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CN109563146A - 包含tnf家族配体三聚体和pd1结合模块的抗原结合分子 - Google Patents

包含tnf家族配体三聚体和pd1结合模块的抗原结合分子 Download PDF

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CN109563146A
CN109563146A CN201780038363.6A CN201780038363A CN109563146A CN 109563146 A CN109563146 A CN 109563146A CN 201780038363 A CN201780038363 A CN 201780038363A CN 109563146 A CN109563146 A CN 109563146A
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Abstract

本发明涉及新颖的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含(a)(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。

Description

包含TNF家族配体三聚体和PD1结合模块的抗原结合分子
发明领域
本发明涉及新颖的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。本发明进一步涉及生成这些分子的方法和使用它们的方法。
发明背景
与TNF(肿瘤坏死因子)受体超家族的分子相互作用的配体在免疫系统的组织和功能中具有关键作用。在调节正常功能诸如免疫应答,造血和形态发生的同时,TNF家族配体(也称作细胞因子)在肿瘤发生,移植排斥,脓毒性休克,病毒复制,骨吸收,类风湿性关节炎和糖尿病中发挥作用(Aggarwal,2003)。TNF配体家族包含编码19种II型(即细胞内N端和细胞外C端)跨膜蛋白质的18种基因,其特征在于构成“TNF同源域”(THD)的保守C端域的存在。这个域负责受体结合且因此对于TNF配体家族成员的生物学活性是至关紧要的。家族成员之间的序列同一性是约20-30％(Bodmer,2002)。TNF配体家族的成员以自装配的非共价三聚体发挥其生物学功能(Banner et al,Cell 1993,73,431-445)。因此,TNF家族配体形成能够结合并活化TNFR超家族的相应受体的三聚体。
TNF受体超家族的一个成员,4-1BB(CD137)最初被鉴定为其表达通过T细胞活化而诱导的分子(Kwon和Weissman,1989)。后续研究证明4-1BB在T和B淋巴细胞(Snell等人,2011；Zhang等人,2010),NK细胞(Lin等人,2008),NKT细胞(Kim等人,2008),单核细胞(Kienzle和von Kempis,2000；Schwarz等人,1995),嗜中性细胞(Heinisch等人,2000),肥大细胞(Nishimoto等人,2005)和树突细胞以及非造血起源的细胞诸如内皮和平滑肌细胞(Broll等人,2001；Olofsson等人,2008)中的表达。4-1BB在不同细胞类型中的表达大多通过各种刺激性信号,诸如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发,以及经由共刺激性分子或促炎性细胞因子的受体诱导的信号传导(Diehl等人,2002；von Kempis等人,1997；Zhang等人,2010)而可诱导和驱动。
4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)的表达更受限制且在专职抗原呈递细胞(APC)诸如B细胞,树突细胞(DC)和巨噬细胞上观察到。4-1BBL的可诱导表达对于包括αβ和γδT细胞子集二者在内的T细胞,和内皮细胞是特征性的(综述见Shao和Schwarz,2011)。
已知CD137信号传导刺激NK细胞的IFNγ分泌和增殖(Buechele等人,2012；Lin等人,2008；Melero等人,1998)以及促进DC活化(如通过其升高的存活和分泌细胞因子的能力指示的)并上调共刺激性分子(Choi等人,2009；Futagawa等人,2002；Wilcox等人,2002)。然而,CD137最好表征为调控T细胞的CD4+和CD8+子集二者中的TCR诱导的活化的共刺激性分子。与TCR触发组合,激动性4-1BB特异性抗体增强T细胞的增殖,刺激淋巴因子分泌并降低T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(综述见Snell等人,2011)。
与在体外4-1BB抗体对T细胞的这些共刺激效应一致,在许多实验性肿瘤模型中将其施用于荷瘤小鼠导致有力的抗肿瘤效果(Melero等人,1997；Narazaki等人,2010)。然而,4-1BB经常仅在与其它免疫调控性化合物(Curran等人,2011；Guo等人,2013；Morales-Kastresana等人,2013；Teng等人,2009年；Wei等人,2013),化疗试剂(Ju等人,2008；Kim等人,2009),肿瘤特异性疫苗接种(Cuadros等人,2005；Lee等人,2011),或放疗(Shi和Siemann,2006)组合施用时展现其作为抗肿瘤剂的效力。体内消减实验证明CD8+ T细胞在4-1BB特异性抗体的抗肿瘤作用中发挥最关键的作用。然而,取决于肿瘤模型或组合疗法(其包括抗4-1BB),已经报告了其它类型的细胞诸如DC,NK细胞或CD4+ T细胞的贡献(Melero等人,1997；Murillo等人,2009；Narazaki等人,2010；Stagg等人,2011)。
在4-1BB激动剂对不同淋巴细胞子集的直接作用以外,经由肿瘤血管内皮上的血管细胞粘附分子1(VCAM1)和细胞间粘附分子1(ICAM1)的4-1BB介导的上调,4-1BB激动剂还能诱导肿瘤中活化的T细胞的浸润和保留(Palazon等人,2011)。
4-1BB触发还可逆转由暴露于可溶性抗原诱导的T细胞无反应性的状态,这可能有助于破坏肿瘤微环境中或慢性感染期间的免疫学耐受(Wilcox等人,2004)。
看来4-1BB激动性抗体在体内的免疫调控特性需要抗体分子上野生型Fc部分的存在,由此暗示Fc受体结合是此类试剂的药理学活性需要的重要事件,正如关于对TNFR超家族的其它凋亡诱导性或免疫调控性成员特异性的激动性抗体已经描述的(Li和Ravetch,2011；Teng等人,2009)。然而,在小鼠中,具有功能性活性Fc域的4-1BB特异性激动性抗体的系统施用也诱导与肝毒性相关的CD8+ T细胞扩充(Dubrot等人,2010),这在功能性Fc受体缺失下减弱或显著减轻。在人临床试验(ClinicalTrials.gov,NCT00309023)中,12周里每三周一次施用Fc胜任的4-1BB激动性抗体(BMS-663513)在具有黑素瘤,卵巢或肾细胞癌的患者中诱导疾病的稳定化。然而,在另一项试验(NCT00612664)中给予的相同抗体引起4级肝炎,导致试验终止(Simeone和Ascierto,2012)。
总之,可得的临床前和临床数据清楚地证明,对有效4-1BB激动剂的临床需求较高。然而,新一代药物候选应当不仅有效啮合造血和内皮细胞的表面上的4-1BB,而且能够经由与结合Fc受体不同的机制实现这一点,从而避免不可控制的副作用。后者可以经由对肿瘤特异性或肿瘤相关模块的优先结合和寡聚化来实现。
已经生成了由4-1BB配体的一个细胞外结构域和单链抗体片段(Mueller等人,2008；Hornig等人,2012)或与重链的C端融合的单个4-1BB配体(Zhang等人,2007)构成的融合蛋白。WO 2010/010051公开了由彼此连接并与抗体部分融合的三个TNF配体外域组成的融合蛋白的生成。
编程性细胞死亡蛋白1(PD-1或CD279)是CD28受体家族的一个抑制性成员,该家族还包括CD28,CTLA-4,ICOS和BTLA。PD-1是一种细胞表面受体且在活化的B细胞,T细胞,和髓样细胞上表达(Okazaki et al.(2002)Curr.Opin.Immunol.14:391779-82；Bennett etal.(2003)J Immunol 170:711-8)。PD1的结构是一种单体1型跨膜蛋白,由一个免疫球蛋白可变样胞外域和一个含有免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)和免疫受体基于酪氨酸的转换基序(ITSM)的胞质域组成。活化的T细胞瞬时表达PD1,但是PD1和它的配体PDL1的持续高表达促进免疫耗尽,导致持久的病毒感染,肿瘤逃脱,升高的感染和死亡率。PD1表达是经由T细胞受体通过抗原识别来诱导的且它的表达是主要经由连续的T细胞受体信号传导来维持的。在延长的抗原暴露之后,PD1座未能再甲基化,这促进连续的高表达。阻断PD1途径能在癌症和慢性病毒感染中恢复耗尽的T细胞功能(Sheridan,Nature Biotechnology30(2012)729-730)。针对PD1的单克隆抗体已有描述,例如在WO 2003/042402,WO 2004/004771,WO 2004/056875,WO 2004/072286,WO 2004/087196,WO 2006/121168,WO 2006/133396,WO 2007/005874,WO 2008/083174,WO 2008/156712,WO 2009/024531,WO 2009/014708,WO 2009/101611,WO 2009/114335,WO 2009/154335,WO 2010/027828,WO 2010/027423,WO 2010/029434,WO 2010/029435,WO 2010/036959,WO 2010/063011,WO 2010/089411,WO 2011/066342,WO 2011/110604,WO 2011/110621,WO 2012/145493,WO 2013/014668,WO 2014/179664,和WO 2015/112900中。Opdivo(纳武单抗,nivolumab)和Keytruda(派姆单抗,pembrolizumab)这两种PD1单克隆抗体早就在售,用于治疗某些癌症。然而,尽管有引人注目的抗肿瘤活性,越来越多地观察到治疗性PD1阻断之后肿瘤生长的复发(Koyama et al.,Nature Communications 2016,DOI:10.1038/ncomms10501)。
已经显示双重靶向肿瘤微环境中的CD137/PD1消除局部遏制且导致效应T细胞的功能挽救和扩充,其随后杀伤癌细胞(Wei等人,2014)。已经显示在用于皮下肿瘤的小鼠模型中与用单独的抗体之一治疗的小鼠相比用抗4-1BB抗体和抗PD1抗体的组合治疗的小鼠具有最好的抗肿瘤应答(Shindo等人,2015)。在肿瘤小鼠模型中施用抗PD1抗体和4-1BB激动性抗体的组合导致有效的长效的系统性抗肿瘤应答,然而单独给予4-1BB激动剂的已知毒性略微升高(Chen等人,2014)。如此,需要具有改善的安全性概况的组合抗PD1抗体以及4-1BB抗体二者的积极效果的新分子。
本发明的新抗原结合分子组合PD1模块与能够形成共刺激性TNF配体三聚体且足够稳定,从而在药学上有用的模块。令人惊讶地,本发明的抗原结合分子提供三聚体且因此有生物学活性的TNF配体,尽管三聚化TNF配体外域之一与该分子的其它两个TNF配体外域位于不同多肽上。通过抗PD1模块的靶向,本发明的抗原结合分子在肿瘤微环境中具有升高的活性且因此应当造成与单独的常规4-1BB激动性抗体相比更少的安全性问题。
发明概述
在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。
在一个特定方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段,和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在又一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
(i)该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有相应的CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,或
(ii)该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有相应的CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段,或
(iii)该第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且该第二多肽含有相应的VL-CH1域或VH-CL域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头与VH或VL且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
在一个特定方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
(i)该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有相应的CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,或
(ii)该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有相应的CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。
在一个方面,该TNF配体家族成员是共刺激人T细胞活化的一种。如此,该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个模块能够特异性结合靶细胞抗原,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段,其中该TNF配体家族成员共刺激人T细胞活化。更加特别地,该TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
在一个特定方面,该TNF配体家族成员是4-1BBL。
在又一个方面,该TNF配体家族成员的外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。更加特别地,该TNF配体家族成员的外域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在又一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
在一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且在于该第二多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在另一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,
(b)第一多肽含有CH1或CL域且第二多肽含有相应的CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,
且其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含通过肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。
在一个方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,
(b)第一多肽含有CH1域且第二多肽含有CL域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,
且其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该CH1域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
在另一个方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,
(b)第一多肽含有CL域且第二多肽含有CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,
且其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
在又一个方面,本发明提供如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块选自由抗体,抗体片段和支架抗原结合蛋白组成的组。特别地,该能够特异性结合PD1的模块选自由抗体片段,Fab分子,交换Fab分子,单链Fab分子,Fv分子,scFv分子,单域抗体,aVH和支架抗原结合蛋白组成的组。
在一个方面,本发明提供如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块是抗体片段。特别地,该能够特异性结合PD1的模块选自由Fab分子,交换Fab分子,单链Fab分子,Fv分子,scFv分子,单域抗体和aVH组成的组。
在一个方面,本发明提供如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块是支架抗原结合蛋白。
在一个特定方面,本发明涉及如上文定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子或scFV分子。更加特别地,该能够特异性结合PD1的模块是Fab分子。
本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合PD1的模块。在一个特定方面,该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个能够特异性结合PD1的模块,意味着该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子是单价的。在另一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含两个能够特异性结合PD1的模块,意味着该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子是二价的。
在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3,
(b)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3,
(c)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3,
(d)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HVR-L3,
(e)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HVR-L3,
(f)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-L3,或
(g)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-L3。
在又一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL域,
(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL域,
(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL域,
(d)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL域,
(e)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL域,
(f)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL域,
(g)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL域,
(h)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL域,
(i)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL域,
(k)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL域,或
(l)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL域。
在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个特定方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL域,
(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL域,
(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL域,
(d)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL域,或
(e)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL域。
在一个方面,提供的是如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变轻链或其中该能够特异性结合PD1的模块包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的可变轻链。
在一个特定方面,本发明涉及如上文定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该肽接头是(G4S)2,即SEQ ID NO:117的肽接头。在一个方面,该肽接头在所有情况中是(G4S)2。
本发明进一步涉及如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在一个方面,本发明的包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子进一步包含(a)能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子,其中该Fab重链在该C端融合至该Fc域中的CH2域的N端。
在又一个方面,该Fc域是IgG,特别是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。
更加特别地,该Fc域是IgG1 Fc域。在一个特定方面,该Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。在一个具体方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W(编号方式依照Kabat EU索引)且该Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S,L368A和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。
在另一个方面,本发明涉及如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中该Fc域包含一处或多处降低对Fc受体,特别是对Fcγ受体的结合的氨基酸替代。
特别地,该Fc域包含IgG重链的位置234和235(EU编号方式)和/或329(EU编号方式)处的氨基酸替代。更加特别地,提供的是依照本发明的含有三聚体TNF家族配体的抗原结合分子,其包含包含位置234和235(EU编号方式)和/或329(EU编号方式)处的氨基酸替代,特别是氨基酸替代L234A,L235A和P329G(EU编号方式)的IgG1 Fc域。
在又一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
第一重链和第一轻链,二者构成能够特异性结合PD1的Fab分子,
第一肽,其包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段,在其C端通过第二肽接头与第二重或轻链融合,
和第二肽,其包含所述TNF配体家族成员的一个外域,在其C端通过第三肽接头与相应的第二轻或重链融合。
在另一个方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的第一肽在其C端通过第二肽接头与作为重链一部分的CH1域融合,且该包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链一部分的CL域融合。
在还有另一个方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的第一肽在其C端通过第二肽接头与作为重链一部分的CL域融合,且该包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链一部分的CH1域融合。
在又一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的第一肽在其C端通过第二肽接头与作为重链一部分的VH域融合,且该包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链一部分的VL域融合。
在一个特定方面,本发明涉及如上文定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该肽接头是(G4S)2,即SEQ ID NO:117的肽接头。在一个方面,该第一,第二和第三肽接头是(G4S)2。
进一步提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中在邻近该TNF配体家族成员的CL域中位置123(EU编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(R)替代且位置124(EU编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(K)替代,且其中在邻近该TNF配体家族成员的CH1域中位置147(EU编号方式)处和位置213(EU编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(E)替代。
在又一个方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子如本文中之前描述的,其中该抗原结合分子包含
(a)第一重链和第一轻链,二者构成能够特异性结合PD1的Fab分子,
(b)第二重链,其包含选自由SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:10组成的组的氨基酸序列,和第二轻链,其包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)能够特异性结合PD1的Fab分子,和
(b)第二重链,其包含选自由SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:10组成的组的氨基酸序列,和第二轻链,其包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
在一个特定方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(i)包含包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域的第一重链和包含包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的VL域的第一轻链或
包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域的第一重链和包含包含选自由SEQID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组的氨基酸序列的VL域的第一轻链,
(ii)包含选自由SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:80组成的组的氨基酸序列的第二重链,和
(iii)包含选自由SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81组成的组的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83或SEQ IDNO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第二重链和包含SEQID NO:75的氨基酸序列的第二轻链,
(b)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83或SEQ IDNO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的第二重链和包含SEQID NO:77的氨基酸序列的第二轻链,
(c)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83或SEQ IDNO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的第二重链和包含SEQID NO:79的氨基酸序列的第二轻链,或
(d)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83或SEQ IDNO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的第二重链和包含SEQID NO:81的氨基酸序列的第二轻链。
在还有另一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有相应的CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
特别地,此类含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够特异性结合PD1的Fab域。
特别地,提供的是如本文中之前描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的第二重链,和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的两条轻链,或
(b)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的第二重链,和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的两条轻链。
在另一个特定方面,本发明提供如本文中之前描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个能够特异性结合PD1的Fab域。
在此类方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(i)融合多肽,其包含Fc域的第一亚基和通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段,(ii)重链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VH域,该Fc域的第二亚基和经由肽接头与该CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,和(iii)轻链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VL域,或
(i)融合多肽,其包含Fc域的第一亚基和通过肽接头与该CH3域的C端连接的一个TNF配体家族成员的外域或其片段,(ii)重链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VH域,该Fc域的第二亚基和经由肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的所述TNF配体家族成员的两个外域或其片段,和(iii)轻链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VL域。
在一个特定方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链,
(b)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链,
(c)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链,
(b)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链。
依照本发明的另一个方面,提供有一种分离的多核苷酸,其编码如本文中之前限定的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。本发明进一步提供一种载体,特别是表达载体,其包含本发明的分离的多核苷酸,和一种宿主细胞,其包含本发明的分离的多核苷酸或载体。在一些实施方案中,该宿主细胞是真核细胞,特别是哺乳动物细胞。
在另一个方面,提供的是一种用于生成本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的方法,其包含在适合于该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子表达的条件下培养本发明的宿主细胞,和分离该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法生成的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
本发明进一步提供一种药用组合物,其包含本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。
本发明还涵盖的是本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或本发明的药用组合物,其供作为药物使用。在一个方面提供的是本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或本发明的药用组合物,其供在有所需要的个体中治疗疾病中使用。在一个具体实施方案中,提供的是本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或本发明的药用组合物,其供在治疗癌症中使用。在另一个方面,提供的是本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或本发明的药用组合物,其供在上调或延长细胞毒性T细胞活性中使用。
还提供的是本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子用于制造用于在有所需要的个体中治疗疾病的药物,特别是用于制造用于治疗癌症的药物的用途,以及一种在个体中治疗疾病的方法,其包含对所述个体施用治疗有效量的包含药学可接受形式的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的组合物。在一个具体实施方案中,该疾病是癌症。还提供的是一种在具有癌症的个体中上调或延长细胞毒性T细胞活性的方法,其包含对该个体施用有效量的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或本发明的药用组合物。在任何上述实施方案中,该个体优选是哺乳动物,特别是人。
附图简述
图1显示用嵌合抗体克隆PD1-0103阻断PD1强烈增强异基因的经刺激的原代人T细胞的IFN伽马分泌。IFN伽马分泌与参照抗体MDX5C4或MK-3475相比更高。
在图2中显示与嵌合克隆PD1-0103相比,用人源化克隆PD1-0103-0312和PD1-103-314阻断PD1甚至更加强烈提高异基因的经刺激的原代人T细胞的干扰素伽马(IFN-γ)分泌。
图3展示用嵌合抗体克隆PD1-0103和人源化克隆PD1-0103-0312和PD1-103-314阻断PD1强烈提高异基因的经刺激的原代人T细胞的肿瘤坏死因子-阿尔法(TNF)分泌。TNF-阿尔法分泌与参照抗体MDX5C4或MK-3475相比更高。
图4A显示在渐增浓度的不同抗PD1抗体(嵌合抗体克隆PD1-0103和人源化克隆PD1-0103-0312,PD1-0103-0313,PD1-0103-0314,PD1-0103-0315)存在下生成粒酶B的CD4+T细胞的频率而图4B显示在渐增浓度的不同抗PD1抗体存在下在MLR的上清液中通过吸光度(光密度,O.D.)检测的IFN-γ的量。
在图5A中显示与单独的PDL1相比在嵌合抗PD1抗体克隆PD1-0103存在下PD1/PD-L1阻断对受到遏制的T细胞受体信号传导的再活化的影响而在图5B中呈现在不同抗PD1抗体(嵌合抗体克隆PD1-0103和人源化克隆PD1-0103-0312,PD1-0103-0313,PD1-0103-0314,PD1-0103-0315)存在下PD1/PD-L1阻断对受到遏制的T细胞受体信号传导的再活化的影响。
图6显示用于装配分拆三聚体人4-1BB配体的构件。图6A显示在C端融合至具有突变E123R和Q124K(带电荷变体)的人CL域的二聚体4-1BB(71-254)配体而图6B显示在其C端融合至具有突变K147E和K213E(带电荷变体)的人CH1域的单体4-1BB(71-254)配体。图6C显示在C端融合至没有突变的人CL域的二聚体4-1BB(71-254)配体而图6D显示在其C端融合至没有突变的人CH1域的单体4-1BB(71-254)配体。图1E显示在N端融合至人IgG1 Fc穴域的二聚体4-1BB(71-254)配体而图1 F显示在N端融合至人IgG1 Fc节域的单体4-1BB(71-254)配体。
图7示意性图示本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子构建物7.1至7.6的结构。这些构建物的制备和生成在实施例2中描述。VH和VL域是抗PD1抗体(特别是0103-0314)的那些,粗黑点代表节-入-穴修饰。*象征CH1和CL域中的氨基酸修饰(所谓的带电荷变体)。图7A显示具有带电荷变体和hu4-1BBL(71-254)的构建物7.1,没有带电荷变体的相应构建物在图7B中显示。如图7D中显示的构建物7.4包含三个hu 4-1BBL(71-248)和带电荷变体,没有带电荷变体的相应构建物在图7E中图示。图7C显示一种在Fc链的C端具有hu4-1BBL(71-254)的二价构建物而具有hu 4-1BBL(71-248)的相应构建物在图7F中显示。
图8显示用于装配分拆三聚体人4-1BB配体的构件。图8A显示在C端融合至具有突变E123R和Q124K(带电荷变体)的人CL域的二聚体4-1BB(71-248)配体而图8B显示在其C端融合至具有突变K147E和K213E(带电荷变体)的人CH1域的单体4-1BB(71-248)配体。图8C显示在C端融合至没有突变的人CL域的二聚体4-1BB(71-248)配体而图8D显示在其C端融合至没有突变的人CH1域的单体4-1BB(71-248)配体。图8E显示在N端融合至人IgG1 Fc穴域的二聚体4-1BB(71-248)配体而图8F显示在N端融合至人IgG1 Fc节域的单体4-1BB(71-248)配体。
图9显示用于装配分拆三聚体人4-1BB配体的构件,其中单体4-1BB配体和二聚体4-1BB配体每一个在其N端与另一条多肽链,特别是Fc域的亚基之一融合。图9A显示在N端融合的二聚体配体而图9B显示在N端融合的单体配体。含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子构建物7.11和7.12的示意图分别在图9C和图9D中显示。在图9C中显示一种抗原结合分子,其中能够特异性结合PD1的Fab域附着至Fc节链,二聚体4-1BBL融合至Fc穴链的C端且单体4-1BBL融合至Fc节链的C端。图9D显示一种抗原结合分子,其中能够特异性结合PD1的Fab域附着至Fc节链,二聚体4-1BBL也融合至Fc节链的C端且单体4-1BBL融合至Fc穴链的C端。
构建物7.13和7.14的示意图分别在图10A和图10B中显示。在图10A中显示一种抗原结合分子,其中能够特异性结合PD1的Fab域附着至Fc穴链,二聚体4-1BBL融合至Fc穴链的C端且单体4-1BBL融合至Fc节链的C端。在图10B中显示一种抗原结合分子,其中能够特异性结合靶细胞抗原的Fab域附着至Fc穴链,二聚体4-1BBL也融合至Fc节链的C端且单体4-1BBL融合至Fc穴链的C端。
在图11A至11D中显示对照分子的示意图。图11A和图11B分别显示构建物7.1和7.3的“非靶向性”变体,其中抗PD1 Fab域用DP47(种系)Fab域替换。该分子分别命名为对照B和对照C。图11C显示命名为对照D的构建物7.4的非靶向性变体。对照分子的制备在实施例2.9中描述。图11D是具有PGLALA突变的单特异性IgG1分子的图,其中Fab域是DP47 Fab域(对照F)或PD10103-0314 Fab域(对照M)。这些分子在实施例2.10中描述。
图12A显示本发明的PD1靶向性含有分拆三聚体C端4-1BB配体的抗原结合分子的同时结合的SPR实验的设置。PD1(0314)靶向性分拆4-1BBL(71-254)Fc kih抗原结合分子构建物7.1对人4-1BB和人PD1的同时结合在图12B中显示。二价PD1(0314)靶向性分拆4-1BBL(71-254)Fc kih抗原结合分子(构建物7.3)对人4-1BB和人PD1的同时结合在图12C中显示。PD1(0314)靶向性分拆4-1BBL(71-248)Fc kih抗原结合分子(构建物7.5)对人4-1BB和人PD1的同时结合在图12D中显示而二价PD1(0314)靶向性分拆4-1BBL(71-248)Fc kih抗原结合分子(构建物7.6)对人4-1BB和人PD1的同时结合在图12E中显示。
图13A至13H显示PD1靶向性4-1BB分拆三聚体配体Fc融合抗原结合分子对新鲜分离的PBMC的结合,如实施例5.1中描述的。显示的是PE缀合的检测二抗的荧光强度的几何(geo)均值(y轴)对测试构建物的浓度(x轴)。为了更好地查看,将图一分为二,分别为图(13A),(13B),(13C)和(13D)和图(13E),(13F),(13G)和(13H),其中在所有图中显示对照F和对照M的曲线作为参照。监测新鲜人CD45+CD3+CD4+ T细胞(图(13A)和(13E)),新鲜人CD45+CD3+CD8+ T细胞(图(13B)和(13F)),新鲜人CD45+CD3+CD4-CD8-γδT细胞(图(13C)和(13G))和CD45+CD3-CD19+B细胞(图(13D)和(13H))上的结合。
图14A至14H图示PD1靶向性分拆三聚体4-1BB配体Fc融合抗原结合分子对活化的人PBMC的结合,如实施例5.1中所述测试。显示的是PE缀合的检测二抗的荧光强度的几何均值(y轴)对测试构建物的浓度(x轴)。使用作为阴性对照的对照F。为了更好地查看,将图一分为二,即拆分为图(14A),(14B),(14C)和(14D)和拆分为图(14E),(14F),(14G)和(14H),其中在所有图中显示对照F和对照M的曲线作为参照。用激动性抗人CD28和抗人CD3抗体活化后4-1BB表达在大多数CD45+CD3+CD8+ T细胞(见图(14A)或(14E))或CD45+CD3+CD4+ T细胞(见图(14B)和(14F))上上调而大多数人CD45+CD3+CD4-CD8-γδT细胞(图(14C)或(14G))或CD45+CD3-CD19+B细胞(图(14D)或(14H))程度较低。
图15A和15B显示PD1靶向性或非靶向性分拆三聚体人4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子对表达人PD1的CHO-k1-huPD1克隆5细胞的结合。方法在实施例5.2中描述。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合并在y轴上显示通过流式细胞术测量的几何均值。在x轴上显示PD1靶向性4-1BB分拆三聚体配体Fc融合抗原结合分子和它们的对照的使用浓度。为了更好地查看,将图一分为二(图(15A)和图(15B)),其中在二者中显示对照F和对照M的曲线作为参照。
图16A和16B显示PD1靶向性或非靶向性分拆三聚体人4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子对表达人4-1BB的HeLa-hu4-1BBL-NFkB-luc克隆26细胞的结合,如实施例5.2中所述测试。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合并在y轴上显示通过流式细胞术测量的几何均值。在x轴上显示PD1靶向性4-1BB分拆三聚体配体Fc融合抗原结合分子和它们的对照的使用浓度。为了更好地查看,将图一分为二,即图(16A)和(16B),其中在二者中显示对照F和对照M的曲线作为参照。
图17显示图示使用报告细胞系的实施例6中描述的NFkB活性测定法的一般原理的示意图。显示的是用表达人4-1BB的HeLa报告细胞系设置的活化测定法。在报告细胞上表达的4-1BB的交联诱导NFκB活化和NFκB介导的萤光素酶表达。在细胞裂解之后萤光素酶能催化萤光素氧化成氧化萤光素。这种化学反应与NFκB介导的萤光素酶表达的强度正相关且可通过光发射的强度(释放光单位)来测量。
图18A至18D显示NFκB活化诱导的萤光素酶表达和活性,如用实施例6中描述的测定法测量的。对0.5s/孔测量释放光单位(URL)并针对PD1靶向性或非靶向性分拆三聚体人4-1BB配体Fc(kih)构建物的使用浓度绘图。在交联性表达人PD1的CHO-k1-huPD1克隆5细胞缺失(图(18A)和(18B))或存在(图(18C)和(18D))下将表达人4-1BB的HeLa报告细胞温育6小时。表达人4-1BB的HeLa报告细胞对CHO-k1-huPD1克隆5细胞的细胞比在每幅图中指示。
发明详述
定义
除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与此发明所属领域中一般使用的相同的含义。出于解释此说明书的目的,会应用下述定义,而且在适宜时,以单数使用的术语还会包括复数,反之亦然。
如本文中使用的,术语“抗原结合分子”以其最广义指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是抗体,抗体片段和支架抗原结合蛋白。
如本文中使用的,术语“能够特异性结合PD1的模块”或“能够特异性结合PD1的抗原结合域”指特异性结合PD1的多肽分子。在一个方面,抗原结合模块能够经由PD1激活信号传导。在一个特定方面,抗原结合模块能够将其附着的实体(例如TNF家族配体三聚体)引导至靶位点,例如携带PD1的特定类型的肿瘤细胞或携带PD1的T细胞。能够特异性结合PD1的模块包括本文中进一步定义的抗体和其片段。另外,能够特异性结合靶细胞抗原的模块包括本文中进一步定义的支架抗原结合蛋白,例如基于设计的重复蛋白或设计的重复域的结合域(参见例如WO 2002/020565)。
关于抗体或其片段,术语“能够特异性结合靶细胞抗原的模块”指分子中包含与抗原的部分或全部特异性结合且互补的区域的部分。可以例如由一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供能够进行特异性抗原结合的模块。特别地,能够进行特异性抗原结合的模块包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的抗原结合活性。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”指自实质性同质的抗体群体获得的抗体,即构成该群体的抗体个体是同一的和/或结合相同表位,除了可能的抗体变体,例如,含有天然发生的突变的或在单克隆抗体制备物的生成期间产生的,此类变体一般以微小量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比,单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体,每个该位点结合相同抗原的相同表位。术语“双特异性”意味着抗原结合分子能够特异性结合至少两种截然不同的抗原性决定簇。典型地,双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点,其每个是对不同抗原性决定簇特异性的。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇,特别是在两种截然不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。
如本申请内使用的术语“价”表示抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。照此,术语“二价”,“四价”,和“六价”分别表示抗原结合分子中两个结合位点,四个结合位点,和六个结合位点的存在。
术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指具有与天然抗体结构实质性相似的结构的抗体。“天然抗体”指具有不同结构的天然发生的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由成二硫键的两条轻链和两条重链构成。自N端至C端,每条重链具有一个可变区(VH),也称作可变重域或重链可变域,接着是三个恒定域(CH1,CH2,和CH3),也称作重链恒定区。类似地,自N端至C端,每条轻链具有一个可变区(VL),也称作可变轻域或轻链可变域,接着是一个轻链恒定域(CL),也称作轻链恒定区。抗体的重链可指派至五种型之一,称作α(IgA),δ(IgD),ε(IgE),γ(IgG),或μ(IgM),其中一些可进一步分成亚型,例如γ1(IgG1),γ2(IgG2),γ3(IgG3),γ4(IgG4),α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列,抗体的轻链可指派至两种型之一,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子,其包含完整抗体中与完整抗体所结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2；双抗体,三抗体,四抗体,交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和单域抗体。关于某些抗体片段的综述,参见Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；还参见WO93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论,参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的,参见例如EP 404,097；WO1993/01161；Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger et al.,Proc NatlAcad Sci USA 90,6444-6448(1993)。Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。单域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术来生成抗体片段,包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成,如本文中描述的。
完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个同一的抗原结合片段,称作“Fab”片段,每个含有重和轻链可变域,还有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。如此,如本文中使用的,术语“Fab片段”指包含包含轻链的VL域和恒定域(CL)的轻链片段,和重链的VH域和第一恒定域(CH1)的抗体片段。Fab’片段因在重链CH1域的羧基末端增加少数残基而与Fab片段不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab’)2片段。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”指其中重和轻链的可变区或恒定区任一交换的Fab片段。交换Fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中:一方面,Fab重和轻链的可变区交换,即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链,和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(VLVH)。另一方面,当Fab重和轻链的恒定区交换时,交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链,和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下述次序之一:a)VH-CH1-接头-VL-CL,b)VL-CL-接头-VH-CH1,c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；且其中所述接头是至少30个氨基酸,优选32至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段经由CL域和CH1域之间的天然二硫键而稳定化。另外,这些单链Fab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照Kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。
“交换单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下述次序之一:a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成特异性结合抗原的抗原结合位点,且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。另外,这些x-scFab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照Kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是以10至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重(VH)和轻(VL)链可变区的融合蛋白。接头经常富含出于柔性的甘氨酸,以及出于溶解性的丝氨酸或苏氨酸,而且可将VH的N端与VL的C端连接,或反之亦然。尽管去除恒定区并引入接头,此蛋白质保留原始抗体的特异性。scFv抗体描述于例如Houston,J.S.,Methods inEnzymol.203(1991)46-96。另外,抗体片段包含具有VH域的特征(即能够与VL域一起装配)或VL域的特征(即能够与VH域一起装配)的单链多肽,VH域与VL域一起装配成功能性抗原结合位点并由此提供全长抗体的抗原结合特性。
“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的,例如,纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)已经用作抗原结合域的备选支架,参见例如Gebauer and Skerra,Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.CurrOpin Chem Biol 13:245-255(2009)和Stumpp et al.,Darpins:A new generation ofprotein therapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面,支架抗原结合蛋白选自由CTLA-4(Evibody),脂质运载蛋白(Anticalin),蛋白A衍生的分子,诸如蛋白A的Z域(Affibody),A域(Avimer/Maxibody),血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin),抗体轻链或重链的可变域(单域抗体,sdAb),抗体重链的可变域(纳米抗体,aVH),VNAR片段,纤连蛋白(AdNectin),C型凝集素域(Tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变域(VNAR片段),人γ-晶体蛋白或泛素(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型域,微体,诸如来自knottin家族的蛋白质,肽适体和纤连蛋白(adnectin)组成的组。
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是一种主要在CD4+ T细胞上表达的CD28家族受体。它的胞外域具有可变域样Ig折叠。可以用异源序列替代与抗体CDR对应的环以赋予不同的结合特性。改造成具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称作Evibody(例如US7166697B1)。Evibody的尺寸与抗体的分离的可变区(例如域抗体)大致相同。进一步的详情参见Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。
脂质运载蛋白是一个细胞外蛋白质家族,其转运小的疏水性分子,诸如类固醇,胆红素,类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构,在锥形结构的开口端具有一些环,能改造成结合不同靶抗原。Anticalin的尺寸介于160-180个氨基酸之间,而且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000),US7250297B1和US20070224633。
Affibody是一种自金黄色葡萄球菌蛋白A衍生的支架,能改造成结合抗原。该域由大约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化生成了文库。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.17,455-462(2004)和EP1641818A1。
Avimer是自A域支架家族衍生的多域蛋白。大约35个氨基酸的天然域采取限定的成二硫键的结构。多样性是通过由A域家族展现的天然变异的改组而产生的。进一步的详情参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion onInvestigational Drugs 16(6),909-917(June 2007)。
转铁蛋白是一种单体血清转运糖蛋白。通过在允许的表面环中插入肽序列,转铁蛋白能改造成结合不同靶抗原。经过改造的转铁蛋白支架的例子包括Trans-body。进一步的详情参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)衍生自锚蛋白,锚蛋白是介导整合膜蛋白附着至细胞骨架的一个蛋白质家族。单个锚蛋白重复是一个33个残基的基序,由两个α-螺旋和一个β-转角组成。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基,它们能改造成结合不同靶抗原。通过增加模块的数目(亲和力成熟的一种方法)能增加它们的结合界面。进一步的详情参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003),PNAS100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)和US20040132028A1。
单域抗体是由单个单体可变抗体域组成的抗体片段。第一种单域是自来自骆驼科动物(camelids)的抗体重链的可变域衍生的(纳米抗体或VHH片段)。而且,术语单域抗体包括自主的(autonomous)人重链可变域(aVH)或自鲨鱼衍生的VNAR片段。
纤连蛋白是一种能改造成结合抗原的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10个域的天然氨基酸序列的主链组成。可以改造β-夹心一端处的三个环,使得Adnectin能够特异性识别感兴趣的治疗靶。进一步的详情参见ProteinEng.Des.Sel.18,435-444(2005),US20080139791,WO2005056764和US6818418B1。
肽适体是由恒定支架蛋白组成的组合识别分子,所述恒定支架蛋白典型地是含有在活性位点处插入的受到约束的可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步的详情参见ExpertOpin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。
微体衍生自长度为25-50个氨基酸的天然发生微蛋白,其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的例子包括KalataBI和芋螺毒素和knottin。微蛋白具有能改造成包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的总体折叠的环。经过改造的knottin域的进一步详情参见WO2008098796。
与参照分子“结合相同表位的抗原结合分子”指如下的抗原结合分子,抗原结合分子在竞争测定法中将参照分子对其抗原的结合阻断50％或更多,相反,参照分子在竞争测定法中将抗原结合分子对其抗原的结合阻断50％或更多。
术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含与抗原的部分或全部特异性结合且互补的区域的部分。在抗原较大的情况中,抗原结合分子可仅仅结合抗原的特定部分,该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个可变域(也称作可变区)提供。优选地,抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文中使用的,术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义,而且指多肽大分子上的如下位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构造),抗原结合模块与该位点结合,形成抗原结合模块-抗原复合物。有用的抗原性决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上,在病毒感染的细胞的表面上,在其它患病细胞的表面上,在免疫细胞的表面上,游离在血清中,和/或在细胞外基质(ECM)中找到。作为本文中的抗原有用的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。在一个特定实施方案中,抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况中,该术语涵盖“全长”未加工的蛋白质以及源自细胞中的加工的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。
术语“能够特异性结合PD1”指能够以足够亲和力结合PD1,使得该抗原结合分子在靶向PD1中作为诊断和/或治疗剂是有用的抗原结合分子。抗原结合分子包括但不限于抗体,Fab分子,交换Fab分子,单链Fab分子,Fv分子,scFv分子,单域抗体,和VH和支架抗原结合蛋白。在一个方面,抗PD1抗原结合分子结合无关的,非PD1的蛋白质的程度小于该抗原结合分子对PD1的结合的约10％,如例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的。特别地,能够特异性结合PD1的抗原结合分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中,抗PD1抗原结合分子结合来自不同物种的PD1。特别地,抗PD1抗原结合分子结合人和食蟹猴PD1。
“特异性结合”意味着结合对于抗原是选择性的且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子结合特定抗原的能力可经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000)),和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一个实施方案中,抗原结合分子对无关蛋白质的结合的程度小于抗原结合分子对抗原的结合的约10％,如通过例如SPR测量的。在某些实施方案中,结合抗原的分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更小,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点和其结合配偶(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力一般可以用解离常数(Kd)来代表,它是解离和结合速率常数(分别是koff和kon)的比。如此,等同的亲和力可包含不同的速率常数,只要速率常数的比保持相同。可以通过本领域已知的常用方法来测量亲和力,包括本文中描述的那些。用于测量亲和力的一种特定方法是表面等离振子共振(SPR)。
如本文中使用的“靶细胞抗原”指在靶细胞(例如T细胞或B细胞,肿瘤中的细胞,诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)的表面上呈现的抗原性决定簇。在某些实施方案中,靶细胞抗原是T细胞的表面上的抗原。在一个实施方案中,靶细胞抗原是PD1。
术语“PD1”,也称作编程性细胞死亡蛋白1,是一种288个氨基酸的I型膜蛋白,最初在1992年描述(Ishida et al.,EMBO J.,11(1992),3887-3895)。PD1是T细胞调节物的扩大的CD28/CTLA-4家族的一个成员且具有两个配体,PD-L1(B7-H1,CD274)和PD-L2(B7-DC,CD273)。该蛋白质的结构包括一个胞外IgV域,接着是一个跨膜区和一个胞内尾。胞内尾含有位于免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序和免疫受体基于酪氨酸的转换基序中的两个磷酸化位点,这提示PD1负调节TCR信号。这与配体结合后SHP-1和SHP-2磷酸酶对PD1的胞质尾的结合一致。虽然PD1不在幼稚T细胞上表达,但是它在T细胞受体(TCR)介导的活化后上调且在活化的和耗尽的T细胞二者上观察到(Agata et al.,Int.Immunology 8(1996),765-772)。这些耗尽的T细胞具有功能障碍性表型且不能够恰当地响应。虽然PD1具有相对广泛的表达样式,但是它最重要的作用很可能是作为T细胞上的共抑制性受体(Chinai et al.,Trends in Pharmacological Sciences 36(2015),587-595)。当前的治疗办法因此聚焦于阻断PD1与它的配体的相互作用以增强T细胞应答。术语“编程性死亡1”,“编程性细胞死亡1”,“蛋白PD-1”,“PD-1”,“PD1”,PDCD1”,“hPD-1”和“hPD-I”可互换使用,而且包括人PD1的变体,同等型,物种同系物,和与PD1具有至少一个共同表位的类似物。人PD1的氨基酸序列在UniProt(www.uniprot.org)登录号Q15116(SEQ ID NO:94)中显示。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗原结合分子结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区域。一般地,天然四链抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1,H2,H3),三个在VL中(L1,L2,L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基,后者具有最高的序列变异性和/或牵涉抗原识别。例示性高变环发生于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1,CDR-L2,CDR-L3,CDR-H1,CDR-H2,和CDR-H3)发生于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35B(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。
高变区(HVR)也称作互补决定区(CDR),而且在提到可变区中形成抗原结合区的部分时,这些术语在本文中可互换使用。这个特定区域已经由Kabat et al.,U.S.Dept.ofHealth and Human Services,"Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983)和由Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述,其中定义包括在针对彼此比较时的氨基酸残基的交叠或子集。无论如何,应用任一定义来提及抗体的CDR或其变体意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每一篇参考文献定义的CDR的适宜氨基酸残基在下文表A中作为比较列出。涵盖特定CDR的确切残基编号会取决于CDR的序列和大小而变化。给予抗体的可变区氨基酸序列,本领域技术人员能例行确定哪些残基构成特定CDR。
表A:CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM<sup>2</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 26-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 52-58 50-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 95-102 95-102
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 24-34
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 50-56
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-97
1表A中的所有CDR定义的编号方式依照Kabat等人(见下文)列出的编号规则。
2如表A中使用的具有小写“b”的“AbM”指如由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将“Kabat编号方式”的这种系统指派给任何可变区序列,不依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文中使用的,“Kabat编号方式”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest"(1983)中列出的编号系统。除非另有规定,抗体可变区中具体氨基酸残基位置的编号的提及依照Kabat编号系统。
除了VH中的CDR1之外,CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”,它们是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短CDR或a-CDR的CDR区域中。例示性a-CDR(a-CDR-L1,a-CDR-L2,a-CDR-L3,a-CDR-H1,a-CDR-H2,和a-CDR-H3)发生于氨基酸残基31-34(L1),50-55(L2),89-96(L3),31-35B(H1),50-58(H2),和95-102(H3)(参见Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外指明,HVR残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等人,见上文编号。
如本文中使用的,在抗原结合分子(例如抗体)的语境中术语“亲和力成熟的”指如下的抗原结合分子,其例如通过突变而自参照抗原结合分子衍生,与参照抗体结合相同抗原,优选结合相同表位；且对抗原具有比参照抗原结合分子要高的亲和力。亲和力成熟一般牵涉修饰抗原结合分子的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基。典型地,亲和力成熟的抗原结合分子与初始参照抗原结合分子结合相同表位。
“框架”或“FR”指除了高变区(HVR)残基之外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR域组成:FR1,FR2,FR3,和FR4。因而,HVR和FR序列一般在VH(或VL)中以下述顺序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文中的目的,“受体人框架”是包含自如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“自”人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列,或者它可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中,氨基酸变化的数目是10或更少,9或更少,8或更少,7或更少,6或更少,5或更少,4或更少,3或更少,或2或更少。在一些实施方案中,VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列同一。
术语“嵌合”抗体指如下的抗体,其中重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生,而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,而且其中若干可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个实质性整个如下的可变域,其中整个或实质性整个HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些,而且整个或实质性整个FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可包含自人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体,例如非人抗体的“人源化形式”指经历人源化的抗体。本发明涵盖的其它形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经自原始抗体的恒定区另外修饰或变化以生成依照本发明的特性,尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些。
“人”抗体是拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义专门排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本文中的术语“Fc域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含Fc区中在CH2域C端的那段残基(即自IgG的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的,此类变体CH3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。在一个实施方案中,人IgG重链Fc区自Cys226或自Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统,也称作EU索引,如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述的。
“节-入-穴”技术在例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中描述。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得该隆起可放置在该空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与隆起相同或相似大小的补偿性空腔。可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个具体实施方案中,节修饰包含Fc域的两个亚基之一中的氨基酸替代T366W,而穴修饰包含Fc域的两个亚基之另一中的氨基酸替代T366S,L368A和Y407V。在又一个具体实施方案中,Fc域中包含节修饰的亚基另外包含氨基酸替代S354C,而Fc域中包含穴修饰的亚基另外包含氨基酸替代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥,如此进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods248,7-15(2001))。编号方式依照Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中的EU索引。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的Fc区的天然发生等位变体以及具有生成替代,添加,或删除的改变但并不实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性)的能力的变体。例如,可以自免疫球蛋白的Fc区的N端或C端删除一个或多个氨基酸,生物学功能没有实质性损失。可以依照本领域已知的一般规则来选择此类变体,从而对活性具有最小限度影响(参见例如Bowie,J.U.et al.,Science247:1306-10(1990))。
术语“效应器功能”指那些可归于抗体的Fc区的生物学活性,其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调,和B细胞活化。
“活化性Fc受体”是在受到抗体的Fc区啮合后引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a),FcγRI(CD64),FcγRIIa(CD32),和FcαRI(CD89)。一种特定活化性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637,版本141)。
术语“TNF配体家族成员”或“TNF家族配体”指促炎性细胞因子。细胞因子,特别是TNF配体家族的成员,一般在免疫系统的刺激和协调中发挥至关紧要的作用。目前,基于序列,功能,和结构相似性,已经将19种细胞因子鉴定为TNF(肿瘤坏死因子)配体超家族的成员。所有这些配体都是具有C端细胞外结构域(外域),N端细胞内结构域和单个跨膜结构域的II型跨膜蛋白。称作TNF同源域(THD)的C端细胞外结构域在超家族成员之间具有20-30％氨基酸同一性且负责结合受体。TNF外域还负责TNF配体形成受到其特异性受体识别的三聚体复合物。
TNF配体家族的成员选自由淋巴毒素α(也称作LTA或TNFSF1),TNF(也称作TNFSF2),LTβ(也称作TNFSF3),OX40L(也称作TNFSF4),CD40L(也称作CD154或TNFSF5),FasL(也称作CD95L,CD178或TNFSF6),CD27L(也称作CD70或TNFSF7),CD30L(也称作CD153或TNFSF8),4-1BBL(也称作TNFSF9),TRAIL(也称作APO2L,CD253或TNFSF10),RANKL(也称作CD254或TNFSF11),TWEAK(也称作TNFSF12),APRIL(也称作CD256或TNFSF13),BAFF(也称作CD257或TNFSF13B),LIGHT(也称作CD258或TNFSF14),TL1A(也称作VEGI或TNFSF15),GITRL(也称作TNFSF18),EDA-A1(也称作外胚层发育异常蛋白A1)和EDA-A2(也称作外胚层发育异常蛋白A2)组成的组。该术语指来自任何脊椎动物来源的任何天然TNF家族配体,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。在本发明的具体实施方案中,TNF配体家族成员选自由OX40L,FasL,CD27L,TRAIL,4-1BBL,CD40L和GITRL组成的组。在一个特定实施方案中,TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
可以自公众可获取的数据库,诸如Uniprot(www.uniprot.org)获得TNF配体家族成员的别的信息,特别是序列。例如,人TNF配体具有下述氨基酸序列:人淋巴毒素α(UniProt登录号P01374,SEQ ID NO:95),人TNF(UniProt登录号P01375,SEQ ID NO:96),人淋巴毒素β(UniProt登录号Q06643,SEQ ID NO:97),人OX40L(UniProt登录号P23510,SEQID NO:98),人CD40L(UniProt登录号P29965,SEQ ID NO:99),人FasL(UniProt登录号P48023,SEQ ID NO:100),人CD27L(UniProt登录号P32970,SEQ ID NO:101),人CD30L(UniProt登录号P32971,SEQ ID NO:102),4-1BBL(UniProt登录号P41273,SEQ ID NO:103),TRAIL(UniProt登录号P50591,SEQ ID NO:104),RANKL(UniProt登录号O14788,SEQID NO:105),TWEAK(UniProt登录号O43508,SEQ ID NO:106),APRIL(UniProt登录号O75888,SEQ ID NO:107),BAFF(UniProt登录号Q9Y275,SEQ ID NO:108),LIGHT(UniProt登录号O43557,SEQ ID NO:109),TL1A(UniProt登录号O95150,SEQ ID NO:110),GITRL(UniProt登录号Q9UNG2,SEQ ID NO:111)和外胚层发育异常蛋白A(UniProt登录号Q92838,SEQ ID NO:112)。
“外域”是膜蛋白中延伸入细胞外空间(即靶细胞以外的空间)的结构域。外域通常是蛋白质中启动与表面接触的部分,这导致信号转导。如此,如本文中定义的TNF配体家族成员的外域指TNF配体蛋白中延伸入细胞外空间的部分(细胞外结构域),但还包括负责三聚化和结合相应的TNF受体的更短部分或其片段。如此,术语“TNF配体家族成员的外域或其片段”指TNF配体家族成员中形成细胞外结构域的细胞外结构域或其仍然能够结合受体的部分(受体结合域)。
术语“共刺激性TNF配体家族成员”或“共刺激性TNF家族配体”指能够共刺激T细胞的增殖和细胞因子生成的TNF配体家族成员亚群。这些TNF家族配体能在与其相应的TNF受体相互作用时共刺激TCR信号,而且与其受体的相互作用导致TNFR相关因子(TRAF)的募集,这启动导致T细胞活化的信号传导级联。共刺激性TNF家族配体选自由4-1BBL,OX40L,GITRL,CD70,CD30L和LIGHT组成的组,更加特别地,共刺激性TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
如本文中之前描述的,4-1BBL是一种II型跨膜蛋白且是TNF配体家族的一个成员。已经描述了具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的完整或全长4-1BBL在细胞的表面上形成三聚体。通过4-1BBL的外域的特定基序而实现三聚体的形成。所述基序在本文中命名为“三聚化区”。人4-1BBL序列的氨基酸50-254(SEQ ID NO:113)形成4-1BBL的细胞外结构域,但是甚至其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中,术语“4-1BBL的外域或其片段”指具有选自SEQ ID NO:4(人4-1BBL的氨基酸52-254),SEQ ID NO:1(人4-1BBL的氨基酸71-254),SEQ ID NO:3(人4-1BBL的氨基酸80-254)和SEQ ID NO:2(人4-1BBL的氨基酸85-254)的氨基酸序列的多肽或具有选自SEQ ID NO:5(人4-1BBL的氨基酸71-248),SEQ IDNO:8(人4-1BBL的氨基酸52-248),SEQ ID NO:7(人4-1BBL的氨基酸80-248)和SEQ ID NO:6(人4-1BBL的氨基酸85-248)的氨基酸序列的多肽,但是能够三聚化的外域的其它片段也包括在本文中。
如本文中之前描述的,OX40L是另一种II型跨膜蛋白且是TNF配体家族的又一个成员。完整或全长人OX40L具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列。人OX40L序列的氨基酸51-183(SEQ ID NO:114)形成OX40L的细胞外结构域,但是甚至其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中,术语“OX40L的外域或其片段”指具有选自SEQ ID NO:114(人OX40L的氨基酸51-183)或SEQ ID NO:115(人OX40L的氨基酸52-183)的氨基酸序列的多肽,但是能够三聚化的外域的其它片段也包括在本文中。
术语“肽接头”指包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的肽。肽接头在本领域中是已知的或在本文中描述。合适的非免疫原性接头肽是例如(G4S)n,(SG4)n或G4(SG4)n肽接头,其中“n”一般是介于1和10之间,典型地介于1和4之间的数目,特别是2,即肽选自由GGGGS(SEQ ID NO:116),GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:117),SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:118),(G4S)3或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:119),GGGGSGGGGSGGGG或G4(SG4)2(SEQ ID NO:120),和(G4S)4或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:121)组成的组,但是还包括序列GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:122),GSGSGSGS(SEQ ID NO:123),GSGSGNGS(SEQ ID NO:124),GGSGSGSG(SEQ ID NO:125),GGSGSG(SEQ ID NO:126),GGSG(SEQ ID NO:127),GGSGNGSG(SEQ ID NO:128),GGNGSGSG(SEQ ID NO:129)和GGNGSG(SEQ ID NO:130)。特别感兴趣的肽接头是(G4S)1或GGGGS(SEQ ID NO:86),(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:117)和GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:112),更加特别是(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:117)。
如此申请内使用的术语“氨基酸”表示天然发生羧基α-氨基酸的组,包含丙氨酸(三字母代码:ala,单字母代码:A),精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp,D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gln,Q),谷氨酸(glu,E),甘氨酸(gly,G),组氨酸(his,H),异亮氨酸(ile,I),亮氨酸(leu,L),赖氨酸(lys,K),甲硫氨酸(met,M),苯丙氨酸(phe,F),脯氨酸(pro,P),丝氨酸(ser,S),苏氨酸(thr,T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr,Y),和缬氨酸(val,V)。
如本文中使用的“融合多肽”或“单一融合多肽”指由与抗原结合模块或Fc部分的一部分融合的所述TNF配体家族成员的一个或两个外域构成的单链多肽。融合可通过经由肽接头将抗原结合模块的N端或C端氨基酸与所述TNF配体家族成员的外域的C或N端氨基酸直接连接而发生。
“融合”或“连接”意味着各构件(例如多肽和所述TNF配体家族成员的外域)通过肽键,或是直接地或是经由一个或多个肽接头连接。
关于参照多肽(蛋白质)序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后,而且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域的技能内的多种方式实现,例如使用公众可得的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对需要的任何算法。然而,出于本文中的目的,使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写,而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局(Washington D.C.,20559),以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(South San Francisco,California)可得到ALIGN-2程序,或者可以自源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统,包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况中,给定氨基酸序列A相对于(to),与(with),或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含相对于,与,或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算:
100 乘 分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中打分为同一匹配的氨基酸残基的数目,且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况中,A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在某些实施方案中,涵盖本文中提供的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如,可能想要改善含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可通过将适宜修饰引入编码该分子的核苷酸序列,或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的删除,和/或插入和/或替代。可进行删除,插入,和替代的任何组合来得到最终的构建物,前提是最终的构建物拥有想要的特征,例如抗原结合。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和框架(FR)。保守替代在表B中在标题“优选替代”下提供且在下文中提及氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可将氨基酸替代引入感兴趣的分子并对产物筛选想要的活性,例如保留/改善的抗原结合,降低的免疫原性,或改善的ADCC或CDC。
表B
原始残基 例示性替代 优选替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以依照共同的侧链特性来分组:
(1)疏水性的:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性亲水性的:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的:Asp,Glu；
(4)碱性的:His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基:Gly,Pro；
(6)芳香族的:Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一类别。
术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中有氨基酸替代的实质性变体。一般地,为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗原结合分子会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力,降低的免疫原性)和/或会实质性保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体,其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之,将一个或多个HVR残基突变并将变体抗原结合分子在噬菌体上展示并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。在某些实施方案中,可以在一个或多个HVR内发生替代,插入,或删除,只要此类变化不实质性降低抗原结合分子结合抗原的能力。例如,可以在HVR中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如如本文中提供的保守替代)。一种对于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域有用的方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如由Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085描述的。在此方法中,鉴定残基或靶残基的组(例如带电荷的残基,诸如Arg,Asp,His,Lys,和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外,利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。作为替代的候选,可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有想要的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。分子的其它插入变体包括与延长含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的血清半衰期的多肽的N或C端的融合。
在某些实施方案中,改变本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或去除一个或多个糖基化位点来方便地获得分子的糖基化变体。在含有TNF配体三聚体的抗原结合分子包含Fc区的情况中,可改变附着于其的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的双触角寡糖,其一般通过N连接附着至Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright etal.,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物,例如甘露糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖,和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可进行含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中的寡糖的修饰以创建具有某些改良特性的变体。在一个方面,提供具有缺乏(直接或间接)附着于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的变体。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能,参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)或US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的别的变体包括那些具有两分寡糖的,例如,其中附着于Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc两分。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能,参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)。还提供附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能且在例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中描述。
在某些实施方案中,可能想要创建本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体,例如“thioMAb”,其中分子的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定实施方案中,替代的残基出现于分子的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,由此反应性硫醇基团放置在抗体的可及位点且可用于将抗体与其它模块诸如药物模块或接头-药物模块缀合以创建免疫缀合物。在某些实施方案中,可以用半胱氨酸替代任一个或多个下述残基:轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。
在某些方面,可一步修饰本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子以含有本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纤维素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(或是均聚物或是随机共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇,及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物的数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言,可基于下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的特定特性或功能,双特异性抗体衍生物是否会用于限定条件下的疗法,等。在另一个方面,提供抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam,N.W.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长的,而且包括但不限于对普通细胞没有损害,但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
在另一个方面,可获得本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与包括但不限于细胞毒剂在内的一个或多个异源分子缀合的抗体。
术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建物,例如信使RNA(mRNA),病毒衍生的RNA,或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键,诸如在肽核酸(PNA)中找到的)。术语“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸区段,例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已经自其天然环境移出的核酸分子,DNA或RNA。例如,出于本发明的目的,认为载体中包含的编码多肽的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中(部分或实质性)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但是该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物,以及正和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件,诸如启动子,核糖体结合位点,或转录终止子。
具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指除了该多核苷酸序列可包括至多该参照核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外,该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列同一。换言之,为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸,参照序列中至多5％的核苷酸可以删除或用另一种核苷酸替代,或者,在参照序列中,总核苷酸的至多5％的数目的多个核苷酸可插入参照序列。参照序列的这些改变可发生于参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方,或是在参照序列中的残基间个别散布或是以一个或多个连续组在参照序列内散布。实际上,使用已知的计算机程序,诸如上文关于多肽讨论的(例如ALIGN-2),可常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一。
术语“表达盒”指重组或合成生成的多核苷酸,具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列规定核酸元件。重组表达盒可并入质粒,染色体,线粒体DNA,质体DNA,病毒,或核酸片段。典型地,在其它序列以外,表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中,本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建物”同义且指用于将与其可操作联合的特定基因导入靶细胞并指导表达的DNA分子。该术语包括作为自身复制性核酸结构的载体以及并入其已经导入的宿主细胞的基因组的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体容许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体在靶细胞内,则由细胞转录和/或翻译机制生成由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。
术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用且指其中已经导入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体/转化子”和“转化细胞”,其包括原代转化细胞和自其衍生的后代,不管传代的次数。后代在核酸内容方面与亲本细胞可以不是完全同一,但是可含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体后代包括在本文中。宿主细胞是可用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,诸如CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞,和植物细胞,仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。
药剂的“有效量”指在接受其施用的细胞或组织中导致生理变化必需的量。
药剂(例如药用组合物)的“治疗有效量”指在剂量和时间段方面有效实现想要的治疗或预防结果必需的量。例如,治疗有效量的药剂消除,减轻/减少,延迟,最小化或预防疾病的不利影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬,和马),灵长类(例如人和非人灵长类,诸如猴),家兔,和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。特定地,个体或受试者是人。
术语“药用组合物”指其为此类形式的制剂,所述形式允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的,而且所述制剂不含另外的对会接受该配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的成分。
“药学可接受赋形剂”指药用组合物中除了活性组分以外,对受试者无毒的组分。药学可接受赋形剂包括但不限于缓冲剂,稳定剂,或防腐剂。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书,其含有关于关注此类治疗性产品的使用的适应症,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。
如本文中使用的,“治疗/处理”指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预,而且可以或是为了预防或是在临床病理学的过程中实施的。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,和消退或改善的预后。在一些实施方案中,使用本发明的分子来延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。
如本文中使用的术语“癌症”指增殖性疾病,诸如淋巴瘤,癌,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,白血病,淋巴细胞性白血病,肺癌,非小细胞肺(NSCL)癌,支气管肺泡细胞肺癌,骨癌,胰腺癌,皮肤癌,头或颈癌,皮肤或眼内黑素瘤,子宫癌,卵巢癌,直肠癌,肛门区癌,胃癌,胃的癌,结肠直肠癌(CRC),胰腺癌,乳腺癌,三重阴性乳腺癌,子宫癌,输卵管癌,子宫内膜癌,宫颈癌,阴道癌,外阴癌,霍奇金(Hodgkin)氏病,食管癌,小肠癌,内分泌系统的癌症,甲状腺癌,甲状旁腺癌,肾上腺癌,软组织肉瘤,尿道癌,阴茎癌,前列腺癌,膀胱癌,肾或输尿管癌,肾细胞癌,肾盂癌,间皮瘤,肝细胞癌,胆道癌,中枢神经系统(CNS)赘生物,脊索瘤,脑干胶质瘤,多形性成胶质细胞瘤,星形细胞瘤,施旺细胞瘤,室管膜瘤,成神经管细胞瘤,脑膜瘤,鳞状细胞癌,垂体腺瘤和尤因氏肉瘤,黑素瘤,多发性骨髓瘤,B细胞癌(淋巴瘤),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),急性成淋巴细胞性白血病(ALL),毛细胞白血病,慢性成髓细胞性白血病,包括任何上述癌症的顽固性形式,或一种或多种上述癌症的组合。
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子
本发明提供新颖的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其具有特别有利特性,诸如可生产性,稳定性,结合亲和力,生物学活性,靶向效率和降低的毒性。
在第一方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。
在一个特定方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段,和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在一个特定方面,该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段,其中该TNF配体家族成员共刺激人T细胞活化。
在另一个特定方面,该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段,其中该TNF配体家族成员的外域在所有情况中是同一的。
在又一个方面,提供的是如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
(i)该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有相应的CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,或
(ii)该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有相应的CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段,或
(iii)该第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且该第二多肽含有VL-CH1域或相应的VH-CL域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头与VH或VL且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
在另一个方面,提供的是如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
(i)该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有相应的CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,或
(ii)该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有相应的CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。
在一个方面,该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含选自4-1BBL和OX40L的共刺激人T细胞活化的TNF配体家族成员。更加特别地,该TNF配体家族成员是4-1BBL。
在另一个方面,其中该TNF配体家族成员的外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。更加特别地,该TNF配体家族成员的外域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在又一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
在一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且在于该第二多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在又一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列且在于该第二多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在另一个方面,该TNF配体家族成员是OX40L。在一个特定方面,提供的是含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该TNF配体家族成员的外域包含SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:115的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:114的氨基酸序列。
在另一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,
(b)含有CH1或CL域的第一多肽和含有相应的CL或CH1域的第二多肽,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,
且其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含通过肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。
在一个方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,
(b)含有CH1域的第一多肽和含有CL域的第二多肽,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,
且其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该CH1域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
在另一个方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,
(b)含有CL域的第一多肽和含有CH1域的第二多肽,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,
且其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
在另一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。
在还有另一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)超过一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽连接的所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。
在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)两个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。
在一个特定方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有相应的CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。特别地,此类含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够特异性结合靶细胞抗原的模块。
在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)两个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,
其中该两个能够特异性结合靶细胞抗原的模块结合两种不同靶细胞抗原。
在又一个方面,本发明提供如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合靶细胞抗原的模块选自由抗体,抗体片段和支架抗原结合蛋白组成的组。
在一个方面,提供的是如本文中之前描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块选自由抗体片段,Fab分子,交换Fab分子,单链Fab分子,Fv分子,scFv分子,单域抗体,aVH和支架抗原结合蛋白组成的组。在一个方面,该能够特异性结合PD1的模块是aVH或支架抗原结合蛋白。在一个方面,该能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合靶细胞抗原的支架抗原结合蛋白。
特别地,该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个或两个能够特异性结合PD1的模块。
在一个特定方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块是能够特异性结合PD1的Fab分子或交换Fab分子。特别地,该能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合PD1的Fab。
在又一个方面,提供的是依照本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的肽在其C端通过第二肽接头与重链的CH1域融合且其中所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段在其C端通过第三肽接头与轻链上的CL域融合。
在另一个方面,提供的是依照本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的肽在其C端通过第二肽接头与重链的CL域融合且其中所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段在其C端通过第三肽接头与轻链上的CH1域融合。
在又一个方面,本发明涉及依照本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的肽在其C端通过第二肽接头与轻链的CL域融合且其中所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段在其C端通过第三肽接头与重链的CH1域融合。
在一个特定方面,本发明涉及如上文定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该肽接头是(G4S)2。在一个方面,该第一肽接头是(G4S)2(SEQ ID NO:117),该第二肽接头是GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:122)且该第三肽接头是(G4S)2(SEQ ID NO:117)。特别地,本发明涉及如上文定义的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子,其中该第一肽接头是(G4S)2(SEQ ID NO:117),该第二肽接头是(G4S)2(SEQ ID NO:117),且该第三肽接头是(G4S)2(SEQ ID NO:117)。
在另一个方面,如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
特别地,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)能够特异性结合PD1的Fab分子,其中该Fab重链在C端与该Fc域中的CH2域的N端融合,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在又一个方面,该Fc域是IgG,特别是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。更加特别地,该Fc域是IgG1 Fc域。在一个特定方面,该Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。
降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc域由包含免疫球蛋白分子的重链域的一对多肽链组成。例如,免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体,其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。
Fc域对本发明的抗原结合分子赋予有利的药动学特性,包括有助于较好的在靶组织中的积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而,与此同时,这可能导致不想要的本发明的双特异性抗体对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。因而,在特定方面,与天然IgG1 Fc域相比,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc域展现降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个方面,Fc并不实质性结合Fc受体和/或并不诱导效应器功能。在一个特定方面,Fc受体是Fcγ受体。在一个方面,Fc受体是人Fc受体。在一个具体方面,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面,Fc域并不诱导效应器功能。降低的效应器功能可包括但不限于下述一种或多种:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,降低的对NK细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的树突细胞成熟,或降低的T细胞引发。
在某些方面,可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc区,由此生成Fc区变体。Fc区变体可包含包含一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4 Fc区)。
在一个特定方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段,和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中该Fc域包含一处或多处降低对Fc受体,特别是对Fcγ受体的结合的氨基酸替代。
在一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。典型地,在Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。特别是,Fc域包含位置E233,L234,L235,N297,P331和P329(EU编号方式)处的氨基酸替代。特别是,Fc域包含IgG重链的位置234和235(EU编号方式)和/或329(EU编号方式)处的氨基酸替代。更特别地,提供的是依照本发明的含有三聚体TNF家族配体的抗原结合分子,其包含具有IgG重链中的氨基酸替代L234A,L235A和P329G(“P329G LALA”,EU编号方式)的Fc域。氨基酸替代L234A和L235A指所谓的LALA突变。“P329G LALA”氨基酸替代组合几乎完全消除人IgG1 Fc域的Fcγ受体结合且在国际专利申请公开号WO 2012/130831 A1中描述,其还描述了制备此类突变体Fc域的方法及用于测定其特性诸如Fc受体结合或效应器功能的方法。“EU编号方式”指依照Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991的EU索引的编号方式。
具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有一个或多个Fc域残基238,265,269,270,297,327和329的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括具有两个或更多个氨基酸位置265,269,270,297和327处的替代的Fc突变体,包括具有残基265和297替代变成丙氨酸的替代的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
在另一个方面,Fc域是IgG4 Fc域。与IgG1抗体相比,IgG4抗体展现降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。在一个更具体方面,Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸替代,特别是氨基酸替代S228P的IgG4 Fc域。在一个更具体方面,Fc域是包含氨基酸替代L235E和S228P和P329G(EU编号方式)的IgG4 Fc域。此类IgG4 Fc域突变体和其Fcγ受体结合特性也在WO 2012/130831中描述。
突变体Fc域可使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除,替代,插入或修饰来制备。遗传方法可包括编码DNA序列的位点特异性诱变,PCR,基因合成,等等。正确的核苷酸变化可例如通过测序来验证。
对Fc受体的结合可例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪(GEHealthcare)的表面等离振子共振(SPR),和Fc受体(诸如可通过重组表达获得的)容易地测定。一种合适的此类结合测定法在本文中描述。或者,Fc域或包含Fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力可使用已知表达特定Fc受体的细胞系,诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来评估。
Fc域或包含Fc域的本发明的双特异性抗体的效应器功能可通过本领域已知方法来测量。一种合适的用于测量ADCC的测定法在本文中描述。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子在美国专利No.5,500,362；Hellstrom et al.,Proc Natl AcadSci USA83,7059-7063(1986)和Hellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann et al.,J Exp Med 166,1351-1361(1987)中描述。或者,可采用非放射性测定法方法(参见例如ACTITMnon-radioactivecytotoxicity assay for flow cytometry(CellTechnology,Inc.,Mountain View,CA)；和CytoToxnon-radioactive cytotoxicity assay(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可以在体内,例如在动物模型中评估感兴趣分子的ADCC活性,诸如Clynes et al.,Proc NatlAcad Sci USA95,652-656(1998)中公开的。
在一些实施方案中,Fc域对补体成分,具体是C1q的结合降低。因而,在其中将Fc域工程化改造成具有降低的效应器功能的一些实施方案中,所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定来确定本发明的双特异性抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化,可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J Immunol Methods202,163(1996)；Cragg et al.,Blood 101,1045-1052(2003)；和Cragg and Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
在一个特定方面,Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。
促进异二聚化的Fc域修饰
在一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中该Fc域包含一处或多处降低对Fc受体,特别是对Fcγ受体的结合的氨基酸替代。如此,它们包含与典型地包含在两条不相同多肽链(“重链”)中的Fc域的两个亚基之一或另一融合的不同模块。这些多肽的重组共表达和后续二聚化导致两条多肽的数种可能组合。为了改善重组生成中含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的产率和纯度,在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc域中引入促进想要的多肽的联合的修饰如此会是有利的。
因而,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此,所述修饰特别是在Fc域的CH3域中。
在一个具体方面,所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰,包含Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。如此,在一个特定方面,本发明涉及如本文中之前描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包括IgG分子,其中第一重链的Fc部分包含第一二聚化模块且第二重链的Fc部分包含第二二聚化模块,容许IgG分子的两条重链异二聚化,而且依照节入穴技术,第一二聚化模块包含节且第二二聚化模块包括穴。
“节-入-穴”技术在例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中描述。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得该隆起可放置在该空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与隆起相同或相似大小的补偿性空腔。
因而,在一个特定方面,在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc域的第一亚基的CH3域中将氨基酸残基用具有较大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的CH3域内生成隆起,其可放置在第二亚基的CH3域内的空腔中,并且在Fc域的第二亚基的CH3域中将氨基酸残基用具有较小侧链体积的氨基酸酸残基替换,由此在第二亚基的CH3域内生成空腔,其内可放置第一亚基的CH3域内的隆起。
可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成隆起和空腔。
在一个具体方面,在Fc域的第一亚基的CH3域中将位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),并且在Fc域的第二亚基的CH3域中将位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。更特别地,在Fc域的第二亚基中另外将位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)并将位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)。更特别地,在Fc域的第一亚基中另外将位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C),并且在Fc域的第二亚基中将位置349处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥。二硫桥进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个备选方面,促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰,例如如PCT公开文本WO 2009/089004中描述的。一般地,这种方法牵涉将两个Fc域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基用带电荷氨基酸残基替换,使得同二聚体形成变成在静电方面不利但异二聚化在静电方面有利。
CH1/CL域中的修饰
为了进一步改善正确配对,该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可含有不同的带电荷氨基酸替代(所谓的“带电荷残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉CH1和CL域。在一个特定方面,本发明涉及一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中在CL域之一中位置123(EU编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(R)替换且位置124(EU编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(K)替换,且其中在CH1域之一中位置147(EU编号方式)处和位置213(EU编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(E)替换。
更特别地,本发明涉及一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中在邻近该TNF配体家族成员的CL域中位置123(EU编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(R)替换且位置124(EU编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(K)替代,且其中在邻近该TNF配体家族成员的CH1域中位置147(EU编号方式)处和位置213(EU编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(E)替代。
如此,在一个特定方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,
(b)含有包含氨基酸突变E123R和Q124K的CL域的第一多肽和含有包含氨基酸突变K147E和K213E的CH1域的第二多肽,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,
且其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
特定的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子
在另一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
第一重链和第一轻链,二者构成能够特异性结合PD1的Fab分子,
第一肽,其包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段,在其C端通过第二肽接头与第二重或轻链融合,
和第二肽,其包含所述TNF配体家族成员的一个外域,在其C端通过第三肽接头与相应的第二轻或重链融合。
在又一个方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的第一肽在其C端通过第二肽接头与作为重链一部分的CH1域融合,且该包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链一部分的CL域融合。
在还有另一个方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的第一肽在其C端通过第二肽接头与作为重链一部分的CL域融合,且该包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链一部分的CH1域融合。
在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中在邻近该TNF配体家族成员的CL域中位置123(EU编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(R)替换且位置124(EU编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(K)替代,且其中在邻近该TNF配体家族成员的CH1域中位置147(EU编号方式)处和位置213(EU编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(E)替代。这些修饰导致所谓的带电荷残基,其具有避免不想要的结果诸如例如错配的有利特性。
特别地,该CL域包含氨基酸突变E123R和Q124K且该CH1域包含氨基酸突变K147E和K213E。
在一个方面,本发明提供如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块是支架抗原结合蛋白。
在一个特定方面,本发明涉及如上文定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。
本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含至少一个能够特异性结合PD1的模块。在一个特定方面,该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个能够特异性结合PD1的模块,意味着该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子是单价的。在另一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含两个能够特异性结合PD1的模块,意味着该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子是二价的。
在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3,
(b)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3,
(c)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3,
(d)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HVR-L3,
(e)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HVR-L3,
(f)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-L3,或
(g)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-L3。
在又一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL域,
(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL域,
(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL域,
(d)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL域,
(e)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL域,
(f)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL域,
(g)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL域,
(h)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL域,
(i)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL域,
(k)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL域,或
(l)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL域。
在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个特定方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL域,
(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL域,
(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL域,
(d)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL域,或
(e)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL域。
在又一个方面,该能够特异性结合PD1的模块包含包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面,该能够特异性结合PD1的模块包含包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个方面,提供的是如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的可变轻链或其中该能够特异性结合PD1的模块包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的可变轻链。
在一个特定方面,该能够特异性结合PD1的模块包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个特定方面,该能够特异性结合PD1的模块包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体方面,该能够特异性结合PD1的模块包含由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的VH域和由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的VL域或由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成的VH域和由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成的VL域。
在又一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,其包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区或包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区,和
(b)第二重链,其包含选自由SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:10组成的组的氨基酸序列,和
第二轻链,其包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
在一个特定方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,其包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区或包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列且该第二多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在又一个方面,提供的是如本文中之前描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)第一重链和第一轻链,二者构成能够特异性结合PD1的Fab分子,
(b)第二重链,其包含选自由SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:10组成的组的氨基酸序列,和
第二轻链,其包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含(a)能够特异性结合PD1的Fab分子,去包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区或包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区,和
(b)第二重链,其包含选自由SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:10组成的组的氨基酸序列,和
第二轻链,其包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)(i)包含包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域的第一重链和包含包含SEQID NO:20的氨基酸序列的VL域的第一轻链或
包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域的第一重链和包含包含选自由SEQID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组的氨基酸序列的VL域的第一轻链,和
(b)第二重链,其包含选自由SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:10组成的组的氨基酸序列,和
第二轻链,其包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
在一个特定方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(i)包含包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域的第一重链和包含包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的VL域的第一轻链或
包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域的第一重链和包含包含选自由SEQID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组的氨基酸序列的VL域的第一轻链,
(ii)包含选自由SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:80组成的组的氨基酸序列的第二重链,和
(iii)包含选自由SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81组成的组的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的第二轻链,
(b)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的第二轻链,
(c)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的第二轻链,或
(d)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的第二轻链。
在又一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的第二轻链,
(b)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的第二轻链,
(c)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的第二轻链,或
(d)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的第二轻链。
特别地,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的第二轻链。
在又一个特定方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的第二轻链。
在还有另一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有相应的CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
特别地,此类含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够特异性结合PD1的Fab域。
特别地,提供的是如本文中之前描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的第二重链,和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的两条轻链,或
(b)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的第二重链,和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的两条轻链。
在又一个方面,提供的是如本文中之前描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的第二重链,和包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的两条轻链,或
(b)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的第二重链,和包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的两条轻链。
在另一个特定方面,本发明提供如本文中之前描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个能够特异性结合PD1的Fab域。
在此类方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(i)融合多肽,其包含Fc域的第一亚基和通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段,(ii)重链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VH域,该Fc域的第二亚基和经由肽接头与该CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,和(iii)轻链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VL域,或
(i)融合多肽,其包含Fc域的第一亚基和通过肽接头与该CH3域的C端连接的TNF配体家族成员的一个外域或其片段,(ii)重链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VH域,该Fc域的第二亚基和经由肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的所述TNF配体家族成员的两个外域或其片段,和(iii)轻链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VL域。
在一个特定方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的轻链,
(b)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的轻链,
(c)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的轻链,或
(d)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的轻链。
在另一个特定方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链,
(b)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链,
(c)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链,或
(d)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链。
多核苷酸
本发明进一步提供分离的多核苷酸,其编码如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其片段。
该分离的编码本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的多核苷酸可以作为编码整个抗原结合分子的单一多核苷酸或作为共表达的多种(例如两种或更多种)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性抗原结合分子。例如,免疫球蛋白的轻链部分与免疫球蛋白的重链部分可以由分开的多核苷酸编码。当共表达时,重链多肽会与轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。
在一些方面,该分离的多核苷酸编码整个依照如本文中描述的发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。特别地,该分离的多核苷酸编码该依照如本文中描述的发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中包含的多肽。
在一个方面,本发明涉及分离的多核苷酸,其编码一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该多核苷酸包含(a)编码能够特异性结合DP1的模块的序列,(b)编码包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或两个其片段的多肽的序列和(c)编码包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段的多肽的序列。
在另一个方面,提供的是一种分离的多核苷酸,其编码含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子,其中该多核苷酸包含(a)编码能够特异性结合PD1的模块的序列,(b)编码包含通过肽接头彼此连接的4-1BBL的两个外域或两个其片段的多肽的序列和(c)编码包含4-1BBL一个外域或其片段的多肽的序列。
在又一个方面,本发明涉及一种分离的多核苷酸,其包含编码包含两个4-1BBL片段的多肽的序列,该4-1BBL片段包含与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中显示的氨基酸序列至少约90％,95％,98％或100％同一的氨基酸序列,且涉及多核苷酸,其包含编码包含一个4-1BBL片段的多肽的序列,该4-1BBL片段包含与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中显示的氨基酸序列至少约90％,95％,98％或100％同一的氨基酸序列。
而且,提供的是一种分离的多核苷酸,其编码一种含有OX40配体三聚体的抗原结合分子,其中该多核苷酸包含(a)编码能够特异性结合PD1的模块的序列,(b)编码包含通过肽接头彼此连接的OX40L的两个外域或两个其片段的多肽的序列和(c)编码包含OX40L的一个外域或其片段的多肽的序列。
在又一些方面,本发明涉及一种多核苷酸,其包含与本文中公开的具体cDNA序列至少约90％,95％,98％或100％同一的序列。在一个特定方面,本发明涉及一种多核苷酸,其包含与本文中公开的具体cDNA序列之一同一的序列。
在其它方面,该核酸分子包含编码如SEQ ID NO:19,20,21,22,23,24,25,32,33,40,41,48,49,56,57,64,65,72或73中任一列出的氨基酸序列的核苷酸序列或由其组成。在又一个方面,该核酸分子包含编码如SEQ ID NO:9,10,11或12中任一列出的氨基酸序列的核苷酸序列或由其组成。
在仍有其它方面,该核酸分子包含选自由SEQ ID NO:131,132,133,134,135,136,137,138,139,140,141,142,143,144,145,146,147,148,149或150组成的组的核苷酸序列或由其组成。
在某些方面,该多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中,本发明的多核苷酸是RNA,例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链的或双链的。
重组方法
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可通过例如固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生成来获得。对于重组生成,分离编码例如如上文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的一种或多种多核苷酸并插入一个或多个载体供进一步克隆和/或宿主细胞中的表达。此类多核苷酸可使用常规规程容易地分离和测序。在本发明的一个方面,提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体,优选表达载体。可使用本领域技术人员公知的方法来构建含有含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子(片段)的编码序列连同适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术,合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如Maniatis et al.,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)中描述的技术。表达载体可以是病毒,质粒的部分,或者可以是核酸片段。表达载体包括其中与启动子和/或其它转录或翻译控制元件可操作联合地克隆编码含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)的表达盒。如本文中使用的,“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的部分。虽然“终止密码子”(TAG,TGA,或TAA)不翻译成氨基酸,但是如果存在的话,它可考虑作为编码区的一部分,但是任何侧翼序列,例如启动子,核糖体结合位点,转录终止子,内含子,5’和3’非翻译区,等等不是编码区的部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建物中,例如在单个载体上,或在分开的多核苷酸构建物中,例如在分开的(不同的)载体上。而且,任何载体可含有单个编码区,或者可包含两个或更多个编码区,例如,本发明的载体可编码一种或多种多肽,其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译地分开成最终的蛋白质。另外,本发明的载体,多核苷酸,或核酸可编码异源编码区,或是与编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段,或其变体或衍生物的多核苷酸融合或是不融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序,诸如分泌信号肽或异源功能域。可操作联合是这样一种方式,当基因产物,例如多肽的编码区与一种或多种调节序列这样联合时,将基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码想要的基因产物的mRNA转录的话且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力的话,两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其联合的启动子)是“可操作联合的”。如此,如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录的话,启动子区与该核酸会是可操作联合的。启动子可以是仅仅在预定细胞中指导DNA实质性转录的细胞特异性启动子。在启动子以外,其它转录控制元件,例如增强子,操纵基因,阻抑物,和转录终止信号可与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。
本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员知道的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区,诸如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子,连同内含子A),猿病毒40(例如早期启动子),和逆转录病毒(诸如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因诸如肌动蛋白,热休克蛋白,牛生长激素和兔α珠蛋白衍生的,以及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地,多种翻译控制元件是本领域普通技术人员知道的。这些包括但不限于核糖体结合位点,翻译起始和终止密码子,和自病毒系统衍生的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES,也称作CITE序列)。表达盒还可包括其它特征,诸如复制起点,和/或染色体整合元件,诸如逆转录病毒长末端重复(LTR),或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌或信号肽(其指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌)的编码区联合。例如,如果想要分泌含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的话,可以将编码信号序列的DNA放置在编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。依照信号假说,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,其在一旦启动生长中的蛋白质链输出穿过粗面内质网时自成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽的N端融合的信号肽,其自翻译的多肽切割下来以生成分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中,使用天然信号肽,例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽,或该序列保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者,可使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如,野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原活化物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替代。
编码可用于推动稍后纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的DNA可以包括在编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。
在本发明的又一个方面,提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中,提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体分别可单一地或组合地并入本文中关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面,宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子(的一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的,术语“宿主细胞”指可以工程化改造以生成本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域公知的。可以用特定的表达载体适当地转染或转导此类细胞,并且可以培养大量的含有载体的细胞供接种大规模发酵罐以获得足够数量的抗原结合分子供临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物,诸如大肠杆菌,或各种真核细胞,诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,昆虫细胞,等等。例如,特别是在不需要糖基化时,可以在细菌中生成多肽。表达后,多肽可以在可溶性级分中自细菌细胞糊分离且可以进一步纯化。在原核生物以外,真核微生物诸如丝状真菌或酵母对于编码多肽的载体是合适的克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已经“人源化”,导致生成具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004),和Li et al.,Nat Biotech 24,210-215(2006)。
对于表达(糖基化)多肽合适的宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞联合使用,特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的众多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978,和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如,适应在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7),人胚肾细胞系(例如Graham et al.,J Gen Virol 36,59(1977)中描述的293或293T细胞),幼仓鼠肾细胞(BHK),小鼠塞托利(Sertoli)细胞(如例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中描述的TM4细胞),猴肾细胞(CV1),非洲绿猴肾细胞(VERO-76),人宫颈癌细胞(HELA),犬肾细胞(MDCK),牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A),人肺细胞(W138),人肝细胞(Hep G2),小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562),TRI细胞(如例如Mather et al.,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中描述的),MRC 5细胞,和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括dhfr-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如YO,NS0,P3X63和Sp2/0。关于适合于蛋白质生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,细菌细胞和植物细胞,在此仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,优选哺乳动物细胞,诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0,NS0,Sp20细胞)。在这些系统中表达外来基因的标准技术是本领域已知的。可以工程化改造表达包含免疫球蛋白重链或轻链任一的多肽的细胞,从而还表达另一条免疫球蛋白链,使得所表达的产物是具有重和轻链二者的免疫球蛋白。
在一个方面,提供一种生成本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的方法,其中该方法包含在适于本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段表达的条件下培养如本文中提供的包含编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞,和自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段。
在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中,各构件(至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块,一条包含TNF配体家族成员的两个外域或其片段的多肽和一条包含所述TNF家族配体家族成员的一个外域或其片段的多肽)在遗传上并非彼此融合。多肽设计成使得其构件(TNF配体家族成员的两个外域或其片段和其它构件诸如CH或CL)直接地或经由接头序列彼此融合。可以依照本领域公知的方法确定接头的组成和长度,而且可以测试功效。本发明的抗原结合分子的不同构件之间的接头序列的例子见本文中提供的序列。如果想要的话,还可以包括另外的序列以掺入切割位点以分开融合蛋白的各个构件,例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中,形成抗原结合分子的一部分的能够特异性结合靶细胞抗原的模块(例如Fab片段)至少包含能够结合抗原的免疫球蛋白可变区。可变区可形成天然或非天然发生的抗体和其片段的一部分且自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域公知的(参见例如Harlow and Lane,"Antibodies,a laboratory manual",ColdSpring Harbor Laboratory,1988)。非天然发生抗体可以使用固相肽合成来构建,可以重组生成(例如如美国专利No.4,186,567中描述的)或可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如授予McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
任何动物物种的免疫球蛋白均可在本发明中使用。在本发明中有用的非限制性免疫球蛋白可以是鼠,灵长类,或人起源的。如果融合蛋白旨在供人使用的话,可使用嵌合形式的免疫球蛋白,其中免疫球蛋白的恒定区来自人。还可依照本领域公知的方法制备人源化或完全人形式的免疫球蛋白(参见例如授予Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可通过多种方法来实现,包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上,有或没有保留关键框架残基(例如那些对于保留优秀的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基),(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上,或(c)移植整个非人可变域,但通过替换表面残基用人样区段“遮盖”它们。人源化抗体和生成它们的方法在例如Almagro andFransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中综述,而且在例如Riechmann et al.,Nature 332,323-329(1988)；Queen et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Jones et al.,Nature 321,522-525(1986)；Morrison et al.,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen et al.,Science239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri et al.,Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua et al.,Methods 36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn et al.,Methods 36,61-68(2005)和Klimka et al.,Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述用于FR改组的“导向选择”办法)中进一步描述。依照本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。人抗体和人可变区可使用本领域已知的多种技术来生成。人抗体在vanDijk and van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr OpinImmunol 20,450-459(2008)中一般性描述。人可变区能形成通过杂交瘤方法生成的人单克隆抗体的一部分且自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人抗体和人可变区还可以通过将免疫原施用于已经修饰以响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。人抗体和人可变区还可以通过分离自人衍生噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变区序列来生成(参见例如Hoogenboom et al.,in Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty et al.,Nature348,552-554；Clackson et al.,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体典型地或是以单链Fv(scFv)片段或是作为Fab片段展示抗体片段。
在某些方面,依照例如PCT公开文本WO 2012/020006(参见关于亲和力成熟的实施例)或美国专利申请公开文本No.2004/0132066中公开的方法工程化改造本发明的抗原结合分子中包含的能够特异性结合靶细胞抗原的模块(例如Fab片段)以具有增强的结合亲和力。本发明抗原结合分子结合特定抗原性决定簇的能力可经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振技术(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000))),和传统的结合测定法(Heeley,EndocrRes 28,217-229(2002))。可使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施方案中,此类竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与参照抗原结合分子结合的相同。用于抗原结合分子结合的表位的作图的详细的例示性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,in Methods in MolecularBiology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中,在包含结合抗原的第一经标记抗原结合分子和第二未标记抗原结合分子(测试其与第一抗原结合分子竞争结合抗原的能力)的溶液中温育固定化抗原。第二抗原结合分子可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照,在包含第一经标记抗原结合分子但不包含第二未标记抗原结合分子的溶液中温育固定化抗原。在允许第一抗体与抗原结合的条件下温育后,去除过量的未结合的抗体,并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果在测试样品中与固定化抗原联合的标记物的量相对于对照样品实质性降低,那么这指示第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合抗原。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manualch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
如本文中所述制备的本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子可通过本领域已知的技术来纯化,诸如高效液体层析术,离子交换层析术,凝胶电泳,亲和层析术,大小排阻层析术,等等。用于纯化特定蛋白质的实际条件会部分取决于诸如净电荷,疏水性,亲水性等因素,而且对于本领域技术人员会是显而易见的。对于亲和层析术纯化,可使用结合含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的抗体,配体,受体或抗原。例如,对于本发明的融合蛋白的亲和层析术纯化,可使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以本质上如实施例中所述使用顺序蛋白A或G亲和层析术和大小排阻层析术来分离抗原结合分子。含有TNF配体三聚体的抗原结合分子或其片段的纯度可通过多种公知的分析方法任一来测定,包括凝胶电泳,高压液体层析术,等等。例如,如实施例中所述表达的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子显示是完整的且正确装配的,如通过还原性和非还原性SDS-PAGE证明的。
测定法
本文中提供的抗原结合分子可通过本领域已知的多种测定法来鉴定,筛选,或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。生物学活性可包括例如增强不同免疫细胞,尤其是T细胞的活化和/或增殖的能力。例如,它们增强免疫调控性细胞因子(例如干扰素-伽马(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα))的分泌。增强的或能增强的其它免疫调控性细胞因子是例如IL12,粒酶B等。生物学活性还可包括食蟹猴结合交叉反应性,以及对不同细胞类型的结合。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗原结合分子。
1.亲和力测定法
本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子对相应的TNF受体的亲和力可依照实施例中提出的方法通过表面等离振子共振(SPR),使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare),和受体或靶蛋白(诸如可通过重组表达获得的)来测定。含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子对PD1的亲和力也可以通过表面等离振子共振(SPR),使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare),和受体或靶蛋白(诸如可通过重组表达获得的)来测定。用于测量结合亲和力的一种具体的说明性和例示性实施方案在实施例4中描述。依照一个方面,于25℃使用T100机器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振测量KD。
2.结合测定法和其它测定法
本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子对相应的表达受体的细胞的结合可例如通过流式细胞术(FACS),使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估。在一个方面,在结合测定法中使用表达TNF受体的新鲜外周血单个核细胞(PBMC)。在分离后(幼稚PMBC)或刺激后(活化的PMBC)直接使用这些细胞。在另一个方面,使用活化的小鼠脾细胞(表达TNF受体分子)来证明本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子对相应的表达TNF受体的细胞的结合。
在又一个方面,使用表达PD1的细胞系来证明抗原结合分子对此靶细胞抗原的结合。
在另一个方面,可以使用竞争测定法来鉴定与具体抗体或抗原结合分子分别竞争结合靶或TNF受体的抗原结合分子。在某些实施方案中,此类竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与具体抗靶抗体或具体抗TNF受体抗体结合的相同。用于抗体结合的表位的作图的详细例示性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,inMethods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。
3.活性测定法
在一个方面,提供用于鉴定具有生物学活性的结合具体靶细胞抗原和具体TNF受体的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的测定法。生物学活性可包括例如经由表达靶细胞抗原的细胞上的TNF受体的激动性信号传导。还提供通过该测定法鉴定为在体外具有此类生物学活性的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
在某些方面,对本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子测试此类生物学活性。用于检测本发明的分子的生物学活性的测定法是实施例5和6中描述的那些。而且,用于检测细胞裂解(例如通过测量LDH释放),诱导的凋亡动力学(例如通过测量胱天蛋白酶3/7活性)或凋亡(例如使用TUNEL测定法)的测定法是本领域公知的。另外,此类复合物的生物学活性可通过评估它们对多种淋巴细胞子集诸如NK细胞,NKT细胞或γδT细胞的存活,增殖和淋巴因子分泌的影响或评估它们调控抗原呈递细胞诸如树突细胞,单核细胞/巨噬细胞或B细胞的表型和功能的能力来评估。
药用组合物,配制剂和施用路径
在又一个方面,本发明提供药用组合物,其包含本文中提供的任何含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,例如供任何下述治疗方法中使用。在一个实施方案中,药用组合物包含本文中提供的任何含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中,药用组合物包含本文中提供的任何含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种例如如下文描述的另外的治疗剂。
本发明的药用组合物包含溶解或分散在药学可接受赋形剂中的治疗有效量的一种或多种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。短语“药用或药学可接受”指在采用的剂量和浓度一般对接受者无毒,即在适当施用于动物,诸如例如人时不产生不利的,变应性的或其它不想要的反应的分子实体和组合物。含有至少一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和任选地另外的活性组分的药用组合物的制备会是本领域技术人员根据本公开内容知道的,如由Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack PrintingCompany,1990例示的,通过援引收入本文。特别地,组合物是冻干配制剂或水溶液。如本文中使用的,“药学可接受赋形剂”包括任何和所有溶剂,缓冲剂,分散介质,包衣,表面活性剂,抗氧化剂,防腐剂(例如抗细菌剂,抗真菌剂),等张剂,盐,稳定剂和其组合,正如本领域普通技术人员会知道的。
胃肠外组合物包括那些为通过注射,例如皮下,皮内,损害内,静脉内,动脉内,肌肉内,鞘内或腹膜内注射的施用而设计的。对于注射,可以在水溶液中,优选在生理学相容缓冲液诸如汉克斯(Hanks)氏溶液,林格(Ringer)氏溶液,或生理盐水缓冲液中配制本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。溶液可含有配制用剂,诸如悬浮,稳定和/或分散剂。或者,融合蛋白可处于粉末形式,供在使用前用合适的媒介,例如无菌无热原水建构。根据需要,通过与下文列举的多种其它组分一起以要求的量在适宜的溶剂中掺入本发明的融合蛋白来制备无菌可注射溶液。无菌性可例如通过穿过无菌滤膜过滤而容易地实现。一般地,通过将多种经过灭菌的活性组分掺入含有基础分散介质和/或其它组分的无菌媒介中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液,悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况中,优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术,其自其先前无菌过滤的液体介质产生活性组分加任何另外的想要的组分的粉末。液体介质在必要时应当适当缓冲且在注射前首先用足够的盐水或葡萄糖使得液体稀释剂变成等张。组合物在制造和贮存条件下必须是稳定的,而且针对微生物,诸如细菌和真菌的污染作用防腐。会领会的是,内毒素污染应当最低限度保持在安全水平,例如小于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受赋形剂包括但不限于:缓冲剂,诸如磷酸盐,柠檬酸盐,和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚,丁或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质,诸如血清清蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖,二糖,和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖,或糊精；螯合剂,诸如EDTA；糖,诸如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子,诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂,诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有提高悬浮液的粘度的化合物,诸如羧甲基纤维素钠,山梨醇,右旋糖酐,等等。任选地,悬浮液还可含有合适的稳定剂或提高化合物的溶解度以容许制备高度浓缩溶液的药剂。另外,活性化合物的悬浮液可制备为适宜的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油诸如芝麻油,或合成脂肪酸酯,诸如油酸乙酯或甘油三酯,或脂质体。
可以将活性组分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊),在胶体药物投递系统(例如脂质体,清蛋白微球体,微乳液,纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质,所述基质处于成形物品的形式,例如薄膜,或微胶囊。在特定实施方案中,通过在组合物中使用延迟吸收的药剂,诸如例如单硬脂酸铝,明胶或其组合,可带来延长的可注射组合物的吸收。
本文中的例示性药学可接受赋形剂进一步包括间质药物分散剂,诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白,诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)在美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968中描述。在一个方面,将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性冻干抗体配制剂在美国专利No.6,267,958中描述。水性抗体配制剂包括美国专利No.6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些,后者的配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
在先前描述的组合物以外,融合蛋白还可配制成贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。如此,例如,融合蛋白可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂,或作为微溶衍生物,例如作为微溶盐配制。
包含本发明的融合蛋白的药用组合物可依靠常规混合,溶解,乳化,封装,包埋或冻干工艺来制造。可以使用推动将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学可接受载剂,稀释剂,赋形剂或助剂以常规方式配制药用组合物。适当的配制剂取决于所选择的施用路径。
可以以游离酸或碱,中性或盐形式将含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子配制成组合物。药学可接受盐是实质性保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐,例如那些与蛋白质性质组合物的游离氨基形成的或那些与无机酸诸如例如盐酸或磷酸,或有机酸诸如乙酸,草酸,酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱,诸如例如氢氧化钠,钾,铵,钙或铁；或有机碱,诸如异丙胺,三甲胺,组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比,药用盐趋于在水性和其它质子溶剂中溶解度更高。
在所治疗的特定适应症需要时,本文中的组合物还可含有超过一种活性组分,优选那些具有彼此没有不利影响的互补活性的。此类活性组分以对于预定目的有效的量适当地组合存在。
要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可例如通过穿过无菌滤膜过滤而容易地实现。
治疗方法和组合物
本文中提供的任何含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子均可在治疗方法中使用。
为了在治疗方法中使用,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以以符合优秀医学实践的方式配制,定剂量和施用。在这种背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症,所治疗的特定哺乳动物,患者个体的临床状况,病症的起因,药剂的投递部位,施用方法,施用进度表,和医学从业人员知道的其它因素。
在一个方面,提供供作为药物使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在别的方面,提供供在治疗疾病中使用,特别是供在治疗癌症中使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在某些方面,提供供在治疗方法中使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个方面,本发明提供供在有所需要的个体中治疗疾病中使用的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在某些方面,本发明提供供在治疗具有疾病的个体的方法中使用的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,该方法包含对该个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些方面,要治疗的疾病是癌症。癌症的例子包括实体瘤,膀胱癌,肾细胞癌,脑癌,头和颈癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,宫颈癌,子宫内膜癌,食管癌,结肠癌,结肠直肠癌,直肠癌,胃癌,前列腺癌,血癌,皮肤癌,鳞状细胞癌,骨癌,和肾癌,黑素瘤,B细胞淋巴瘤,B细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤和急性成淋巴细胞性白血病。如此,提供供在治疗癌症中使用的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。需要治疗的受试者,患者,或“个体”典型地是哺乳动物,更具体地是人。
在另一个方面,提供的是供在治疗感染性疾病,特别是供治疗病毒感染中使用的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在又一个方面,提供供治疗自身免疫疾病,诸如例如狼疮疾病中使用的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
在又一个方面,本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于在有所需要的个体中治疗疾病的药物中的用途。在一个方面,该药物供在治疗疾病的方法中使用,该方法包含对具有该疾病的个体施用治疗有效量的该药物。在某些实施方案中,要治疗的疾病是增殖性病症,特别是癌症。如此,在一个方面,本发明涉及本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗癌症的药物中的用途。癌症的例子包括实体瘤,膀胱癌,肾细胞癌,脑癌,头和颈癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,宫颈癌,子宫内膜癌,食管癌,结肠癌,结肠直肠癌,直肠癌,胃癌,前列腺癌,血癌,皮肤癌,鳞状细胞癌,骨癌,和肾癌,黑素瘤,B细胞淋巴瘤,B细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤和急性成淋巴细胞性白血病。使用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以治疗的其它细胞增殖病症包括但不限于位于腹部,骨,乳腺,消化系统,肝,胰腺,腹膜,内分泌腺(肾上腺,甲状旁腺,垂体,睾丸,卵巢,胸腺,甲状腺),眼,头和颈,神经系统(中枢和周围),淋巴系统,骨盆,皮肤,软组织,脾,胸区,和泌尿生殖系统中的赘生物。还包括的是癌前状况或损害和癌症转移。在某些实施方案中,癌症选自由肾细胞癌,皮肤癌,肺癌,结肠直肠癌,乳腺癌,脑癌,头和颈癌组成的组。技术人员可认识到在一些情况中含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可能不提供治愈但可能仅提供部分益处。在一些方面,具有一些益处的生理变化也认为是治疗上有益的。如此,在一些方面,提供生理变化的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的量认为是“有效量”或“治疗有效量”。
在又一个方面,本发明涉及如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗感染性疾病,特别是用于治疗病毒感染或用于治疗自身免疫疾病,例如狼疮疾病的药物中的用途。
在又一个方面,本发明提供一种用于在个体中治疗疾病的方法,该方法包含对所述个体施用治疗有效量的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个方面,对所述个体施用包含处于药学可接受形式的本发明的融合蛋白的组合物。在某些方面,要治疗的疾病是增殖性病症。在一个特定方面,该疾病是癌症。在另一个方面,该疾病是感染性疾病或自身免疫疾病。在某些方面,该方法进一步包含对该个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂,如果要治疗的疾病是癌症的话。依照任何上述实施方案的“个体”可以是哺乳动物,优选人。
为了预防或治疗疾病,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的适宜剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)会取决于要治疗的疾病的类型,施用路径,患者的体重,抗原结合分子的类型,疾病的严重程度和过程,施用融合蛋白是出于预防还是治疗目的,先前或并行的治疗性干预,患者的临床史和对融合蛋白的响应,和主治医师的斟酌。在任何情况下,负责施用的从业人员会决定组合物中活性组分的浓度和对于受试者个体适宜的剂量。本文中涵盖各种剂量给药进度表,包括但不限于在多个时间点上的多次或单次施用,推注施用,和脉冲输注。
以一次或以一系列治疗适当地将含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子施用于患者。取决于疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以是用于对患者施用的初始候选剂量,例如无论是通过一次或多次分开的施用,还是通过连续输注。取决于上面提到的因素,一种典型的日剂量可能范围为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长的反复施用,取决于状况,治疗一般会持续直至发生想要的疾病症状的遏制。融合蛋白的一种例示性剂量会在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围中。在其它例子中,剂量还可以包含每次施用自约1μg/kg体重,约5μg/kg体重,约10μg/kg体重,约50μg/kg体重,约100μg/kg体重,约200μg/kg体重,约350μg/kg体重,约500μg/kg体重,约1mg/kg体重,约5mg/kg体重,约10mg/kg体重,约50mg/kg体重,约100mg/kg体重,约200mg/kg体重,约350mg/kg体重,约500mg/kg体重,至约1000mg/kg体重或更多,和其中可派生的任何范围。在自本文中列出的数字可派生的范围的例子中,基于上文描述的数字,可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重,约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等范围。如此,可以将约0.5mg/kg,2.0mg/kg,5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一或多剂施用于患者。此类剂量可以间歇施用,例如每周或每三周(例如,使得患者接受约2剂至约20剂,或例如约6剂融合蛋白)。可以施用一个初始的较高加载剂量,接着是一个或多个较低剂量。然而,其它剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展容易通过常规技术和测定法来监测。
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子一般会以有效实现预定目的的量使用。对于治疗或预防疾病状况的用途,以治疗有效量施用或应用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其药用组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内,尤其是根据本文中提供的详细公开内容。
对于系统施用,可以首先自体外测定法,诸如细胞培养物测定法估算治疗有效剂量。然后可以在动物模型中确定实现包括如在细胞培养物中确定的IC50的循环浓度范围的剂量。此类信息可以用于更精确地确定在人中有用的剂量。
也可以使用本领域公知的技术自体内数据(例如动物模型)估算初始剂量。本领域普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。
可以个别地调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量范围为约0.1至50mg/kg/天,典型地是约0.5至1mg/kg/天。治疗有效血浆水平可以通过每天施用多剂来实现。血浆中的水平可以例如通过HPLC来测量。
在局部施用或选择性摄取的情况中,含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员会能够优化治疗有效局部剂量而无需过度实验。
本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的治疗有效剂量一般会提供治疗益处而不引起实质性毒性。融合蛋白的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来确定。可使用细胞培养物测定法和动物研究来确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗上有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数,它可以表述为比率LD50/ED50。展现较大治疗指数的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子是优选的。在一个实施方案中,依照本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子展现高治疗指数。自细胞培养物测定法和动物研究获得的数据可以在配制适合于在人中使用的剂量范围中使用。剂量优选在具有很小或没有毒性的包括ED50的循环浓度范围内。剂量可以在这个范围内取决于多种因素而变化,例如所采用的剂型,所利用的施用路径,受试者的状况,等等。考虑到患者的状况,确切的配制剂,施用路径和剂量可以由医师个体选择(参见例如Fingl et al.,1975,in:The Pharmacological Basis ofTherapeutics,Ch.1,p.1,通过援引完整收入本文)。
用本发明的融合蛋白治疗的患者的主治医师会知道如何和何时由于毒性,器官功能障碍,等等而终止,中断,或调整施用。相反,如果临床反应不足(排除毒性),主治医师也会知道将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中施用的剂量的大小会随着要治疗的状况的严重程度,施用路径,等等而变化。状况的严重程度可以例如部分地通过标准预后评估方法来评估。而且,剂量和可能剂量频率也会依照患者个体的年龄,体重,和响应而变化。
其它药剂和治疗
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以在疗法中与一种或多种其它药剂组合施用。例如,本发明的融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖可以为了在需要此类治疗的个体中治疗症状或疾病而施用的任何药剂。此类另外的治疗剂可包含任何适合于所治疗的特定适应症的活性组分,优选那些具有彼此没有不利影响的互补活性的。在某些实施方案中,另外的治疗剂是另一种抗癌剂。
此类其它药剂以对于预定目的有效的量适当地组合存在。此类其它药剂的有效量取决于所使用的融合蛋白的量,病症或治疗的类型,和上文讨论的其它因素。含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子一般以与本文中所述相同的剂量和施用路径,或本文中描述的剂量的约1至99％,或以凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。
上述提到的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一组合物或分开的组合物中)和分开施用,在该情况中,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的施用可以在另外的治疗剂和/或佐剂的施用之前,同时,和/或之后发生。
制品
在本发明的另一个方面,提供一种制品,其含有对于治疗,预防和/或诊断上文描述的病症有用的材料。制品包含容器和在容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,IV溶液袋,等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有本身或与另一种组合物组合有效治疗,预防和/或诊断状况的组合物且可具有无菌存取口(例如,容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子。
标签或包装插页指示组合物用于治疗选择的状况。此外,制品可包含(a)其中装有组合物的第一容器,其中该组合物包含本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子；和(b)其中装有组合物的第二容器,其中该组合物包含别的细胞毒性或其它方面的治疗剂。本发明的这个实施方案中的制品可进一步包含指示组合物可用于治疗特定状况的包装插页。
或者/另外,制品可进一步包含第二(或第三)容器,其包含药学可接受缓冲剂,诸如抑菌性注射用水(BWFI),磷酸盐缓冲盐水,林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料,包括其它缓冲剂,稀释剂,滤器,针,和注射器。
表C(序列)
关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中给出。抗体链的氨基酸依照如上文定义的依照Kabat的EU编号系统(Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(1991))进行编号和提及。
下述编号段落(段)是本发明的各方面:
1.一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。
2.段1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其进一步包含
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
3.段1或2的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
a.该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有相应的CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,或
b.该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有相应的CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段,或
c.该第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且该第二多肽含有相应的VL-CH1域或VH-CL域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头与VH或VL且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
4.段1至3中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该TNF配体家族成员共刺激人T细胞活化。
5.段1至4中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
6.段1至5中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该TNF配体家族成员是4-1BBL。
7.段1至6中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该TNF配体家族成员的外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
8.段1至7中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该TNF配体家族成员的外域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
9.段1至8中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
10.段1至9中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)含有CH1或CL域的第一多肽和含有相应的CL或CH1域的第二多肽,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,
且其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的仅仅一个外域或其片段。
11.段1至10中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块选自由抗体片段,Fab分子,交换Fab分子,单链Fab分子,Fv分子,scFv分子,单域抗体,aVH和支架抗原结合蛋白组成的组。
12.段1至11中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该分子包含一个能够特异性结合PD1的模块。
13.段1至12中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块是能够特异性结合PD1的Fab分子。
14.段1至13中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3,
(b)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3,
(c)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3,
(d)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HVR-L3,
(e)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HVR-L3,
(f)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-L3,或
(g)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-L3。
15.段1至14中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL域,
(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL域,
(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL域,
(d)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL域,
(e)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL域,
(f)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL域,
(g)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL域,
(h)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL域,
(i)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL域,
(k)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL域,或
(l)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL域。
16.段1至14中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
17.段1至16中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL域,
(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL域,
(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL域,
(d)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL域,或
(e)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL域。
18.段2至17中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该Fc域是IgG,特别是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。
19.段2至18中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该Fc域是包含位置234和235(EU编号方式)和/或329(EU编号方式)处的氨基酸替代的IgG1 Fc域。
20.段1至19中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W(编号方式依照Kabat EU索引)且该Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S,L368A和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。
21.段1至20中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
第一重链和第一轻链,二者构成能够特异性结合PD1的Fab分子,
第一肽,其包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段,在其C端通过第二肽接头与第二重或轻链融合,
和第二肽,其包含所述TNF配体家族成员的一个外域,在其C端通过第三肽接头与相应的第二轻或重链融合。
22.段1至20中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的第一肽在其C端通过第二肽接头与作为重链一部分的CH1域融合,
且该包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链一部分的CL域融合。
23.段1至20中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的第一肽在其C端通过第二肽接头与作为重链一部分的CL域融合,
且该包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链一部分的CH1域融合。
24.段1至20中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的第一肽在其C端通过第二肽接头与作为重链一部分的VH域融合,且该包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链一部分的VL域融合。
25.段21至23的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中在邻近该TNF配体家族成员的CL域中位置123(EU编号方式)处的氨基酸已经用精氨酸(R)替换且位置124(EU编号方式)处的氨基酸已经用赖氨酸(K)替代,且其中在邻近该TNF配体家族成员的CH1域中位置147(EU编号方式)处和位置213(EU编号方式)处的氨基酸已经用谷氨酸(E)替代。
26.段1至20中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)第一重链和第一轻链,二者构成能够特异性结合PD1的Fab分子,
(b)第二重链,其包含选自由SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:10组成的组的氨基酸序列,和
第二轻链,其包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
27.段1至20或26中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(i)包含包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域的第一重链和包含包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的VL域的第一轻链或
包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域的第一重链和包含包含选自由SEQID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组的氨基酸序列的VL域的第一轻链,
(ii)包含选自由SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:80组成的组的氨基酸序列的第二重链,和
(iii)包含选自由SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81组成的组的氨基酸序列的第二轻链。
28.段1至21中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的第二轻链,
(b)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的第二轻链,
(c)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的第二轻链,或
(d)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的第二轻链。
29.段1至20中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的Fab域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有相应的CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
30.段29的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含两个能够特异性结合PD1的Fab域。
31.段29的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的第二重链,和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的两条轻链,或
(b)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的第二重链,和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的两条轻链。
32.段29的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含一个能够特异性结合PD1的Fab域。
33.段29或32的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(i)融合多肽,其包含Fc域的第一亚基和通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段,(ii)重链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VH域,该Fc域的第二亚基和经由肽接头与该CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,和(iii)轻链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VL域,或
(i)融合多肽,其包含Fc域的第一亚基和通过肽接头与该CH3域的C端连接的TNF配体家族成员的一个外域或其片段,(ii)重链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VH域,该Fc域的第二亚基和经由肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的所述TNF配体家族成员的两个外域或其片段,和(iii)轻链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VL域。
34.段31的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的轻链,
(b)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的轻链,
(c)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的轻链,
(b)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的轻链。
35.一种分离的多核苷酸,其编码段1至34中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
36.一种载体,特别是表达载体,其包含段35的分离的多核苷酸。
37.一种宿主细胞,其包含段35的分离的多核苷酸或段36的载体。
38.一种用于生成段1至34中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的方法,其包含下述步骤:
(i)在适合于该抗原结合分子表达的条件下培养段37的宿主细胞,和
(ii)回收该抗原结合分子。
39.一种药用组合物,其包含段1至34中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。
40.段1至34中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或段39的药用组合物,其供作为药物使用。
41.段1至34中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或段39的药用组合物,其供在治疗癌症中使用。
42.段1至34中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子用于制造用于治疗癌症的药物的用途。
43.一种在个体中治疗疾病的方法,其包含对所述个体施用治疗有效量的包含药学可接受形式的段1至34中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的组合物。
44.段43的方法,其中所述疾病的癌症。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于上文提供的一般性描述,可以实践多种其它实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA,如Sambrook et al.,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中描述的。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No91-3242中给出。
DNA测序
通过双链测序测定DNA序列。
基因合成
想要的基因区段或是使用适宜的模板通过PCR来生成或是由Geneart AG(Regensburg,Germany)自合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动化基因合成来合成。在确切的基因序列不可得的情况中,基于来自最近同源物的序列设计寡核苷酸引物,并通过RT-PCR自源自适宜组织的RNA分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入标准克隆/测序载体。自转化细菌纯化质粒DNA并通过UV光谱术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以容许亚克隆入相应的表达载体。所有构建物均设计成具有编码在真核细胞中将蛋白质靶向分泌的前导肽的5’端DNA序列。
细胞培养技术
使用标准细胞培养技术,如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.and Yamada,K.M.(eds.),John Wiley&Sons,Inc.中描述的。
蛋白质纯化
参考标准方案,自经过过滤的细胞培养物上清液纯化蛋白质。简言之,将抗体应用于蛋白A Sepharose柱(GE Healthcare)并用PBS清洗。于pH 2.8实现抗体的洗脱,之后立即中和样品。在PBS中或在20mM组氨酸,150mM NaCl(pH 6.0)中通过大小排阻层析术(Superdex 200,GE Healthcare)将聚集的蛋白质从单体抗体分开。合并单体抗体级分,使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩机浓缩(在需要时),冷冻并贮存于-20℃或-80℃。提供部分样品用于后续蛋白质分析和分析性表征,例如通过SDS-PAGE,大小排阻层析术(SEC)或质谱术。
SDS-PAGE
依照制造商的说明书使用预制凝胶系统(Invitrogen)。特别地,使用10％或4-12％Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和MES(还原凝胶,具有抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原凝胶)运行缓冲液。
分析性大小排阻层析术
通过HPLC层析术实施大小排阻层析术(SEC),用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之,将经过蛋白A纯化的抗体应用于Agilent HPLC 1100系统上的300mM NaCl,50mMKH2PO4/K2HPO4,pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱或Dionex HPLC系统上的2x PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分量化洗脱的蛋白质。BioRad凝胶过滤标准品151-1901充当标准品。
质谱术
此节描述具有VH/VL交换(VH/VL CrossMab)的多特异性抗体的表征,重点在于它们的正确装配。通过去糖基化的完整CrossMab和去糖基化的/纤溶酶消化的或替代地去糖基化的/有限LysC消化的CrossMab的电喷雾电离质谱术(ESI-MS)分析预期的一级结构。
将VH/VL CrossMab以1mg/ml的蛋白质浓度用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F于37℃去糖基化至多17小时。纤溶酶或有限LysC(Roche)消化用Tris缓冲液pH 8中的100μg去糖基化的VH/VL CrossMab分别于室温实施120小时和于37℃实施40分钟。质谱术前,将样品在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上经由HPLC脱盐。在配备有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上经由ESI-MS测定总质量。
使用表面等离振子共振(SPR)(BIACORE)测定多特异性抗体对相应抗原的结合和结合亲和力
使用BIACORE仪器(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)通过表面等离振子共振调查所生成的抗体对相应抗原的结合。简言之,为了亲和力测量,将山羊抗人IgG,JIR 109-005-098抗体经由胺偶联固定化在CM5芯片上,用于呈现针对相应抗原的抗体。于25℃(或替代地于37℃)在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES,150mM NaCl,0.005％吐温20,pH 7.4))中测量结合。以溶液中的多种浓度添加抗原(R&D Systems或内部纯化的)。通过80秒至3分钟的抗原注射来测量结合；通过用HBS缓冲液清洗芯片表面3-10分钟来测量解离,并使用1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型来估算KD值。自样品曲线减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线),用于修正系统内在基线漂移和噪声信号降低。使用相应的Biacore评估软件进行传感图的分析和亲和力数据的计算。
实施例1
1.1抗PD-1抗体的生成
小鼠的免疫接种
对NMRI小鼠进行遗传免疫接种,其使用编码全长人PD1的质粒表达载体通过皮内应用100ug载体DNA(质粒15300_hPD1-fl),接着电穿孔(2个1000V/cm矩形脉冲,持续0.1ms,间隔0.125s；接着4个287.5V/cm矩形脉冲,持续10ms,间隔0.125s)进行。小鼠在第0,14,28,42,56,70,和84天连续接受6次免疫接种。在第36,78和92天采集血液并制备血清,用于通过ELISA进行的滴度测定(见下文)。选择具有最高滴度的动物在第96天通过静脉内注射50ug重组人PD1人Fc嵌合物进行强化,并通过在强化后3天融合脾细胞与骨髓瘤细胞系通过杂交瘤技术分离单克隆抗体。
血清滴度的测定(ELISA)
在PBS中以0.3ug/ml,100ul/孔在96孔NUNC Maxisorp板上固定化人重组PD1人Fc嵌合物,接着是:用含2％Crotein C的PBS,200ul/孔封闭板；应用抗血清的连续稀释液,一式两份,在含0.5％Crotein C的PBS中,100ul/孔；用HRP缀合的山羊抗小鼠抗体(JacksonImmunoresearch/Dianova 115-036-071；1/16 000)检测。对于所有步骤,将板于37℃温育1小时。在所有步骤之间,将板用含0.05％Tween 20的PBS清洗3次。通过添加BM Blue POD底物溶液(Roche),100ul/孔来发生信号；并通过添加1M HCl,100ul/孔来停止。于450nm读取吸光度,针对690nm作为参照。滴度定义为产生半最大信号的抗血清的稀释度。
1.2抗PD1抗体的表征/抗PD1抗体对人PD1的结合
针对人PD1的ELISA
将Nunc Maxisorp链霉亲合素包被板(MicroCoat#11974998001)用25μl/孔生物素化PD1-ECD-AviHis包被并于4℃温育过夜。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl抗PD1样品或参照抗体(人抗PD1；Roche/小鼠抗PD1；Biolegend；目录:329912)并于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,以1:2000/1:1000稀释度添加25μl/孔山羊抗人H+L-POD(JIR,JIR109-036-088)/绵羊抗小鼠-POD(GE Healthcare；NA9310)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl/孔TMB底物(Roche目录号11835033001)并温育直至OD 2–3。于370/492nm进行测量。
在下文汇总表1和2中作为EC50值[ng/ml]列出ELISA结果。
针对PD1的细胞ELISA
以0.01x10E6细胞/孔的浓度在384孔平底板中接种用编码全长人PD1的质粒15311_hPD1-fl_pUC_Neo稳定转染并用G418(质粒上的新霉素抗性标志物)选择的贴壁CHO-K1细胞系并生长过夜。
次日,添加25μl/孔PD1样品或人抗PD1(Roche)/小鼠抗PD1(Biolegend；目录:329912)参照抗体并于4℃温育2小时(以避免内在化)。小心清洗(1x 90μl/孔PBST)后,通过添加30μl/孔在1x PBS缓冲液中稀释的0.05％戊二醛(Sigma,目录号:G5882,25％)并于室温温育10分钟来固定细胞。清洗(3x90μl/孔PBST)后,添加25μl/孔二抗进行检测:山羊抗人H+L-POD(JIR,JIR109-036-088)/绵羊抗小鼠-POD(GE NA9310),接着在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST)后,添加25μl/孔TMB底物溶液(Roche11835033001)并温育直至OD 1.0–2.0。于370/492nm测量板。
下文汇总表2中作为“EC50CHO-PD1”值[ng/ml]列出细胞ELISA结果。
针对食蟹猴PD1的ELISA
将Nunc Maxisorp链霉亲合素包被板(MicroCoat#11974998001)用25μl/孔生物素化cynoPD1-ECD-生物素包被并于4℃温育过夜。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl抗PD1样品或参照抗体(人抗PD1；Roche)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,以1:1000稀释度添加25μl/孔山羊抗人H+L-POD(JIR,JIR109-036-088)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl/孔TMB底物(Roche,11835033001)并温育直至OD 2–3。于370/492nm进行测量。
在下文汇总表1和2中作为EC50值[ng/ml]列出ELISA结果。
PD配体1置换测定法
将Nunc Maxisorp链霉亲合素包被板(MicroCoat#11974998001)用25μl/孔生物素化PD1-ECD-AviHis包被并于4℃温育过夜。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl抗PD1样品或参照抗体(小鼠抗PD1；Biolegend；目录:329912)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl/孔PD-L1(重组人B7-H1/PD-L1 Fc嵌合物；156-B7,R&D)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,以1:1000稀释度添加25μl/孔山羊抗人H+L-POD(JIR,109-036-088)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl/孔TMB底物(Roche,11835033001)并温育直至OD 2–3。于370/492nm进行测量。
在下文汇总表1中作为IC50值[ng/ml]列出ELISA结果。
PD配体2置换测定法
将Nunc Maxisorp链霉亲合素包被板(MicroCoat#11974998001)用25μl/孔生物素化PD1-ECD-AviHis包被并于4℃温育过夜。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl抗PD1样品或参照抗体(小鼠抗huPD1；Roche)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl/孔PD-L2(重组人B7-DC/PD-L2 Fc嵌合物；1224-PL-100,R&D)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,以1:2000稀释度添加25μl/孔山羊抗人H+L-POD(JIR,109-036-088)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl/孔TMB底物(Roche,11835033001)并温育直至OD 2–3。于370/492nm进行测量。
在下文汇总表1中作为IC50值[ng/ml]列出ELISA结果。
表位作图ELISA/结合竞争测定法
将Nunc Maxisorp板(Nunc#464718)用25μl/孔捕捉抗体(山羊抗小鼠IgG；JIR；115-006-071)包被并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,将板用含有2％BSA的PBS缓冲液在摇床上于室温封闭1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl小鼠抗PD1样品并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,将捕捉抗体用30μl/孔小鼠IgG(JIR；015-000-003)在摇床上于室温封闭1小时。同时,将生物素化PD1-ECD-AviHis与第二样品抗体一起在摇床上于室温预温育1小时。清洗测定板(3x90μl/孔PBST缓冲液)后,将PD1抗体混合物转移至测定板并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,以1:4000稀释度添加25μl/孔链霉亲合素POD(Roche,#11089153001)并在摇床上于室温温育1小时。清洗(3x 90μl/孔PBST缓冲液)后,添加25μl/孔TMB底物(Roche,11089153001)并温育直至OD 1.5–2.5。于370/492nm进行测量。通过针对参照抗体的等级聚簇来定义表位组。
表1:例示性PD1抗体的结合,PD-L1抑制和表位区分组(ELISA)
表2:自亲本小鼠抗体PD1-0103衍生的人源化PD1抗体的生化和细胞结合(ELISA)
人源化抗PD1抗体的Biacore表征
已经使用基于表面等离振子共振(SPR)的测定法在数种鼠PD1结合物以及商业性人PD1结合参照之间测定结合的动力学参数。因此,通过胺偶联将抗人IgG固定化至(Biacore)CM5传感器芯片的表面。然后捕捉样品并使人PD1-ECD结合至它们。在每个分析循环后再生传感器芯片表面。最终通过将数据拟合至1:1Langmuir相互作用模型来得到平衡常数和动力学速率常数。
通过使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare)于pH 5.0将约2000个响应单位(RU)的20μg/ml抗人IgG(GE Healthcare#BR-1008-39)偶联到Biacore T200中的CM5传感器芯片的流动室1和2(或者3和4)上。
样品和运行缓冲液是HBS-EP+(0.01M HEPES,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05％v/v表面活性剂P20,pH 7.4)。流动室温度设定为25℃,而样品隔室温度设定为12℃。用运行缓冲液引发系统。
样品以10nM的浓度注射20秒,并结合至第二流动室。然后在每份样品上注射一整套人PD1-ECD浓度(144nM,48nM,16nM,5.33nM,1.78nM,0.59nM,0.20nM和0nM)达120秒,接着是解离时间30/300秒和3M MgCl2的两个20秒再生步骤,其中最后一个含有运行缓冲液的“注射后额外清洗”。
最终,用Biacore T200评估软件将双重参照数据拟合至1:1Langmuir相互作用模型。所得KD,ka和kd值在表3中显示。
表3:通过Biacore测定的嵌合PD1-0103和人源化PD1抗体的动力学速率常数和平衡常数
配体 k<sub>a</sub>[M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>] k<sub>d</sub>[s<sup>-1</sup>] K<sub>D</sub>[nM]
嵌合PD1-0103 3.86E+05 3.07E-04 0.8
PD1-0103-0312 1.95E+05 3.45E-04 1.8
PD1-0103-0313 1.60E+05 3.67E-04 2.3
PD1-0103-0314 1.87E+05 2.79E-04 1.5
PD1-0103-0315 1.89E+05 2.91E-04 1.5
如表3中显示的,嵌合PD1-0103的所有人源化型式(生成见实施例1.3)展示与亲本抗体(嵌合PD1-0103)相似的动力学特性。
动力学
将S系列CM5传感器安置到Biacore 4000系统中并依照制造商的说明书对检测点进行流体动力学编址。
在流动室1,2,3和4中的检测点1和5上以10 000Ru固定化多克隆家兔IgG抗体<IgGFCγM>R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)。经由EDC/NHS化学依照制造商的说明书进行偶联。流动室中的剩余点充当参照。样品缓冲液是补充有1mg/ml羧甲基葡聚糖的系统缓冲液。
在一个实施方案中,于25℃驱动测定法。在另一个实施方案中,于37℃驱动测定法。通过以10μl/min注射1分钟,在传感器表面上捕捉50nM每一种鼠单克隆抗体。随后,对于4分钟结合期时间,以30μl/min注射相应抗原的100nM,2x 33nM,11nM,4nM,1nM浓度系列和系统缓冲液0nM。监测解离另外4分钟。使用以30μl/min注射10mM甘氨酸pH 1.5达3分钟来再生捕捉系统。使用Biacore评估软件依照制造商的说明书计算相关动力学数据。
表位作图
对Biacore 4000仪器安置Biacore CAP传感器并像制造商推荐的那样做好准备。仪器缓冲液是HBS-ET(10mM HEPES pH 7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.005％w/v Tween20)。于25℃运行仪器。
在系统缓冲液中稀释所有样品。通过在流动室1,2,3和4中在点1和5中以30μl/min注射1分钟,以200RU在CAP传感器表面上捕捉35kDa生物素化抗原PD1-ECD-AviHis。点2,3和4充当参照。在另一个实施方案中,以相同方式以200RU在CAP传感器上捕捉35kDa生物素化抗原PD1-ECD-AviHis。
随后,以30μl/min注射100nM一抗达3分钟,接着以30μl/min注射100nM二抗达3分钟。注射一抗直至表面呈递抗原完全饱和。在一抗和二抗注射期结束时,设置报告点“晚结合”(BL)来监测相应抗体的结合响应。计算二抗结合响应“BL2”和一抗响应“BL1”之间的商,摩尔比。使用该摩尔比作为抗原早就被一抗复合时,二抗的抗原可及性的指标。
如制造商推荐的那样,通过以30μl/min注射2M盐酸胍250mM NaOH再生缓冲液达2分钟,自传感器表面完全去除复合物,接着以30μl/min注射系统缓冲液达1分钟。
1.3在混合淋巴细胞反应(MLR)中不同抗PD1抗体对细胞因子生成的影响
3A)混合淋巴细胞反应(MLR)是一种免疫细胞测定法,其测量来自一名个体(供体X)的淋巴细胞对来自另一名个体(供体Y)的淋巴细胞的活化。使用混合淋巴细胞反应来证明阻断PD1途径对淋巴细胞效应细胞的影响。在抗PD1单抗存在或缺失下对该测定法中的T细胞测试活化和它们的IFNγ分泌。
为了实施异基因MLR,使用Leukosep(Greiner Bio One,227 288)通过密度梯度离心分离来自HLA类型未知的至少四名健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)。简言之,用3倍体积的PBS稀释肝素化血液样品并在50ml Leukosep管中铺放稀释血液的25ml等分试样。于室温以800x g离心15分钟(无中断)后,收获含有淋巴细胞的级分,在PBS中清洗并直接用于功能测定法或以1.0E+07个细胞/ml在冷冻介质(10％DMSO,90％FCS)中重悬浮并在液氮中保存。如下设置个体两路MLR反应,即以1:1刺激者/响应者细胞比混合来自两名不同供体的PBMC并至少一式两份在平底96孔板中在不同浓度范围的纯化的抗PD1单克隆抗体PD1-0050,PD1-0069,PD1-0073,PD1-0078,PD1-0098,PD1-0102,PD1-0103存在或缺失下于37℃,5％CO2进行共培养6天。作为参照抗PD1抗体,合成包含纳武单抗(也称作MDX-5C4或MDX-1106)或帕姆单抗(也称作MK-3475或Org 1.09A)的VH和VL域的抗体并与人IgG1主链(具有突变L234A,L235A和P329G(Kabat的EU索引))一起克隆。使用无抗体或同种型对照抗体作为阴性对照并使用重组人IL-2(20EU/ml)作为阳性对照。第6天后,自每一份培养物取出100μl培养液用于测量细胞因子。使用OptEIA ELISA试剂盒(BD Biosciences)测量IFNγ的水平。
结果在表4中显示(IFNγ分泌/释放)。抗PD1单克隆抗体以浓度依赖性方式促进T细胞活化和IFNγ分泌。IFNγ分泌的％升高值与不添加任何阻断性单抗的MLR(基础异基因刺激诱导的IFNγ值作为E-c)和有添加20EU/ml重组人IL-2的MLR(阳性对照＝100％IFNg值作为E+c)的IFN-g生成相比计算并依照下面的公式计算:相对刺激[％]＝((实施例-E-c)/(E+c-E-c))*100
表4:异基因刺激和抗PD1抗体处理后IFNγ分泌的百分比,与作为阳性对照的重组人IL-2处理(20EU/ml)(＝100％升高)的效果比较
浓度(μg/ml) 1:12 1:120 1:1200 在MLR中的效果
PD1-0050 44 136 96 33 +++
PD1-0069 60 76 71 55 +++
PD1-0073 43 103 63 38 ++
PD1-0078 64 99 72 21 ++
通过增强干扰素伽马(IFNγ)的分泌(没有显示所有抗体的数据),数种PD1阻断性抗体PD1-0050,PD1-0069,PD1-0073,PD1-0078,PD1-0098,PD1-0102,PD1-0103展现强免疫调控活性。
3B)在又一项实验中,评估嵌合PD1-0103(具有突变L234A,L235A和P329G(Kabat的EU索引)的人IgG1同种型)。用嵌合PD1-0103阻断PD1强烈增强异基因的经刺激的原代人T细胞的IFNγ分泌。嵌合PD1-0103比参照抗PD1抗体更加有力(见图1)。
为了比较,使用合成包含纳武单抗(也称作MDX5C4或MDX-1106)和帕姆单抗(也称作MK-3475或Org 1.09A)的VH和VL域并与人IgG1主链(具有突变L234A,L235A和P329G(Kabat的EU索引))一起克隆的参照抗PD1抗体。
3C)在另外的实验中,在上文所述MLR中评估抗PD1抗体PD1-0103的人源化变体(人源化抗体PD1-0103-0312,PD1-0103-0314,在图2和3中)的免疫调控活性,a)IFNγ释放(分泌)和b)TNFα释放(分泌)。将嵌合PD1-0103抗体及其人源化型式的效果与包含纳武单抗(也称作MDX5C4或MDX-1106)和帕姆单抗(也称作MK-3475或Org 1.09A)任一的VH和VL域且具有人IgG1主链(具有突变L234A,L235A和P329G(Kabat的EU索引))的参照抗PD1抗体进行比较。MLR培养6天后,取出50μl上清液并使用Bio-Plex ProTM人细胞因子Th1/Th2测定法(Bio-RadLaboratories Inc.)在一份培养物中测量多种细胞因子(没有显示所有细胞因子的数据)。
嵌合PD1-0103抗体及其人源化型式(PD1-0103_0312和PD1-0103_0314)与参照抗PD1抗体相比在增强T细胞活化和IFNγ分泌方面更加有力(见图2)。
而且,嵌合PD1-0103抗体及其人源化变体提高抗原呈递细胞的肿瘤坏死因子α(TNFα)(见图3)和IL-12(数据未显示)分泌且增强单核细胞/巨噬细胞或抗原呈递细胞刺激T细胞的能力。
1.4抗PD1阻断对与异基因成熟树突细胞共培养的人CD4T细胞的细胞毒性粒酶B释放和IFN-γ分泌的影响
为了进一步调查抗PD1处理在异基因设置中的效果,我们开发了一种测定法,其中将新鲜纯化的CD4T细胞在单核细胞衍生的异基因成熟树突细胞(mDC)存在下共培养5天。1周前,经由塑胶粘附,接着去除非粘附细胞,自新鲜PBMC分离单核细胞。然后,通过将它们在含有GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(100ng/ml)的培养基中培养5天,我们自单核细胞生成未成熟DC。为了诱导iDC成熟,我们对培养中的培养基添加TNF-α,IL-1β和IL-6(各50ng/ml)再过2天。然后,通过经由流式细胞术(LSRFortessa,BD Biosciences)测量它们II类主要组织相容性复合物(MHCII),CD80,CD83和CD86的表面表达,我们评估DC成熟。
在最小限度混合淋巴细胞反应(mMLR)那天,经由微珠试剂盒(Miltenyi Biotec)自从无关供体获得的108个PBMC富集CD4T细胞。培养前,用5μM羧基-荧光素-琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记CD4T细胞。然后在浓度为10μg/ml(若图中没有不同标示)的阻断性抗PD1抗体(PD1-0103,嵌合PD1-0103,或人源化抗体PD1-0103-0312,PD1-0103-0313,PD1-0103-0314,PD1-0103-0315,在图4A和4B中缩写为0312,0313,0314,0315)存在或缺失下在96孔板中与成熟异-DC一起(5:1)铺放105个CD4T细胞。
5天后,我们收集细胞培养物上清液,稍后用于通过ELISA(R&D systems)测量IFNγ水平,并将细胞在Golgi Plug(布雷菲德菌素A)和Golgi Stop(莫能菌素)存在下于37℃再放置5小时。然后,清洗细胞,在表面上用抗人CD4抗体和活/死可固定染料Aqua(Invitrogen)染色,之后用固定/透化缓冲液(BD Bioscience)固定/透化。我们实施了针对粒酶B(BD Bioscience),IFNγ和IL-2(二者均来自eBioscience)的细胞内染色。
我们还测试了不同浓度的人源化变体PD1-0103(人源化抗体PD1-0103-0312,PD1-0103-0313,PD1-0103-0314,PD1-0103-0315,在图中缩写为0312,0313,0314,0315,还可见下文实施例1.6)并发现它们在增强粒酶B和干扰素γ方面同等好。DP47是一种非结合性人IgG,具有Fc部分中的LALA突变以避免受到FcγR识别且用作阴性对照。结果在图4A和4B中显示。
1.5嵌合抗体衍生物
生成了嵌合PD1抗体,其通过经由PCR扩增抗PD1小鼠抗体PD1-0098,PD1-0103的可变重和轻链区并将它们作为与具有消除效应器功能的突变L234A,L235A和P329G(Kabat的EU索引))(亮氨酸234变成丙氨酸,亮氨酸235变成丙氨酸,脯氨酸329变成甘氨酸)的人IgG1主链/人CH1-铰链-CH2-CH3的融合蛋白克隆入重链表达载体及作为与人Cκ的融合蛋白克隆入轻链表达载体。然后将LC和HC质粒共转染入HEK293并在7天后通过抗体纯化的标准方法自上清液纯化。将嵌合PD1抗体重命名为嵌合chiPD1-0098(chiPD1-0098)和嵌合PD1-0103(chiPD1-0103)。为了比较,使用合成包含纳武单抗(也称作MDX-5C4或MDX-1106)和帕姆单抗(也称作MK-3475或Org1.09A)任一的VH和VL域的参照抗PD1抗体并与人IgG1主链(具有突变L234A,L235A和P329G(Kabat的EU索引))一起克隆。
1.6抗PD1抗体PD-0103的人源化变体(huMabPD-0103)的生成,表达和纯化及表征
鼠抗PD1抗体0103的VH和VL域的人源化
基于鼠抗PD1抗体PD1-0103的鼠VH和VL域的氨基酸序列(SEQ ID NO:43和44),生成了人源化抗PD1抗体变体。
VH的人源化变体基于人种系IMGT_hVH_3_23,与具有数项突变的人J-元件种系IGHJ5-01组合(产生SEQ ID NO:45)。
VL的人源化变体基于人种系IMGT_hVK_4_1,IMGT_hVK_2_30,IMGT_hVK_3_11和IMGT_hVK_1_39,与人J-元件种系IGKJ1-01组合。不同突变产生人源化变体SEQ ID NO:46至SEQ ID NO:49。
将PD1-0103的重和轻链可变区的人源化氨基酸序列逆翻译成DNA并合成(GenArt)所得cNDA,然后作为与具有消除效应器功能的LALA和PG突变(亮氨酸234变成丙氨酸,亮氨酸235变成丙氨酸,脯氨酸329变成甘氨酸)的人IgG1主链/人CH1-铰链-CH2-CH3的融合蛋白克隆入重链表达载体或作为与人Cκ的融合蛋白克隆入轻链表达载体。然后将LC和HC质粒共转染入HEK293并在7天后通过抗体纯化的标准方法自上清液纯化。所得人源化PD1抗体命名如下:
表5:PD1-0103的人源化变体抗体的VH和VL序列
表6:PD1-0103的人源化变体抗体的HVR序列
如上文所述表征人源化PD1-0103抗体变体和亲本嵌合PD1-0103。结果在表7中显示。
表7:人源化PD1-0103抗体变体和亲本嵌合PD1-0103的结果的汇总
1.7 PD1抗体的中和效力
为了测试内部生成的PD1抗体在体外在模拟恢复受到遏制的T细胞应答中的中和效力,使用可商购的PD1/PD-L1报告物测定法(Promega)。这个系统由PD1+NFAT Jurkat细胞和PD-L1+CHO对应物(其还给出活化信号)组成。原理上,报告物系统基于三个步骤:(1)TCR介导的NFAT活化,(2)活化后PD-1/PD-L1轴对NFAT信号的抑制和(3)PD1阻断性抗体对NFAT信号的恢复。
材料和方法:
·PD-L1培养基:PAN Biotech(#P04-03609)；FBS(10％)和L-Gln(4mM)
·测定培养基:RPMI 1640(#31870；Invitrogen),25mM HEPES,2mM L-Gln,FBS(2％)
·用于这项测定法的细胞(两种细胞类型均购自Promega):
PD-L1+CHO细胞(批号#139147):2-3x104个细胞/96孔
PD1+NFAT Jurkat细胞(批号#133024:3.5x104个细胞/孔
第1天,融化PD-L1+细胞,以所示细胞浓度在上文所述培养基中接种并于37℃和5％CO2培养过夜。次日,去除培养基并将PD-L1+细胞与所示浓度的制备的抗体一起温育(在测定培养基中)。平行地,融化PD1+NFAT Jurkat细胞并将上文所述细胞数转移至PD-L1+细胞并共培养。于37℃和5％CO2温育6小时后,温热Bio-Glo底物至室温(在添加前1-2小时)。自温箱取出细胞培养板并调节至室温(10分钟),之后添加每孔80μl Bio-Glo溶液,温育5-10分钟,之后在Tecan Infinite读数仪上依照试剂盒制造商的推荐测量发光。结果可以在图5A和5B中看到,其中显示了TCR刺激后不同PD1抗体对PD1/PD-L1介导的NFAT信号遏制的恢复:图5A:嵌合PD1-0103显示可再现的与参照抗体相比卓越的效果。作为参照,合成包含纳武单抗(也称作MDX-5C4或MDX-1106)的VH和VL域并与人IgG1主链(具有突变L234A,L235A和P329G(Kabat的EU索引))一起克隆的抗PD1抗体。图5B:PD1-0103的四种人源化变体展现与先导抗体相似的体外效力且略微优于参照抗体。
实施例2
PD1靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
依照Uniprot数据库的P41273序列(SEQ ID NO:103)合成编码人4-1BB配体的部分外域(氨基酸71-254和71-248)的DNA序列的不同片段。
2.1具有交叉的CH1-CL域具有带电荷残基的单价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建物7.1)的制备
克隆含有通过(G4S)2接头分开的4-1BB配体的两个外域(71-254)且与人IgG1-CL域融合的多肽,如图6A中描绘的:人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人CL。
克隆含有4-1BB配体的一个外域(71-254)且与人IgG1-CH1域融合的多肽,如图6B中描述的:人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人CH。
为了改善正确配对,已经在交叉的CH-CL中引入下述突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中,将突变K147E和K213E克隆入人CH1域,如国际专利申请公开号WO 2015/150447中描述的。
将编码对PD1特异性的结合物,克隆0314(或0103-0314)的重和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆。该PD1结合物的生成和制备在实施例1中描述。
依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法,已经在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。
对于所有构建物,以节链中的S354C/T366W突变和穴链中的相应的Y349C/T366S/L368A/Y407V突变使用节入穴异二聚化技术。
二聚体配体-含有S354C/T366W突变的Fc节链,单体CH1融合物,靶向性抗PD1-含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链和抗PD1轻链的组合容许生成包括装配好的三聚体4-1BB配体和PD1结合性Fab的异二聚体(图7,构建物7.1)。
表8显示含有CH1-CL交换和带电荷残基的单价PD1(0314)-人4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建物7.1)的cDNA和氨基酸序列。
表8:单价PD1(0314)靶向性含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子构建物7.1的序列
2.2具有交叉的CH1-CL域没有带电荷残基的单价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建物7.2)的制备
克隆含有通过(G4S)2接头分开的4-1BB配体的两个外域(71-254)且与人IgG1-CL域融合的多肽,如图6C中描绘的:人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人CL。
克隆含有4-1BB配体的一个外域(71-254)且与人IgG1-CH1域融合的多肽,如图6D中描述的:人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人CH1。
将编码对PD1特异性的结合物,克隆0103-0314的重和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆。
已经在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合(WO 2012/130831)。
二聚体配体-含有S354C/T366W突变的Fc节链,单体CH1融合物,靶向性抗FAP-含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链和抗FAP轻链的组合容许生成包括装配好的三聚体4-1BB配体和FAP结合性Fab的异二聚体(图7,构建物7.2)。
表9显示含有CH1-CL交换没有带电荷残基的单价抗PD1(0314)人4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建物7.2)的cDNA和氨基酸序列。
表9:单价PD1(0314)靶向性含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子构建物7.2的序列
2.3二聚体和单体4-1BB配体在每条重链的C端融合的二价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建物7.3)的制备
将含有通过(G4S)2接头分开的4-1BB配体的两个外域(71-254)的多肽融合至人IgG1 Fc穴链的C端,如图6E中描绘的:人IgG1 Fc穴,(G4S)2连接头,人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人4-1BB配体。将含有4-1BB配体的一个外域(71-254)的多肽融合至人IgG1 Fc节链的C端,如图6F中描述的:人IgG1 Fc节,(G4S)2连接头,人4-1BB配体。
将编码对PD1特异性的结合物,克隆0103-0314的重和轻链DNA序列的可变区与穴,节的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆。
依照WO 2012/130831中描述的方法,已经在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗FAP huIgG1穴二聚体配体链,含有S354C/T366W突变的抗FAP huIgG1节单体配体链和抗FAP轻链的组合容许生成包括装配好的三聚体4-1BB配体和两个PD1结合性Fab的异二聚体(图7,构建物7.3)。
表10显示二价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建物7.3(2个抗PD1 Fab,二聚体和单体4-1BB配体分别融合在每条重链的C端的PD1分拆三聚体)的cDNA和氨基酸序列。
表10:二价PD1(0314)靶向性含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子构建物7.3的序列
2.4具有交叉的CH1-CL域具有带电荷残基的单价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建物7.4)的制备
克隆含有通过(G4S)2接头分开的4-1BB配体的两个外域(71-248)且与人IgG1-CL域融合的多肽,如图8A中描绘的:人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人CL。克隆含有4-1BB配体的一个外域(71-248)且与人IgG1-CH域融合的多肽,如图8B中描述的:人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人CH1。
为了改善正确配对,已经在交叉的CH-CL中引入下述突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中将突变K147E和K213E克隆入人CH1域,如国际专利申请公开号WO 2015/150447中描述的。
将编码对PD1特异性的结合物,克隆0103-0314的重和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆。
依照WO 2012/130831中描述的方法,已经在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。
二聚体配体-含有S354C/T366W突变的Fc节链,单体CH1融合物,靶向性抗PD1(0314)-含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链和抗PD1(0314)轻链的组合容许生成包括装配好的三聚体4-1BB配体和FAP结合性Fab的异二聚体(图7,构建物7.4)。
表11显示含有CH1-CL交换具有带电荷残基的单价PD1(0314)-人4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建物7.4)的cDNA和氨基酸序列。
表11:单价PD1(0314)靶向性含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子构建物7.4的序列
2.5具有交叉的CH1-CL域没有带电荷残基的单价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建物7.5)的制备
克隆含有通过(G4S)2接头分开的4-1BB配体的两个外域(71-248)且与人IgG1-CL域融合的多肽,如图8C中描绘的:人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人CL。克隆含有4-1BB配体的一个外域(71-248)且与人IgG1-CH域融合的多肽,如图8D中描述的:人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人CH。
将编码对PD1特异性的结合物,克隆0103-0314的重和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆。
依照WO 2012/130831中描述的方法,已经在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。
二聚体配体-含有S354C/T366W突变的Fc节链,单体CH1融合物,含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向性抗PD1 Fc穴链和抗PD1轻链的组合容许生成包括装配好的三聚体4-1BB配体和FAP结合性Fab的异二聚体(图7,构建物7.5)。
表12显示含有CH1-CL交换没有带电荷残基的单价PD1(0314)-人4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建物7.5)的cDNA和氨基酸序列。
表12:单价PD1(0314)靶向性含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子构建物7.5的序列
2.6二聚体和单体4-1BB配体融合在每条重链的C端的二价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建物7.6)的制备
将含有通过(G4S)2接头分开的4-1BB配体的两个外域(71-248)的多肽融合至人IgG1 Fc穴链的C端,如图8E中描绘的:人IgG1 Fc穴,(G4S)2连接头,人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人4-1BB配体。将含有4-1BB配体的一个外域(71-248)的多肽融合至人IgG1 Fc节链的C端,如图8F中描述的:人IgG1 Fc节,(G4S)2连接头,人4-1BB配体。
将编码对PD1特异性的结合物,克隆0103-0314的重和轻链DNA序列的可变区与穴,节的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆。
依照WO 2012/130831中描述的方法,已经在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗PD1huIgG1穴二聚体配体链,含有S354C/T366W突变的抗PD1huIgG1节单体配体链和抗PD1轻链的组合容许生成包括装配好的三聚体4-1BB配体和两个PD1结合性Fab的异二聚体(图7,构建物7.6)。
表13显示二价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建物7.6(2个抗PD1 Fab,二聚体和单体4-1BB配体分别融合在每条重链的C端的PD1分拆三聚体)的cDNA和氨基酸序列。
表13:二价PD1(0314)靶向含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子(构建物7.6)的序列
2.7二聚体和单体4-1BB配体融合在每条重链的C端的单价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(抗PD1在节链上,构建物7.11和7.12)的制备
将含有通过(G4S)2接头分开的4-1BB配体的两个外域的多肽同框亚克隆至人IgG1Fc穴或节链的C端,如图9A中描绘的:人IgG1 Fc,(G4S)2连接头,人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人4-1BB配体。将含有4-1BB配体的一个外域的多肽同框亚克隆至人IgG1 Fc节或穴链的C端,如图9B中描述的:人IgG1 Fc,(G4S)2连接头,人4-1BB配体。
将编码对PD1特异性的结合物,克隆0314的重和轻链DNA序列的可变区与节的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆。
依照WO 2012/130831中描述的方法,已经在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的huIgG1穴链,含有S354C/T366W突变的抗PD1huIgG1节链和抗PD1轻链的组合容许生成包括装配好的三聚体4-1BB配体和一个PD1结合性Fab的异二聚体(图9C和D,构建物7.11和7.12)。
表14显示单价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建物7.11(一个抗PD1 Fab,二聚体4-1BB配体融合在Fc穴链的C端且单体4-1BB配体融合在Fc节链的C端的PD1分拆三聚体)的cDNA和氨基酸序列。
表14:单价PD1(0314)靶向性含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子(构建物7.11)的序列
表15显示单价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建物7.12(PD1分拆三聚体,具有一个抗PD1 Fab,二聚体4-1BB配体融合于Fc节链的C端且单体4-1BB配体融合于Fc穴链的C端)的cDNA和氨基酸序列。
表15:单价PD1(0314)靶向性含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子(构建物7.12)的序列
2.8二聚体和单体4-1BB配体融合在每条重链的C端的单价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(抗PD1在穴链上,构建物7.13和7.14)的制备
将含有通过(G4S)2接头分开的4-1BB配体的两个外域的多肽同框亚克隆至人IgG1Fc穴或节链的C端,如图9A中描绘的:人IgG1 Fc,(G4S)2连接头,人4-1BB配体,(G4S)2连接头,人4-1BB配体。将含有4-1BB配体的一个外域的多肽同框亚克隆至人IgG1 Fc节或穴链的C端,如图9B中描述的:人IgG1 Fc,(G4S)2连接头,人4-1BB配体.。
将编码对PD1特异性的结合物,克隆0314的重和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆。
依照WO 2012/130831中描述的方法,已经在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗PD1huIgG1穴链,含有S354C/T366W突变的huIgG1节链和抗PD1轻链的组合容许生成包括装配好的三聚体4-1BB配体和一个PD1结合性Fab的异二聚体(图10A和B,构建物7.13和7.14)。
表16显示单价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建物7.13(具有一个抗PD1 Fab,二聚体4-1BB配体融合在Fc穴链的C端且单体4-1BB配体融合在Fc节链的C端的PD1分拆三聚体)的cDNA和氨基酸序列。
表16:单价PD1(0314)靶向性含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子(构建物7.13)的序列
表17显示单价PD1(0314)靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建物7.14(具有一个抗PD1 Fab,二聚体4-1BB配体融合于Fc节链的C端且单体4-1BB配体融合于Fc穴链的C端的PD1分拆三聚体)的cDNA和氨基酸序列。
表17:单价PD1(0314)靶向性含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子(构建物7.14)的序列
2.9非靶向性含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(对照分子)的制备
如上文关于PD1靶向性抗原结合分子描述的制备对照分子,唯一的差异在于抗PD1结合物(VH和VL)用称作DP47,不结合该抗原的种系对照替换。
对照B是一种含有CH-CL交换具有带电荷残基的非靶向性单价分拆三聚体人4-1BB配体(71-254)Fc(kih)抗原结合分子(图11A)。它对应于构建物7.1,然而PD1结合物的重和轻链DNA序列的可变区用种系对照(DP47)的那些替换并与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆。
与二价构建物7.3和7.6类似地制备一种二价变体对照C(图11B)并与构建物7.3(含有4-1BB配体(71-248)三聚体)类似地制备一种单价变体对照D(图11C),唯一的差异在于抗PD1结合物(VH和VL)用称作DP47,不结合该抗原的种系对照替换。
表18显示含有4-1BB配体的臂中具有CH1-CL交换和带电荷残基的DP47非靶向性含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(对照B)的cDNA和氨基酸序列。
表18:DP47非靶向性含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(DP47分拆4-1BBL三聚体)对照B的序列
表19显示二价DP47非靶向性分拆三聚体4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合分子对照C的cDNA和氨基酸序列。
表19:二价DP47非靶向性含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子对照C的序列
表20分别显示含有CH-CL交叉具有带电荷残基的单价DP47非靶向性分拆三聚体4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物,对照D的cDNA和氨基酸序列。
表20:具有CH-CL交叉和具有带电荷残基的单价DP47非靶向性分拆三聚体人4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(对照D)的cDNA和氨基酸序列。*带电荷残基
2.10作为对照的人IgG1抗原结合分子的制备
测定法中使用的另外一种对照分子(对照F)是一种非靶向性DP47,种系对照,人IgG1,依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法含有Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。
表21显示非靶向性DP47huIgG1PGLALA(对照F)的cDNA和氨基酸序列。
表21:非靶向性DP47huIgG1(对照F)的序列
表22显示抗PD1huIgG1PGLALA(克隆0314),即对照M的cDNA和氨基酸序列。
表22:抗PD1(0314)huIgG1PGLALA(对照M)的cDNA和氨基酸序列
实施例3
单价和二价抗PD1靶向性分拆三聚体4-1BB配体Fc融合抗原结合分子和对照分子的生成和纯化
将靶向性和非靶向性分拆三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合分子编码序列克隆入质粒载体,其自MPSV启动子驱动插入物表达且含有位于CDS的3’端的合成polyA序列。另外,该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞来生成分拆三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合分子。用相应的表达载体转染细胞。对于构建物7.1,7.2,7.4,7.6和相应的对照分子对照B和D,以1:1:1:1比率(“载体Fc穴链”:“载体PD1轻链”:“载体Fc节链”:“载体4-1BBL轻链”)。对于构建物7.3,7.6,7.11,7.12,7.13,7.14和对照C,以1:1:1比率(“载体Fc穴链”:“载体Fc节链”:“载体抗PD1轻链”)。就像双特异性构建物那样生成在测定法中作为对照使用的人IgG(对于转染,仅仅以1:1比率使用轻链的载体和重链的载体)。
对于500mL摇瓶中的生成,在转染之前24小时接种300x106个HEK293EBNA细胞。对于转染,将细胞以210x g离心10分钟,并用20mL预温热的CD CHO培养基替换上清液。在20mLCD CHO培养基中混合表达载体(200μg总DNA)。添加540μL PEI之后,将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后,将细胞与DNA/PEI溶液混合,转移至500mL摇瓶并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育之后,添加160mL补充有6mM L-谷氨酰胺,5g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基并将细胞培养24小时。转染之后一天,添加12％补料7和葡萄糖(终浓度3g/L)。培养7天之后,通过以至少400x g离心30-40分钟来收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器),补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v),并保持于4℃。
通过使用蛋白A的亲和层析,继以大小排阻层析,自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。对于亲和层析,将上清液加载到用磷酸钠(20mM),柠檬酸钠(20mM)缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL,树脂来自GE Healthcare)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液清洗来去除未结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠,100mM氯化钠,100mM甘氨酸缓冲液(pH2.5)的线性梯度(20个CV)或分步洗脱(8个CV)任一洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度,应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过添加1/10(v/v)的0.5M磷酸钠,pH 8.0来调节收集的级分的pH。浓缩蛋白质,之后加载到用pH 6.0的20mM组氨酸,140mM氯化钠,0.01％(v/v)吐温20溶液平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数,通过测量280nm处的光密度(OD)来确定蛋白质浓度。通过在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和缺失下的SDS-PAGE和用Coomassie SimpleBlueTMSafeStain(Invitrogen USA)的染色或使用Caliper LabChipGXII(Perkin Elmer)的CE-SDS来分析靶向性三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合物的纯度和分子量。于25℃使用在25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM L-精氨酸一氢氯化物,0.02％(w/v)NaN3,pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)分析样品的聚集物含量。
表23汇总FAP(4B9)靶向性和非靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子和对照分子的产率和最终单体含量。
表23:PD1靶向性和非靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子和对照分子的生化分析
构建物 单体[％](SEC) 产率[mg/l]
构建物7.1 97.2 110.2
构建物7.3 96.6 8.9
构建物7.5 85 5.1
构建物7.6 100 16.5
对照B 99 15.4
对照C 98 12.6
对照D 99.5 25.9
对照M 99 34.4
对照F 100 50
实施例4
PD1靶向性4-1BB分拆三聚体配体Fc融合抗原结合分子的同时结合,通过表面等离振子共振
4.1用于表面等离振子共振的抗原的制备,纯化和表征
4-1BB Fc(kih)融合分子的制备
将编码人4-1BB的外域(人4-1BB的氨基酸24至186,依照Q07011,SEQ ID NO:163)的DNA序列与节上的人IgG1重链CH2和CH3域同框亚克隆。在抗原外域和人IgG1的Fc之间引入AcTEV蛋白酶切割位点。在抗原-Fc节的C端引入用于定向生物素化的Avi标签。含有S354C/T366W突变的抗原-Fc节链与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链的组合容许生成异二聚体,其包括含有单拷贝的4-1BB外域的链,从而创建单体形式的Fc连接的抗原。表24显示抗原Fc融合构建物的cDNA和氨基酸序列。
表24:单体抗原Fc(kih)融合分子的cDNA和氨基酸序列
将所有4-1BB-Fc融合分子编码序列克隆入质粒载体,其自MPSV启动子驱动插入物表达且含有位于CDS 3’端的合成polyA信号序列。另外,该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
对于生物素化的单体抗原/Fc融合分子的制备,用编码融合蛋白的两种构件(节和穴链)以及生物素化反应所必需的酶BirA的三种载体共转染指数式生长的悬浮HEK293EBNA细胞。以2:1:0.05比率(“抗原ECD-AcTEV-Fc节”:“Fc穴”:“BirA”)使用相应的载体。
对于500ml摇瓶中的蛋白质生成,在转染前24小时接种400x106个HEK293 EBNA细胞。对于转染,将细胞以210g离心5分钟,并用预温热的CD CHO培养基替换上清液。在含有200μg载体DNA的20mL CD CHO培养基中重悬浮表达载体。添加540μL聚乙烯亚胺(PEI)之后,将溶液漩涡震荡15秒并于室温温育10分钟。之后,将细胞与DNA/PEI溶液混合,转移至500mL摇瓶并在具有5％CO2气氛的温箱中于37℃温育3小时。温育之后,添加160mL F17培养基并将细胞培养24小时。转染之后一天,将1mM丙戊酸和7％含有补充物的补料1添加至培养物。培养7天之后,通过以210x g悬降15分钟来收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器),补充叠氮化钠至终浓度0.01％(w/v),并保持于4℃。
通过使用蛋白A的亲和层析,继以大小排阻层析,自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。对于亲和层析,将上清液加载到用40mL 20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠pH 7.5平衡的HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5mL,GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的含有20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠,0.5M氯化钠的缓冲液(pH 7.5)清洗来去除未结合的蛋白质。使用在20个柱体积的20mM柠檬酸钠,0.01％(v/v)吐温20,pH 3.0上创建的氯化钠的线性pH梯度(0至500mM)洗脱结合的蛋白质。然后将柱用10个柱体积的20mM柠檬酸钠,500mM氯化钠,0.01％(v/v)吐温20,pH 3.0清洗。
通过添加1/40(v/v)的2M Tris,pH8.0来调节收集的级分的pH。浓缩并过滤蛋白质,之后加载到用pH 7.4的2mM MOPS,150mM氯化钠,0.02％(w/v)叠氮化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
对于对人受体的亲和力测定,还将人4-1BB的外域与avi(GLNDIFEAQKIEWHE,SEQID NO:168)和六组氨酸标签同框亚克隆。
如上文关于Fc融合蛋白描述的实施蛋白质生成。通过螯合层析,继以大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。在20mM磷酸钠,500nM氯化钠,pH 7.4中平衡的NiNTA Superflow筒(5ml,Qiagen)上实施第一层析步骤。通过应用洗脱缓冲液(20mM磷酸钠,500nM氯化钠,500mM咪唑,pH7.4)在12个柱体积上的5％至45％梯度来实施洗脱。浓缩并过滤蛋白质,之后加载到用pH 7.4的2mM MOPS,150mM氯化钠,0.02％(w/v)叠氮化钠溶液平衡的HiLoad Superdex 75柱(GE Healthcare)上(表25)。
表25:单体人4-1BB His分子的序列
人PD1 Fc融合抗原购自R&D systems(目录号1086-PD-050)。
4.2通过表面等离振子共振测定靶向性C端4-1BB分拆三聚体配体Fc融合抗原结合分子的同时结合
通过表面等离振子共振(SPR)评估同时结合人4-1BB Fc(kih)和人PD1的能力。于25℃在Biacore T200上实施所有SPR实验,用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20,Biacore,Freiburg/Germany)。
将生物素化人4-1BB Fc(kih)直接偶联至链霉亲合素(SA)传感器芯片的流动室。使用高至200个共振单位(RU)的固定化水平。使靶向性三聚体C端4-1BB配体Fc(kih)融合分子以200nM的浓度范围以30μL/min的流流过流动室达90秒并将解离设置成零秒。以500nM的浓度以30μL/min的流作为第二分析物注射人PD1-Fc(R&D systems)通过流动室达90秒(图12A)。对解离监测120秒。通过减去在参照流动室中获得的响应来修正本体(bulk)折射率差异,那里不固定化蛋白质。所有双特异性构建物能同时结合人4-1BB和人PD1(图12B,12C,12D和12E)。
实施例5
PD1靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
5.1 PD1靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子在新鲜和活化的人PMBC上的结合
自苏黎世献血中心获得血沉棕黄层。为了分离新鲜的外周血单个核细胞(PBMC),用相同体积的DPBS(Gibco by Life Technologies,目录号14190 326)稀释血沉棕黄层。对50mL聚丙烯离心管(TPP,目录号91050)供应15mL Histopaque 1077(SIGMA Life Science,目录号10771,聚蔗糖和泛影酸钠,调节至1.077g/mL的密度)并将经过稀释的血沉棕黄层内容物在Histopaque1077上分层。将管以450x g离心30分钟。然后自界面收集PBMC,用DPBS清洗三次并在由供应有10％(v/v)胎牛血清(FBS,美国起源,PAN biotech,P30-2009,批号P150307GI,经伽马照射的,无支原体,56℃热灭活35分钟),1％(v/v)GlutaMAX-I(GIBCO byLife Technologies,目录号35050 038),1mM丙酮酸钠(SIGMA,目录号S8636),1％(v/v)MEM非必需氨基酸(SIGMA,目录号M7145)和50μMβ-巯基乙醇(SIGMA,M3148)的RPMI 1640培养基(Gibco by Life Technology,目录号42401-042)组成的T细胞培养基中重悬浮。
PBMC在分离之后直接使用(新鲜人PBMC上的结合)或刺激它们以诱导T细胞的细胞表面上的4-1BB表达(活化的人PBMC上的结合)。为了诱导人T细胞上的4-1BB上调,将PBMC以1x106个细胞/mL的浓度在供应有10％胎牛血清(FBS,美国起源,PAN biotech,P30-2009,批号P150307GI,经伽马照射的,无支原体且,56℃热灭活35分钟),1％GlutaMAX-I(GIBCO byLife Technologies,目录号35050-038),200U/mL Proleukin(Novartis Pharma SchweizAG,CHCLB-P-476-700-10340,批号AA4493BAL)和2μg/mL PHA-L(SIGMA,目录号L2769)的RPMI 1640(Gibco by Life Technology,目录号42401-042)中培养3天。3天后,收获预活化的人PBMC,在供应有10％FBS,1mM丙酮酸钠(SIGMA,目录号S8636),1％Gluta-MAX-I,1％MEM非必需氨基酸溶液(SIGMA,目录号M7145)和50μMβ-巯基乙醇(Sigma,M3148)的RPMI 1640中重悬浮至1x106个细胞/mL的终浓度。之后,在已经用10μg/mL抗人CD3(克隆OKT3,小鼠IgG2a,BioLegend,目录号317315)和2μg/mL抗人CD28(克隆CD28.2,小鼠IgG1,BioLegend,目录号302923)于4℃包被过夜的6孔组织培养板(TTP,目录号92006)中接种细胞。将细胞进一步于37℃和5％CO2温育2天。
对于结合测定法,将0.1x 106个新鲜或活化的PBMC添加至圆底悬浮细胞96孔板(greiner bio-one,celltar,目录号650185)的每个孔。将板以350x g且于4℃离心5分钟并丢弃上清液。之后,将细胞在100μL/孔含有1:5000稀释的可固定存活力染料eF660(eBioscience,目录号65-0864-18)的DPBS中于4℃在黑暗中染色30分钟。将细胞用200μL冰冷的DPBS缓冲液清洗一次。接着,添加50μL/孔4℃冷的含有滴定浓度的构建物7.1,构建物7.3,构建物7.5和构建物7.6和作为对照的对照B,对照C,对照D,对照M和对照F的FACS缓冲液(供应有2％FBS,5mM EDTA pH 8(Amresco,目录号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-Aldrich,目录号S2002)的DPBS)并将细胞于4℃温育60分钟,用200μL/孔4℃FACS缓冲液清洗三次。将细胞进一步在50μL/孔4℃冷的含有0.67μg/mL抗人CD45-AF488(克隆HI30,小鼠IgG1k,BioLegend,目录号304019),0.33μg/mL抗人CD8a-BV510(克隆SK1,小鼠IgG1k,BioLegend,目录号344732),0.23μg/mL抗人CD4-BV421(克隆OKT4,小鼠IgG2bκ,BioLegend,目录号317434),0.67μg/mL抗人CD3-PerCP-Cy5.5(克隆UCHT1,小鼠IgG1k,BioLegend,目录号300430),0.67μg/mL抗人CD19-PE/Cy7(克隆HIB19,小鼠IgG1k,BioLegend,目录号302216),5μg/mL PE缀合的AffiniPure抗人IgG F(ab`)2片段特异性山羊F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch,目录号109 116098)的FACS缓冲液中重悬浮并于4℃温育30分钟。将细胞用200μL/孔4℃FACS缓冲液清洗两次,然后用供应有1％甲醛(Sigma,HT501320-9.5L)的DPBS固定。将细胞在100μL/孔FACS缓冲液中重悬浮并使用MACS Quant Analyzer10(Miltenyi Biotech)获取。使用FlowJo V10(FlowJo,LLC)和GraphPad Prism 6.04(GraphPad Software,Inc)分析数据。
在活的CD45+CD3+CD19-CD8-CD4+ T细胞,CD45+CD3+CD19-CD4-CD8+ T细胞,CD45+CD3+CD4-CD8-γδT细胞和CD45+CD3-CD19+B细胞上设置门并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgGFcγ片段特异性山羊F(ab`)2片段的荧光强度的几何均值针对PD1靶向性或DP47非靶向性4-1BB分拆三聚体配体Fc融合抗原结合分子的滴定浓度绘图。如图13A-H中显示,在来自健康供体的静息的新鲜分离的人PBMC上,只有PD1靶向性4-1BB分拆三聚体配体Fc融合抗原结合分子(构建物7.1.,构建物7.3,构建物7.5和构建物7.6)和PD1靶向性人IgG对照M结合CD3+CD4+,CD3+CD8+和CD3+CD4-CD8-γδT细胞。而DP47非靶向性4-1BB分拆三聚体配体Fc融合抗原结合分子(对照B,C和D)并不结合任何新鲜分离的PBMC。因此,在新鲜分离的人PBMC上,大多数细胞并不表达4-1BB,而T细胞的一个群体表达可检测量的PD1。在表26中为对新鲜分离的人PBMC的结合曲线汇总EC50值。
表26:对新鲜分离的静息人PBMC的结合曲线的EC50值
如图14A-H中显示,在活化之后,活的CD45+CD3+CD19-CD8-CD4+ T细胞,CD45+CD3+CD19-CD4-CD8+ T细胞,CD45+CD3+CD4-CD8-γδT细胞和CD45+CD3-CD19+B细胞表达人4-1BB和人PD1。仅PD1结合性分子(对照M)或仅人4-1BB结合性分子(对照B,对照C和对照D)由此证明PD1在活化的CD4+ T细胞,CD8+ T细胞,γδT细胞和B细胞上高度上调,而4-1BB主要在CD8+ T细胞,γδT细胞和B细胞上上调而在CD4+ T细胞上程度较低。PD1靶向性4-1BB分拆三聚体配体Fc融合抗原结合分子(构建物7.1,构建物7.3,构建物7.5和构建物7.6)结合PD1和人4-1BB,而且这表现为与适配对照相比更高的荧光强度的几何均值。在表27中为对活化的人PBMC的结合曲线汇总EC50值。
表27:对活化的人PBMC的结合曲线的EC50值
5.2人PD1和人4-1BB转染的肿瘤细胞的结合
对于在表达PD1和4-1BB的肿瘤细胞上的结合测定法,使用两种经过遗传修饰的肿瘤细胞。人表达性HeLa-hu4-1BB-NFκB-luc克隆26细胞的生成会在实施例5.3.1中描述。对于表达人PD1的肿瘤细胞系,如下用人PD1转染CHO-k1细胞:用编码全长人PD1的质粒15311_hPD1-fl_pUC_Neo稳定转染亲本贴壁CHO-K1细胞系(ATCC CCL-61)并用G418(质粒上的新霉素抗性标志物)选择。
将0.1x 106个在DPBS(Gibco by Life Technologies,目录号14190 326)中重悬浮的肿瘤细胞添加至圆底悬浮细胞96孔板(greiner bio-one,celltar,目录号650185)的每个孔。将细胞用200μL DPBS清洗一次。将细胞在100μL/孔4℃冷的含有1:5000稀释的可固定存活力染料eFluor 660(eBioscience,目录号65-0864-18)的DPBS缓冲液中重悬浮并将板于4℃温育30分钟。将细胞用200μL/孔4℃冷的DPBS缓冲液清洗一次并在50μL/孔4℃冷的以一系列浓度含有PD1靶向性4-1BB分拆三聚体配体Fc融合抗原结合分子的FACS缓冲液(供应有2％FBS,5mM EDTA pH 8(Amresco,目录号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-Aldrich,S2002)的DPBS)中重悬浮,继以于4℃温育1小时。广泛清洗之后,将细胞进一步用50μL/孔4℃冷的含有5μg/mL PE缀合的AffiniPure抗人IgG F(ab`)2片段特异性山羊F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch,目录号109 116 098)的FACS缓冲液于4℃染色30分钟。将细胞用200μL/孔4℃FACS缓冲液清洗两次并在50μL/孔含有1％甲醛(Sigma,HT501320-9.5L)的DPBS中固定细胞。将细胞在100μL/孔FACS缓冲液中重悬浮并使用MACS Quant Analyzer 10(Miltenyi Biotech)获取。使用FlowJo V10(FlowJo,LLC)和GraphPad Prism 6.04(GraphPad Software,Inc)分析数据。
在活的肿瘤细胞上设置门并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgG Fcγ片段特异性山羊F(ab`)2片段的荧光强度的几何均值针对PD1靶向性4-1BB分拆三聚体配体Fc融合抗原结合分子或它们的对照的滴定浓度绘图。如图15A和15B中显示的,只有PD1靶向性分拆三聚体4-1BB配体融合分子构建物7.1,构建物7.3,构建物7.5和构建物7.6和对照M结合表达PD1的CHO-k1-huPD1克隆5而非PD1靶向性对照分子对照B,对照C,对照D和对照F不结合肿瘤细胞。在图16A和16B中,只有含有分拆三聚体4-1BB配体的融合分子构建物7.1,构建物7.3,构建物7.5和构建物7.6和对照B,对照C和对照D结合表达人4-1BB的HeLa-hu4-1BB-NFkB-luc克隆26而并不含有融合的分拆三聚体4-1BB配体的对照(对照F和对照M)不结合表达人4-1BB的肿瘤细胞。在表28中列出曲线的EC50值。
表28:对表达人PD1或人4-1BB的肿瘤细胞的结合曲线的EC50值
实施例6
PD1靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物学活性表达人4-1BB的HeLa报告细胞系的NF-κB活化
6.1表达人4-1BB和NF-κB-萤光素酶的HeLa细胞的生成
用基于表达载体pETR10829的质粒转导人乳头瘤病毒18诱发的宫颈癌细胞系HeLa(ATCC CCL-2),该质粒含有在CMV启动子控制下的人4-1BB的序列(Uniprot登录号Q07011)和嘌呤霉素抗性基因。在供应有10％胎牛血清(FBS,GIBCO by Life Technologies,目录号16000-044,批号941273,经伽马照射的,无支原体,于56℃热灭活35分钟),1％GlutaMAX-I(GIBCO by Life Technologies,目录号35050-038)和3μg/mL嘌呤霉素(InvivoGen,目录号ant-pr-1)的DMEM培养基(Gibco by Life Technologies,目录号42430-025)中培养细胞。
通过流式细胞术对经4-1BB转导的HeLa细胞测试4-1BB表达:在含有0.1μg PerCP/Cy5.5缀合的抗人4-1BB小鼠IgG1κ克隆4B4-1(BioLegend目录号309814)或其同种型对照(PerCP/Cy5.5缀合的小鼠IgG1κ同种型对照抗体克隆MOPC 21,BioLegend目录号400150)的100μL FACS缓冲液(供应有2％FBS,5mM EDTA pH 8(Amresco,目录号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-Aldrich,目录号S2002)的DPBS)中重悬浮0.2x 106个活的细胞并于4℃温育30分钟。将细胞用FACS缓冲液清洗两次,在300μL含有0.06μg DAPI(Santa Cruz Biotec,目录号Sc-3598)的FACS缓冲液中重悬浮并使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience,DIVAsoftware)获取。如下实施有限稀释以生成单克隆:将经人4-1BB转导的HeLa细胞在培养基中重悬浮至10,5和2.5个细胞/mL的浓度并将200μL细胞悬浮液转移至经过处理的圆底组织培养96孔板(6块板/细胞浓度,TPP目录号92697)。收获单克隆,扩充并如上文描述的测试4-1BB表达。选择具有最高4-1BB表达的克隆(克隆5)用于后续用NFκB-萤光素酶表达载体5495p Tranlucent HygB的转染。该载体赋予转染细胞以对潮霉素B的抗性和在NFκB应答元件控制下表达萤光素酶的能力二者(Panomics,目录号LR0051)。将人4-1BB HeLa克隆5细胞培养至70％汇合。将50μg(40μL)线性化(限制酶AseI和SalI)5495p Tranlucent HygB表达载体添加至一系列0.4cm Gene Pulser/MicroPulser杯(Biorad,目录号165-2081)。添加400μl无补充物的DMEM中的2.5x 106个人4-1BB HeLa克隆5细胞并与质粒溶液小心混合。以下述设置使用Gene Pulser Xcell total system(Biorad,目录号165 2660)实施细胞转染:指数式脉冲,电容500μF,电压160V,电阻∞。在脉冲之后立即将转染细胞转移至装有15mL 37℃温热的供应有10％FBS和1％GlutaMAX I(GIBCO by Life Technologies,目录号35050 038)的DMEM培养基(GIBCO by Life Technologies,目录号42430-025)的75cm2的组织培养瓶(TPP,目录号90075)。次日,添加含有3μg/mL嘌呤霉素(InvivoGen,目录号ant pr-1)和200μg/mL潮霉素B(Roche,目录号10843555001)的培养培养基。扩充存活细胞并如上文描述的实施有限稀释以生成单克隆。如上文描述的对克隆测试4-1BB表达并如下测试NFκB-萤光素酶活性:在选择培养基中收获克隆并使用Cell Counter Vi-cell xr 2.03(BeckmanCoulter,目录号731050)计数。将细胞设置成0.33x 106个细胞/mL的细胞密度并将150μL这种细胞悬浮液转移至带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio one,目录号655083)和作为对照的正常96孔平底组织培养板(TPP,目录号92096)的每个孔,次日测试存活和细胞密度。将细胞于37℃和5％CO2温育过夜。次日,将50μL含有不同浓度的重组人肿瘤坏死因子α(rhTNFα,PeproTech,目录号300 01A)的培养基添加至96孔板的每个孔,产生100,50,25,12.5,6.25和0ng/孔的rhTNFα终浓度。将细胞于37℃和5％CO2温育6小时,然后用200μL/孔DPBS清洗三次。将报告物裂解缓冲液(Promega,目录号E3971)添加至每个孔(30μl)并将板于-20℃保存过夜。次日,将冷冻的细胞板和检测缓冲液(萤光素酶1000测定系统,Promega,目录号E4550)融化至室温。将100μL检测缓冲液添加至每个孔并使用SpectraMax M5/M5e微量板读数仪和SoftMax Pro软件(Molecular Devices)尽可能快地测量板。采用测量到的对照(不添加rhTNFα)以上的URL作为萤光素酶活性。选择展现最高萤光素酶活性和可观水平的4-1BB表达的NFκB-luc-4-1BB-HeLa克隆26供进一步使用。
6.2与表达PD1的CHO-k1-huPD1克隆5细胞共培养的表达人4-1BB的HeLa报告细胞的NF-κB活化
用DPBS(GIBCO by Life Technologies,目录号14190 326)清洗NFκB-luc-4-1BB-HeLa克隆26细胞并用0.05％胰蛋白酶EDTA(GIBCO by Life Technologies,目录号25300054)于37℃处理5分钟。收获细胞并在供应有10％胎牛血清(FBS,美国起源,PAN biotech,P30-2009,批号P150307GI,经伽马照射,无支原体,于56℃热灭活35分钟)和1％GlutaMAX-I(GIBCO by Life Technologies,目录号35050 038)的DMEM培养基(GIBCO by LifeTechnologies,目录号42430 025)中重悬浮。使用Cell Counter Vi-cell xr 2.03(Beckman Coulter,目录号731050)对细胞计数并设置成0.2x 106个细胞/mL的细胞密度。将100μL(2x 104个细胞)这种细胞悬浮液转移至带盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio one,目录号655083)的每个孔并将板于37℃和5％CO2温育过夜。次日,添加50μL含有不同滴定的含有分拆三聚体4-1BB配体的融合分子构建物7.1,构建物7.3,构建物7.5和构建物7.6或适配对照对照B,对照C,对照D,对照F和对照M的培养基。对于PD1结合介导的交联,使用表达PD1的CHO-k1-huPD1克隆5细胞。
用DPBS(GIBCO by Life Technologies,目录号14190 326)清洗贴壁CHO-k1-huPD1克隆5细胞并用无酶,基于PBS的细胞解离缓冲液(GIBCO by Life Technologies,目录号13151-014)于37℃处理10分钟。之后,收获细胞并使用Cell Counter Vi-cell xr2.03计数。将细胞在供应有10％FBS和1％L-GlutaMAX-I的DEM中重悬浮至2x 106个细胞/mL并添加50μL/孔。在添加表达交联PD1的CHO-k1-huPD1克隆5细胞之后,将板于37℃和5％CO2温育6小时。将白色平底96孔板用200μL/孔DPBS清洗三次。将40μl新鲜制备的报告物裂解缓冲液(Promega,目录号E3971)添加至每个孔并将板于-20℃保存过夜。次日,将冷冻的板和检测缓冲液(萤光素酶1000测定系统,Promega,目录号E4550)融化至室温。将100uL检测缓冲液添加至每个孔并以下述设置使用SpectraMax M5/M5e微量板读数仪和SoftMax Pro软件(Molecular Devices)尽可能快地测量板:对于萤光素酶(RLU),500ms积分时间,无滤光片,收集所有波长和头等读数。
PD1靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(PD1分拆4-1BBL三聚体)在表达PD1的肿瘤细胞存在下在报告细胞系中触发NFκB信号传导途径的激活。与之对比,同一分子的非靶向性变体在测试的任何浓度未能触发此类效应(图17C和17D)。靶向性4-1BBL的这种活性严格依赖于肿瘤细胞的细胞表面上PD1的表达,因为在与PD1阴性肿瘤细胞一起培养NF-kB报告细胞系后检测不到NF-kB活化,甚至在PD1靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子存在下(图17A和17B)。显示了对构建物7.1,7.3,7.5和7.6测量到的活性。在表达PD1的肿瘤细胞存在下测量到的EC50值在下文表29中给出。
表29:NFκB活化诱导的萤光素酶活性曲线的EC50值
构建物7.1 构建物7.3 构建物7.5 构建物7.6
CHO-k1-huPD1克隆5的EC<sub>50</sub>[nM] 0.004 0.004 0.006 0.007
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Claims (36)

1.一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
2.权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其进一步包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
3.权利要求1或2的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
(i)该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有相应的CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,或
(ii)该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有相应的CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,或
(iii)该第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且该第二多肽含有相应的VL-CH1域或VH-CL域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头与VH或VL且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
4.权利要求1至3中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
5.权利要求1至4中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该TNF配体家族成员是4-1BBL。
6.权利要求1至5中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该TNF配体家族成员的外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
7.权利要求1至6中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:10组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组的氨基酸序列。
8.权利要求1至6中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的模块,和
(b)含有CH1或CL域的第一多肽和含有相应的CL或CH1域的第二多肽,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含通过肽接头与该CH1或CL域且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且在于该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
9.权利要求1至8中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块是能够特异性结合PD1的Fab分子。
10.权利要求1至9中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3,
(b)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的HVR-L1(v)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的HVR-L3,
(c)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的HVR-L1(v)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HVR-L3,
(d)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的HVR-L1(v)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的HVR-L3,
(e)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的HVR-L1(v)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的HVR-L3,
(f)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的HVR-L1(v)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的HVR-L3,或
(g)VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的HVR-L1(v)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的HVR-L3。
11.权利要求1至10中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL域,
(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL域,
(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL域,
(d)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL域,
(e)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL域,
(f)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL域,
(g)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL域,
(h)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL域,
(i)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL域,
(k)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL域,或
(l)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL域。
12.权利要求1至11中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含VH域和VL域,该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3,该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1,(v)包含SEQID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
13.权利要求1至12中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该能够特异性结合PD1的模块包含
(a)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL域,
(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的VL域,
(c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL域,
(d)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的VL域,或
(e)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的VL域。
14.权利要求1至13中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
第一重链和第一轻链,二者构成能够特异性结合PD1的Fab分子,第一肽,其包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段,在其C端通过第二肽接头与第二重或轻链融合,和第二肽,其包含所述TNF配体家族成员的一个外域,在其C端通过第三肽接头与相应的第二轻或重链融合。
15.权利要求1至13中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段的第一肽在其C端通过第二肽接头与作为重链一部分的CL域融合,
其该包含所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段的第二肽在其C端通过第三肽接头与作为轻链一部分的CH1域融合。
16.权利要求1至13中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合PD1的Fab域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有相应的CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段。
17.权利要求1至13中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(i)融合多肽,其包含Fc域的第一亚基和通过肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的TNF配体家族成员的两个外域或其片段,(ii)重链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VH域,该Fc域的第二亚基和经由肽接头与该CH3域的C端连接的所述TNF配体家族成员的一个外域或其片段,和(iii)轻链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VL域,或(i)融合多肽,其包含Fc域的第一亚基和通过肽接头与该CH3域的C端连接的一个TNF配体家族成员的外域或其片段,(ii)重链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VH域,该Fc域的第二亚基和经由肽接头与该CH3域的C端且彼此连接的所述TNF配体家族成员的两个外域或其片段,和(iii)轻链,其包含该能够特异性结合PD1的Fab域的VL域。
18.权利要求2至17中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该Fc域包含一处或多处降低对Fc受体,特别是对Fcγ受体的结合的氨基酸替代。
19.权利要求2至18中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该Fc域是包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)的IgG1Fc域。
20.权利要求2至19中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的节-入-穴修饰。
21.权利要求1至13或18至20中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(i)包含包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VH域的第一重链和包含包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL域的第一轻链或
包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的VH域的第一重链和包含包含选自由SEQ IDNO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组的氨基酸序列的VL域的第一轻链,
(ii)包含选自由SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:80组成的组的氨基酸序列的第二重链,和
(iii)包含选自由SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:81组成的组的氨基酸序列的第二轻链。
22.权利要求1至13或18至21中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的第二轻链,
(b)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的第二轻链,
(c)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的第二轻链,或
(d)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的第二轻链。
23.权利要求1至13或16或18至20中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含两个能够特异性结合PD1的Fab域。
24.权利要求1至13或16或18至20或23中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的第二重链,和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的两条轻链,或
(b)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的第二重链,和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的两条轻链。
25.权利要求1至13或17或18至20中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该抗原结合分子包含
(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链,
(b)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链,
(c)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链,
(b)包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的融合多肽,包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链。
26.一种分离的多核苷酸,其编码权利要求1至25中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
27.一种载体,特别是表达载体,其包含权利要求26的分离的多核苷酸。
28.一种宿主细胞,其包含权利要求26的分离的多核苷酸或权利要求27的载体。
29.一种生成权利要求1至25中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的方法,其包含在适合于该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子表达的条件下培养权利要求28的宿主细胞和分离该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
30.一种药用组合物,其包含权利要求1至25中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。
31.权利要求1至25中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或权利要求30的药用组合物,其供作为药物使用。
32.权利要求1至25中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或权利要求30的药用组合物,其供在上调或延长细胞毒性T细胞活性中使用。
33.权利要求1至25中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其供在治疗癌症中使用。
34.权利要求1至25中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子用于制造用于治疗癌症的药物的用途。
35.一种治疗具有癌症的个体的方法,其包含对该个体施用有效量的权利要求1至25中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或权利要求30的药用组合物。
36.一种在具有癌症的个体中上调或延长细胞毒性T细胞活性的方法,其包含对该个体施用有效量的权利要求1至25中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或权利要求30的药用组合物。
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