中生长。
为了确认TALEN介导的定点整合，从选择的R0植物中分离基因组DNA，并进行PCR测定以鉴定在L7靶位点包含CP4-EPSPS盒插入的单株植物。设计PCR引物使得仅当CP4-EPSPS盒插入玉米基因组的靶向L7区域时才产生产物。使用实施例9中描述的和图5中所示的PCR方案和引物来鉴定包含CP4-EPSPS盒的靶向整合的单株植物。PCR后，将产物在琼脂糖凝胶上进行解析，以鉴定对于CP4-EPSPS盒的5’端和3’端具有正确大小的条带的植物。如表7中所列，对于对照载体7A：在通过PCR筛选的226株R0植物当中，1株植物对于左侧翼是阳性的，4株植物对右侧翼是阳性的。对于载体7B，在通过PCR筛选的292株R0植物当中，2株植物对于左侧翼是阳性的，26株植物对右侧翼是阳性的。一株植物对于右侧翼和左侧翼PCR是阳性的。对于载体7C，在通过PCR筛选的241株R0植物当中，7株植物对于左侧翼是阳性的，7株植物对右侧翼是阳性的。4株植物对于右侧翼和左侧翼PCR产物是阳性的。
数据表明，与仅包含1个靶位点和侧接货物序列的两个RB DNA序列的土壤杆菌属载体(载体7A)相比，使用包含两个TALEN靶位点和侧接目标货物序列的两个RB DNA序列的土壤杆菌属载体(载体7B)的TALEN介导的定点整合(SDI)具有更优的功效。该数据进一步表明当载体包含侧接有同源臂和两个RB DNA序列的货物序列(载体7C)时，通过HR产生的完全整合事件的数量增加。
表7.边界构型和定点整合频率的概述。
实施例14.土壤杆菌属介导的转化过程中的共培养时间影响定点整合频率
对于未成熟玉米胚的转化，通常将含有转化载体的土壤杆菌属与未成熟玉米胚一起孵育12-16小时。本文详述的意外观察结果是，将包含载体的土壤杆菌属与未成熟玉米胚的共培养时间延长至3天导致更多数量的具有包含在载体中的目标序列的靶向整合的事件。
除改变共培养时间外，使用标准方案将图4A和实施例1中述的载体用于土壤杆菌属介导的转化。将外植体与土壤杆菌属共培养1天、3天、5天或7天。在8个不同的实验日期进行未成熟胚的转化。在交替的日期(每个总共4个实验处理日期)进行1天和3天的共培养处理，并且每个实验分别处理平均1086个和1132个外植体。在8个日期中的每一个日期进行5天和7天的处理，并且每个实验分别处理平均558个和556个外植体。转化后，将转化体移至含有0.1mM草甘膦作为选择剂的愈伤组织诱导培养基中。将在草甘膦选择后存活的R0植物转移到穴盘中并在温室中生长。将每次实验处理产生的稳定的除草剂耐受性事件的数量除以经处理的外植体的数量以测定转化频率。将实施例9中描述的PCR方案和引物与来自扩展共培养方案的R0植物的基因组DNA一起使用，以鉴定包含CP4-EPSPS盒的靶向整合的单株植物。如实施例9中所述和图5中所说明的，使用两组PCR引物检测CP4-EPSPS盒在L7基因座处的靶向整合。将每个实验处理检测到的定点整合事件的数量(通过侧翼中的任一个或两个侧翼的阳性侧翼PCR结果测定的)除以回收的外植体的数量以估计SDI频率。使用混合线性模型分析数据。表8显示进行3天的共培养存在最多数量的左侧翼、右侧翼或左侧翼和右侧翼的阳性PCR结果。
表8.共培养实验中左侧翼和右侧翼PCR、转化频率以及SDI的百分比的概述。TFN，转化；Pos.，阳性；SDI，定点整合

Claims (36)

1.一种向玉米植物细胞的基因组提供目标序列的方法，所述方法包括使所述玉米植物细胞与能够转化所述植物细胞的根瘤菌目细胞接触，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成在T链的至少一部分中是互补的两条T链的载体，并且
其中所述至少一种载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，并且其中所述RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得所述目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得所述目标序列相对于所述第一T链中的所述目标序列处于反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述目标序列的至少一部分中是互补的，并且其中所述载体不包含左边界DNA序列，并且其中所述RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQID NO:4和SEQ ID NO:12的序列并且其中所述至少一个目标序列包含编码靶向玉米中L7基因座的位点特异性酶的序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述目标序列包含一个或多个表达盒。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述目标序列包含选自以下的一种或多种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码蛋白质的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述目标序列还包含至少一个同源臂DNA序列。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述至少一个同源臂DNA序列包含与植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述侧接有同源臂的目标序列包含与所述植物细胞的天然基因具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述非蛋白质编码RNA选自由以下组成的组：微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、长度为22-26nt的小RNA和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述位点特异性酶选自由内切核酸酶、重组酶和转座酶组成的组。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute和RNA引导的内切核酸酶。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述RNA引导的内切核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、CasX、CasY和Cpf1核酸酶。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述位点特异性酶靶位点选自Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。
13.如权利要求3所述的方法，其中所述目标序列包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述目标序列的至少一部分通过同源重组或通过非同源末端连接整合到所述植物基因组中，其中所述目标序列的至少一部分的整合导致点突变、插入、缺失、倒位、增加的所述内源基因座的转录、减少的所述内源基因座的转录、改变的蛋白质活性、改变的RNAi产物、改变的RNAi靶位点、改变的RNAi途径活性、增加的所述目标序列的转录、减少的所述整合目标序列的转录或其任何组合。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述根瘤菌目细胞选自土壤杆菌属的某种、慢生根瘤菌属的某种、中生根瘤菌属的某种、苍白杆菌属的某种、叶杆菌属的某种、根瘤菌属的某种和中华根瘤菌属的某种。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述根瘤菌目细胞还含有包含至少一个表达盒的载体，其中所述表达盒包含编码参与DNA修复的蛋白质的序列，并且其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞已包含位点特异性酶。
18.一种土壤杆菌属细胞，其包含至少一种能够形成两条互补的T链的载体，其中所述至少一种载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，并且其中所述RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得所述目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得所述目标序列相对于所述第一T链中的所述目标序列处于反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述目标序列的至少一部分中是互补的，并且其中所述载体不包含左边界DNA序列，并且其中所述RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:4和SEQID NO:12的序列并且其中所述至少一个目标序列包含编码靶向玉米中L7基因座的位点特异性酶的序列。
19.如权利要求18所述的土壤杆菌属细胞，其中所述目标序列包含一个或多个表达盒。
20.如权利要求18所述的土壤杆菌属细胞，其中所述目标序列包含选自以下的至少一种序列：基因、基因的一部分、基因间序列、增强子、启动子、内含子、外显子、编码转录终止序列的序列、编码叶绿体靶向肽的序列、编码线粒体靶向肽的序列、绝缘子序列、编码反义RNA构建体的序列、编码蛋白质的序列、编码非蛋白质编码RNA的序列(npcRNA)、编码重组酶的序列、编码重组酶识别位点的序列、着陆垫、编辑模板、表达盒、编码转基因的两个或更多个表达盒的堆叠、编码位点特异性酶靶位点的序列、编码选择标记的序列、包含编码用于增加DNA修复的细胞因子的序列的基因表达盒、包含接头或间隔子的序列、包含一个或多个限制性酶切位点的序列、用于模板化基因组编辑的序列及其任何组合。
21.如权利要求18所述的土壤杆菌属细胞，其中所述目标序列还包含至少一个同源臂DNA序列。
22.如权利要求21所述的土壤杆菌属细胞，其中所述目标序列包含左同源臂DNA序列和右同源臂DNA序列。
23.如权利要求21所述的土壤杆菌属细胞，其中所述至少一个同源臂DNA序列包含与所述植物基因组中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的序列。
24.如权利要求20所述的土壤杆菌属细胞，其中所述非蛋白质编码RNA选自由微小RNA(miRNA)、miRNA前体、小干扰RNA(siRNA)、长度为22-26nt的小RNA和编码其的前体、异染色质siRNA(hc-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、发夹双链RNA(发夹dsRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)、天然存在的反义siRNA(nat-siRNA)、示踪RNA(tcRNA)、引导RNA(gRNA)和单引导RNA(sgRNA)或其任何组合。
25.如权利要求19所述的土壤杆菌属细胞，其中所述表达盒包含与天然植物基因具有至少80％同一性的核酸序列。
26.如权利要求19所述的土壤杆菌属细胞，其中所述至少一个表达盒包含选自以下的序列：杀虫抗性基因、除草剂耐受性基因、氮素利用效率基因、水利用效率基因、营养品质基因、DNA结合基因、可选择标记基因、RNAi构建体、位点特异性核酸酶基因、引导RNA及其任何组合。
27.如权利要求20所述的土壤杆菌属细胞，其中所述位点特异性酶选自内切核酸酶、重组酶、转座酶及其任何组合。
28.如权利要求27所述的土壤杆菌属细胞，其中所述内切核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute和RNA引导的内切核酸酶。
29.如权利要求28所述的土壤杆菌属细胞，其中所述RNA引导的内切核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、CasX、CasY和Cpf1核酸酶。
30.如权利要求20所述的土壤杆菌属细胞，其中所述位点特异性酶靶位点选自由以下组成的组：Cre/lox重组位点、Flp/FRT重组位点、内切核酸酶识别位点和TALEN位点。
31.如权利要求19所述的土壤杆菌属细胞，其中所述目标序列包含编码至少一种参与DNA修复的蛋白质的序列，其中所述蛋白质选自包含来自Ti质粒的vir基因、Rad51、Rad52、Rad2、显性负性Ku70或其任何组合的组。
32.一种向玉米植物基因组提供目标序列的方法，所述方法包括使至少一种玉米植物细胞与至少一种能够转化所述植物细胞的根瘤菌目细胞在共培养基上接触至少2天，其中所述根瘤菌目细胞包含至少一种能够形成两条互补的T链的载体，其中所述至少一种载体包含第一右边界DNA序列(RB1)、第二右边界DNA序列(RB2)和至少一个目标序列，并且其中所述RB1位于所述载体中以启动第一T链的合成，使得所述目标序列处于第一T链的5’端至3’端的有义方向；并且所述RB2位于所述载体中以启动第二T链的合成，使得所述目标序列相对于所述第一T链中的所述目标序列处于反义方向，并且其中所述由RB1和RB2处的启动产生的两条T链在所述目标序列的至少一部分中是互补的，并且其中所述载体不包含左边界DNA序列，并且其中所述RB1和RB2中的至少一种包含选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:12的序列并且其中所述至少一个目标序列包含编码靶向玉米中L7基因座的位点特异性酶的序列。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述接触包括将所述植物细胞与所述根瘤菌目细胞共培养至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述根瘤菌目细胞选自由以下组成的组：土壤杆菌属的某种的细胞、慢生根瘤菌属的某种的细胞、中生根瘤菌属的某种的细胞、苍白杆菌属的某种的细胞、叶杆菌属的某种的细胞、根瘤菌属的某种的细胞和中华根瘤菌属的某种的细胞。
35.如权利要求32所述的方法，所述方法还包括检测所述载体的所述目标序列的至少一个片段在所述至少一个植物细胞中的整合。
36.如权利要求32所述的方法，其中所述植物细胞选自由以下组成的组：玉米未成熟胚细胞、玉米成熟胚细胞和玉米种子细胞。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11168319B1 (en) 2017-02-28 2021-11-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Plant cell culture
WO2019144124A1 (en) * 2018-01-22 2019-07-25 Inari Agriculture, Inc. Plant gene editing systems, methods, and compositions
AU2019275464B2 (en) 2018-05-24 2025-04-03 Monsanto Technology Llc Genome editing in plants
US12331329B2 (en) 2018-05-24 2025-06-17 Monsanto Technology Llc Genome editing in plants
CA3132423A1 (en) * 2019-03-06 2020-09-10 Plantform Corporation T-dna vectors with engineered 5' sequences upstream of post-translational modification enzymes and methods of use thereof
US11746354B2 (en) 2019-07-19 2023-09-05 Inari Agriculture Technology, Inc. Homology dependent repair genome editing
CA3201517A1 (en) 2020-11-11 2022-05-19 Monsanto Technology Llc Methods to improve site-directed integration frequency
CA3205117A1 (en) * 2020-12-15 2022-06-23 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for short stature plants through manipulation of gibberellin metabolism

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6265638B1 (en) * 1998-10-01 2001-07-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of plant transformation
US6603061B1 (en) * 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
WO2005029944A2 (en) * 2003-09-22 2005-04-07 J.R. Simplot Company Refined plant transformation
US8076536B2 (en) * 2006-05-12 2011-12-13 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for obtaining marker-free transgenic plants
US8609934B2 (en) * 2004-02-13 2013-12-17 Monsanto Technology Llc In vivo assembly of transcription units

Family Cites Families (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5094945A (en) 1983-01-05 1992-03-10 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
US5034322A (en) 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
EP0154204B1 (en) 1984-03-06 1994-01-12 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US6774283B1 (en) 1985-07-29 2004-08-10 Calgene Llc Molecular farming
HU209143B (en) 1986-01-08 1994-03-28 Rhone Poulenc Agrochimie Method for producing nitrilase specific to halogenated benzonitryl, sequences containing its coding gene and cells containing said sequences
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
EP0242236B2 (en) 1986-03-11 1996-08-21 Plant Genetic Systems N.V. Plant cells resistant to glutamine synthetase inhibitors, made by genetic engineering
US5750871A (en) 1986-05-29 1998-05-12 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in Brassica species
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5276268A (en) 1986-08-23 1994-01-04 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5637489A (en) 1986-08-23 1997-06-10 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5605011A (en) 1986-08-26 1997-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5378824A (en) 1986-08-26 1995-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5322938A (en) 1987-01-13 1994-06-21 Monsanto Company DNA sequence for enhancing the efficiency of transcription
US5359142A (en) 1987-01-13 1994-10-25 Monsanto Company Method for enhanced expression of a protein
CN87100603A (zh) 1987-01-21 1988-08-10 昂科公司 抗黑素瘤疫苗
US5229114A (en) 1987-08-20 1993-07-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Approaches useful for the control of root nodulation of leguminous plants
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5597718A (en) 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
WO1990010076A1 (en) 1989-02-24 1990-09-07 Monsanto Company Synthetic plant genes and method for preparation
US5106739A (en) 1989-04-18 1992-04-21 Calgene, Inc. CaMv 355 enhanced mannopine synthase promoter and method for using same
US5217902A (en) 1989-05-26 1993-06-08 Dna Plant Technology Corporation Method of introducing spectinomycin resistance into plants
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5689041A (en) 1989-08-10 1997-11-18 Plant Gentic Systems N.V. Plants modified with barstar for fertility restoration
US6051753A (en) 1989-09-07 2000-04-18 Calgene, Inc. Figwort mosaic virus promoter and uses
DE69033628T2 (de) 1989-10-31 2001-04-19 Monsanto Co., St. Louis Promotor für transgene Pflanzen
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
CA2074355C (en) 1990-01-22 2008-10-28 Ronald C. Lundquist Method of producing fertile transgenic corn plants
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5837848A (en) 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
US6426447B1 (en) 1990-11-14 2002-07-30 Monsanto Technology Llc Plant seed oils
US5543576A (en) 1990-03-23 1996-08-06 Mogen International Production of enzymes in seeds and their use
US5969214A (en) 1990-06-11 1999-10-19 Calgene, Inc. Glycogen biosynthetic enzymes in plants
FI925228A0 (fi) 1990-06-18 1992-11-18 Monsanto Co Oekad staerkelsehalt i vaexter
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
EP0536330B1 (en) 1990-06-25 2002-02-27 Monsanto Technology LLC Glyphosate tolerant plants
US6483008B1 (en) 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
DE69133512T2 (de) 1990-11-23 2006-09-28 Bayer Bioscience N.V. Verfahren zur Transformation monokotyler Pflanzen
JPH06504668A (ja) 1990-12-26 1994-06-02 モンサント　カンパニー 果実の成熟および植物の老化の制御
US5767366A (en) 1991-02-19 1998-06-16 Louisiana State University Board Of Supervisors, A Governing Body Of Louisiana State University Agricultural And Mechanical College Mutant acetolactate synthase gene from Ararbidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants
DE69334225D1 (de) 1992-07-07 2008-07-31 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US6011199A (en) 1992-12-15 2000-01-04 Commonwealth Scientific Method for producing fruiting plants with improved fruit flavour
US6414222B1 (en) 1993-02-05 2002-07-02 Regents Of The University Of Minnesota Gene combinations for herbicide tolerance in corn
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
JPH08509871A (ja) 1993-09-30 1996-10-22 アグラシータス インコーポレイテッド 異種ペルオキシダーゼを生産するトランスジェニック綿植物
WO1995016031A1 (fr) 1993-12-08 1995-06-15 Japan Tobacco Inc. Procede de transformation de plantes et vecteur necessaire
WO1998055632A1 (en) 1997-06-05 1998-12-10 Calgene Llc FATTY ACYL-CoA: FATTY ALCOHOL ACYLTRANSFERASES
US6828475B1 (en) 1994-06-23 2004-12-07 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding a plant cytoplasmic protein involved in fatty acyl-CoA metabolism
US6080560A (en) 1994-07-25 2000-06-27 Monsanto Company Method for producing antibodies in plant cells
US6140075A (en) 1994-07-25 2000-10-31 Monsanto Company Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells
US5750876A (en) 1994-07-28 1998-05-12 Monsanto Company Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases
US5633437A (en) 1994-10-11 1997-05-27 Sandoz Ltd. Gene exhibiting resistance to acetolactate synthase inhibitor herbicides
US5631152A (en) 1994-10-26 1997-05-20 Monsanto Company Rapid and efficient regeneration of transgenic plants
US5716837A (en) 1995-02-10 1998-02-10 Monsanto Company Expression of sucrose phosphorylase in plants
US6051409A (en) * 1995-09-25 2000-04-18 Novartis Finance Corporation Method for achieving integration of exogenous DNA delivered by non-biological means to plant cells
US6091002A (en) 1996-03-13 2000-07-18 Monsanto Company Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants
US6946588B2 (en) 1996-03-13 2005-09-20 Monsanto Technology Llc Nucleic acid encoding a modified threonine deaminase and methods of use
US5958745A (en) 1996-03-13 1999-09-28 Monsanto Company Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants
US6166292A (en) 1996-04-26 2000-12-26 Ajinomoto Co., Inc. Raffinose synthetase gene, method of producing raffinose and transgenic plant
AR006928A1 (es) 1996-05-01 1999-09-29 Pioneer Hi Bred Int Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas.
US5985605A (en) 1996-06-14 1999-11-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms
US5998700A (en) 1996-07-02 1999-12-07 The Board Of Trustees Of Southern Illinois University Plants containing a bacterial Gdha gene and methods of use thereof
US5850019A (en) 1996-08-06 1998-12-15 University Of Kentucky Research Foundation Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants
US5750848A (en) 1996-08-13 1998-05-12 Monsanto Company DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates
AU4208797A (en) 1996-09-05 1998-03-26 Unilever Plc Salt-inducible promoter derivable from a lactic acid bacterium, and its use in a lactic acid bacterium for production of a desired protein
US6271443B1 (en) 1996-10-29 2001-08-07 Calgene Llc Cotton and rice cellulose synthase DNA sequences
CA2275491A1 (en) 1997-01-20 1998-07-23 Plant Genetic Systems, N.V. Pathogen-induced plant promoters
US5922564A (en) 1997-02-24 1999-07-13 Performance Plants, Inc. Phosphate-deficiency inducible promoter
US6040497A (en) 1997-04-03 2000-03-21 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
US6171640B1 (en) 1997-04-04 2001-01-09 Monsanto Company High beta-conglycinin products and their use
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
AR013633A1 (es) 1997-04-11 2001-01-10 Calgene Llc METODO PARA LA ALTERACIoN DE LA COMPOSICIoN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA MEDIA EN SEMILLAS VEGETALES QUE EXPRESAN UNA TIOESTERASA QUE PREFIERE CADENA MEDIA VEGETAL HETERoLOGA.
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6380466B1 (en) 1997-05-08 2002-04-30 Calgene Llc Production of improved rapeseed exhibiting yellow-seed coat
DK1009842T3 (da) * 1997-06-30 2004-09-27 Syngenta Mogen Bv Plasmider til plantetransformation samt fremgangsmåde til anvendelse heraf
IL122270A0 (en) 1997-11-20 1998-04-05 Yeda Res & Dev DNA molecules conferring to plants resistance to a herbicide and plants transformed thereby
US6072103A (en) 1997-11-21 2000-06-06 Calgene Llc Pathogen and stress-responsive promoter for gene expression
US6653530B1 (en) 1998-02-13 2003-11-25 Calgene Llc Methods for producing carotenoid compounds, tocopherol compounds, and specialty oils in plant seeds
JP2002503487A (ja) 1998-02-19 2002-02-05 コットン，インコーポレイテッド 茎頂端部を使用したトランスジェニック植物の作成方法
AU754376B2 (en) 1998-02-26 2002-11-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Family of maize PR-1 genes and promoters
DE69933713T2 (de) 1998-02-26 2007-08-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mais alpha-tubulin 3-18 Promoter
US6051756A (en) 1998-02-26 2000-04-18 Cargill, Incorporated Particle bombardment transformation of Brassica
US5914451A (en) 1998-04-06 1999-06-22 Monsanto Company Efficiency soybean transformation protocol
US6635806B1 (en) 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
US6307123B1 (en) 1998-05-18 2001-10-23 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for transgene identification
JP2002517201A (ja) 1998-06-05 2002-06-18 カルジーン エルエルシー アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ関連核酸配列
WO1999064614A2 (en) 1998-06-12 1999-12-16 Calgene Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
EP1098962B1 (en) 1998-07-02 2009-09-09 Calgene LLC Diacylglycerol acyl transferase proteins
JP2002520019A (ja) 1998-07-10 2002-07-09 カルジーン エルエルシー 植物色素体における真核性ペプチドの発現
JP2000083680A (ja) 1998-07-16 2000-03-28 Nippon Paper Industries Co Ltd 光誘導型プロモ―タ―の制御下に置かれた不定芽再分化遺伝子を選抜マ―カ―遺伝子とする植物への遺伝子導入方法及びこれに用いる植物への遺伝子導入用ベクタ―
US6476294B1 (en) 1998-07-24 2002-11-05 Calgene Llc Plant phosphatidic acid phosphatases
CA2339084C (en) 1998-08-04 2013-01-08 Cargill, Incorporated Plant fatty acid desaturase promoters
US6365802B2 (en) 1998-08-14 2002-04-02 Calgene Llc Methods for increasing stearate content in soybean oil
US6531648B1 (en) 1998-12-17 2003-03-11 Syngenta Participations Ag Grain processing method and transgenic plants useful therein
BRPI0007815B1 (pt) 1999-01-14 2016-04-19 Monsanto Technology Llc processo de transformação da soja
EP1171610B1 (en) 1999-04-15 2007-04-04 Calgene LLC Nucleic acid sequences to proteins involved in isoprenoid synthesis
US6207879B1 (en) 1999-05-14 2001-03-27 Dekalb Genetics Corporation Maize RS81 promoter and methods for use thereof
US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
US6194636B1 (en) 1999-05-14 2001-02-27 Dekalb Genetics Corp. Maize RS324 promoter and methods for use thereof
US6232526B1 (en) 1999-05-14 2001-05-15 Dekalb Genetics Corp. Maize A3 promoter and methods for use thereof
WO2000075350A2 (en) 1999-06-08 2000-12-14 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding proteins involved in fatty acid beta-oxidation and methods of use
US6770465B1 (en) 1999-06-09 2004-08-03 Calgene Llc Engineering B-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity
WO2001004314A2 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Monsanto Technology, Llc. Nucleic acid molecules and proteins associated with sterol synthesis and metabolism
US6297056B1 (en) 1999-10-12 2001-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brassica transformation via microprojectile bombardment
US6613963B1 (en) 2000-03-10 2003-09-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Herbicide tolerant Brassica juncea and method of production
BR0112716A (pt) 2000-07-25 2003-06-24 Calgene Llc Sequencias de ácidos nucléicos codificando beta-cetoacil-acp sintase e aplicações das mesmas
CA2425956C (en) 2000-10-30 2014-12-23 Maxygen, Inc. Novel glyphosate n-acetyltransferase (gat) genes
AUPR143100A0 (en) 2000-11-10 2000-12-07 Bureau Of Sugar Experiment Stations Plant transformation
US7151204B2 (en) 2001-01-09 2006-12-19 Monsanto Technology Llc Maize chloroplast aldolase promoter compositions and methods for use thereof
EP2239332A3 (en) 2001-07-06 2011-01-19 Monsanto Technology LLC Methods for enhancing segregation of transgenes in plants and compositions thereof
CA2851035C (en) 2002-07-18 2018-05-29 Stanislaw Flasinski Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing
CN1745173B (zh) 2002-12-18 2012-11-28 阿则耐克斯公司 能赋予除草剂抗性的基因
BRPI0407592B1 (pt) 2003-02-18 2019-12-31 Monsanto Technology Llc 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (epsps) de classe i resistente ao glifosato, molécula de dna codificando a mesma, constructo de dna e processos de preparação de uma planta tolerante ao glifosato e de controle de ervas-daninhas
WO2005003362A2 (en) 2003-03-10 2005-01-13 Athenix Corporation Methods to confer herbicide resistance
US7575917B2 (en) 2003-04-09 2009-08-18 Monsanto Technology Llc DNA constructs and methods to enhance the production of commercially viable transgenic plants
US20050289672A1 (en) * 2004-06-28 2005-12-29 Cambia Biological gene transfer system for eukaryotic cells
CA2579641C (en) * 2004-09-08 2013-01-29 J.R. Simplot Company Plant-specific genetic elements and transfer cassettes for plant transformation
CA2581440C (en) * 2004-09-24 2016-11-29 J.R. Simplot Company Gene silencing
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
US20060150286A1 (en) * 2004-12-23 2006-07-06 Shihshieh Huang Gene suppression in transgenic plants using multiple constructs
MX2008014663A (es) 2006-05-16 2008-11-27 Monsanto Technology Llc Uso de especies bacterianas no agrobacterium para transformacion vegetal.
WO2008011465A2 (en) * 2006-07-19 2008-01-24 Monsanto Technology Llc Use of multiple transformation enhancer sequences to improve plant transformation efficiency
BR122021012776B1 (pt) * 2010-12-17 2022-08-16 Monsanto Technology Llc Método para melhorar a competência de uma célula de planta para transformação mediada por bactérias
EP2841581B2 (en) * 2012-04-23 2023-03-08 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome engineering in plants
DE102013215045B4 (de) 2013-07-31 2023-05-04 Siemens Healthcare Gmbh Dreheinheit mit einer Vorrichtung zur drahtlosen Datenübertragung zwischen zwei relativ zueinander bewegbaren Teilen sowie Verfahren zur drahtlosen Datenübertragung zwischen zwei relativ zueinander bewegbaren Teilen

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6265638B1 (en) * 1998-10-01 2001-07-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of plant transformation
US6603061B1 (en) * 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
WO2005029944A2 (en) * 2003-09-22 2005-04-07 J.R. Simplot Company Refined plant transformation
US8609934B2 (en) * 2004-02-13 2013-12-17 Monsanto Technology Llc In vivo assembly of transcription units
US8076536B2 (en) * 2006-05-12 2011-12-13 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for obtaining marker-free transgenic plants

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