[go: up one dir, main page]

CN109609628A - 一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN109609628A
CN109609628A CN201910099165.1A CN201910099165A CN109609628A CN 109609628 A CN109609628 A CN 109609628A CN 201910099165 A CN201910099165 A CN 201910099165A CN 109609628 A CN109609628 A CN 109609628A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutant
seq
probe
detecting
specific hybridization
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910099165.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李轶
王华林
张涛
杨娟
邓菲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Institute of Virology of CAS
Original Assignee
Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Institute of Virology of CAS filed Critical Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority to CN201910099165.1A priority Critical patent/CN109609628A/zh
Publication of CN109609628A publication Critical patent/CN109609628A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒，试剂盒包括引物组和偶联有特异型杂交探针的荧光微球。本发明具有操作简单、反应快、高通量以及数字化的优点。

Description

一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒
技术领域
本发明涉及遗传病分子检测领域，具体涉及一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒。
背景技术
地中海贫血是由于珠蛋白基因的缺失或突变导致珠蛋白生成障碍而引起的溶血性贫血疾病，是世界上最常见、发病率最高的遗传病之一。该病症广泛发生于热带国家，并呈世界性分布，几乎可见于所有人群和种族。在我国地中海贫血高发于长江以南广西、广东、海南、云南、贵州、四川等地区。我国已发现的能够导致β-地中海贫血症的β-珠蛋白(β-globin)基因突变型中有5种突变类型最为常见：-28(A>G),CD17(A>T),CD41/42(delTCTT)，CD71/72(ins T)和IVS-Ⅱ-654(C>T)。β-珠蛋白基因全长1.6kb，包含了三个外显子、二个内含子和分别位于5’和3’端的非编码区，上述5种突变类型分别位于该基因的5’非编码区、外显子1和2区域以及内含子2区域。
目前重型β-地贫尚无有效的治疗方法，且输血治疗和骨髓移植的高昂费用给患者家属带来了巨大的经济负担，因此，早期筛查和快速准确的检测诊断方法和技术，对地中海贫血的预防和治疗具有重要的意义。
地中海贫血的实验室诊断方法主要包括筛查法和基因分子检测法。筛查法主要通过血常规检测、红细胞形态学检测、红细胞渗透脆性实验、血红蛋白分析技术等以红细胞形态及理化特性为诊断依据，只能做初步定性诊断，无法确定其致病原因。基因分子检测法主要是以PCR为基础而进行的各种基因检测技术，主要包括跨越断裂位点(gag-PCR)法、PCR结合反向点杂交法(PCR-RDB)、实时荧光定量PCR、基于实时PCR的溶解曲线分析技术、基因芯片、DNA序列测定等。
Luminex Multi-Analyte Profiling(xMAP)技术，又称为液相芯片技术，是对核酸、蛋白质等生物分子进行高通量分析的一种新型检测技术。利用该技术对SNP多态性进行检测，可实现对一份样本同时进行多达500个不同突变位点的检测。Luminex xMAP的核心技术是把检测用的微小聚苯乙烯颗粒(又称为“微球”)用荧光颜色编码，同时偶联上特定的捕获核酸探针。在悬浮溶液中，靶标分子与微球表面的捕获分子发生特异性结合后，通过激光检测设备读取荧光数值后对检测结果进行判读，从而完成检测分析。由于该技术具有快速、高通量、准确度高、重复性好、灵敏度高和特异性强等优势，近年来被广泛应用于感染性疾病的病原检测与研究、细菌耐药基因的检测与药物筛选研究中。
发明内容
本发明为解决上述技术问题提供了一种检测地中海贫血突变体的引物组、试剂盒及其检测方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于检测地中海贫血突变体的引物组，包括下述三对扩增引物对：
扩增-28(A>G)突变体和CD17(A>T)突变体的扩增引物对1：
HBB-exon1-F：
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAGGGTTGGCCAATCTACTCC，如SEQ ID NO:1所示，
HBB-exon1-R：
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTCTCCACATGCCCAGTTTC，如SEQ ID NO:2所示；
扩增CD41/42(-TTCT)突变体和CD71/72(+T)突变体的扩增引物对2：
HBB-exon2-F:
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGGGCAGGTTGGTATCAAGG，如SEQ ID NO:3所示，
HBB-exon2-R:
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAAGCGTCCCATAGACTCACC，如SEQ ID NO:4所示；
扩增IVS-Ⅱ-654(C>T)突变体的扩增引物对3：
HBB-IVS-Ⅱ-654-F:
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGTATCATGCCTCTTTGCACCA，如SEQ ID NO:5所示；
HBB-IVS-Ⅱ-654-R:
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGGCCTAGCTTGGACTCAG，如SEQ ID NO:6所示。
本发明的有益效果是：该引物组针对我国常见的5种β-地中海贫血的突变类型进行引物设计，可以对常见的5种β-地中海贫血的突变类型进行检测。
本发明还提供了一种用于检测地中海贫血突变体的试剂盒，包括上述的引物组和十种偶联有不同的特异性杂交探针的荧光微球，所述特异性杂交探针分别为：
检测-28(A>G)位点处野生型的特异性杂交探针-28-probe-A：NH2-(CH2)12-CTGGGCATAAAAGTCAGGGC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
检测-28(A>G)位点处突变型的特异性杂交探针-28-probe-G：NH2-(CH2)12-CTGGGCATAGAAGTCAGGGC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
检测CD17(A>T)位点处野生型的特异性杂交探针CD17-probe-A：NH2-(CH2)12-CTGTGGGGCAAGGTGAACGT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
检测CD17(A>T)位点处突变型的特异性杂交探针CD17-probe-T：NH2-(CH2)12-CTGTGGGGCTAGGTGAACGT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
检测CD41/42(-TTCT)位点处野生型的特异性杂交探针CD41/42-probe-TTCT：NH2-(CH2)12-GAGGTTCTTTGAGTCCTTTG，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
检测CD41/42(-TTCT)位点处突变型的特异性杂交探针CD41/42-probe-del：NH2-(CH2)12-CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG，其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
检测CD71/72(ins T)位点处野生型的特异性杂交探针CD71/72-probe-wt：NH2-(CH2)12-GGTGCCTTTAGTGATGGCCT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
检测CD71/72(ins T)位点处突变型的特异性杂交探针CD71/72-probe-+T：NH2-(CH2)12-GTGCCTTTTAGTGATGGCCT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
检测IVS-Ⅱ-654(C>T)位点处野生型的特异性杂交探针IVS-Ⅱ-654-probe-C：NH2-(CH2)12-GGGTTAAGGCAATAGCAATA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
检测IVS-Ⅱ-654(C>T)位点处突变型的特异性杂交探针IVS-Ⅱ-654-probe-T：NH2-(CH2)12-GGGTTAAGGTAATAGCAATA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述荧光微球为羧基化荧光微球。
进一步，每种特异性杂交探针偶联的羧基化荧光微球的对应不同的荧光。
进一步，上述试剂盒还包括通用引物对，所述通用引物对序列带有生物素标记，其核苷酸序列为：
Universal-F：TACAGTCGGTCGCGTGCCTC，如SEQ ID NO:17所示，
Universal-R：biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG，如SEQ ID NO:18所示。
进一步，所述试剂盒是通过包括以下步骤的方法实施的：
S1.提取血样中的基因组DNA，并用所述扩增引物对对其进行扩增；
S2.将步骤S1的产物与偶联有特异性杂交探针的荧光微球杂交；
S3.将步骤S2的产物通过Luminex100仪器检测荧光信号；
S4.检测结果判定：用Luminex100仪器分别读取不同荧光编码微球的编号以及各个微球表面的荧光数值的中位值MFI，其中Allelic Ratio wt＝MFIwt/(MFI wt+MFImutant)，Allelic Ratio mutant＝MFImutant/(MFI wt+MFImutant)，计算各等位基因处野生型和突变型分别所占的荧光比值，结果判定标准具体为：
1)Blank检测MFI值均＜200，样品检测MFI值＞200，且Allelic Ratiowt ormutant值＞0.6，即判定为对应基因型别的纯合子；
2)Blank检测MFI值均＜200，样品检测MFI值＞200，且Allelic Ratiowt ormutant值在0.4-0.6之间，即判定为对应基因型别的杂合子。
进一步，步骤S1还包括将扩增产物用所述通用引物进行第二轮扩增，步骤S2中杂交后，还有将获得的杂交产物与报告分子亲和素-藻红蛋白共孵育的步骤。
进一步，用扩增引物对进行扩增的PCR反应条件为：
94℃，5分钟，1个循环；
94℃，15秒，
56℃，30秒，
72℃，30秒，29个循环；
72℃，10分钟，1个循环；
用通用引物进行第二轮扩增的PCR反应条件为：
94℃，5分钟，1个循环；
94℃，15秒，
56℃，30秒，
72℃，30秒，29个循环；
72℃，10分钟，1个循环。
进一步，所述步骤S2中杂交反应的条件为：避光，95℃下保温5min，59℃下保温15min，共孵育的反应条件为：避光，59℃下保温5min。
本发明的检测方法简单，灵敏性高，可以高效的检测5种常见的β-地中海贫血的突变类型。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1用于检测地中海贫血突变体的引物组设计
根据美国国立生物技术信息中心的基因库中检索到的位于人类11号染色体末端11p15.3位点上的β-珠蛋白基因序列进行分析和设计，得到可以对我国常见的5种β-地中海贫血突变类型进行检测的扩增引物对，共3对，包括：
扩增-28(A>G)突变体和CD17(A>T)突变体的扩增引物对1：
HBB-exon1-F：
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAGGGTTGGCCAATCTACTCC，如SEQ ID NO:1所示，
HBB-exon1-R：
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTCTCCACATGCCCAGTTTC，如SEQ ID NO:2所示；
扩增CD41/42(-TTCT)突变体和CD71/72(+T)突变体的扩增引物对2：
HBB-exon2-F:
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGGGCAGGTTGGTATCAAGG，如SEQ ID NO:3所示，
HBB-exon2-R:
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAAGCGTCCCATAGACTCACC，如SEQ ID NO:4所示；
扩增IVS-Ⅱ-654(C>T)突变体的扩增引物对3：
HBB-IVS-Ⅱ-654-F:
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGTATCATGCCTCTTTGCACCA，如SEQ ID NO:5所示；
HBB-IVS-Ⅱ-654-R:
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGGCCTAGCTTGGACTCAG，如SEQ ID NO:6所示。
实施例2探针序列设计
设计能够对我国常见的5中β-地中海突变类型进行检测的特异性杂交探针10条，分别与上述5种突变位点对应设计，包括：
检测-28(A>G)位点处野生型的特异性杂交探针-28-probe-A：NH2-(CH2)12-CTGGGCATAAAAGTCAGGGC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
检测-28(A>G)位点处突变型的特异性杂交探针-28-probe-G：NH2-(CH2)12-CTGGGCATAGAAGTCAGGGC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
检测CD17(A>T)位点处野生型的特异性杂交探针CD17-probe-A：NH2-(CH2)12-CTGTGGGGCAAGGTGAACGT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
检测CD17(A>T)位点处突变型的特异性杂交探针CD17-probe-T：NH2-(CH2)12-CTGTGGGGCTAGGTGAACGT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
检测CD41/42(-TTCT)位点处野生型的特异性杂交探针CD41/42-probe-TTCT：NH2-(CH2)12-GAGGTTCTTTGAGTCCTTTG，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
检测CD41/42(-TTCT)位点处突变型的特异性杂交探针CD41/42-probe-del：NH2-(CH2)12-CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG，其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
检测CD71/72(ins T)位点处野生型的特异性杂交探针CD71/72-probe-wt：NH2-(CH2)12-GGTGCCTTTAGTGATGGCCT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
检测CD71/72(ins T)位点处突变型的特异性杂交探针CD71/72-probe-+T：NH2-(CH2)12-GTGCCTTTTAGTGATGGCCT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
检测IVS-Ⅱ-654(C>T)位点处野生型的特异性杂交探针IVS-Ⅱ-654-probe-C：NH2-(CH2)12-GGGTTAAGGCAATAGCAATA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
检测IVS-Ⅱ-654(C>T)位点处突变型的特异性杂交探针IVS-Ⅱ-654-probe-T：NH2-(CH2)12-GGGTTAAGGTAATAGCAATA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
实施例3
采用上述特异性扩增引物对和特异性杂交探针，对我国能导致β-地中海贫血病症发生的5种常见的β-珠蛋白突变型进行检测，包括两轮PCR反应、PCR产物与偶联有特异性杂交探针荧光微球的杂交和检测等步骤，从而确定样本中β-地中海贫血的致病类型。具体地说，第一轮PCR反应使用特异性扩增引物对靶标基因片段进行扩增，第二轮PCR反应是以第一轮PCR产物为模版，利用生物素标记的通用引物进行二次扩增，使得PCR产物带有生物素标记，同时第二轮PCR反应具有将第一轮PCR信号放大的作用，增加检测的灵敏度。然后将第二轮PCR反应获得的PCR产物与偶联在不同微球上的特异性检测探针进行分子杂交，杂交产物与报告分子亲和素-藻红蛋白孵育，亲和素-藻红蛋白可与杂交产物上的生物素特异性结合，使之带有荧光，最后使用Luminex100系统进行检测荧光信号。
本实施例中使用的健康人群血液样本来自中国科学院武汉病毒研究所微生物菌(毒)种资源保藏中心。患病人群的血液样本分别由湖北省荆州市中心医院和湖南省长沙第一医院友情馈赠的已知基因型的血样，样品信息见表1。
表1.检测样品信息
其中包括5种常见的β-珠蛋白突变型样品16份，其他基因突变类型的地中海病人样品11份，健康人血液样品11份，共计38份样品。分为4组进行检测。
1.第一轮PCR反应
使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(购自QIAGEN公司)提取样本中基因组DNA，以提取的样本中的总DNA为模板，采用上述3组扩增引物对进行PCR。
反应体系为：2×Taq PCR Master MIX缓冲液(DBI bioscience)12.5μL、浓度为20μmol/L PCR特异性引物对各1.25μL、DNA模板50ng，加入双蒸水补足至25μL，所得的产物为第一轮PCR扩增的目标基因片段。
第一轮PCR反应的条件为：
94℃，5分钟，1个循环；94℃，15秒，56℃，30秒，72℃，30秒，29个循环；72℃，10分钟，1个循环。
2.第二轮PCR反应
上述3组特异性扩增引物的5’端均有一段标签序列，用于与通用引物互补配对使得扩增产物带上生物素标签修饰。以上述第一轮PCR扩增的目标基因片段为模板进行第二轮PCR，用于第二轮PCR的生物素修饰的通用引物序列为：
Universal-F：TACAGTCGGTCGCGTGCCTC(SEQ ID NO:17)
Universal-R：biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG(SEQ ID NO:18)
反应体系为：2×Taq PCR Master MIX缓冲液(DBI bioscience)12.5μL、混合生物素修饰引物0.5μL、第一轮PCR的产物2μL，加入双蒸水补足至25μL，得到第二轮PCR的产物为带有生物素标记的目标基因。
第二轮PCR反应的条件为：
94℃，5分钟，1个循环；94℃，15秒，56℃，30秒，72℃，30秒，29个循环；72℃，10分钟，1个循环。
3.PCR产物与特异性杂交探针杂交
上述10条检测探针的5’端结合有氨基化修饰的碳臂NH2-(CH2)12基团，它能将特异性的检测探针序列以共价方式结合到指定颜色的微球表面的羧基上，用1.5×TMAC(氯化四甲铵)杂交缓冲液稀释，使得每微升含有100个微球。将第二轮PCR产物分别与混合了的微球在避光反应容器中进行杂交，以得到荧光标记的靶标基因扩增片段与相应的检测探针结合的产物。
杂交体系为50μL，其中含有混合微球的1.5×TMAC 33μL，PCR反应产物5μL，加入1×TE缓冲液(pH8.0)补充体积至50μL；95℃下保温5min后，59℃下保温15min，然后加入亲和素-藻红蛋白(Invitrogen)于59℃下保温5min。
4.检测及结果判定
用Luminex100仪器分别读取10种荧光编码微球的编号以及各个微球表面的荧光数值的中位值MFI，然后根据如下公式：
Allelic Ratio wt＝MF Iwt/(MFI wt+MF Imutant)
Allelic Ratio mutant＝MF Imutant/(MFI wt+MF Imutant)
计算各等位基因处野生型和突变型分别所占的荧光比值，结果判定标准具体为：
1)Blank检测MFI值均＜200，样品检测MFI值＞200，且Allelic Ratiowt ormutant值＞0.6，即判定为对应基因型别的纯合子。
2)样品检测MFI值＞200，且Allelic Ratiowt or mutant值在0.4-0.6之间，即判定为对应基因型别的杂合子。
5、检测结果
1)第一组样品检测的荧光中位值MFI见下表：
根据上述公式计算各样品等位基因MFI的比值，如下表：
根据所得比值情况，我们可以看出第一组的15份样品中，-28(A>G)突变型有2份，分别是HN-4和HN-6；CD17(A>T)突变型有1份，为HB-19；CD41/42(delTCTT)突变型有5份，为HB-24,HN-1,HN-2,HN-5和HN-7；IVS-II-654(C>T)突变型有4份，为HB-11,HB-12,HB-29和HB-30；sample-1,HB-22和HB-27分别是健康人全血和CD27/CD28(+C)突变型，用上述引物探针以及检测方法并没有出现非特异的检出。同时，-28(A>G)的-28-G-probe检测比值均为0.44，在0.4-0.6之间，表明HN-4和HN-5样品为-28(A>G)突变型杂合子，与预期一致；CD17(A>T)的CD17-T-probe检测比值为0.51，在0.4-0.6之间，表明HB-19样品为CD17(A>T)突变型杂合子，与预期一致；CD41/42(delTCTT)的CD41/42-del-probe检测比值为0.40-0.47，在0.4-0.6之间，表明5份样品均为CD41/42(delTCTT)突变型杂合子，与预期一致；IVS-II-654(C>T)的IVS-II-654-T-probe检测比值为0.57-0.59，在0.4-0.6之间，表明4份样品均为IVS-II-654(C>T)突变型杂合子，与预期一致。而其他3份样品wt-probe比值均>0.6,表明无上述5种基因突变型的检出。
2)第二组样品检测的荧光中位值MFI见下表：
根据上述公式计算各样品等位基因MFI的比值，如下表：
根据所得比值情况，我们可以看出第二组的10份样品中，CD41/42(delTCTT)突变型有1份，为HN-86；CD71/72(+T)突变型有1份，为HN-66；其他8份样品全部是α-地中海贫血病人血清，用上述引物探针以及检测方法并没有出现非特异的检出。同时，CD41/42(delTCTT)的CD41/42-del-probe检测比值为0.42，在0.4-0.6之间，表明HN-86样品为CD41/42(delTCTT)突变型杂合子，与预期一致。同样，CD71/72(+T)的CD71/72-+T-probe检测比值为0.44，在0.4-0.6之间，表明HN-66样品为CD71/72(+T)突变型杂合子，与预期一致。其他样品wt-probe比值均>0.6,表明无上述5种基因突变型的检出。
3)第三组样品检测的荧光中位值MFI见下表：
根据上述公式计算各样品等位基因MFI的比值，如下表：
根据所得比值情况，我们可以看出第三组的9份样品中，CD17(A>T)突变型有1份，为HB-5；IVS-II-654(C>T)突变型有1份，为HB-4；sample-HB-1,2,3,8,9和10是健康人血清；sample-HB-6是CD27/CD28(+C)突变型，用上述引物探针以及检测方法并没有出现非特异的检出。同时，CD17(A>T)的CD17-T-probe检测比值为0.59，在0.4-0.6之间，表明HB-5样品为CD17(A>T)突变型杂合子，与预期一致。同样，IVS-II-654(C>T)的IVS-II-654-T-probe检测比值为0.53，在0.4-0.6之间，表明HB-4样品为IVS-II-654(C>T)突变型杂合子，与预期一致。其他样品wt-probe比值均>0.6,表明无上述5种基因突变型的检出。
4)第四组样品检测的荧光中位值MFI见下表：
根据上述公式计算各样品等位基因MFI的比值，如下表：
根据所得比值情况，我们可以看出第四组的5份样品分别是健康人全血和血清，用上述引物探针以及检测方法并没有出现非特异的检出。且wt-probe比值均>0.6，表明这些样品均无上述5种基因突变型的检出。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacagtcggt cgcgtgcctc agggttggcc aatctactcc 40
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctggtccgta cttccgagcg tgtctccaca tgcccagttt c 41
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacagtcggt cgcgtgcctc tgggcaggtt ggtatcaagg 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggtccgta cttccgagcg aagcgtccca tagactcacc 40
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tacagtcggt cgcgtgcctc tgtatcatgc ctctttgcac ca 42
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggtccgta cttccgagcg agggcctagc ttggactcag 40
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgggcataa aagtcagggc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgggcatag aagtcagggc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgtggggca aggtgaacgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgtggggct aggtgaacgt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaggttcttt gagtcctttg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccagaggtt gagtcctttg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtgccttta gtgatggcct 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtgcctttta gtgatggcct 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggttaaggc aatagcaata 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggttaaggt aatagcaata 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tacagtcggt cgcgtgcctc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctggtccgta cttccgagcg 20

Claims (9)

1.一种用于检测地中海贫血突变体的引物组，其特征在于，包括下述三对扩增引物对：
扩增-28(A>G)突变体和CD17(A>T)突变体的扩增引物对1：
HBB-exon1-F：
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAGGGTTGGCCAATCTACTCC，如SEQ ID NO:1所示，
HBB-exon1-R：
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTGTCTCCACATGCCCAGTTTC，如SEQ ID NO:2所示；
扩增CD41/42(-TTCT)突变体和CD71/72(+T)突变体的扩增引物对2：
HBB-exon2-F:
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGGGCAGGTTGGTATCAAGG，如SEQ ID NO:3所示，
HBB-exon2-R:
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAAGCGTCCCATAGACTCACC，如SEQ ID NO:4所示；
扩增IVS-Ⅱ-654(C>T)突变体的扩增引物对3：
HBB-IVS-Ⅱ-654-F:
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGTATCATGCCTCTTTGCACCA，如SEQ ID NO:5所示；
HBB-IVS-Ⅱ-654-R:
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGAGGGCCTAGCTTGGACTCAG，如SEQ ID NO:6所示。
2.一种用于检测地中海贫血突变体的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组和十种偶联有不同的特异性杂交探针的荧光微球，所述特异性杂交探针分别为：
检测-28(A>G)位点处野生型的特异性杂交探针-28-probe-A：NH2-(CH2)12-CTGGGCATAAAAGTCAGGGC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
检测-28(A>G)位点处突变型的特异性杂交探针-28-probe-G：NH2-(CH2)12-CTGGGCATAGAAGTCAGGGC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
检测CD17(A>T)位点处野生型的特异性杂交探针CD17-probe-A：NH2-(CH2)12-CTGTGGGGCAAGGTGAACGT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
检测CD17(A>T)位点处突变型的特异性杂交探针CD17-probe-T：NH2-(CH2)12-CTGTGGGGCTAGGTGAACGT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
检测CD41/42(-TTCT)位点处野生型的特异性杂交探针CD41/42-probe-TTCT：NH2-(CH2)12-GAGGTTCTTTGAGTCCTTTG，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
检测CD41/42(-TTCT)位点处突变型的特异性杂交探针CD41/42-probe-del：NH2-(CH2)12-CCCAGAGGTTGAGTCCTTTG，其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
检测CD71/72(ins T)位点处野生型的特异性杂交探针CD71/72-probe-wt：NH2-(CH2)12-GGTGCCTTTAGTGATGGCCT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
检测CD71/72(ins T)位点处突变型的特异性杂交探针CD71/72-probe-+T：NH2-(CH2)12-GTGCCTTTTAGTGATGGCCT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
检测IVS-Ⅱ-654(C>T)位点处野生型的特异性杂交探针IVS-Ⅱ-654-probe-C：NH2-(CH2)12-GGGTTAAGGCAATAGCAATA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
检测IVS-Ⅱ-654(C>T)位点处突变型的特异性杂交探针IVS-Ⅱ-654-probe-T：NH2-(CH2)12-GGGTTAAGGTAATAGCAATA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测地中海贫血突变体的试剂盒，其特征在于，所述荧光微球为羧基化荧光微球。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测地中海贫血突变体的试剂盒，其特征在于，每种特异性杂交探针偶联的羧基化荧光微球的对应不同的荧光。
5.根据权利要求2-4任一项所述的一种用于检测地中海贫血突变体的试剂盒，其特征在于，还包括通用引物对，所述通用引物对序列带有生物素标记，其核苷酸序列为：
Universal-F：TACAGTCGGTCGCGTGCCTC，如SEQ ID NO:17所示，
Universal-R：biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG，如SEQ ID NO:18所示。
6.根据权利要求2-5任一项所述一种用于检测地中海贫血突变体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是通过包括以下步骤的方法实施的：
S1.提取血样中的基因组DNA，并用所述扩增引物对对其进行扩增；
S2.将步骤S1的产物与偶联有特异性杂交探针的荧光微球杂交；
S3.将步骤S2的产物通过Luminex100仪器检测荧光信号；
S4.检测结果判定：用Luminex100仪器分别读取不同荧光编码微球的编号以及各个微球表面的荧光数值的中位值MFI，其中Allelic Ratio wt＝MFIwt/(MFIwt+MFImutant)，AllelicRatio mutant＝MFImutant/(MFIwt+MFImutant)，计算各等位基因处野生型和突变型分别所占的荧光比值，结果判定标准具体为：
1)Blank检测MFI值均＜200，样品检测MFI值＞200，且Allelic Ratiowt or mutant值＞0.6，即判定为对应基因型别的纯合子；
2)Blank检测MFI值均＜200，样品检测MFI值＞200，且Allelic Ratiowt or mutant值在0.4-0.6之间，即判定为对应基因型别的杂合子。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测地中海贫血突变体的试剂盒，其特征在于，步骤S1还包括将扩增产物用所述通用引物进行第二轮扩增，步骤S2中杂交后，还有将获得的杂交产物与报告分子亲和素-藻红蛋白共孵育的步骤。
8.根据权利要求7所述一种用于检测地中海贫血突变体的试剂盒，其特征在于，用扩增引物对进行扩增的PCR反应条件为：
94℃，5分钟，1个循环；
94℃，15秒，
56℃，30秒，
72℃，30秒，29个循环；
72℃，10分钟，1个循环；
用通用引物进行第二轮扩增的PCR反应条件为：
94℃，5分钟，1个循环；
94℃，15秒，
56℃，30秒，
72℃，30秒，29个循环；
72℃，10分钟，1个循环。
9.根据权利要求7所述的一种用于检测地中海贫血突变体的试剂盒，其特征在于，所述步骤S2中杂交反应的条件为：避光，95℃下保温5min，59℃下保温15min，共孵育的反应条件为：避光，59℃下保温5min。
CN201910099165.1A 2019-01-31 2019-01-31 一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒 Pending CN109609628A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910099165.1A CN109609628A (zh) 2019-01-31 2019-01-31 一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910099165.1A CN109609628A (zh) 2019-01-31 2019-01-31 一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109609628A true CN109609628A (zh) 2019-04-12

Family

ID=66019398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910099165.1A Pending CN109609628A (zh) 2019-01-31 2019-01-31 一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109609628A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471763A (zh) * 2020-06-17 2020-07-31 厦门安普利生物工程有限公司 用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒
CN111593115A (zh) * 2020-06-17 2020-08-28 厦门安普利生物工程有限公司 用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合及试剂盒
CN112746071A (zh) * 2019-10-31 2021-05-04 华东师范大学 一种造血干细胞hbb基因修复的方法及产品

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101629214A (zh) * 2009-04-21 2010-01-20 山东省疾病预防控制中心 手足口病相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用
CN102181532A (zh) * 2011-03-21 2011-09-14 中国科学院武汉病毒研究所 用液相芯片检测虫媒或接触传播病原的引物和探针及方法
CN102277419A (zh) * 2011-04-06 2011-12-14 广东省妇幼保健院 基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101629214A (zh) * 2009-04-21 2010-01-20 山东省疾病预防控制中心 手足口病相关病毒平行检测液相芯片及其制备方法与应用
CN102181532A (zh) * 2011-03-21 2011-09-14 中国科学院武汉病毒研究所 用液相芯片检测虫媒或接触传播病原的引物和探针及方法
CN102277419A (zh) * 2011-04-06 2011-12-14 广东省妇幼保健院 基于液相芯片系统诊断地中海贫血的方法及试剂盒与应用

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112746071A (zh) * 2019-10-31 2021-05-04 华东师范大学 一种造血干细胞hbb基因修复的方法及产品
WO2021083183A1 (zh) * 2019-10-31 2021-05-06 上海邦耀生物科技有限公司 一种造血干细胞hbb基因修复的方法及产品
CN112746071B (zh) * 2019-10-31 2022-01-04 华东师范大学 一种造血干细胞hbb基因修复的方法及产品
CN111471763A (zh) * 2020-06-17 2020-07-31 厦门安普利生物工程有限公司 用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒
CN111593115A (zh) * 2020-06-17 2020-08-28 厦门安普利生物工程有限公司 用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合及试剂盒
CN111471763B (zh) * 2020-06-17 2023-06-02 厦门安普利生物工程有限公司 用于α-地中海贫血多重实时荧光PCR检测的引物、探针和反应缓冲液组合及试剂盒
CN111593115B (zh) * 2020-06-17 2023-06-02 厦门安普利生物工程有限公司 用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102141091B1 (ko) 토종닭의 유전적 배경 또는 품종을 판별하기 위한 snp 마커 세트 및 이의 용도
CN100569956C (zh) 检测结核分枝杆菌及其耐药基因突变的方法和试剂盒
US8673595B2 (en) Sample analysis method and assay kit used therein
CN109609628A (zh) 一种用于检测地中海贫血突变体的引物组及试剂盒
CN101487051B (zh) Braf基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法
CN112501268A (zh) 一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用
JPH10510710A (ja) 保存酵母核酸配列
KR102439855B1 (ko) 토종닭 또는 육계 신품종을 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도
CN103451268B (zh) 一种检测线粒体a3243g杂合突变率的标准品、试剂盒及其检测方法
CN109628628B (zh) 水稻抗稻瘟病基因Pi2的SNP标记的开发和应用
CN101955994B (zh) Npm1基因突变的联合检测方法及诊断试剂盒
CN102041313A (zh) 一种K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测方法及应用
CN110241259A (zh) 一种快速区分鹅1型星状病毒与鹅2型星状病毒的hrm检测方法及其引物
JPH01501339A (ja) 改良された核酸ハイブリダイゼーション方法及びそれに用いるキット
CN109182557A (zh) 一种鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的snp分子标记及其应用
CN101245390A (zh) 一种检测snp的磁珠系统及其使用方法
CN112226532A (zh) 检测玉米基因组中snp的多态性的物质在鉴定玉米镉含量中的应用
KR20100128118A (ko) 담수어류 종 판별용 프로브 및 디엔에이 칩
CN116751883B (zh) 一种与大豆赖氨酸相关的kasp标记及其应用
CN112176094A (zh) 一种筛选不同千粒重、株高和/或叶绿素含量的小麦的方法及其使用的试剂盒
KR20180055075A (ko) 고추 풋마름병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도
CN117106967A (zh) 水稻抗稻瘟病基因的功能性kasp分子标记及其应用
CN114085926B (zh) Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法
WO2010030243A1 (en) Gene sequences for the detection of chikungunya and dengue fever
CN105624308A (zh) 一种检测染色体16p11.2微缺失的产品

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190412