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JP7285076B2 - Ｔｎｆファミリーリガンドトリマーとテネイシン結合部分とを含む抗原結合分子 - Google Patents

Ｔｎｆファミリーリガンドトリマーとテネイシン結合部分とを含む抗原結合分子 Download PDF

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Description

本発明は、新規ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、（ａ）テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分と、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドとを含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子に関する。本発明は、さらに、これらの分子の製造方法及びこれらの分子の使用方法に関する。
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体スーパーファミリーの分子と相互作用するリガンドは、免疫系の機構及び機能に極めて重要な役割を担っている。免疫応答、造血及び形態形成等の正常な機能を調節する上に、ＴＮＦファミリーリガンド（サイトカインとも呼ばれる）は、腫瘍発生、移植拒絶反応、敗血症性ショック、ウイルス複製、骨吸収、関節リウマチ及び糖尿病にも関与する（Aggarwal、2003）。ＴＮＦリガンドファミリーは、「ＴＮＦ相同ドメイン」（ＴＨＤ）と命名された保存Ｃ末端ドメインの存在を特徴とする、１９のＩＩ型（すなわち、細胞内Ｎ末端及び細胞外Ｃ末端）膜貫通タンパク質をコードする１８の遺伝子を含む。このドメインは、受容体結合に関与し、したがって、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの生物活性に肝要である。ファミリーメンバー間の配列同一性は、約２０－３０％である（Bodmer、2002）。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、それらの生物学的機能を自己集合性一価トリマーとして発揮する（Banner等、Cell 1993、73、431-445）。したがって、ＴＮＦファミリーリガンドは、ＴＮＦＲスーパーファミリーの対応する受容体と結合することができ、該受容体を活性化することができるトリマーを形成する。
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、その発現がＴ細胞活性化により誘導される分子として始めて同定された（Kwon及びWeissman、1989）。その後の研究により、Ｔ及びＢリンパ球における４－１ＢＢの発現（Snell等、2011;Zhang等、2010）、ＮＫ細胞における４－１ＢＢの発現（Lin等、2008）、ＮＫＴ細胞における４－１ＢＢの発現（Kim等、2008）、単球における４－１ＢＢの発現（Kienzle及びvon Kempis、2000;Schwarz等、1995）、好中球における４－１ＢＢの発現（Heinisch等、2000）、マスト細胞における４－１ＢＢの発現（Nishimoto等、2005）及び樹状細胞並びに非造血系由来の細胞、例えば内皮細胞及び平滑筋細胞、における４－１ＢＢの発現（Broll等、2001;Olofsson等、2008）が実証された。異なる細胞型における４－１ＢＢの発現は、主として誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体誘発等の様々な刺激シグナルによってはもちろん、炎症性サイトカインの共刺激分子又は受容体により誘導されるシグナル伝達によっても駆動される（Diehl等、2002;von Kempis等、1997;Zhang等、2010）。
４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）の発現は、より限定され、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージ等のプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で観察される。４－１ＢＢＬの誘導性発現は、αβＴ細胞サブセットとγδＴ細胞サブセットの両方を含むＴ細胞、及び内皮細胞に特有である（Shao及びSchwarz、2011に概説がある）。
ＣＤ１３７シグナル伝達が、ＮＫ細胞のＩＦＮγ分泌及び増殖を刺激すること（Buechele等、2012;Lin等、2008;Melero等、1998）、並びに生残期間の延長、サイトカイン分泌能力の増大及び共刺激分子発現増加能力の増大によって示されるようにＤＣ活性化を促進すること（Choi等、2009;Futagawa等、2002;Wilcox等、2002）は公知である。しかし、ＣＤ１３７は、Ｔ細胞のＣＤ４＋サブセットとＣＤ８＋サブセットの両方においてＴＣＲ誘導活性化を調節する共刺激分子として最もよく特徴づけられている。ＴＣＲ誘発と併せて、アゴニスト４－１ＢＢ特異的抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するＴリンパ球の感受性を減少させる（Snell等、2011に概説がある）。
インビトロでのＴ細胞に対する４－１ＢＢのこれらの共刺激効果と一致して、担腫瘍マウスへのそれらの投与は、多くの実験腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍効果をもたらす（Melero等、1997;Narazaki等、2010）。しかし、４－１ＢＢは、通常は、他の免疫調節化合物（Curran等、2011;Guo等、2013;Morales-Kastresana等、2013;Teng等、2009;Wei等、2013）、化学療法試薬（Ju等、2008;Kim等、2009）、腫瘍特異的ワクチン接種（Cuadros等、2005;Lee等、2011）又は放射線療法（Shi及びSiemann、2006）と併用で投与されたときにのみ、抗腫瘍剤としてのその効力を呈示する。インビボ枯渇実験により、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、４－１ＢＢ特異的抗体の抗腫瘍作用に最も肝要な役割を果たすことが実証された。しかし、抗４－１ＢＢを含む、腫瘍モデル又は併用療法に依存して、ＤＣ、ＮＫ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞等の他の細胞型の寄与が報告されている（Melero等、1997;Murillo等、2009;Narazaki等、2010;Stagg等、2011）。
異なるリンパ球サブセットに対するそれらの直接的効果に加えて、４－１ＢＢアゴニストは、腫瘍血管内皮上での細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ１）及び血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）の４－１ＢＢ媒介発現増加によって活性化Ｔ細胞の腫瘍内への浸潤及び腫瘍内での保持も誘導することができる（Palazon等、2011）。
４－１ＢＢ誘発は、腫瘍微小環境内又は慢性感染中の免疫学的寛容の破綻の一因となり得る、可溶型抗原への曝露により誘導されるＴ細胞アネルギーの状態も好転させることがある（Wilcox等、2004）。
ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のアポトーシス誘導又は免疫調節メンバーに特異的なアゴニスト抗体について記載されているように（Li及びRavetch、2011;Teng等、2009）、インビボでの４－１ＢＢアゴニスト抗体の免疫調節特性には抗体分子上の野生型Ｆｃ部分の存在が必要であるため、Ｆｃ受容体結合は、そのような試薬の薬理活性に必要な重要な事象として意味づけられると思われる。しかし、機能的に活性なＦｃドメインを有する４－１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与は、肝毒性に関連するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖も誘導し（Dubrot等、2010）、これは、マウスでは機能性Ｆｃ受容体の非存在下で減少されるか、又は有意に改善される。ヒト臨床治験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、ＮＣＴ００３０９０２３）で１２週間にわたって３週間に１回投与されたＦｃコンピテント４－１ＢＢアゴニスト抗体（ＢＭＳ－６６３５１３）は、メラノーマ、卵巣又は腎細胞がんを有する患者において疾患の安定化を誘導した。しかし、別の治験（ＮＣＴ００６１２６６４）で投与された同じ抗体は、グレード４肝炎を引き起こして治験の中止をもたらした（Simeone及びAscierto、2012）。
まとめると、入手可能な前臨床及び臨床データは、有効な４－１ＢＢアゴニストの高度な臨床的需要があることを明確に示す。しかし、新世代薬候補は、造血細胞及び内皮細胞の表面で４－１ＢＢと有効に会合しなければならないばかりでなく、制御できない副作用を回避するためにＦｃ受容体との結合以外のメカニズムによってその有効な会合を果たすこともできなければならない。後者は、腫瘍特異的部分又は腫瘍関連部分への優先的結合によってし得る。
テネイシンは、脊椎動物に見られる、大きい多量体細胞外マトリックス（ＥＣＭ）糖タンパク質の高度に保存されるファミリーである。テネイシンＣ、テネイシンＲ、テネイシンＸ及びテネイシンＷと称される４つのテネイシンパラログが、哺乳動物において同定されている。テネイシンファミリータンパク質は、Ｎ末端７アミノ酸リピート、上皮増殖因子（ＥＧＦ）様リピート、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインリピート及びＣ末端フィブリノーゲン様球状ドメインを含む、共通の一次構造を有する。Ｎ末端オリゴマー化ドメインによって、個々のサブユニットは、集合してトリマーになり、又はさらにはＴｎＣの場合のようにヘキサマーになる。実際、ＴｎＣのオリゴマー化ドメインは、それぞれのＴＮＦ受容体リガンドに融合されたとき、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４１ＢＢＬ、及びグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体リガンドの三量体化を増進すると報告された（Wyzgol等、J Immunol. 183(3)、1851-61(2009)及びBerg等、Cell Deatch and Differentiation 14(12、2021-2034(2007)を参照されたい）。これらの研究は、ＴｎＣポリペプチド鎖の断片を使用して、ＴｎＣ－ＴＮＦ－リガンド融合ポリペプチド中の活性化トリマー形態のＴＮＦリガンドを安定させた。
哺乳動物テネイシンＣ（ＴｎＣ）モノマーは、典型的に、１．４５個のＥＧＦ様リピート及び８個のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインリピートを有し、これらは、全てのテネイシンＣアイソフォームにより共有される。しかし、９個以下のさらなるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ドメインＡ１からＤ）を独立して選択的スプライシングにより含めること又は排除することができ、その結果、多数のテネイシンＣアイソフォームが生じる（例えば、Hsia及びSchwarzbauer、J Biol Chem 280、26641-26644(2005)を参照されたい）。
テネイシンＣは、発生中の胚において一過性発現されるが、実際上、成体組織には存在しない。しかし、テネイシンＣは、ある特定の病的状態、例えば創傷治癒、炎症及びがんを含む、再形成過程を経る組織において再び現れる（Chiquet-Ehrismann及びChiquet、J Pathol 200、488-499(2003)に概説がある）。
重要なこととして、テネイシンＣは、脳、乳房、結腸、肺、皮膚及び他の器官の腫瘍を含む、悪性固形腫瘍の大多数において高度に発現され（Orend及びChiquet-Ehrismann、Cancer Letters 244、143-163(2006)に概説がある）、これらの器官における腫瘍微小環境では形質転換上皮細胞によってはもちろん間質細胞によっても発現され得る（Yoshida等、J Pathol 182、421-428(1997)、Hanamura等、Int J Cancer 73、10-15(1997)）。特に、選択的スプライシングを受けたドメインＡ１からＤを含有するテネイシンＣの「大型アイソフォーム」は、浸潤がんでは発現されるが、健常成体組織ではほぼ検出不能である（Borsi等、Int J Cancer 52、688-692(1992)、Carnemolla等、Eur J Biochem 205、561-567(1992)）。
活性で安全な４－１ＢＢアゴニストが依然として必要とされている。本発明の二重特異性分子は、本発明の分子を広範な悪性腫瘍の腫瘍細胞に標的指向化する少なくとも１つのＴｎＣ抗原結合部分と、トリマーの従って生物活性のＴＮＦリガンドとを有するものであり、腫瘍細胞に対処するためのユニークな標的指向化ツールとなる。本発明の抗原結合分子は、薬学的に有用であるために十分な安定性を有し、向上した効率及び安全性で種々のがんの治療に使用することができる。
一態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
特定の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子であり、
（ｃ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
さらなる態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１若しくはＣＬドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＬ若しくはＣＨ１ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１若しくはＣＬドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＬ若しくはＣＨ１ドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによってポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ－ＣＬ若しくはＶＬ－ＣＨ１ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＶＬ－ＣＨ１ドメイン若しくはＶＨ－ＣＬドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ若しくはＶＬに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバー２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＶＬ若しくはＶＨに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、抗原結合分子を提供する。
特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ヒトＴ細胞活性化を共刺激するものである。したがって、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とし、この場合、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ヒトＴ細胞活性化を共刺激する。より特に、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４－１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
一態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４－１ＢＢＬである。
さらなる態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１８３、配列番号１９２、配列番号１９３及び配列番号１９４からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に、配列番号１７２又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片は、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に、配列番号１７２又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。より特に、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１７６、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１７２、配列番号１７４及び配列番号１７５及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１８７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
なおさらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１８４のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１８８又は配列番号１８９のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ＣＨ１又はＣＬドメインを含有する第１のポリペプチド、及びＣＬ又はＣＨ１ドメインを含有する第２のポリペプチドと
をそれぞれ含み、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
一態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ＣＨ１ドメインを含有する第１のポリペプチド、及びＣＬドメインを含有する第２のポリペプチドと
を含み、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１ドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＬドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ＣＬドメインを含有する第１のポリペプチド、及びＣＨ１ドメインを含有する第２のポリペプチドと
を含み、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＬドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＨ１ドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が抗体断片である、上文で定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
特に、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分は、抗原結合部分である。
特に、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分は、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、並びにａＶＨ及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される。
特に、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、ＴｎＣと特異的に結合することができる１つ又は２つの部分を含む。
特定の態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分がＦａｂ分子である、上で定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
一態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が足場抗原結合タンパク質である、上文で定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、ＴｎＣと特異的に結合することができる１つの部分を含む。別の態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる２つの部分を含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、（ｉ）配列番号６７又は配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号６８又は配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号６９又は配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５５又は配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５６又は配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号５７又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、（ｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
別の態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、（ｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
一態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、配列番号４６のアミノ酸配列を含む可変重鎖と配列番号４５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含むか、又はＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、配列番号４８のアミノ酸配列を含む可変重鎖と配列番号４７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む、上文で定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、本発明によるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖のＣＨ１又はＣＬドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片が、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖のＣＬ又はＣＨ１ドメインに融合されている、抗原結合分子が提供される。
特定の態様では、本発明は、ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）２、すなわち、配列番号１５０のペプチドリンカーである、上で定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。一態様では、第１のペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２であり、第２のペプチドリンカーは、ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１５３）であり、第３のペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。別の態様では、第１、第２及び第３のペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。
本発明は、安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、上文で定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子にさらに関する。
特に、（ｃ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原と特異的に結合することができるＦａｂ分子をさらに含み、Ｆａｂ重鎖は、そのＣ末端でＦｃドメイン内のＣＨ２ドメインのＮ末端に融合されている。
さらなる態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの結合を促進する修飾を含む。
別の態様では、本発明は、
（ｃ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体との、特に、Ｆｃγ受容体への結合を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、上文で定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５位（ＥＵ番号付け）並びに／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より特に、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を有するＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、本発明によるトリマーＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、本発明は、第１の重鎖及び第１の軽鎖を含むＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、第１の重鎖及び第１の軽鎖の双方が、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子、Ｃ末端で第２のペプチドリンカーにより第２の重鎖又は軽鎖に融合されている第１のペプチドであって、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチド及びＣ末端で第３のペプチドリンカーにより第２の軽鎖又は重鎖に融合されている第２のペプチドであって、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含む第２のペプチドを含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
別の態様では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＬドメインに融合されている、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
さらに別の態様では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＬドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されている、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、本発明は、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＶＨドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＶＬドメインに融合されている、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
さらに、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメイン内の１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）に置換されており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）に置換されている、及びＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメイン内の１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子を両方が含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖、
（ｂ）配列番号１７６、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７５及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、上文に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と
を含む、抗原結合分子が提供される。
別の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１０２、配列番号１０８、配列番号１１６及び配列番号１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１７及び配列番号１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と
を含む、抗原結合分子を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む抗原結合分子を提供する。
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドは、そのＮ末端でＦｃドメインのサブユニットの一方のＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドは、そのＮ末端でＦｃドメインのサブユニットの他方のＣ末端に融合されており、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドは、配列番号１７６及び配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドは、配列番号１７２及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドは、配列番号１７６のアミノ酸配列を含み、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドは、配列番号１７２のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドは、配列番号１８４のアミノ酸配列を含み、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。
一態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインのサブユニットの一方のＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインのサブユニットの他方のＣ末端に融合されている抗原結合分子を提供する。したがって、本発明は、標的細胞抗原への結合について一価である、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
さらなる態様では、本発明は、（ｄ）ＴｎＣと特異的に結合することができないＦａｂドメインをさらに含む、前に定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。したがって、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドであって、第１のポリペプチドは、そのＮ末端でＦｃドメインのサブユニットの一方のＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドは、そのＮ末端でＦｃドメインの他方のサブユニットのＣ末端に融合されている、ポリペプチドと、
（ｄ）標的細胞抗原と特異的に結合することができないＦａｂドメインと
を含む、抗原結合分子を提供する。
特に、
（ｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖
を含む、上文に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
特に、そのようなＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、ＴｎＣと特異的に結合することができる２つの部分を含む。一態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる２つの部分を含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。特に、
（ｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖
を含む、上文に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーはＯＸ４０Ｌである。さらなる態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号１８１又は配列番号１８２からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１９０又は配列番号１９１のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１８１又は配列番号１８２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上文に記載の抗原結合分子が提供される。
別の態様では、標的細胞抗原がテネイシンＣ（ＴｎＣ）であり、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、（ｉ）配列番号６７又は配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号６８又は配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号６９又は配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５５又は配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５６又は配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号５７又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
特に、
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と
を含む、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
本発明の別の態様によれば、上文で定義するような抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター、及び本発明の単離されたポリペプチド又はベクターを含む宿主細胞を、さらに提供する。一部の実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、特に、哺乳動物細胞である。
別の態様では、本発明の抗原結合分子を産生する方法であって、（ｉ）本発明の宿主細胞を抗原結合分子の発現に好適な条件下で培養するステップ、及び（ｉｉ）抗原結合分子を回収するステップを含む方法が提供される。本発明は、本発明の方法により産生される抗原結合分子も包含する。
本発明は、本発明の抗原結合分子と少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とを含む薬学的組成物をさらに提供する。
医薬として使用するための、本発明の抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物も、本発明に包含される。一態様では、それを必要とする個体における疾患の治療に使用するための、本発明の抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物が提供される。特定の実施態様では、がんの治療に使用するための、本発明の抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物が提供される。
それを必要とする個体における疾患の治療用の医薬を製造するための、特に、がんの治療用の医薬を製造するための、本発明の抗原結合分子の使用、並びに個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態の本発明の抗原結合分子を含む組成物の治療有効量を前記個体に投与することを含む方法も提供される。具体的実施態様では、疾患は、がんである。上記実施態様の何れにおいても、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
図１は、抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４（図１ｂ）及び抗ＴｎＣクローン１１Ｃ７（図１ｃ）で染色したときの、倍率１００倍でのＬＳ１７４Ｔ異種移植片腫瘍における免疫組織学的染色を示す図である。染色パターンは、特定のＴｎＣ間質線維に対応する。クローン１８Ｄ４とクローン１１Ｃ７両方についてのＴｎＣ染色は、全体的に見て、中等度の強度で発現される。ネガティブアイソタイプコントロールシグナルは、この手法の特異性を確証する（図１ａ）。 図２は、ヒト腫瘍アレイにおけるウサギアイソタイプコントロールでの免疫組織学的染色の結果を示す図である。試験した全ての組織において、ネガティブアイソタイプコントロールシグナルは、この手法の特異性を確証する。 図３は、ヒト腫瘍アレイにおける抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４での免疫組織学的染色の結果を示す図である。染色パターンは、特定のＴｎＣ間質線維に対応する。ＴｎＣ染色は、殆どの腫瘍組織においてコントロール正常ペア組織と比較して高レベルで発現される。 図４は、抗ＴｎＣクローン１１Ｃ７でのヒト腫瘍アレイにおける免疫組織学的染色の結果を示す図である。染色パターンは、特定のＴｎＣ間質線維に対応する。ＴｎＣ染色は、殆どの腫瘍組織においてコントロール正常ペア組織と比較して高レベルで発現される。 図５は、一価のＴｎＣ標的スプリットトリマーヒト４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）（コンストラクト６．１）の集合成分を示す図である。Ａ）ヒトＩｇＧ１－ＣＬドメインに融合されているダイマーリガンド。Ｂ）ヒトＩｇＧ１－ＣＨ１ドメインに融合されているモノマーリガンド。 図６は、本発明の４－１ＢＢＬトリマー含有抗原結合分子コンストラクト６．１（ＣＨ－ＣＬクロスと荷電残基を含有する、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）ＰＧＬＡＬＡ融合体）を示す図である。このコンストラクトの調製及び産生は、実施例１．１で説明する。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＴｎＣ抗体１８Ｄ４のものであり、大きい黒い点は、ノブイントゥーホール修飾を表す。＊は、ＣＨ１及びＣＬドメインにおけるアミノ酸修飾（いわゆる荷電残基）を表す記号である。 図７は、一価のＴｎＣ標的スプリットトリマーヒト４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）（コンストラクト６．２）の集合成分を示す図である。Ａ）は、ヒトＩｇＧ１－ＣＬドメインに融合されているダイマーリガンドを示す。Ｂ）は、ヒトＩｇＧ１－ＣＨ１ドメインに融合されているモノマーリガンドを示す。 図８は、ＣＨ－ＣＬクロスを含有し、荷電残基を有さない、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．２）を示す図である。このコンストラクトの調製及び産生は、実施例１．２で説明する。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＴｎＣ抗体１８Ｄ４のものであり、大きい黒い点は、ノブイントゥーホール修飾を表す。 図９は、二価のＴｎＣ標的のスプリットトリマーヒト４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）（コンストラクト６．３）の集合成分を示す図である。Ａ）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖に融合されているダイマーリガンドを示す。Ｂ）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ鎖に融合されているモノマーリガンドを示す。 図１０は、二価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）ＰＧＬＡＬＡ融合体（コンストラクト６．３）を示す図である。このコンストラクトの調製及び産生は、実施例１．３で説明する。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＴｎＣ抗体１８Ｄ４のものであり、大きい黒い点は、ノブイントゥーホール修飾を表す。 図１１は、一価のＴｎＣ標的スプリットトリマーヒト４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）（コンストラクト６．４）の集合成分を示す図である。Ａ）は、ヒトＩｇＧ１－ＣＬドメインに融合されているダイマーリガンドを示す。Ｂ）は、ヒトＩｇＧ１－ＣＨ１ドメインに融合されているモノマーリガンドを示す。 図１２は、ＣＨ－ＣＬクロスと荷電残基を含有する、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．４）の図である。このコンストラクトの調製及び産生は、実施例１．４で説明する。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＴｎＣ抗体１８Ｄ４のものであり、大きい黒い点は、ノブイントゥーホール修飾を表す。 図１３は、一価のＴｎＣ標的スプリットトリマーヒト４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）（コンストラクト６．５）の集合成分を示す図である。Ａ）は、ヒトＩｇＧ１－ＣＬドメインに融合されているダイマーリガンドを示す。Ｂ）は、ヒトＩｇＧ１－ＣＨ１ドメインに融合されているモノマーリガンドを示す。 図１４は、ＣＨ－ＣＬクロスを含有し、荷電残基を有さない、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．５）を示す図である。このコンストラクトの調製及び産生は、実施例１．５で説明する。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＴｎＣ抗体１８Ｄ４のものであり、大きい黒い点は、ノブイントゥーホール修飾を表す。 図１５は、二価のＴｎＣ標的のスプリットトリマーヒト４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）（コンストラクト６．６）の集合成分を示す図である。Ａ）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖に融合されているダイマーリガンドを示す。Ｂ）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ鎖に融合されているモノマーリガンドを示す。 図１６は、二価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．６）を示す図である。このコンストラクトの調製及び産生は、実施例１．６で説明する。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＴｎＣ抗体１８Ｄ４のものであり、大きい黒い点は、ノブイントゥーホール修飾を表す。 図１７は、ヒトＦｃのＣ末端に融合されている一価の標的指向性スプリットトリマーヒト４－１ＢＢリガンドの集合成分を示す図である。Ａ）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール又はノブ鎖に融合されているダイマーリガンドを示す。Ｂ）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ又はホール鎖に融合されているモノマーリガンドを示す。 図１８は、一価の標的指向性スプリットトリマーＣ末端４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）ノブ融合体を示すものであり、図１８ａは、ダイマー４－１ＢＢＬがホールＦｃ鎖に融合されており、モノマー４－１ＢＢＬがノブＦｃ鎖に融合されている、コンストラクト６．１１を示す図である。このコンストラクトの調製及び産生は、実施例１．７で説明する。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＴｎＣ抗体１８Ｄ４のものであり、大きい黒い点は、ノブイントゥーホール修飾を表す。 図１８は、一価の標的指向性スプリットトリマーＣ末端４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）ノブ融合体を示すものであり、図１８ｂは、ダイマー４－１ＢＢＬがノブＦｃ鎖に融合されており、モノマー４－１ＢＢＬがホールＦｃ鎖に融合されている、コンストラクト６．１２を示す図である。このコンストラクトの調製及び産生は、実施例１．７で説明する。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＴｎＣ抗体１８Ｄ４のものであり、大きい黒い点は、ノブイントゥーホール修飾を表す。 図１９は、一価の標的指向性（ホール鎖）スプリットトリマーＣ末端４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体を示すものであり、図１９ａは、ダイマー４－１ＢＢＬがホールＦｃ鎖に融合されており、モノマー４－１ＢＢＬがノブＦｃ鎖に融合されている、コンストラクト６．１３の図である。このコンストラクトの調製及び産生は、実施例１．８で説明する。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＴｎＣ抗体１８Ｄ４のものであり、大きい黒い点は、ノブイントゥーホール修飾を表す。 図１９は、一価の標的指向性（ホール鎖）スプリットトリマーＣ末端４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体を示すものであり、図１９ｂは、ダイマー４－１ＢＢＬがノブＦｃ鎖に融合されており、モノマー４－１ＢＢＬがホールＦｃ鎖に融合されている、コンストラクト６．１４の図である。このコンストラクトの調製及び産生は、実施例１．８で説明する。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＴｎＣ抗体１８Ｄ４のものであり、大きい黒い点は、ノブイントゥーホール修飾を表す。 図２０は、標的指向性スプリットトリマーＣ－末端４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の同時結合に関するものであり、図２０ａは、ＳＰＲ実験の仕組みを示す図である。 図２０は、標的指向性スプリットトリマーＣ－末端４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の同時結合に関するものであり、図２０ｂは、コンストラクト６．５についてのヒト４－１ＢＢ及びヒトＴｎＣの同時結合を示す図である。 図２０は、標的指向性スプリットトリマーＣ－末端４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の同時結合に関するものであり、図２０ｃは、コンストラクト６．６についてのヒト４－１ＢＢ及びヒトＴｎＣの同時結合を示す図である。 図２１は、ＴｎＣ標的４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドＦｃ融合抗原結合分子の、単離したてのＰＭＢＣへの結合を示す図である。ＰＥがコンジュゲートされた二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均（ｙ軸）を、試験したコンストラクトの濃度（ｘ軸）に対して示す。新鮮ヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８ｎｅｇ ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２１ａ）、新鮮ヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４ｎｅｇ ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２１ｂ）、新鮮ヒトＣＤ４５＋ＣＤ３ｎｅｇ ＣＤ１９＋Ｂ細胞（図２１ｃ）及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４ｎｅｇ ＣＤ８ｎｅｇ γδＴ細胞（図２１ｄ）に関して、結合をモニターした。 図２２は、ＴｎＣ標的４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドＦｃ融合抗原結合分子の活性化ＰＭＢＣへの結合を示す図である。ＰＥがコンジュゲートされた二次検出抗体の蛍光強度の幾何平均（ｙ軸）を、試験したコンストラクトの濃度（ｘ軸）に対して示す。活性化ヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８ｎｅｇ ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２２ａ）、活性化ヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４ｎｅｇ ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２２ｂ）、ＣＤ４５＋ＣＤ３ｎｅｇ ＣＤ１９＋Ｂ細胞（図２２ｃ）及び活性化ヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４ｎｅｇ ＣＤ８ｎｅｇ γδＴ細胞（図２２ｄ）に関して結合をモニターした。 図２３は、ＴｎＣ標的又は非標的指向性のスプリットトリマーヒト４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子の、ヒトＴｎＣ発現Ｕ８７－ＭＧ腫瘍細胞株への結合を示す図である。Ｒ－フィコエリトリン蛍光色素がコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて結合を検出し、フローサイトメトリーにより測定した幾何平均をｙ軸上に示す。ｘ軸上には、ＴｎＣ標的４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドＦｃ融合抗原結合分子及びそれらのコントロールについての使用濃度を示す。 図２４は、ヒト４－１ＢＢ発現ＨｅＬａレポーター細胞株を用いる活性化アッセイの仕組みの説明を示す図である。レポーター細胞上で発現される４－１ＢＢの架橋が、ＮＦκＢ活性化及びＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現を誘導する。細胞の溶解後、ルシフェラーゼは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸化を触媒することができる。この化学反応は、ＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現と正の相関を示し、この化学反応を発光強度（放出光単位）により測定することができる。 図２５は、ＮＦκＢ活性化誘導ルシフェラーゼ活性を示す図である。放出光単位（ＵＲＬ）を１ウェルにつき０．５秒間測定し、スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド含有融合分子及びコントロールの使用濃度に対してプロットしたものである。ヒト４－１ＢＢ発現ＨｅＬａ－レポーター細胞を、ヒトＴｎＣ発現Ｕ８７ＭＧ細胞による架橋の非存在下（図２５ａ）及び存在下（図２５ｂ）で６時間インキュベートした。４－１ＢＢ発現ＨｅＬａレポーター細胞のＴｎＣ発現腫瘍細胞に対する細胞比は、１：５であった。 図２６は、ＴｎＣ発現Ｕ８７ＭＧ、アゴニストヒトＣＤ３抗体及び二重特異性抗ＴｎＣスプリットトリマー４－１ＢＢＬ融合分子コンストラクト６．５の存在下でのヒトＰＢＭＣ活性化の概略的仕組みの説明を示す図である。 図２７は、ＴｎＣ＋Ｕ８７ＭＧ、アゴニストＣＤ３抗体、及びＴｎＣ標的スプリットトリマー４－１ＢＢ融合分子の存在下での、ヒトＰＢＭＣ活性化アッセイを示す図である。全ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する頻度としてのＣＤ２５及びＣＤ１３７（４－１ＢＢ）の発現レベルを、コンストラクト６．５及び６．６又はコントロール（コントロールＦ、コントロールＬ及びコントロールＥ）の使用濃度に対してプロットしたものである。
定義
別途定義がない限り、本明細書で使用される専門及び科学用語は、本発明が属する技術分野において一般に使用されているのと同じ意味を有する。本明細書を解釈するため、以下の定義を適用することとし、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含むことになり、また逆に複数形で使用される用語は単数形も含むことになる。
本明細書で使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
本明細書で使用される用語「特異的に結合することができる部分」は、抗原決定基と特異的に結合することができるポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合部分は、その標的細胞抗原によるシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合部分は、それが結合している実体（例えば、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー）を標的部位に、例えば、抗原決定基を有する特定の種類の腫瘍細胞又は腫瘍間質に指向させることができる。標的細胞抗原と特異的に結合することができる部分は、本明細書中でさらに定義されるような抗体及びそれらの断片を含む。加えて、標的細胞抗原と特異的に結合することができる部分は、本明細書中でさらに定義されるような足場抗原結合タンパク質、例えば、設計リピートタンパク質又は設計リピートドメインに基づく結合ドメインを含む（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照されたい）。
抗体又はその断片に関して、用語「特異的に結合することができる部分」は、抗原の一部又は全てと特異的に結合する領域であって抗原の一部又は全てと相補的である領域を含む、分子の一部を指す。特異的に抗原に結合することができる部分は、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって、提供され得る。特に、特異的に抗原に結合することができる部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
本明細書での用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、そのような抗体構造には、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）が含まれ、抗体断片も、それらが所望の抗原結合活性を呈示するのであれば、含まれる。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体、例えば、天然に存在する突然変異を含有する変異抗体又はモノクローナル抗体の産生中に生じる変異抗体であって、一般に少量で存在するそのような変異体を除いて、同一である、及び／又は同一のエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を概して含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体は、各々が同じ抗原の同じエピトープと結合する１つ又は複数の結合部位を有する抗体を示す。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基と特異的に結合することができることを意味する。典型的に、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的である２つの抗原結合部位を含む。ある特定の実施態様では、二重特異性抗原結合部位は、２つの抗原決定基、特に、２つの異なる細胞上で発現される２つの抗原決定基に、同時に結合することができる。
本願の中で使用される用語「原子価」は、抗原結合分子中の指定数の結合部位の存在を示す。しかるが故に、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗原結合分子中の２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在をそれぞれ示す。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体を指すために本明細書では同義で使用される。「天然抗体」は、様々な構造を有する、天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、ジスルフィド結合されている２つの軽鎖と２つの重鎖から構成されている、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へ、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続いて、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続いて、軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプのうちの１つに割り当てることができ、これらのタイプの一部は、サブタイプ、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）にさらに分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの一方に割り当てることができる。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ Ｍｅｄ ９、１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加されている、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の論考については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片であり、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ Ｍｅｄ ９、１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０、６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ Ｍｅｄ ９、１２９－１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部分又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部分を含む、抗体断片である。ある特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号Ｂ１を参照されたい）である。抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）による産生を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の様々な手法によって作製することができる。
インタクトな抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片であって、各々が、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する、２つの抗原結合断片を生じさせる。したがって、本明細書で使用される用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む軽鎖断片を含む、抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインをはじめとする、少数の残基の重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における付加が、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有する、Ｆａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）とＦｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。
用語「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる組成があり得、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。他方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであって、前記抗体ドメイン及び前記リンカーが、Ｎ末端からＣ末端方向に、ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬの順序のうちの１つを有し、前記リンカーが、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２アミノ酸と５０アミノ酸の間のポリペプチドである、ポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメイン間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。加えて、単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、カバット番号付けに従って可変重鎖内の４４位及び可変軽鎖内の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化されることもある。
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであって、前記抗体ドメイン及び前記リンカーが、Ｎ末端からＣ末端方向に、ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及びｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬの順序のうちの一方を有し、ＶＨ及びＶＬが一緒に、抗原と特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記リンカーが、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである、ポリペプチドである。加えて、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、カバット番号付けに従って可変重鎖内の４４位及び可変軽鎖内の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化されることもある。
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０から約２５アミノ酸の短いリンカーで接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）可変領域と軽鎖（ＶＬ）可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシンを多く含んでいることはもちろん、溶解性のためにセリン又はスレオニンも多く含んでおり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続することができ、又は逆にＶＬのＣ末端をＶＨのＮ末端と接続することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特性、すなわち、ＶＬドメインと集合することができる特性、又はＶＬドメインの特性、すなわち、ＶＨドメインと集合して機能性抗原部位になる特性を有し、その結果、完全長抗体の抗原結合特性を提供する、単鎖ポリペプチドを含む。
「足場抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で公知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、抗原結合ドメインの代替足場として使用されている。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ及びＳｋｅｒｒａ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３：２４５－２５５（２００９）、及びＳｔｕｍｐｐ等、Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １３：６９５－７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（エビボディ（Evibody））、リポカリン（アンチカリン（Anticalin））、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Affibody））、Ａ－ドメイン（アビマー／マキシボディ（Avimer/Maxibody））、血清トランスフェリン（トランスボディ（trans-body））；設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Tetranectin））；新規抗原受容体ベータ－ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトガンマ－クリスタリン又はユビキチン（Ａｆｆｉｌｉｎ分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリーからのタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。
ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主としてＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現される、ＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ｉｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ－４は、エビボディとしても公知である（例えば米国特許第７１６６６９７号Ｂ１）。エビボディは、抗体の単離された領域（例えば、ドメイン抗体）と同じくらいのサイズである。さらなる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１－２）、３１－４５（２００１）を参照されたい。
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド等の小さい疎水性分子を輸送する、細胞外タンパク質の１ファミリーである。リポカリンは、異なる標的抗原と結合するように操作することができる、円錐構造の開口端に多数のループを有する、堅いベータシート二次構造を有する。アンチカリンは、サイズが１６０－１８０アミノ酸であり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２：３３７－３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７号Ｂ１及び米国特許出願公開第２００７／０２２４６３３を参照されたい。
アフィボディは、抗原と結合するように操作することができる、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。このドメインは、おおよそ５８アミノ酸の３ヘリックスバンドルからなる。表面残基の無作為化によりライブラリーが作成されている。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７、４５５－４６２（２００４）及び欧州特許第１６４１８１８号Ａ１を参照されたい。
アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。おおよそ３５アミノ酸の天然ドメインが定義されたジスルフィド結合構造をとる。Ａドメインのこのファミリーにより呈示される自然変異のシャッフリングにより多様性が生じる。さらなる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）、１５５６－１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）、９０９－９１７（２００７年６月）を参照されたい。
トランスフェリンは、モノマー血清輸送糖タンパク質である。許容表面ループ内へのペプチド配列の挿入により異なる標的抗原に結合するようにトランスフェリンを操作することができる。操作されたトランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。さらなる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４、２４０６６－２４０７３（１９９９）を参照されたい。
設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、膜内在性タンパク質の細胞骨格への接着を媒介するタンパク質の１ファミリーであるアンキリンから誘導されたものである。単一のアンキリンリピートは、２つのアルファヘリックスと１つのベータターンからなる３３残基モチーフである。各リピートの第１のアルファヘリックス及びベータターンにおける残基を無作為化することにより異なる標的抗原に結合するようにＤＡＲＰｉｎを操作することができる。モジュールの数を増加させること（アフィニティー成熟法）により、ＤＡＲＰｉｎの結合面を増加させることができる。さらなる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９－５０３（２００３）、ＰＮＡＳ １００（４）、１７００－１７０５（２００３）、及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５－１０２８（２００７）、及び米国特許出願公開第２００４／０１３２０２８号Ａ１を参照されたい。
単一ドメイン抗体は、単一モノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片である。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物からの抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ又はＶＨＨ断片）から誘導された。さらに、用語単一ドメイン抗体は、サメに由来する自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はＶＮＡＲ断片を含む。
フィブロネクチンは、抗原と結合するように操作することができる足場である。アドネクチンは、繰り返し単位数１５のヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる。ベータサンドイッチの一端の３つのループを、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８、４３５－４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８／０１３９７９１、国際公開第２００５／０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８号Ｂ１を参照されたい。
ペプチドアプタマーは、活性部位に挿入された拘束された可変ペプチドループを含有する典型的なチオレドキシン（ＴｒｘＡ）である定常足場タンパク質からなる、コンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細については、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３－７９７（２００５）を参照されたい。
ミクロボディは、３～４個のシステイン架橋を含有する、長さ２０－５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質から誘導されたものであり、微小タンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチンが挙げられる。微小タンパク質は、その微小タンパク質の全フォールドに影響を与えずに２５個までのアミノ酸を含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインのさらなる詳細については、国際公開第２００８／０９８７９６号を参照されたい。
参照分子と「同じエピトープと結合する抗原結合分子」は、競合アッセイで参照分子のその抗原への結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に言うと、参照分子は、競合アッセイで抗原結合分子のその抗原への結合を５０％以上ブロックする。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全てと特異的に結合する領域であって抗原の一部又は全てと相補的である領域を含む、抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと称される抗原の特定の部分のみと結合することができる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によってもたらされることがある。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
本明細書で使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、その結果、抗原結合部分－抗原複合体を形成することになる、ポリペプチド上の部位（例えば、アミノ酸の近接ストレッチ、又は近接していないアミノ酸から構成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面で、ウイルス感染細胞の表面で、他の罹病細胞の表面で、免疫細胞の表面で、血清中で遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中で見いだすことができる。本明細書において抗原として有用なタンパク質は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源からの、任意の天然形態のタンパク質であり得る。特定の実施態様では、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書で特定のタンパク質に言及する場合のこの用語は、「完全長」のプロセッシングされていないタンパク質はもちろん、細胞内でのプロセッシングの結果として得られる任意の形態のタンパク質も包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在する変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体も包含する。
用語「ＴｎＣと特異的に結合することができる」は、テネイシンＣ（ＴｎＣ）に十分なアフィニティーで結合することができる抗原結合分子又は抗原結合部分を指し、したがって、抗原結合分子は、ＴｎＣを標的とする点で診断及び／又は治療剤として有用である。抗原結合分子には、抗体、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、並びにＶＨ及び足場抗原結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。一実施態様では、無関係の非ＴｎＣタンパク質への抗ＴｎＣ抗原結合分子の結合度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定して、ＴｎＣへの抗原結合分子の結合の約１０％未満である。ある特定の実施態様では、ＴｎＣと結合する抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍから１０－１３Ｍ、例えば、１０ｎＭから０．１ｎＭ、例えば、５ｎＭから０．１ｎＭ、例えば、２ｎＭから０．１ｎＭ）の解離定数（ＫＤ）を有する。ある特定の実施態様では、抗ＴｎＣ抗原結合分子は、異なる種からのＴｎＣ間で保存されるＴｎＣエピトープと結合する。ある特定の実施態様では、ＴｎＣのエピトープと結合する抗原結合分子は、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、ＡＤ１、ＡＤ２、Ｃ及びＤからなる群から選択されるドメインのうちの少なくとも１つに特異的である。ある特定の実施態様では、ＴｎＣ Ａ１及びＴｎＣ Ａ４ドメインに特異的な抗原結合分子が提供される。ある特定の実施態様では、ＴｎＣ Ｃドメインに特異的な抗原結合分子が提供される。「特異的結合」とは、結合が抗原に対して選択であることを意味し、望ましくない又は非特異的な相互作用とは区別することができる。特定の抗原と結合する抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又は当業者によく知られている他の手法、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）手法（Ｂｉａｃｏｒｅ装置で分析される）（Liljeblad等、Glyco J 17、323-329(2000)）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley、Endocr Res 28、217-229(2002)）、どちらかによって測定することができる。一実施態様では、無関係の非ＴｎＣタンパク質への抗原結合分子の結合度は、例えばＳＰＲによって測定して、抗原への抗原結合分子の結合の約１０％未満である。ある特定の実施態様では、抗原と結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍから１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
「アフィニティー」又は「結合アフィニティー」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合的相互作用の総計の強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される「結合アフィニティー」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１相互作用を表す固有の結合フィニティーを指す。分子ＸのそのパートナーＹに対するアフィニティーは、解離速度定数と結合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆとｋｏｎ）の比である、解離定数（Ｋｄ）によって一般に表すことができる。したがって、同等のアフィニティーは、速度定数の比が同じままであるならば、異なる速度定数を含むこともある。アフィニティーは、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。アフィニティーを測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
本明細書で使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えば、がん細胞等の腫瘍内の細胞、又は腫瘍間質の細胞の表面に又はその環境で提示される抗原決定基を指す。ある特定の実施態様では、標的細胞抗原は、腫瘍組織内又は周囲の細胞外マトリックスにおいて発現される。特に、標的細胞抗原は、テネイシンＣ（ＴｎＣ）である。本明細書で使用される用語「テネイシンＣ」又は「ＴｎＣ」は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意の天然ＴｎＣを指す。この用語は、「完全長」のプロセッシングされていないＴｎＣ、並びに細胞内でのプロセッシングの結果として得られる任意の形態のＴｎＣを包含する。この用語は、ＴｎＣの天然に存在する変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＴｎＣ抗原配列（Ｎ末端ＧＳＴ及び６ｘＨｉｓタグ、並びにＣ末端ａｖｉタグ及び６ｘＨｉｓタグを有する）のアミノ酸配列は、配列番号４で示される。例示的マウスＴｎＣ抗原配列（Ｎ末端ＧＳＴ及び６ｘＨｉｓタグ、並びにＣ末端ａｖｉタグ及び６ｘＨｉｓタグを有する）のアミノ酸配列は、配列番号５で示される。例示的カニクイザルＴｎＣ抗原配列（Ｎ末端ＧＳＴ及び６ｘＨｉｓタグ、並びにＣ末端ａｖｉタグ及び６ｘＨｉｓタグを有する）のアミノ酸配列は、配列番号６で示される。ヒトＴｎＣ分子に関して、５番目の定常フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインと６番目の定常フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン間に挿入され得る、９つ以下の選択的スプライシングを受けたフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインが公知である（ＴｎＣのドメイン構造の模式図については、例えば、Orend及びChiquet-Ehrismann、Cancer Letters 244、143-163(2006)を参照されたい）。同様に、マウスＴｎＣ分子に関して、６つの選択的スプライシングを受けたフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインが（例えば、Joestner and Faissner、J Biol Chem 274、17144-17151(1999)に）記載されている。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する、抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む、同様の構造を一般に有する。例えば、Ｋｉｎｄｔ等、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ｐ．９１（２００７）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分であり得る。
本明細書で使用される用語「超可変領域」、又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変性である、及び／又は構造的に明確なループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の、６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、超可変ループからの及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、ＣＤＲは、配列可変性が最も高い及び／又は抗原認識に関与するものである。例示的超可変ループは、アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）に存在する。（Chothia及びLesk、J.Mol.Biol.196:901-917(1987)）。例示的ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４－３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０－５６、Ｌ３のアミノ酸残基８９－９７、Ｈ１のアミノ酸残基３１－３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０－６５、及びＨ３のアミノ酸残基９５－１０２に存在する。（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は、本明細書では抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及する際に同義で使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって及びＣｈｏｔｈｉａ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）によって記載されており、これらの文献における定義は、互いに比較したとき、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。それでもなお、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及するためのどちらかの定義の適用は、本明細書中で定義され、使用されるこの用語の範囲内であると考えている。上記引用参考文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を比較として下の表Ａに記載する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズによって変わることになる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考えれば、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを常套的に決定することができる。
Figure 0007285076000001
1 表A中の全てのCDR定義の番号付けは、カバット等により記載された番号付け規定によるものである(下記参照)。
2 表A中で使用されている小文字「b」を伴う「AbM」は、Oxford Molecularの「AbM」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるようなCDRを指す。
カバット等は、任意の抗体に適用することができる可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者は、配列自体以外の何れの実験データにも頼らずに、「カバット番号付け」のこのシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用される「カバット番号付け」は、Ｋａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって記載された番号付けシステムを指す。別途定めがない限り、抗体可変領域内の特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、カバット番号付けシステムによるものである。
ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」、すなわち「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮ＣＤＲ又はａ－ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含有される。例示的ａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２、及びａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１－３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０－５５、Ｌ３のアミノ酸残基８９－９６、Ｈ１のアミノ酸残基３１－３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０－５８、及びＨ３のアミノ酸残基９５－１０２に存在する。（Almagro及びFransson、Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)を参照されたい）。別途指示がない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔ等に従って番号付けされる。
抗原結合分子（例えば、抗体）に関連して本明細書で使用される用語「アフィニティー成熟した」は、親抗原結合分子から例えば突然変異によって誘導される抗原結合分子であって、親抗体と、同じ抗原と結合し、好ましくは同じエピトープと結合し、抗原に対して参照抗原結合分子のものより高いアフィニティーを有する抗原結合分子を指す。アフィニティー成熟は、一般に、抗原結合分子の１つ又は複数のＣＤＲ内の１つ又は複数のアミノ酸残基の修飾を含む。典型的に、アフィニティー成熟した抗原結合分子は、最初の親抗原結合分子と同じエピトープと結合する。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４という４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）内に、ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４という配列で出現する。
本明細書での「アクセプターヒトフレームワーク」は、下で定義されるようなヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらの同じアミノ酸配列を含むこともあり、又はある特定のアミノ酸配列変化を有することもある。一部の実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。一部の実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、配列の点で、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の源又は種に由来するが、その重鎖及び／又は軽鎖の残部が異なる源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという５つの主要抗体クラスがあり、これらのうちの幾つかは、さらに、サブクラス（アイタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ。α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基とヒトＦＲからのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定実施態様ではヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つの、典型的には２つの、可変ドメインの実質的に全てを含むことになる。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を任意選択的に含んでいてもよい。抗体の、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域を、元の抗体の定常領域から、本発明による特性、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関する特性を生じさせるようにさらに修飾又は変化させたものである。
「ヒト」抗体は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生される抗体のアミノ酸配列に対応する、又はヒト抗体レパートリーを用いる若しくはヒト抗体をコードする他の配列を用いる非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応する、アミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、厳密に言えば、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
本明細書での用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部分を含有する抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基にわたる。一実施態様では、糖鎖がＣＨ２ドメインに結合している。本明細書でのＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメインであってもよく、又は変異ＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｃ末端のＦｃ領域内のＣＨ２ドメインへの（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基への）残基のストレッチを含む。本明細書でのＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメインであってもよく、変異ＣＨ３ドメイン（例えば、その一方の鎖内に「突出部」（「ノブ」）が導入されており、その他方の鎖に相応じて「空洞」（「ホール」）が導入されているＣＨ３；本明細書に参照により明確に援用される米国特許第５８２１３３３号を参照されたい）であってもよい。そのような変異ＣＨ３ドメインを使用して、掘明細書に記載の２つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進することができる。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端にわたる。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、又は存在しなくてもよい。本明細書中で別途定めがない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されているような、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵ番号付けシステムによるものである。
「ノブイントゥーホール」（ｋｉｈ）技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号、米国特許第７６９５９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ等、Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９、６１７－６２１（１９９６）、及びＣａｒｔｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８、７－１５（２００１）に記載されている。一般に、この方法は、突出部を空洞内に配置してヘテロ二量体形成を促進すること及びホモ二量体形成を妨げることができるように、第１のポリペプチドの接触面に突出部（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞（「ホール」）を導入することを含む。突出部は、第１のポリペプチドの接触面からの小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換することにより構築される。大きい側鎖をより小さい側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）で置換することにより、突出部と同一又は同様のサイズの代償的「空洞」が第２の抗体の境界面に作出される。突出部及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を例えば部位特異的突然変異誘発により又はペプチド合成により改変することによって、作製することができる。具体的実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる具体的実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃ領域の２つサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、かくてダイマーがさらに安定化される結果となる（Carter、J Immunol Methods 248、7-15(2001)）。この番号付けは、Ｋａｂａｔ等、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１のＥＵインデックスによるものである。
「免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体はもちろん、置換、付加又は欠失を生じさせる改変だが免疫グロブリンのエフェクター機能を媒介する能力（例えば、抗体依存性細胞傷害）を実質的に低下させない改変を有する変異体も含むことを意図したものである。例えば、生物学的機能を実質的に失うことなく、１つ又は複数のアミノ酸を免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失させることができる。当該技術分野で公知の一般的規則に従って、活性に対してわずかな影響しか及ぼさないような変異体を選択することができる（例えば、Bowie, J. U.等、Science 247:1306-10(1990)を参照されたい）。
用語「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の発現低下、及びＢ細胞活性化が挙げられる。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による会合を受けてエフェクター機能を果たすように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達事象を惹起するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１を参照されたい）。
用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「ＴＮＦファミリーリガンド」は、炎症誘発性サイトカインを指す。一般に、サイトカイン、特に、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、免疫系の刺激及び協調に極めて重要な役割を果たす。現在、配列、機能及び構造の類似性に基づいてＴＮＦ（腫瘍壊死因子）リガンドスーパーファミリーのメンバーとして１９のサイトカインが同定されている。これら全てのリガンドは、Ｃ末端細胞外ドメイン（エクトドメイン）とＮ末端細胞内ドメインと単一の膜貫通ドメインとを有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）として公知のＣ末端細胞外ドメインは、スーパーファミリーメンバー間で２０－３０％アミノ酸同一性を有し、受容体との結合に関与する。ＴＮＦエクトドメインは、ＴＮＦリガンドによるそれらの特異的受容体により認識されるトリマー複合体の形成にも関与する。
ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、リンホトキシンα（別名ＬＴＡ又はＴＮＦＳＦ１）、ＴＮＦ（別名ＴＮＦＳＦ２）、ＬＴβ（別名ＴＮＦＳＦ３）、ＯＸ４０Ｌ（別名ＴＮＦＳＦ４）、ＣＤ４０Ｌ（別名ＣＤ１５４又はＴＮＦＳＦ５）、ＦａｓＬ（別名ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ１７８又はＴＮＦＳＦ６）、ＣＤ２７Ｌ（別名ＣＤ７０又はＴＮＦＳＦ７）、ＣＤ３０Ｌ（別名ＣＤ１５３又はＴＮＦＳＦ８）、４－１ＢＢＬ（別名ＴＮＦＳＦ９）、ＴＲＡＩＬ（別名ＡＰＯ２Ｌ、ＣＤ２５３又はＴＮＦＳＦ１０）、ＲＡＮＫＬ（別名ＣＤ２５４又はＴＮＦＳＦ１１）、ＴＷＥＡＫ（別名ＴＮＦＳＦ１２）、ＡＰＲＩＬ（別名ＣＤ２５６又はＴＮＦＳＦ１３）、ＢＡＦＦ（別名ＣＤ２５７又はＴＮＦＳＦ１３Ｂ）、ＬＩＧＨＴ（別名ＣＤ２５８又はＴＮＦＳＦ１４）、ＴＬ１Ａ（別名ＶＥＧＩ又はＴＮＦＳＦ１５）、ＧＩＴＲＬ（別名ＴＮＦＳＦ１８）、ＥＤＡ－Ａ１（別名エクトジスプラシンＡ１）及びＥＤＡ－Ａ２（別名エクトジスプラシンＡ２）からなる群から選択される。この用語は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）、非霊長類（例えば、カニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からの任意の天然ＴＮＦファミリーリガンドを指す。本発明の具体的実施態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ＯＸ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＴＲＡＩＬ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬからなる群から選択される。特定の実施態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４－１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのさらなる情報、特に配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）等の公的にアクセス可能なデータベースから得ることができる。例えば、ヒトＴＮＦリガンドは、次のアミノ酸配列を有する：ヒトリンホトキシンα（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０１３７４、配列番号２０３）、ヒトＴＮＦ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０１３７５、配列番号２０４）、ヒトリンホトキシンβ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ０６６４３、配列番号２０５）、ヒトＯＸ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ２３５１０、配列番号２０６）、ヒトＣＤ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ２９９６５、配列番号２０７）、ヒトＦａｓＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ４８０２３、配列番号２０８）、ヒトＣＤ２７Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ３２９７０、配列番号２０９）、ヒトＣＤ３０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ３２９７１、配列番号２１０）、４－１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ４１２７３、配列番号２１１）、ＴＲＡＩＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ５０５９１、配列番号２１２）、ＲＡＮＫＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｏ１４７８８、配列番号２１３）、ＴＷＥＡＫ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｏ４３５０８、配列番号２１４）、ＡＰＲＩＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｏ７５８８８、配列番号２１５）、ＢＡＦＦ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ９Ｙ２７５、配列番号２１６）、ＬＩＧＨＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｏ４３５５７、配列番号２１７）、ＴＬ１Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｏ９５１５０、配列番号２１８）、ＧＩＴＲＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ９ＵＮＧ２、配列番号２１９）及びエクトジスプラシンＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ９２８３８、配列番号２２０）。
「エクトドメイン」は、細胞外空間（すなわち、標的細胞の外側の空間）にわたる膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは、通常は、シグナル伝達をもたらす表面との接触を開始させるタンパク質の一部である。したがって、本明細書中で定義されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、細胞外空間にわたるＴＮＦリガンドタンパク質の一部（細胞外ドメイン）を指すが、三量体化及び対応するＴＮＦ受容体との結合に関与するそのより短い部分又は断片も含む。したがって、用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片」は、細胞外ドメインを形成するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの細胞外ドメインを指すか、又は受容体となお結合することができるその一部（受容体結合ドメイン）を指す。
用語「共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦファミリーリガンド」は、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができる、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのサブグループを指す。ＴＮＦファミリーリガンドは、それらの対応するＴＮＦ受容体との相互作用によりＴＣＲシグナルを共刺激することができ、それらの受容体との相互作用は、Ｔ細胞を活性化する結果となるシグナル伝達カスケードを開始させるＴＮＦＲ関連因子の動員をもたらす。共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ及びＬＩＧＨＴからなる群から選択され、より特に、共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４－１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
上文で説明したように４－１ＢＢＬは、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦリガンドファミリーの１メンバーである。配列番号２１２のアミノ酸配列を有する完全又は完全長４－１ＢＢＬは、細胞の表面でトリマーを形成すると記載されている。トリマーの形成は、４－１ＢＢＬのエクトドメインの特異的輸送性によって可能になる。前記輸送性は、ここでは「三量体化領域」に指定される。ヒト４－１ＢＢＬ配列（配列番号１８０）のアミノ酸５０－２５４は、４－１ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するが、その断片でさえトリマーを形成することができる。本発明の具体的実施態様では、用語「４－１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号１７５（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸５２－２５４）、配列番号１７２（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸７１－２５４）、配列番号１７４（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸８０－２５４）及び配列番号１７３（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸８５－２５４）から選択されるアミノ酸を有するポリペプチド、又は配列番号１８３（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸７１－２４８）、配列番号１９４（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸５２－２４８）、配列番号１９３（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸８０－２４８）及び配列番号１９２（（ヒト４－１ＢＢＬのアミノ酸８５－２４８）から選択されるアミノ酸を有するポリペプチドを指すが、四量体化することができるエクトドメインの他の断片もここに含まれる。
上文で説明したように、ＯＸ４０Ｌは、もう１つのタイプのＩＩ型膜貫通タンパク質であり、ＴＮＦリガンドファミリーのさらなるメンバーである。完全又は完全長ＯＸ４０Ｌは、配列番号２０６のアミノ酸配列を有する。ヒトＯＸ４０Ｌ配列（配列番号１８１）のアミノ酸５１－１８３は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを形成するが、その断片でさえトリマーを形成することができる。本発明の具体的実施態様では、用語「ＯＸ４０Ｌのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号１８１（ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸５１－１８３）又は配列番号１８２（ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸５２－１８３）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すが、三量体化することができるエクトドメインの他の断片もここに含まれる。
用語「ペプチドリンカー」は、１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で公知であり、又は本明細書で説明される。好適な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカー（ここで、「ｎ」は、一般に１と１０の間の数、典型的には１と４の間の数、特に２である）であり、すなわち、ＧＧＧＧＳ（配列番号１６２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５０）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１５１）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１５２）からなる群から選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１５３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１５４）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１５５）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１５６）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１５７）、ＧＧＳＧ（配列番号１５８）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１５９）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１６０）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１４９）も含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）１、すなわち、ＧＧＧＧＳ（配列番号１６２）、（Ｇ４Ｓ）２、すなわち、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５０）、及びＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１５３）であり、より特に、（Ｇ４Ｓ）２、すなわち、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５０）、及びＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１５３）である。
本願の中で使用される用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字表記：ａｌａ、１文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα－アミノ酸の群を示す。
本明細書で使用される「単鎖融合タンパク質」は、抗原結合部分の一部又はＦｃ部分に融合されている前記ＴＮＦリガンドファミリーの１つ又は２つのエクトドメインから構成されている単鎖ポリペプチドを指す。この融合は、抗原結合部分のＮ又はＣ末端アミノ酸をペプチドリンカーによって前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインのＣ又はＮ末端アミノ酸に直接的に連結させることにより行うことができる。
「融合されている」又は「接続されている」とは、成分（例えば、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及びエクトドメイン）が、ペプチド結合により、直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーによって連結されていることを意味する。
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列をアラインし、必要に応じて、最大パーセントの配列同一性を達成するようにギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義する。パーセントアミノ酸配列同一性の決定を目的とするアラインメントは、当該技術分野での技能の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ．ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＳＴＡＲ）ソフトウェア等の、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、果たすことができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアライメントに適しているパラメータを決定することができる。しかし、本明細書では、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の著作物であり、ソースコードは、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９にユーザー文書と共に出願され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であり、又はＡＬＩＧＨＮ－２プログラムをソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ－２プログラムを、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ操作システムでの使用用にコンパイルしたほうがよい。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定され、変わらない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に利用される状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、又はそれに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、又はそれに対するある特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することができる）は、次のように算出される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
（ここで、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により該プログラムのＡとＢのアライメントで同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと同一でない場合、ＡのＢに対しての％アミノ酸配列同一性が、ＢのＡに対しての％アミノ酸配列同一性と同一にならないことは理解されるであろう。別途特に指定のない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸同一異性は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して直ぐ前の段落で説明したように得たものである。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供されるＴＮＦリガンドトリマー含有抗原結合分子の「アミノ酸配列変異体」が企図される。例えば、ＴＮＦリガンドトリマー含有抗原結合分子の結合フィニティー及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望ましいこともある。ＴＮＦリガンドトリマー含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、当該分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、調製することができる。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、及び／又はアミノ酸配列への残基の挿入、及び／又はアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有するのであれば、欠失、挿入及び置換をどのように組み合わせて最終コンストラクトに達してもよい。置換突然変異の対象となる部位としては、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が挙げられる。保存的置換は、表Ｂ中の「好ましい置換」という見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラス（１）から（６）に関して下でさらに説明される。目的の分子にアミノ酸置換を導入し、それらの産物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持／向上、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの向上についてスクリーニングすることができる。
Figure 0007285076000002
アミノ酸を共通側鎖特性に従って分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１クラスのメンバーを別のクラスと交換することを必然的に伴うことになる。
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基のアミノ酸置換がある実質的変異体を含む。一般に、さらなる研究に選択される、結果として得られる変異体は、親抗原結合分子と比較してある特定の生物学的特性の修飾（例えば、向上）（例えば、フィニティー増大、免疫原性低下）を有することになり、及び／又は親抗原結合分子のある特定の生物学的特性を実質的に保持していることになる。例示的な実質的変異体は、アフィニティー成熟した抗体であり、この抗体は、例えば、ファージディスプレイに基づくアフィニティー成熟手法、例えば本明細書に記載の手法を使用して生成することができる。簡単に言うと、１つ又は複数のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異抗原結合分子をファージ上に提示させ、特定の生物活性（例えば、結合フィニティー）についてスクリーニングする。ある特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失を、そのような改変が、抗原に結合する抗原結合分子の能力を実質的に低下させないのであれば、１つ又は複数のＨＶＲ内で行うことができる。例えば、結合アフィニティーを実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域の有用な同定方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５により記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、荷電残基、例えばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）の残基又は群が同定され、中性又は負荷電アミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換され、それによって、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかが判定される。最初の置換に対する官能基の感受性を立証するために、さらなる置換がアミノ酸位置に導入してもよい。或いは、又は加えて、抗体と抗原間の接点を同定するために、抗原－抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基を置換の候補として、標的にしてもよく、又は除去してもよい。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを判定してもよい。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまで長さに幅があるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一の又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有するＴＮＦリガンドトリマー含有抗原結合分子が挙げられる。分子の他の挿入変異体は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の血清半減期を増加させる、ポリペプチドへのＮ又はＣ末端の融合を含む。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作出又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより得ることができる。ＴＮＦリガンドトリマー含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合している糖を改変してもよい。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、Ｎ結合によりＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合されている分岐した、二分岐オリゴ糖を概して含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ等、ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な糖、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」の中のＧｌｃＮＡｃに結合しているフコースを含み得る。一部の実施態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾を行って、ある特定の向上した特性を有する変異体を作出することができる。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合しているフコースを欠く糖鎖構造を有する、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の変異体が提供される。そのようなフコシル化変異体は、向上したＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開番号・米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照されたい。本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のさらなる変異体としては、例えば、Ｆｃ領域に結合している二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有するものが挙げられる。そのような変異体は、フコシル化の低下及び／又はＡＤＣＣ機能の向上を有することができる。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ等）、米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａ等）、及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ等）を参照されたい。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する変異体も提供される。そのような抗体変異体は、ＣＤＣの機能向上を有することができ、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（（Ｐａｔｅｌ等）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
ある特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のシステイン操作変異体、例えば、当該分子の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を作出することが望ましいこともある。特定の実施態様では、置換される残基は、分子の到達可能な部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、その結果として反応性チオール基は抗体の到達可能な部位に位置し、それを使用して抗体を他の部分、例えば、薬物部分又はリンカー－薬物部分にコンジュゲートさせて、イムノコンジュゲートを作出することができる。ある特定の実施態様では、次の残基の何れか１つ又は複数をシステインで置換することができる：軽鎖のＶ２０５（カバット番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗原結合分子は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されているように生成することができる。
ある特定の態様では、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、当該技術分野で公知であり、容易に入手することができるさらなる非タンパク質性部分を含有するように、さらに修飾することができる。抗体の誘導体化に好適な部分は、水溶性ポリマーが含むが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダム共重合体のどちらか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにこれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定のため、製造において有利であり得る。ポリマーは、何れの分子量のものであってもよく、及び分岐していてもよく、又は分岐していなくてもよい。抗体に結合しているポリマーの数は様々であってよく、１つより多くのポリマーが結合している場合、それらは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、これらに限定されないが、抗体の向上させるべき特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されることになるかどうか等を含む、考慮事項に基づいて、決定することができる。別の態様では、放射線への曝露により選択的に加熱することができる、抗体と非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブ（Kam, N.W.等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(2005) 11600-11605）である。放射線は、何れの波長のものであってもよく、抗体－非タンパク質性部分の近位にある細胞が殺滅される温度に非タンパク質性部分を加熱するが通常の細胞を害さない波長を含むが、これに限定されない。
別の態様では、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のイムノコンジュゲートを得ることができる。「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがこれに限定されない１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートしている抗体である。
「異種間反応性」は、ある特定の抗体が抗体のそれぞれの標的抗原と特異的に結合できることを指し、ここで前記標的抗原は、異なる種（例えば、ヒト、マウス、カニクイザル等）に由来し得る。異種間反応性抗体は、少なくとも２つの異なる種に由来するそのそれぞれの標的抗原と約１μＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、より好ましくは約１０ｎＭ未満、より好ましくは約５ｎＭ未満、最も好ましくは約２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。用語「少なくとも２つの異なる種に由来するそのそれぞれの標的抗原と～未満のＫＤ値で結合する」は、それぞれの抗体が、指定された種の各々に由来する標的抗原と、指定されたＫＤ値未満の解離定数ＫＤで結合することを意味する。好ましい実施態様では、異種間反応性抗体は、指定された全ての種からの標的抗原と、同様のアフィニティーで、好ましくは、１０ｎＭから０．１ｎＭ、より好ましくは５ｎＭから０．１ｎＭ、最も好ましくは２ｎＭから０．１ｎＭのＫＤ範囲内で結合する。一部の実施態様では、数種に由来する抗原に対する同様のアフィニティーは、目的の全ての種に対して狭いＫＤ範囲内（例えば、１０ｎＭから０．１ｎＭの範囲内又はそれより狭い範囲内）での標的抗原の結合を意味し、例えば、ヒト疾患の診断アッセイ又は動物モデルに有利である。さらに好ましい実施態様では、異種間反応性抗体は、指定された全ての種（例えば、ヒト、マウス及びカニクイザル）からの標的抗原と、同様のアフィニティーで、特に、１００倍のＫＤ範囲内、５０倍のＫＤ範囲内、２０倍のＫＤ範囲内、１０倍のＫＤ範囲内、５倍のＫＤ範囲内で結合する。好ましい実施態様では、異種間反応性抗体は、ヒト、マウス及びカニクイザルからの標的抗原と、同様のアフィニティーで、特に１０倍のＫＤ範囲内で結合する。明確にするために言えば、異種間反応性抗体は、指定された他の種と比較して最も高いアフィニティーを有する指定された種の１つと結合する。したがって、異種間反応性抗体は、指定された他の種と比較して最も低いアフィニティーを有する指定された種の１つと結合する。定義された倍数ＸのＫＤ範囲内とは、最高のアフィニティーを有する指定された種に対するアフィニティーが、最低のアフィニティーを有する指定された種に対するアフィニティーのＸ倍以下であることを意味する。言い換えると、最低のアフィニティーを有する指定された種のＫＤ値は、最高のアフィニティーを有する指定された種のＫＤ値のＸ分の１以下である。指定された全ての種のＫＤ測定に同じ条件が適用されるのであれば、何れのアフィニティー又はアビディティー測定方法を使用して、異種間反応性抗体が、指定された全ての種からの標的抗原と本明細書に記載の所与のＫＤ倍数範囲内で結合することを検証してもよいことは、明らかである。好ましくは、ＫＤ値は、ＳＰＲを使用して、特に２５℃で測定される。好ましくは、アフィニティーは、異種間反応性抗体をＦａｂ断片として使用して測定される。
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合を含むこともあり、又は通常のものでない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において見られるもの等のアミド結合）を含むこともある。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図したものである。例えば、ベクターに含有されているポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明では単離されたものとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶解状態の（部分的に若しくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離された核酸は、そのポリヌクレオチド分子を元々含有する細胞に含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、又はその自然な染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写物はもちろん、プラス及びマイナス鎖形態、並びに二本鎖形態も含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成により産生されたそのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターを含むこともあり、又は含まないこともある。
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個毎に５つ以下の点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図したものである。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％以下を欠失させてもよく、若しくは別のヌクレオチドで置換してもよく、又は参照配列中の全ヌクレオチドの５％以下の数のヌクレオチドを参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの改変を、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置で行ってもよく、或いは参照配列内の残基又は参照配列内の１つ若しくは複数の近接する基内の残基間に個々に散在する、これらの末端位置の間のどこで行ってもよい。実際問題として、何れかの特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上で論じたもの（例えばＡＬＩＧＮ－２）を使用して従来通りに決定することができる。
用語「発現カセット」は、標的細胞内での特定の核酸の転写を可能にする一連の指定核酸エレメントを有する、組換えにより又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットをプラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込むことができる。典型的に、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、数ある配列の中でも特に、転写すべき核酸配列、及びプロモーターを含む。ある特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はそれらの断片を含む。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、作動可能に結合されている特定の遺伝子を標的細胞に導入し、その標的細胞内でのその遺伝子の発現を指示する、ＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターはもちろん、導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定したｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞の内部に入ると、遺伝子によりコードされているリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構により産生される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はそれらの断片を含む、発現カセットを含む。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、同義で使用され、外来性核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含めて、含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、これらには、初代形質転換細胞、及び継代数を問わずそれらに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量の点で親細胞と完全に同一でないこともあり、突然変異を含有することもある。最初に形質転換された細胞の中でスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が、ここに含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる任意のタイプの細胞システムである。宿主細胞には、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げれば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞等の、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が含まれるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内に含まれている細胞も含まれる。
薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療有効量」は、必要な投薬量で、必要な期間にわたって、所望の治療又は予防結果を達成するために、有効な量を指す。薬剤の治療有効量は、例えば、疾患の有害作用を除去する、減少させる、遅延させる、最小にする、又は予防する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の場合、個体又は対象はヒトである。
用語「薬学的組成物」は、含有する活性成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態である調製物であって、その製剤が投与されることになる対象にとって許容できないほど毒性であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される添加添加剤」は、薬学的組成物中の活性成分以外の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。薬学的に許容される添加剤としては、バッファー、安定剤又は防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「添付文書」は、治療用製品の市販のパッケージの中に通例含まれている説明書であって、そのような治療用製品に関する適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告についての情報を含む説明書を指すために使用される。
本明細書で使用される「治療」（及び「治療する」又は「治療すること」等の文法上の語尾変化形）は、治療を受ける個体の自然な経過を改変しようとする臨床的介入を指し、予防のために行われることもあり、又は臨床病理検査の過程において行われることもある。治療の望ましい効果としては、疾患の発生又は再発の予防、症候の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行速度の低下、病態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施態様では、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を緩徐化するために使用される。
本明細書で使用される用語「がん」は、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、がん、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん（stomach cancer、gastric cancer）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞がん、腎盂がん、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（中枢神経系）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮がん、下垂体腺腫及びユーイング肉腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、Ｂ細胞がん（リンパ腫）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病を、上記のがんの何れかについての難治性型、又は上記のがんの１つ若しくは複数についての組合せを含めて指す。
組成物及び方法
テネイシンＣ（ＴｎＣ）の選択的スプライシングを受けた異なるアイソフォームは、ある特定の病的状態で特異的に発現されるが健常成人組織には本質的に存在せず、したがって、ＴｎＣ標的抗原結合分子には大きな治療上の可能性がある。本発明は、生産性、安定性、結合アフィニティー、生物活性、標的指向化効率、及び毒性低下等の、特に有利な特性を有する、新規ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。本発明は、ＴｎＣと結合する抗原結合分子、特に、アフィニティー及び異種間反応性が向上した抗原結合分子を、さらに提供する。本発明の抗原結合分子は、例えば、ＴｎＣの発現を特徴とする疾患、例えばがんの診断又は治療に、有用である。
一態様では、標的細胞抗原がテネイシンＣ（ＴｎＣ）である、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
特定の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されている、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子であり、
（ｃ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、抗原結合分子を提供する。
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されている、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とし、この場合、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ヒトＴ細胞活性化を共刺激する。
別の特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とし、この場合、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、全ての場合、同一である。
さらなる態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１若しくはＣＬドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＬ若しくはＣＨ１ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１若しくはＣＬドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＬ若しくはＣＨ１ドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ－ＣＬ若しくはＶＬ－ＣＨ１ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＶＬ－ＣＨ１ドメイン若しくはＶＨ－ＣＬドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ若しくはＶＬに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバー２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＶＬ若しくはＶＨに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、本明細書に記載の抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１若しくはＣＬドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＬ若しくはＣＨ１ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１若しくはＣＬドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＬ若しくはＣＨ１ドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、請求項１に記載の抗原結合分子が提供される。
ある特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、４－１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される、ヒトＴ細胞活性化を共刺激するＴＮＦリガンドファミリーメンバーを含む。より特に、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４－１ＢＢＬである。
別の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１８３、配列番号１９２、配列番号１９３及び配列番号１９４からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に、配列番号１７２又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片は、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に、配列番号１７２又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片は、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドが、配列番号１７６、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７５及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。特定の実施態様では、第１のポリペプチドは、配列番号１８４のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドが、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドが、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１８７のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
なおさらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドが、配列番号１８４のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１８８又は配列番号１８９のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
別の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーはＯＸ４０Ｌである。特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号１８１又は配列番号１８２のアミノ酸配列、特に、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
一態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１９０又は配列番号１９１のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１８１又は配列番号１８２のアミノ酸配列を含むことを、それぞれ特徴とする抗原結合分子に関する。
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ＣＨ１又はＣＬドメインを含有する第１のポリペプチド、及びＣＬ又はＣＨ１ドメインを含有する第２のポリペプチドと
をそれぞれ含み、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、
抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
一態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ＣＨ１ドメインを含有する第１のポリペプチド、及びＣＬドメインを含有する第２のポリペプチドと
を含み、
第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１ドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＬドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ＣＬドメインを含有する第１のポリペプチド、及びＣＨ１ドメインを含有する第２のポリペプチドと
を含み、
第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＬドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＨ１ドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子が提供される。
別の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる１つより多くの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドに接続されている、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる２つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子を提供する。
特定の態様では、ＴＮＦファミリー、リガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む抗原結合分子が提供される。特に、そのようＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、ＴｎＣと特異的に結合することができる２つの部分を含む。
さらなる態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される、上文で定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
一態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される、上文に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。一態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分は、ａＶＨ又は足場抗原結合タンパク質である。一態様では、標的細胞抗原と特異的に結合することができる部分は、標的細胞抗原と特異的に結合することができる足場抗原結合タンパク質である。
特に、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、ＴｎＣと特異的に結合することができる１つ又は２つの部分を含む。
特定の態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、標的細胞抗原と特異的に結合することができるＦａｂ分子又はクロスオーバーＦａｂ分子である、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。特に、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分は、Ｆａｂ分子である。
さらなる態様では、第１の重鎖及び第１の軽鎖を含む、本発明によるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、第１の重鎖及び第１の軽鎖の双方が、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子、Ｃ末端で第２のペプチドリンカーにより第２の重鎖又は軽鎖に融合されている第１のペプチドであって、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチド及びＣ末端で第３のペプチドリンカーにより第２の軽鎖又は重鎖に融合されている第２のペプチドであって、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含む第２のペプチドを含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供される。
さらなる態様では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖のＣＨ１ドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片が、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖のＣＬドメインに融合されている、本発明によるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＬドメインに融合されている、本発明によるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
別の態様では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖のＣＬドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片が、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖のＣＨ１ドメインに融合されている、本発明によるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
別の態様では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＬドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されている、本発明によるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、本発明は、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより軽鎖のＣＬドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片が、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより重鎖のＣＨ１ドメインに融合されている、本発明によるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
別の態様では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＶＨドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＶＬドメインに融合されている、本発明によるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
特定の態様では、本発明は、ペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）２である、上で定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。一態様では、第１のペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１５０）であり、第２のペプチドリンカーは、ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１５３）であり、第３のペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１５０）である。特に、本発明は、第１のペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１５０）であり、第２のペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１５０）であり、第３のペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１５０）である、上で定義された通りのＴＮＦリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
別の態様では、上文で定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
特に、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、（ａ）Ｆａｂ重鎖が、そのＣ末端でＦｃドメイン内のＣＨ２ドメインのＮ末端に融合されている、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子と、（ｃ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含む。
さらなる態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの結合を促進する修飾を含む。
Ｆｃ受容体結合を低減させる及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖を含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、各々のサブユニットがＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む、ダイマーである。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定的に結合することができる。
Ｆｃドメインは、標的組織内への良好な蓄積及び有利な組織－血液分布比の一因となる長い半減期を含む、有利な薬物動態特性を、本発明の抗原結合分子に付与する。しかし、同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞へではなくＦｃ受容体を発現する細胞への本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的指向化をもたらす。したがって、特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合アフィニティーの低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈示する。一態様では、Ｆｃは、Ｆｃ受容体と実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。具体的態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインは、エフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下は、これらに限定されないが、次のうちの１つ又は複数を含み得る：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減。
ある特定の態様では、１つ又は複数のアミノ酸修飾を本明細書で提供される抗原結合分子のＦｃ領域に導入することによってＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
特定の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子であり、
（ｃ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体との、特に、Ｆｃγ受容体への結合を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合アフィニティー及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸突然変異を含む。典型的に、同じ１つ又は複数のアミノ酸突然変異が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５位（ＥＵ番号付け）並びに／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。より特に、ＩｇＧ重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む、本発明による抗原結合分子が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ突然変異を指す。アミノ酸置換の組合せ「ＰＧＬＡＬＡ」は、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させ、国際特許出願公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載されており、この参考特許文献には、そのような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びその特性、例えば、Ｆｃ受容体結合又はエフェクター機能を判定する方法も記載されている。「ＥＵ番号付け」は、Ｋａｂａｔ等、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１のＥＵインデックスによる番号付けを指す。
Ｆｃ受容体結合が低減された及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数についての置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ突然変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位のうちの２カ所以上に置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許７３３２５８１号）。
別の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合アフィニティーの低下及びエフェクター機能の低下を呈示する。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（カバット番号付け）にアミノ酸置換を含む、特に、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。そのようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン突然変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
変異Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を使用してアミノ酸欠失、置換、挿入又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法としては、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を挙げることができる。正しいヌクレオチド変化を例えば配列決定によって検証することができる。
Ｆｃ受容体への結合は、例えばＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的計測手段と組換え発現により得ることができるものなどのＦｃ受容体とを使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に判定することができる。好適なそのような結合アッセイは、本明細書で説明される。或いは、Ｆｃドメインの、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティーは、特定のＦｃ受容体を発現することが公知の細胞株、例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して、評価することができる。
Ｆｃドメインのエフェクター機能、又はＦｃドメインを含む本発明の抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野で公知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣの測定に好適なアッセイは、本明細書で説明される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３、７０５９－７０６３（１９８６）；及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２、１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ等、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６、１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。或いは、非放射性アッセイの方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。或いは、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５、６５２－６５６（１９９８）に開示されているもの等の動物モデルにおいて、評定することができる。
一部の実施態様では、補体成分への、特にＣ１ｑへの、Ｆｃドメインの結合が低減される。したがって、エフェクター機能を低下させるようにＦｃドメインを操作する一部の実施態様では、前記エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下を含む。本発明の抗原結合分子が、Ｃ１ｑに結合することができるかどうか、及びそれ故にＣＤＣ活性を有するかどうかを判定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを行ってもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro等、J Immunol Methods 202、163(1996);Cragg等、Blood 101、1045-1052(2003);並びにCragg及びGlennie、Blood 103、2738-2743(2004)を参照されたい）。
特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの結合を促進する修飾を含む。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とし、
（ｃ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含み、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体との、特に、Ｆｃγ受容体への結合を低減させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。したがって、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、２つの非同一のポリペプチド鎖（「重鎖」）に通常は含まれているＦｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合されている、異なる部分を含む。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化は、２つのポリペプチドの幾つかの可能な組合せをもたらす。したがって、組換え産生でのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の収量及び純度を向上させるために、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のＦｃドメインに所望のポリペプチドの結合を促進する修飾を導入することは、有利であるであろう。
したがって、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの結合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質－タンパク質相互作用部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、前記修飾は、特に、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおけるものである。
具体的態様では、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のサブユニットに「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方のサブユニットに「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブイントゥーホール」修飾である。したがって、特定の態様では、本発明は、ＩｇＧ分子を含む、上文に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、第１の重鎖のＦｃ部分が第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分が、第２の二量体化モジュールを含むことにより、ＩｇＧ分子の２つの重鎖のヘテロ二量体化が可能になり、ノブイントゥーホール技術に従って、第１の二量体化モジュールがノブを含み、第２の二量体化モジュールがホールを含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
ノブイントゥーホール技術は例えば、米国特許第５７３１１６８号、米国特許第７６９５９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ等、Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９、６１７－６２１（１９９６）、及びＣａｒｔｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８、７－１５（２００１）に記載されている。一般に、この方法は、突出部を空洞内に配置して、ヘテロ二量体形成を促進すること及びホモ二量体形成を妨げることができるように、第１のポリペプチドの接触面に突出部（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞（「ホール」）を導入することを含む。突出部は、第１のポリペプチドの接触面からの小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換することにより構築される。大きい側鎖をより小さい側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）で置換することにより、突出部と同一又は同様のサイズの代償的「空洞」が第２の抗体の境界面に作出される。
したがって、特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基がより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞の中に位置することができる突出部が第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基がより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突出部が位置することができる空洞が第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成される。
突出部及び空洞は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドを例えば部位特異的突然変異誘発により又はペプチド合成により改変することによって、作製することができる。
具体的態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置換され（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の４０７位のチロシン残基がバリン残基で置換される（Ｙ４０７Ｖ）。より特に、Ｆｃドメインの第２のサブユニット内で、さらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置換され（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置換される（Ｌ３６８Ａ）。より特に、Ｆｃドメインの第１のサブユニット内で、さらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置換され（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット内で、さらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置換される（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入の結果、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成されることになる。このジスルフィド架橋がダイマーをさらに安定させる（Carter、J Immunol Methods 248、7-15(2001)）。
代替態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの結合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ公開・国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような、静電的ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモダイマー形成が静電的に不利になるが、ヘテロ二量体化が静電的に有利になるように、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面の１つ又は複数のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基に置換することを含む。
ＣＨ１／ＣＬドメインにおける修飾
正しいペアリングをさらに増進するために、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含有することができる。これらの修飾は、クロスした又はクロスしていないＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、ＣＬドメインのうちの１つにおいて１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）に置換されており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）に置換されている、及びＣＨ１ドメインのうちの１つにおいて１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
より特に、本発明は、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメイン内の１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）に置換されており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）に置換されている、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメイン内の１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
特定のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子
別の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子を両方が含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖と、第２のペプチドリンカーによりそのＣ末端で第２の重鎖又は軽鎖に融合されている、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、第１のペプチドと、第３のペプチドリンカーによりそのＣ末端で第２の軽鎖又は重鎖に融合されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含む、第２のペプチドとをそれぞれ含む、抗原結合分子を提供する。
さらなる態様では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＬドメインに融合されている、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
さらに別の態様では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＬドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されている、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＶＨドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＶＬドメインに融合されている、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
一態様では、本発明は、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメイン内の１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）に置換されており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）に置換されている、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメイン内の１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。これらの修飾は、例えばミスペアリング等の望ましくない効果を回避する有利な特性を有する、いわゆる荷電残基をもたらす。
一態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、そのＮ末端で、ノブ突然変異を含むＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端で、ホール突然変異を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されている、抗原結合分子が提供される。
特定の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、そのＮ末端で、ノブ突然変異を含むＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端で、ホール突然変異を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されており、Ｆａｂ重鎖が、そのＣ末端で、ノブ突然変異を含むＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端側に融合されている、抗原結合分子を提供する。
別の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、そのＮ末端で、ノブ突然変異を含むＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端で、ホール突然変異を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されており、Ｆａｂ重鎖が、そのＣ末端で、ホール突然変異を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されている、抗原結合分子を提供する。
さらなる態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、そのＮ末端で、ホール突然変異を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端で、ノブ突然変異を含むＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、抗原結合分子が提供される。
特定の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、そのＮ末端で、ホール突然変異を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端で、ノブ突然変異を含むＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端側に融合されており、Ｆａｂ重鎖が、そのＣ末端で、ノブ突然変異を含むＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、抗原結合分子を提供する。
別の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、そのＮ末端で、ホール突然変異を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端で、ノブ突然変異を含むＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端側に融合されており、Ｆａｂ重鎖が、そのＣ末端で、ホール突然変異を含むＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されている、抗原結合分子を提供する。
特定のＴｎＣ結合部分
一態様では、本発明は、ＴｎＣ結合部分を提供する。別の態様では、本発明のＴＮＣ結合部分に、本明細書に記載の二価又は多価結合分子を含めることができる。一実施態様態では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分は、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、並びにａＶＨ及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される。別の態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる１つ又は複数の部分を含む抗原結合分子を提供する。本明細書に記載のＴｎＣ結合部分を含む本発明の分子は、１つ又は複数のＴｎＣドメインに対する高いアフィニティー、及び／又は異種間反応性を有する。
一実施態様では、本発明の抗ＴｎＣ抗原結合分子は、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２からなる群から選択される少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５若しくは６つ）の重鎖若しくは軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は前記ＣＤＲの特異性決定残基（ＳＤＲ）を少なくとも含有する領域の変異体若しくは切断型を含む。
一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、（ａ）配列番号６７及び配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６８及び配列番号７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号６９及び配列番号７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全ての重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）を含む。さらなる実施態様では、抗原結合分子は、（ａ）配列番号６７及び配列番号７０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号６８及び配列番号７１からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号６９及び配列番号７２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３、を含む重鎖可変領域、又は前記ＣＤＲについてのＳＤＲを少なくとも含有する重鎖可変領域の変異体若しくは切断型を含む。
一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、（ａ）配列番号５５及び配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５６及び配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号５７及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全ての軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）を含む。さらなる実施態様では、抗原結合分子は、（ａ）配列番号５５及び配列番号５８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号５６及び配列番号５９からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｃ）配列番号５７及び配列番号６０からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３、を含む、軽鎖可変領域、又は前記ＣＤＲについてのＳＤＲを少なくとも含有する軽鎖可変領域の変異体若しくは切断型を含む。
一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、配列番号６７及び配列番号７０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１と、配列番号６８及び配列番号７１からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２と、配列番号６９及び配列番号７２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１とを含む、重鎖可変領域；及び配列番号５５及び配列番号５８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号５６及び配列番号５９からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号５７及び配列番号６０からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１とを含む、軽鎖可変領域；又は前記ＣＤＲについてのＳＤＲを少なくとも含有する可変領域の変異体若しくは切断型を含む。
さらに別の具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、配列番号６７の重鎖ＣＤＲ１と、配列番号６８の重鎖ＣＤＲ２と、配列番号６９の重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域；及び配列番号５５の軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む。
さらに別の具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、配列番号７０の重鎖ＣＤＲ１と、配列番号７１の重鎖ＣＤＲ２と、配列番号７２の重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域；及び配列番号５８の軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号５９の軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号６０の軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む。
一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、配列番号４６及び配列番号４８からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一実施態様では、抗原結合分子は、配列番号４６及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
ある特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗ＴｎＣ抗原結合分子は、ＴｎＣと結合する能力を保持する。ある特定の実施態様では、配列番号４６又は配列番号４８における合計１から１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲ又はＣＤＲ外の領域で（すなわち、ＦＲ内で）行われる。任意選択的に、本発明による抗ＴｎＣ抗原結合分子は、配列番号４６又は配列番号４８のＶＨ配列を含み、この配列は、この配列の後翻訳修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３について配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の配列から選択される１、２又は３つの重鎖ＣＤＲを含む。
別の実施態様では、本発明の抗原結合分子は、配列番号４５及び配列番号４７からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに別の実施態様では、抗原結合分子は、配列番号４５及び配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
ある特定の実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗ＴｎＣ抗原結合分子は、ＴｎＣと結合する能力を保持する。ある特定の実施態様では、配列番号４５又は配列番号４７における合計１から１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲ又はＣＤＲ外の領域で（すなわち、ＦＲ内で）行われる。任意選択的に、本発明の抗ＴｎＣ抗原結合分子は、配列番号４５又は配列番号４７のＶＬ配列を含み、この配列は、この配列の後翻訳修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３について配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９及び配列番号６０に記載の配列から選択される１、２又は３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
別の態様では、上で提供された実施態様の何れかにおけるようなＶＨと、上で提供された実施態様の何れかにおけるようなＶＬとを含む、抗ＴｎＣ抗原結合分子が提供される。一実施態様では、抗原結合分子は、配列番号４６及び配列番号４８の群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５及び配列番号４７の群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一実施態様では、抗原結合分子は、配列番号４６又は配列番号４８及び配列番号４５又は配列番号４７のＶＨ及びＶＬ配列をそれぞれ含み、これらの配列は、これらの配列の後翻訳修飾を含む。
具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施態様では、上記実施態様の何れかによる抗原結合分子は、さらに、Ｆｃ領域を含むか、又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、Ｆｃ領域、特にＩｇＧ Ｆｃ領域、最も特にＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。特定の実施態様では、本発明の抗原結合分子は、完全長抗体、特にＩｇＧクラス抗体、最も特にＩｇＧ１アイソタイプ抗体である。別の実施態様では、本発明の抗原結合分子のＴｎＣ結合部分は、ｓｄＦｖ断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片の群から選択される、抗体断片である。さらなる実施態様では、本発明の抗原結合分子は、Ｆｃ領域を有する抗体断片であるか又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む融合タンパク質である。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、モノクローナル抗体である。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、キメラのものであり、より具体的にはヒト化されたものである。特定の実施態様において、本発明の抗原結合分子は、ヒトのものである。別の実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト定常領域を含む。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒトＦｃ領域、好ましくはヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、最も特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。
一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、重鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ領域を含むヒトＩｇＧ定常領域、特にヒトＩｇＧ１定常領域である。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、重鎖領域を含み、前記重鎖領域は、Ｆｃ領域を含むヒトＩｇＧ重鎖領域、特にヒトＩｇＧ１重鎖領域である。具体的な実施態様では、抗原結合分子は、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８３及び配列番号８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖領域を含む。別の具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、配列番号７７及び配列番号７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖領域を含む。さらに別の具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む重鎖領域、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。さらに別の具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖領域、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗原結合分子であって、ａ）Ｆｃ領域を含むか又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域を含む、配列番号７８及び配列番号８０からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖領域、又は配列番号７７及び配列番号７９からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖領域、又はこれらの組合せを含む、抗原結合分子を提供する。
一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、テネイシンＣ（ＴｎＣ）と、約１μＭ未満から約０．０１ｎＭの解離定数（ＫＤ）値、特に約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、又は約１ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒトテネイシンＣ（ＴｎＣ）と、約１ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣと結合する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、異種間反応性を有する。別の具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのＣドメインと結合する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、異種間反応性を有する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのうちの少なくとも１つと約１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満又は２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのうちの少なくとも１つと約２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。さらなる実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、前記抗原結合分子は、マウスと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、前記抗原結合分子は、カニクイザルと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択されるＫＤ値の全てが、約１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満又は２ｎＭ未満である。なおさらなる実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、前記抗原結合分子は、マウスと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、前記抗原結合分子は、カニクイザルと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択されるＫＤ値の全てが、１０ｎＭから０．１ｎＭの範囲、５ｎＭから０．１ｎＭの範囲、又は２ｎＭから０．１ｎＭの範囲である。さらなる実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、前記抗体は、マウスと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、前記抗体は、カニクイザルと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択されるＫＤ値の全てが、２０倍のＫＤ範囲内である。さらなる実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＴｎＣと第１のＫＤ値ＫＤ１で結合し、前記抗体は、マウスと第２のＫＤ値ＫＤ２で結合し、前記抗体は、カニクイザルと第３のＫＤ値ＫＤ３で結合し、ＫＤ１、ＫＤ２及びＫＤ３からなる群から選択されるＫＤ値の全てが、１０倍のＫＤ範囲内である。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、ＡＤ１、ＡＤ２、Ｃ及びＤからなる群から選択されるＴｎＣドメインのうちの少なくとも１つに特異的である。一実施態様では、Ａ１、Ａ４及びＣからなる群から選択されるＴｎＣドメインのうちの少なくとも１つと特異的に結合することができる抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ＴｎＣドメインＡ１及びＡ４に特異的である。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ＴｎＣドメインＣに特異的である。具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣの、Ａ１ドメインと及びＡ４ドメインと結合する。別の具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのＣドメインと結合する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、異種間反応性を有する。より具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣ Ａ１のＡ１ドメインと、並びにヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣ Ａ４のＡ４ドメインと、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満又は約２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する。ＫＤ値は、抗体をＦａｂ又はＩｇＧとして使用して表面プラズモン共鳴により決定される。一実施態様では、本発明の抗ＴｎＣ抗原結合分子は、ヒト組織内のＴｎＣに結合する。
一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、Ｆｃ領域を含み、前記抗原結合分子は、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施態様では、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む本発明の抗原結合分子は、親非置換Ｆｃ領域を含む抗原結合分子と比較して、エフェクター機能が低下されている、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが低下されている。具体的な実施態様では、前記親非置換Ｆｃ領域は、アミノ酸残基Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５及びＰｒｏ３２９を含み、置換Ｆｃ領域は、親非置換Ｆｃ領域と比べて、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙからなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗原結合分子であって、ａ）配列番号８３及び配列番号８４からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖領域と、配列番号７７及び配列番号７９からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖領域とを含む、抗原結合分子を提供する。具体的な実施態様では、本発明の抗体は、配列番号８３及び配列番号８４の群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖領域を含む。さらなる実施態様では、置換Ｆｃ領域を含む抗原結合分子は、親非置換重鎖領域を含む抗原結合分子と比較して、エフェクター機能が低下されている、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが低下されている。さらなる具体的な実施態様では、前記置換Ｆｃ領域を含む本発明の抗原結合分子は、親非置換Ｆｃ領域と比べてアミノ酸置換Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙを含み、ＦｃγＲ及びＣ１ｑとの結合が消失される、及び／又はＦｃ媒介エフェクター機能が消失される。特定の実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＡＤＣＣの低下である。別の特定の実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＡＤＣＣの消失である。Ｆｃ受容体結合の減少は、好ましくは、活性化Ｆｃ受容体、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａへの結合の減少である。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、治療有効量で個体に投与されたとき、臨床的に有意なレベルの毒性の原因とならない。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗原結合分子であって、ａ）配列番号４６及び配列番号４８からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は配列番号４５及び配列番号４７からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又はこれらの組合せと、ｂ）Ｆｃ領域、又は免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域とを含む、抗原結合分子を提供する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域は、糖改変Ｆｃ領域である。さらなる実施態様では、本発明の抗原結合分子は、Ｆｃ領域に修飾オリゴ糖を有するように糖改変される。具体的な実施態様では、抗原結合分子は、非糖改変抗原結合分子と比較して、Ｆｃ領域内の二分されたオリゴ糖の割合が増加されている。より具体的な実施態様では、抗原結合分子のＦｃ領域内のＮ結合型オリゴ糖の少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％は、二分されている。二分されたオリゴ糖は、ハイブリッド型であってもよく、複合体型であってもよい。別の具体的な実施態様では、本発明の抗原結合分子は、非糖改変抗原結合分子と比較して、Ｆｃ領域内の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加されている。より具体的な実施態様では、抗原結合分子のＦｃ領域内のＮ結合型オリゴ糖の少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％は、フコシル化されていない。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド型であってもよく、複合体型であってもよい。特定の実施態様では、本発明の抗原結合分子は、非糖改変抗原結合分子と比較して、Ｆｃ領域内の二分された非フコシル化オリゴ糖の割合が増加されている。具体的には、抗原結合分子は、Ｎ結合型オリゴ糖の少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％、好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約２５％、少なくとも約３５％又は少なくとも約５０％が、二分されており、フコシル化されていない、Ｆｃ領域を含む。二分された非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド型であってもよく、複合体型であってもよい。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、エフェクター機能が増加されている、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが増大されている。エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合の増加は、例えば、抗体の糖改変及び／又はアフィニティー成熟に起因し得る。一実施態様では、エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合の増加は、抗原結合分子のＦｃ領域の糖改変の結果である。別の実施態様では、エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合の増加は、アフィニティーの増大と糖改変の組合せの結果である。エフェクター機能の増加は、これらに限定されないが、次のうちの１つ又は複数を含み得る：Ｆｃ媒介細胞傷害性の増加（抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加を含む）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の増加、標的結合抗体の架橋の増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。特定の実施態様では、エフェクター機能の増加は、ＡＤＣＣの増加である。Ｆｃ受容体結合の増加は、好ましくは、活性化Ｆｃ受容体、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加である。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、治療有効量で個体に投与されたとき、臨床的に有意なレベルの毒性の原因とならない。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含む抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含む抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーの増大を有するように糖改変されている、抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、エフェクター機能の増加及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーの増大を有するように糖改変されている、抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、抗原結合分子であり、親非置換Ｆｃ領域が、アミノ酸残基Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５及びＰｒｏ３２９を含み、置換されているＦｃ領域が、親非置換Ｆｃ領域と比べてＬｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙからなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含み、置換されているＦｃ領域を含む当該抗原結合分子が、親非置換Ｆｃ領域を含む抗原結合分子と比較して、エフェクター機能が低下されており、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが低下されている、抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、抗原結合分子であり、親非置換Ｆｃ領域が、アミノ酸残基Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５及びＰｒｏ３２９を含み、置換されているＦｃ領域が、親非置換Ｆｃ領域と比べてＬｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙからなる群から選択されるアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含み、置換されているＦｃ領域を含む当該抗原結合分子が、親非置換Ｆｃ領域を含む抗原結合分子と比較して、エフェクター機能が低下されており、及び／又はＦｃ受容体結合アフィニティーが低下されている、抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、
（ａ）配列番号６７の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号６８の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号６９の重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
（ａ）配列番号５５の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５６の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５７の軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、
（ａ）配列番号７０の重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号７１の重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号７２の重鎖ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
（ａ）配列番号５８の軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５９の軽鎖ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号６０の軽鎖ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号７８のアミノ酸配列を含む重鎖領域と、配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖領域とを含む抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含む抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖領域と、配列番号７９の群から選択されるアミノ酸を含む軽鎖領域とを含む、抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明は、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含む抗原結合分子を提供する。
別の特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、Ｆｃ領域内の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加されている、及び／又は二分されたオリゴ糖の割合が増加されている、抗原結合分子を提供する。別の特定の実施態様では、本発明は、ＴｎＣのＣドメインと特異的に結合する抗原結合分子であって、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域とを含み、Ｆｃ領域内の非フコシル化オリゴ糖の割合が増加されている、及び／又は二分されたオリゴ糖の割合が増加されている、抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合する抗原結合分子であって、親抗原結合分子の少なくとも１つの重鎖又は軽鎖ＣＤＲに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む抗原結合分子を提供する。例えば、抗原結合分子は、親抗原結合分子の１つ又は複数の超可変領域又はＣＤＲ（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの超可変領域又はＣＤＲ）に、少なくとも１つの、例えば、約１つから約１０（すなわち、約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）、特に、約２つから約５つの置換を含み得る。
加えて、抗原結合分子は、親抗原結合分子と比較して、重鎖又は軽鎖どちらかの１つ又は複数のフレームワーク領域に１つ又は複数の付加、欠失及び／又は置換も含み得る。一実施態様では、少なくとも１つのＣＤＲにおける前記少なくとも１つのアミノ酸置換は、その親抗原結合分子と比較して、抗原結合分子の結合アフィニティーの増加の一因となる。別の実施態様では、前記抗原結合分子は、ＴｎＣに対して親抗原結合分子より少なくとも約２倍から約１０倍大きいアフィニティーを（本発明の抗原結合分子と親抗原結合分子を同じ形式、例えばＦａｂ形式で比較したとき）有する。さらに、親抗原結合分子に由来する抗原結合分子は、本発明の抗体に関して上段で説明した特徴の何れかを、単独で又は組合せで取り入れることができる。
ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の特定のＴｎＣ結合部分
一態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、（ｉ）配列番号６７又は配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号６８又は配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号６９又は配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５５又は配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５６又は配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号５７又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
特定の態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、（ｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子であり、（ｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む可変重鎖と配列番号４５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含むか、又は配列番号４８のアミノ酸配列を含む可変重鎖と配列番号４７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む。
さらなる態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分は、配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
別の態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分は、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
特定の態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の特定の態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分は、配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。具体的な態様では、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分は、配列番号４６のアミノ酸配列をからなるＶＨドメイン、及び配列番号４５のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む。
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子を両方が含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖、
（ｂ）配列番号１７６、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７５及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１７６、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７５及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＴｎＣと特異的結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１７２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＴｎＣと特異的結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１８４のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１８３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１７６、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７５及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１７６のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１７２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＴｎＣと特異的結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１８４のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１８３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
一態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と
を含む、抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子を両方が含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖と、第２のペプチドリンカーによりそのＣ末端でＣＨ１ドメインに融合されている、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、第２の重鎖と、第３のペプチドリンカーによりそのＣ末端でＣＬドメインに融合されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、第２の軽鎖とを含み、
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と
を含む抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子を両方が含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖と、第１のペプチドリンカーにより互いに接続されており、第２のペプチドリンカーによりそのＣ末端でＣＬドメインに融合されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、第２の重鎖と、第３のペプチドリンカーによりそのＣ末端でＣＨ１ドメインに融合されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む、第２の軽鎖とを含み、
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１０２、配列番号１０８、配列番号１１６及び配列番号１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１７及び配列番号１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と
を含む抗原結合分子が提供される。
別の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１０２、配列番号１０８、配列番号１１６及び配列番号１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１７及び配列番号１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と
を含む、抗原結合分子を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む抗原結合分子を提供する。
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドは、そのＮ末端でＦｃドメインのサブユニットの一方のＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドは、そのＮ末端でＦｃドメインの他方のサブユニットのＣ末端に融合されており、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドは、配列番号１７６及び配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドは、配列番号１７２及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドは、配列番号１７６のアミノ酸配列を含み、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドは、配列番号１７２のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドは、配列番号１８４のアミノ酸配列を含み、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドは、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。
一態様では、本発明は、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つのＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインのサブユニットの一方のＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの他方のサブユニットのＣ末端に融合されているＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。したがって、本発明は、標的細胞抗原への結合について一価である、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
さらなる態様では、本発明は、
（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインのサブユニットの一方のＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの他方のサブユニットのＣ末端に融合されているＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
別の態様では、本発明は、
（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、又は配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインのサブユニットの一方のＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの他方のサブユニットのＣ末端に融合されており、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドが、配列番号１７６及び配列番号１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドが、配列番号１７２及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及びＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインのサブユニットの一方のＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの他方のサブユニットのＣ末端に融合されており、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含む第１のポリペプチドが、配列番号１８４のアミノ酸配列を含み、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含む第２のポリペプチドが、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む、抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ｉ）ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインのＶＬドメインを含む軽鎖と、
（ｉｉ）Ｆｃドメインの第１のサブユニットと、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドとを含む融合ポリペプチドであって、第１のポリペプチドがそのＮ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットに融合されている、融合ポリペプチドと、
（ｉｉｉ）ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインのＶＨドメインと、Ｆｃドメインの第２のサブユニットと、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドとを含む重鎖であって、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインの可変重鎖が、そのＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されている重鎖と
を含む、抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、本発明は、（ｄ）ＴｎＣと特異的に結合することができないＦａｂドメインをさらに含む、前に定義された通りのＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。したがって、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインと、
（ｂ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、
（ｃ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチド、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドと
を含み、第１のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインのサブユニットの一方のＣ末端側に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの他方のサブユニットのＣ末端に融合されており、
（ｄ）標的細胞抗原と特異的に結合することができないＦａｂドメイン
を含む、抗原結合分子を提供する。
本発明のさらなる特定の態様では、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子を両方が含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖（この場合、第１の重鎖は、配列番号４６のアミノ酸配列を含み、第１の軽鎖は配列番号４５のアミノ酸配列を含む）と、
（ｂ）第２のペプチドリンカーによりそのＣ末端でＣＬドメインに融合されている第１のペプチドリンカーによって互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第２の重鎖、及び第３のペプチドリンカーによりそのＣ末端がＣＨ１ドメインに融合されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の軽鎖（この場合、第２の重鎖は、配列番号１１６又は配列番号１２０のアミノ酸配列を含み、第２の軽鎖は配列番号１１７又は配列番号１２１のアミノ酸配列を含む）と
を含むＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。特に、第２の重鎖は、配列番号１１６のアミノ酸配列を含み、第２の軽鎖は、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む。
さらに、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む抗原結合分子を提供する。
特に、
（ｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖
を含む、上文に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
特定の態様では、そのようなＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、ＴｎＣと特異的に結合することができる２つの部分を含む。
一態様では、本発明は、ＴｎＣと特異的に結合することができる２つの部分を含む、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を提供する。特に、
（ｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖
を含む、上文に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ｉ）ＴＮＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインのＶＬドメインを含む軽鎖と、
（ｉｉ）Ｆｃドメインの第１のサブユニットと、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドとを含む融合ポリペプチドであって、第２のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されている、融合ポリペプチドと、
（ｉｉｉ）ＴＮＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインのＶＨドメインと、Ｆｃドメインの第２のサブユニットと、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドとを含む重鎖であって、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインの可変重鎖が、そのＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、重鎖と
を含む、抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ｉ）ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインのＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインのＶＨドメインと、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドとを含む第１の重鎖であって、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインの可変重鎖が、そのＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、第２のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されている、第１の重鎖と、
（ｉｉｉ）標的細胞抗原と特異的に結合することができないＦａｂドメインのＶＨドメインと、Ｆｃドメインの第２のサブユニットと、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドとを含む第２の重鎖であって、標的細胞抗原と特異的に結合することができないＦａｂドメインの可変重鎖が、そのＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されている第２の重鎖と、
（ｉｖ）標的細胞抗原と特異的に結合することができないＦａｂドメインのＶＬドメインを含む第２の軽鎖と
を含む、抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ｉ）ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインのＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインのＶＨドメインと、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドとを含む第１の重鎖であって、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂドメインの可変重鎖が、そのＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されている、第１の重鎖と、
（ｉｉｉ）標的細胞抗原と特異的に結合することができないＦａｂドメインのＶＨドメインと、Ｆｃドメインの第２のサブユニットと、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドとを含む第２の重鎖であって、標的細胞抗原と特異的に結合することができないＦａｂドメインの可変重鎖が、そのＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のポリペプチドが、そのＮ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、第２の重鎖と、
（ｉｖ）標的細胞抗原と特異的に結合することができないＦａｂドメインのＶＬドメインを含む第２の軽鎖と
を含む抗原結合分子が提供される。
さらなる特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
ａ）配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
ｂ）配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、又は
ｄ）配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
ｅ）配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｆ）配列番号１２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、又は
（ｇ）配列番号１２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｈ）配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｊ）配列番号１３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む１つの軽鎖
を含むＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
さらなる特定の態様では、本発明は、
ａ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子、
ｂ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子、
（ｃ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖を含む分子、
ｄ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子、
ｅ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号７７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子、
（ｆ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖を含む分子、
（ｇ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖を含む分子、
（ｈ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖を含む分子、
（ｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖を含む分子、
（ｊ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖を含む分子
からなる群から選択されるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に関する。
別の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがＯＸ４０Ｌであり、標的細胞抗原がテネイシンＣ（ＴｎＣ）であり、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号６７又は配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号６８又は配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号６９又は配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３と
を含むＶＨドメイン、及び
（ｉｖ）配列番号５５又は配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、
（ｖ）配列番号５６又は配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、
（ｖｉ）配列番号５７又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３と
を含むＶＬドメイン
を含むＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子が提供される。
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と
を含む。
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載の抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片をさらに提供する。
本発明の抗原結合分子の単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されることもあり、又は共発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されることもある。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段によって機能性抗原結合分子を形成するように結合することができる。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、該免疫グロブリンの重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによりコードされ得る。共発現されたとき、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと結合して、免疫グロブリンを形成することになる。
一部の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明による抗原結合分子全体をコードする。特に、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載の本発明によるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子に含まれているポリペプチドをコードする。
一態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる部分をコードする配列と、（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むポリペプチドをコードする配列と、（ｃ）ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列とを含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。
別の態様では、本発明は、４－１ＢＢリガンドトリマー含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる部分をコードする配列と、（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続されている４－１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むポリペプチドをコードする配列と、（ｃ）４－１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列とを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一実施態様では、本発明は、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の重鎖若しくは軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５若しくは６つ）をコードする配列、又は前記ＣＤＲについての特異性決定残基（ＳＤＲ）を少なくとも含有する配列の変異体若しくは切断型を含む。
別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２から選択される３つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）若しくは３つの軽鎖ＣＤＲ（例えばＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）をコードする配列、又は前記３つの相補性決定領域の各々についてのＳＤＲを少なくとも含有する配列の変異体若しくは切断型を含む。さらに別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２から選択される３つの重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖軽鎖ＣＤＲ（例えばＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）をコードする配列を含む。
特定の実施態様では、１つ又は複数のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５及び配列番号６６のＣＤＲヌクレオチド配列のうちの１つ又は複数と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む。
さらなる実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号４６及び配列番号４８の群から選択される重鎖可変領域をコードする配列、並びに／又は配列番号４５及び配列番号４７の群から選択される軽鎖可変領域をコードする配列を含む。特定の実施態様では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４からなる可変領域ヌクレオチド配列の群からなる群から選択される選択される配列、又はそれらの組合せを含む。
具体的な実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号４６及び配列番号４８の群から選択される重鎖可変領域をコードする配列と、重鎖定常領域、特にヒト重鎖定常領域、をコードする配列とを含む。特定の実施態様では、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ領域を含むヒトＩｇＧ重鎖定常領域、特にヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。別の具体的な実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５及び配列番号４７の群から選択される軽鎖可変領域をコードする配列と、軽鎖定常領域、特にヒト軽鎖定常領域、をコードする配列とを含む。
一実施態様では、本発明は、配列番号７７及び配列番号７９からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする第１の単離されたポリヌクレオチドと、配列番号７８及び配列番号８０からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする第２の単離されたポリヌクレオチドとを含む、組成物に関する。
一実施態様では、本発明は、配列番号７７及び配列番号７９からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む第１の単離されたポリヌクレオチドと、配列番号８３及び配列番号８４からなる群から選択される配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む第２の単離されたポリヌクレオチドとを含む、組成物に関する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５又は配列番号１８３で示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む２つの４－１ＢＢＬ断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関し、及び配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５又は配列番号１８３で示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む１つの４－１ＢＢＬ断片を含むポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドに関する。
さらに、ＯＸ４０リガンドトリマー含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる部分をコードする配列と、（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続されているＯＸ４０Ｌの２つのエクトドメイン又はそれらの２つの断片を含むポリペプチドをコードする配列と、（ｃ）ＯＸ４０Ｌの１つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列とを含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
別の態様では、本発明は、配列番号１８１又は配列番号１８２で示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む２つの４－１ＢＢＬ断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関し、及び配列番号１８１又は配列番号１８２で示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む１つの４－１ＢＢＬ断片を含むポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で開示される特異的ｃＤＮＡ配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一である配列を含むポリヌクレオチドに関する。特定の態様では、本発明は、本明細書で開示される特異的ｃＤＮＡ配列の１つと同一である配列を含むポリヌクレオチドに関する。
他の態様では、核酸分子は、配列番号１７６、１７７、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８若しくは１８９の何れか１つに記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はそのようなヌクレオチド配列からなる。さらなる態様では、核酸分子は、配列番号１０２、１０３、１０４、１０８、１０９、１１２、１１３、１１６、１１７、１２０、１２１、１２４、１２５、１２７、１３０、１３１、１３３、１３６、１３７、１７８及び１７９の何れか１つに記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、又はそのようなヌクレオチド配列からなる。
さらに他の態様では、核酸分子は、配列番号４１、４２、４３、４４、４９、５０、５１、５２、５３、５４、６１、６２、６３、６４、６５、６６、７３、７４、７５、７６、８１、８２、８８、８９、９０、９１、９６、９８、９９、１００、１０６、１０７、１１０、１１１、１１４、１１５、１１８、１１９、１２２、１２３、１２６、１２８、１２９、１３２、１３４若しくは１３５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、又はそのようなヌクレオチド配列からなる。
ある特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖のものであってもよく、又は二本鎖のものであってもよい。
組換え方法
本発明の抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生の場合、抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、例えば上で説明したようなポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために、単離され、１つ又は複数のベクターに挿入される。そのようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定することができる。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドのうちの１つ又は複数を含むベクター、好ましくは、発現ベクターが提供される。当業者に周知である方法を使用して、抗原結合分子（断片）のコード配列を適切な転写／翻訳制御シグナルと共に含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ手法、合成手法及びインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ等、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の手法を参照されたい。発現ベクターは、プラスミドの一部、ウイルスであることができ、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、発現カセットを含む、抗原結合分子又はそのポリペプチド断片（すなわち、コード化領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合した状態で発現カセットにクローニングされる。本明細書で使用される「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部とみなされることがあり、しかし、何れの隣接配列も、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域等は、コード化領域の一部ではない。２つ以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト内に、例えば単一のベクター上に、存在することができ、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト内に、例えば、別々の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、何れのベクターも、単一のコード化領域を含有することができ、又は２つ以上のコード化領域を含むことができ、例えば、本発明のベクターは、タンパク質切断による後翻訳又は共翻訳によって最終タンパク質に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の抗原結合分子若しくはそのポリペプチド断片又はそれらの変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合されている又は融合されていない、異種コード化領域をコードすることができる。異種コード配列には、限定ではないが、特殊化したエレメント又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが含まれる。作動可能な結合は、遺伝子産物の発現が調節配列の影響下又は制御下で起こるように遺伝子産物、例えばポリペプチド、のコード化領域が１つ又は複数の調節配列と結合している場合である。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード化領域及びそれと結合しているプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力に干渉しない、又は転写されるＤＮＡテンプレートの能力に干渉しない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域とポリペプチドをコードする核酸とは、プロモーターがその核酸の転写を果たすことができた場合、作動可能に結合していることになる。プロモーターは、所定の細胞内でのみＤＮＡの実質的転写を指示する細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターに加えて他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルを、ポリヌクレオチドと作動可能に結合させて、細胞特異的転写を指示することもできる。
好適なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書で開示される。様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらの転写制御領域としては、限定ではないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、これらに限定されないが、サイトメガロウイルスからのプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、イントロンＡと共に、前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば、初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギαグロビン等の、脊椎動物遺伝子に由来するもの、並びに真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。さらなる好適な転写制御領域としては、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンを誘導することができるプロモーター）が挙げられる。同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらの翻訳制御エレメントとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系に由来するエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、すなわちＩＲＥＳであって、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されない。発現カセットは、他の特徴、例えば、複製開始点、及び／又は染色体組み込みエレメント、例えばレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）も含むことができる。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード化領域を、本発明のポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード化領域と結合させることができる。例えば、抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横断する成長ポリペプチド鎖の輸送が開始されたら成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドにはこのポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドがあり、このシグナルペプチドが、翻訳されたポリペプチドから切断されて、そのポリペプチドの分泌形態又は「成熟」形態を生じさせることを承知している。ある特定の実施態様では、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれと作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換してもよい。
後の精製を助長するために使用することができる短いタンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）又は融合タンパク質への標識を支援するために使用することができる短い配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド内に又はそのようなポリヌクレオチドの末端に含めてもよい。
本発明のさらなる態様では、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある特定の実施態様では、本発明の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド又はベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターに関して本明細書にそれぞれ記載の特徴のいずれかを、個々に又は組み合わせて取り入れることができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の本発明の抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、そのようなベクターで形質転換されている、又はそのようなベクターがトランスフェクトされている）。本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することができる任意の種類の細胞システムを指す。抗原結合分子の複製に及び発現を支持するのに好適な宿主細胞は、当該技術分野で周知である。そのような細胞に特定の発現ベクターを適宜トランスフェクト又は形質導入してもよく、そして大量のベクター含有細胞を大規模発酵槽への播種のために増殖させて、臨床応用のための十分な量の抗原結合分子を得ることができる。好適な宿主細胞としては、原核微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が挙げられる。例えば、特にグリコシル化の必要がない場合、ポリペプチドを細菌において産生させてもよい。発現後、ポリペプチドを可溶型画分中の細菌細胞ペーストから単離してもよく、そしてさらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核微生物は、ポリペプチドをコードするベクターのための好適なクローニング又は発現宿主であり、そのような糸状菌又は酵母等の真核微生物には、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、その結果、部分的又は完全ヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生することになる、真菌及び酵母株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２、１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ等、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４、２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
（グリコシル化された）ペプチドの発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。非常に多数のバキュロウイルス株が同定されており、それらは、特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併用され得る。植物細胞培養物も宿主として用いることができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号及び同第６４１７４２９号を参照されたい（これらの特許文献には、トランスジェニック植物において抗体を産生させるためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術が記載されている）。脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁状態での増殖に適応する哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓系（例えば、Graham等、J Gen Virol 36、59(1977)に記載の、２９３又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Mather、Biol Reprod 23、243-251(1980)に記載の、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Mather等、Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68(1982)に記載のもの）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Urlaub等、Proc Natl Acad Sci USA 77、4216(1980)）をはじめとするチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びに骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に好適な哺乳動物宿主細胞の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻（B.K.C. Lo編、Humana Press、Totowa、NJ）、ｐ２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、ほんの数例を挙げれば、培養細胞、例えば哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内に含まれている細胞も挙げられる。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現させるための標準的技術は、当該技術分野で公知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のどちらかを含むポリペプチドを発現する細胞を、免疫グロブリン鎖の他方も発現するように操作することができ、その結果、発現産物は、重鎖と軽鎖の両方を有する免疫グロブリンになる。
一態様では、本発明の抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を産生する方法であって、本明細書で提供されるような、本発明の抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本発明の抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の発現に好適な条件下で培養するステップ、及び宿主細胞（又は宿主細胞培地）から本発明の抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を回収するステップを含む方法が提供される。
本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子中の成分（ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む１つのポリペプチドと、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド）は、互いに遺伝子融合されていない。ポリペプチドは、その成分（ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片、及び他の成分、例えばＣＨ又はＣＬ）が直接的に又はリンカー配列によって互いに融合されるように設計される。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定することができ、又は有効性について試験することができる。本発明の抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列の中で見付けられる。所望される場合には融合タンパク質の個々の成分を分離するために、さらなる配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列、を切断部位に組み込むこともできる。
ある特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する、ＴｎＣと特異的位結合することができる部分（例えば、Ｆａｂ断片）は、抗原と結合することができる免疫グロブリン可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然に存在する又は天然に存在しない抗体及びそれらの断片の一部を形成することができ、並びにそのような抗体及びそれらの断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Harlow及びLane、「Antibodies, a laboratory manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、1988を参照）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、組換え産生することができ（例えば、米国特許第４１８６５６７号に記載の通り）、又は例えば、可変重鎖と可変軽鎖とを含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照されたい）。
任意の動物種の免疫グロブリンを本発明で使用することができる。本発明において有用な非限定的免疫グロブリンは、マウス、霊長類又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒト用である場合、免疫グロブリンの定常領域がヒトからのものであるキメラ形態の免疫グロブリンを使用してもよい。ヒト化形態又は完全ヒト形態の免疫グロブリンを当該技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照されたい）。ヒト化は、様々は方法によって果たすことができ、そのような方法としては、（ａ）肝要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合アフィニティー若しくは抗体機能の保持に重要であるもの）を保持して若しくは保持せずにヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域上に非ヒト（例えば、ドナー抗体）ＣＤＲをグラフトする方法、（ｂ）ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ若しくはａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用に肝要な残基）のみをグラフトする方法、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、それらを表面残基の置換によりヒト様切片で「クローキング」する方法が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３、１６１９－１６３３（２００８）に概説があり、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３３２、３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６、１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号；Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２１、５２２－５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１、６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４、６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３）、１６９－２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６、２５－３４（２００５）（該文献にはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフト化が記載されている）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８、４８９－４９８（１９９１）（該文献には「リサーフェーシング」が記載されている）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６、４３－６０（２００５）（該文献には「ＦＲシャッフリング」が記載されている）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６、６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ等、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３、２５２－２６０（２０００）（該文献にはＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチが記載されている）に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野で公知の様々な手法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、ｖａｎ Ｄｉｊｋ及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８－７４（２００１）並びにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０－４５９（２００８）に一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法により作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、そのようなヒトモノクローナル抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、p51-63（Marcel Dekker, Inc.、New York、1987）を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原曝露に応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することもできる（例えば、Lonberg、Nat Biotech 23、1117-1125(2005)を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することにより生成することもできる（例えば、Hoogenboom等、Methods in Molecular Biology 178、1-37（O'Brien等編、Human Press、Totowa、NJ、2001）;及びMcCafferty等、Nature 348、552-554;Clackson等、Nature 352、624-628(1991)を参照されたい）。ファージは、概して、抗体断片を単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として提示するか、又はＦａｂ断片として提示する。
ある特定の態様では、本発明の抗原結合分子に含まれている標的細胞抗原と特異的に結合することができる部分（例えば、Ｆａｂ断片）は、例えば、ＰＣＴ公開・国際公開第２０１２／０２０００６号又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６に従って、結合アフィニティー増強を有するように操作される。特異的抗原決定基と結合する本発明の抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又は当業者によく知られている他の手法、例えば表面プラズモン共鳴法（Liljeblad等、Glyco J 17、323-329(2000)）及び伝統的な結合アッセイ（Heeley、Endocr Res 28、217-229(2002)）、どちらかによって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定してもよい。ある特定の実施態様では、そのような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子が結合するのと同じエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）と結合する。抗原結合分子が結合するエピトープの詳細な例示的マッピング方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６６巻（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）のＭｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」に提供されている。例示的競合アッセイでは、固定化抗原が、その抗原と結合する第１の標識抗原結合分子と、その抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されることになる第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中で、インキュベートされる。第２の抗原結合分子は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体の抗原への結合が可能な条件下でのインキュベーション後、過剰な非結合抗体が除去され、固定化抗原と結合している標識の量が測定される。固定化抗原と結合している標識の量が、試験試料においてコントロール試料と比べて実質的に低減された場合には、それは、第２の抗原結合分子が第１の抗原結合分子と抗原への結合について競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第１４章（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照されたい。
本明細書に記載の通りに調製された本発明の抗原結合分子を、当該技術分野で公知の技法、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等により精製してもよい。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部は、正味電荷、疎水性、親水性などのような因子に依存することになり、当業者には明らかであるであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製には、抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製に、プロテインＡ又はプロテインＧを有するマトリックスを使用してもよい。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、本質的に実施例に記載するように抗原結合分子を単離することができる。ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む、様々な周知分析法の何れによって抗原結合分子又はその断片の純度を判定してもよい。例えば、実施例に記載するように発現された抗原結合分子は、還元又は非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより実証されるように、インタクトであること及び適切に集合することを示した。
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子を、当該技術分野で公知の様々なアッセイにより、同定することができ、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物活性についてスクリーニングすること又は特徴を明らかにすることができる。
１．アフィニティーアッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子のＴｎＣに対する及び／又は対応するＴＮＦ受容体に対するアフィニティーを、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的計測手段と、受容体又は標的タンパク質、例えば組換え発現により得ることができるものとを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、実施例に記載の方法に従って判定することができる。ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の標的細胞抗原に対するアフィニティーも、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的計測手段と、受容体又は標的タンパク質、例えば組換え発現により得ることができるものとを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により判定することができる。結合アフィニティーの測定についての説明に役立つ例示的な具体的実施態様を実施例４に記載する。一態様によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２５℃で表面プラズモン共鳴により測定される。
２．結合アッセイ及び他のアッセイ
本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の対応する受容体発現細胞への結合は、特定の受容体又は標的細胞抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。一態様では、ＴＮＦ受容体を発現する新鮮な抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）が結合アッセイに使用される。これらの細胞は、単離後に直接使用される（ナイーブＰＭＢＣ）か、又は刺激後に使用される（活性化ＰＭＢＣ）。別の態様では、活性化マウス脾細胞（ＴＮＦ受容体分子を発現する）を使用して、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の対応するＴＮＦ受容体発現細胞への結合を実証した。
さらなる態様では、ＴｎＣを発現するがん細胞株を使用して、抗原結合分子の標的細胞抗原への結合を実証した。
別の態様では、競合アッセイを使用して、標的又はＴＮＦ受容体との結合について特定の抗体又は抗原結合分子とそれぞれ競合する抗原結合分子を同定することができる。ある特定の実施態様では、そのような競合抗原結合分子は、特定の抗標的抗体又は特定の抗ＴＮＦ受容体抗体が結合するのと同じエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）と結合する。抗体が結合するエピトープの詳細な例示的マッピング方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６６巻（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）のＭｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」に提供されている。
３．活性アッセイ
一態様では、特定の標的細胞抗原と結合し、生物活性を有する特定のＴＮＦ受容体と結合する、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性としては、例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上のＴＮＦ受容体によるアゴニストシグナル伝達を挙げることができる。アッセイによりインビトロでそのような生物活性を有すると同定されたＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子も提供される。
ある特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子は、そのような生物活性について試験される。本発明の分子の生物活性を検出するためのアッセイは、実施例１２に記載のものである。さらに、細胞溶解を（例えば、ＬＤＨ放出の測定により）検出するアッセイ、誘導アポトーシス動態を（例えば、カスパーゼ３／７活性の測定により）検出するアッセイ、又はアポトーシスを（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して）検出するアッセイは、当該技術分野で周知である。加えて、そのような複合体の生物活性を、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞若しくはγδＴ細胞等の様々なリンパ球サブセットの生存、増殖及びリンホカイン分泌に対するそれらの効果を評価することによって、又は樹状細胞、単球／マクロファージ若しくはＢ細胞等の抗原提示細胞の表現型及び機能を調節するそれらの能力を評定することによって、評定することができる。
薬学的組成物、製剤及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供される抗原結合分子の何れかを含む薬学的組成物であって、例えば、下記治療方法の何れかにおいて使用するための薬学的組成物が提供される。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗原結合分子の何れかと、少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とを含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗原結合分子の何れかと、少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば下記のものとを含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加剤に溶解又は分散された１つ又は複数の抗原結合分子の治療有効量を含む。句「薬学的又は薬学的に許容される」は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して一般に非毒性である、すなわち、例えばヒト等の動物に必要に応じて投与されたときに有害反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を生じさせない、分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つの抗原結合分子と任意選択的にさらなる活性成分とを含有する医薬組成物の調製は、本明細書に参照により援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版、Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０によって例示されるように、本開示に鑑みて当業者には公知であるであろう。特に、組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される「薬学的に許容される添加剤」は、当業者に公知であるであろうような、任意の及び全ての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、塩、安定剤及びこれらの組合せを含む。
非経口組成物としては、注射、例えば、皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射による投与用に設計されたものが挙げられる。注射のために、本発明の抗原結合分子を、水溶液中で、好ましくは、生理的に適合性の緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液又は生理食塩水バッファー中で製剤化することができる。溶液は、調合剤、例えば、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤を含有してもよい。或いは、融合タンパク質は、使用前に好適なビヒクル、例えば、滅菌した発熱物質不含の水で構成するための粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、必要量の本発明の融合タンパク質を、必要に応じて、下に列挙する様々な他の成分と共に、適切な溶媒に添合することにより調製される。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜による濾過により、容易に果たすことができる。一般に、分散体は、塩基性分散媒及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクルに滅菌された様々な活性成分を添合することによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又はエマルジョンの調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、任意のさらなる所望成分を加えた活性成分の粉末を、前以て滅菌濾過されたその液体媒体から生じさせる、真空乾燥及び凍結乾燥手法である。液体媒体は、必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、注射前に、十分な食塩水又はグルコースを用いて先ず液体希釈剤を等張性にすべきである。組成物は、製造及び保管条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染を安全レベルで、例えばタンパク質１ｍｇ当り０．５ｎｇ未満で、最小限に保つべきであることは理解されるであろう。薬学的に許容される好適な添加剤としては、バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル若しくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジン；単糖類、二糖類及び他の糖（グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む）；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えばナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。注射用水性懸濁液は、懸濁液の粘度を上昇させる化合物、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン等を含有してもよい。任意選択的に、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能にするために、好適な安定剤、又は化合物の溶解度を増加させる好適な薬剤も含有してもよい。加えて、活性化合物の懸濁液を適切な注射用油性懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸、例えば、エチルクリート（ethyl cleat）若しくはトリグリセリド、又はリポソームが挙げられる。
活性成分を、例えば、コアセルベーション手法により若しくは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入してもよい。そのような手法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（18版、Mack Printing Company、1990）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放調製物の好適な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、造形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はこれらの組合せ等の、吸収を遅らせる薬剤の組成物における使用によって、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
本明細書での例示的な薬学的に許容される添加剤としては、侵入型の薬物分散剤、例えば、可溶型中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶型ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）がさらに挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的ｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の１つ又は複数のグルコサミノグリカナーゼと併用される。
例示的凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン－酢酸塩バッファーを含む。
前述の組成物に加えて、融合タンパク質を持効性製剤として製剤化することもできる。そのような長時間作用性製剤は、埋め込み（例えば、皮下に又は筋肉内に）によって投与することができ、又は筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、融合タンパク質は、好適な高分子又は疎水性材料を用いて（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）製剤化することができ、又はイオン交換樹脂を用いて製剤化することができ、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として製剤化することができる。
本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。薬学的に使用することができる調製物へのタンパク質の加工を助長する１つ又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、添加剤又は助剤を使用して、従来の様式で薬学的組成物を製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
抗原結合分子を、遊離酸若しくは塩基、中性又は塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基とで形成される酸付加塩、或いは例えば塩酸若しくはリン酸等の無機酸とで、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸のような有機酸とで形成される酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基とで形成される塩を、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄などの無機塩基から誘導することもでき、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインのような有機塩基から誘導することもできる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より水性及び他のプロトン性溶媒への可溶性が高い傾向がある。
本明細書における組成物はまた、治療することになる特定の適応症のための活性成分、好ましくは、互いに有害に作用しない相補的活性を有するものも、必要に応じて１つより多く含有することができる。そのような活性成分は、好適には、所期の目的に有効である量での組合せで存在する。
インビボでの投与に使用されることになる製剤は、一般に無菌である。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜による濾過により、容易に果たすことができる。
治療方法及び治療用組成物
本明細書で提供される抗原結合分子の何れを治療方法に使用してもよい。治療方法での使用のために、本発明の抗原結合分子を、医学行動規範と一致した様式で製剤化、投薬及び投与することができる。これに関連して考慮する因子としては、治療されることになる特定の障害、治療されることになる特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療施術者に公知の他の因子が挙げられる。
一態様では、医薬として使用するための本発明の抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、疾患の治療に使用するための、特に、がんの治療に使用するための、本発明の抗原結合分子が提供される。ある特定の態様では、治療方法に使用するための本発明の抗原結合分子が提供される。一態様では、本発明は、それを必要とする個体における疾患の治療に使用するための、本明細書に記載の抗原結合分子を提供する。ある特定の態様では、本発明は、疾患を有する個体を治療する方法に使用するための抗原結合分子を提供し、方法は、治療有効量の融合タンパク質を個体に投与することを含む。ある特定の態様では、治療されることになる疾患は、がんである。がんの例としては、固形腫瘍、膀胱がん、腎細胞がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮がん、骨がん、及び腎臓がん、メラノーマ、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、及び急性リンパ芽球性白血病が挙げられる。したがって、がんの治療に使用するための本明細書に記載の抗原結合分子が提供される。治療を必要とする対象、患者、又は「個体」は、典型的に哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
別の態様では、感染性疾患の治療に使用するための、特に、ウイルス感染症の治療のための、本明細書に記載の抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、例えば狼瘡疾患等の自己免疫疾患の治療に使用するための、本明細書に記載の抗原結合分子が提供される。
一態様では、標的細胞抗原がＴｎＣである、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、乳がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん（ＰＡＣ）、胃がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及び中皮腫の治療に使用するための、本発明による抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする個体における疾患を治療ための医薬の製造又は調製における抗原結合分子の使用に関する。一態様では、医薬は、疾患を有する個体に治療有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法に使用するためのものである。ある特定の実施態様では、治療されることになる疾患は、増殖性疾患、特にがんである。したがって、一態様では、本発明は、がんを治療ための医薬の製造又は調製における本発明の抗原結合分子の使用に関する。がんの例としては、固形腫瘍、膀胱がん、腎細胞がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮がん、骨がん、及び腎臓がん、メラノーマ、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、及び急性リンパ芽球性白血病が挙げられる。本発明の抗原結合分子を使用して治療することができる他の細胞増殖疾患としては、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎皮質、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。前がん状態又は病変及びがん転移も挙げられる。ある特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんからなる群から選択される。当業者は、一部のケースでは、抗原結合分子が治癒をもたらさないこともあり、部分的恩恵しかもたらさないこともあることを認識しているだろう。一部の態様では、何らかの恩恵がある生理的変化も治療に有益とみなされる。したがって、一部の態様では、生理的変化をもたらす抗原結合分子の量が「有効量」又は「治療有効量」とみなされる。
さらなる態様では、本発明は、感染性疾患の治療のための、特に、ウイルス感染症の治療のための又は自己免疫疾患、例えば狼瘡疾患の治療のための、医薬の製造又は調製における本明細書に記載の抗原結合分子の使用に関する。
さらなる態様では、本発明は、個体における疾患を治療する方法であって、本発明の抗原結合分子の治療有効量を前記個体に投与することを含む方法を提供する。一態様では、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物が前記個体に投与される。ある特定の態様では、治療されることになる疾患は、増殖性疾患ある。特定の態様では、疾患は、がんである。別の態様では、疾患は、感染性疾患又は自己免疫疾患である。ある特定の態様では、方法は、少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば、治療することになる疾患ががんである場合には抗がん剤の治療有効量を個体に投与することをさらに含む。上記実施態様の何れによる「個体」も、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
疾患の予防又は治療のための、本発明の抗原結合分子の（単独で使用される場合、又は１つ若しくは複数の他のさらなる治療剤と併用される場合の）適切な投薬量は、治療されることになる疾患のタイプ、投与経路、患者の体重、融合タンパク質のタイプ、疾患の重症度及び経過、融合タンパク質が予防目的で投与されるのか又は治療目的で投与されるのか、以前の又は現行の治療的介入、患者の病歴及び融合タンパク質への応答、並びに主治医の裁量に依存することになる。いずれにせよ、投与を担当する施術者が、個々の対象のための、組成物中の活性成分の濃度、及び適切な用量を決定することになる。単回投与又は様々な時点にわたっての複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない、様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図されている。
抗原結合分子は、１回で、又は一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。疾患のタイプ及び重症度に依存して、抗原結合分子約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ－１０ｍｇ／ｋｇ）が、例えば、１回の投与若しくは複数回の別々の投与によるか、連続注入によるかを問わず、患者への投与のための最初の候補投薬量であり得る。１つの典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上にわたり得る。状態に応じて数日又はそれより長きにわたる反復投与については、一般に、病徴の所望の抑制が起こるまでその治療が持続されることになる。抗原結合分子の１つの例示的投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲となる。他の例では、用量は、１投与につき約１μｇ／ｋｇ体重から、約５μｇ／ｋｇ体重から、約１０μｇ／ｋｇ体重から、約５０μｇ／ｋｇ体重から、約１００μｇ／ｋｇ体重から、約２００μｇ／ｋｇ体重から、約３５０μｇ／ｋｇ体重から、約５００μｇ／ｋｇ体重から、約１ｍｇ／ｋｇ体重から、約５ｍｇ／ｋｇ体重から、約１０ｍｇ／ｋｇ体重から、約５０ｍｇ／ｋｇ体重から、約１００ｍｇ／ｋｇ体重から、約２００ｍｇ／ｋｇ体重から、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重から、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重以上まで、及びこれらの中から導かれる任意の範囲も含み得る。ここに列挙した数値から導くことができる例では、上記の数値に基づいて約５ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重から約５００ｍｇ／ｋｇ体重等の範囲を、投与することができる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのうちの１つ又は複数の用量（又はこれらの任意の組合せ）を患者に投与してもよい。そのような用量を、間欠的に、例えば、週に１回又は３週間に１回（例えば、患者が、約２から約２０用量、又は例えば約６用量の融合タンパク質を受けるように）投与してもよい。より高い初期負荷用量、その後、より低い１用量又は複数の用量を投与してもよい。しかし、他の投与レジメンが有用であることもある。この治療の進展は、従来の手法及びアッセイによって容易にモニターされる。
本発明の抗原結合分子は、一般に、意図された目的を達成するのに有効な量で使用されることになる。病状の治療又は予防に使用するための、本発明の抗原結合分子又はそれらの薬学的組成物は、治療有効量で投与又は適用される。治療有効量の決定は、特に、本明細書で提供される詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与のための治療有効用量は、最初は細胞培養アッセイ等のインビトロアッセイから推定することができる。次いで、用量を動物モデルで公式化して、細胞培養物で決定されるようなＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成することができる。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
当該技術分野で周知である手法を使用して、インビボデータ、例えば動物モデルから、初期投薬量を推定することもできる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができるだろう。
投薬量及び間隔を個々に調整して、治療効果を維持するのに十分である抗原結合分子の血漿レベルをもたらすことができる。注射による投与についての通常の患者投薬量は、約０．１から５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５から１ｍｇ／ｋｇ／日にわたる。治療有効血漿レベルは、毎日複数用量を投与することにより達成することができる。血漿中レベルは、例えばＨＰＬＣにより、測定することができる。
局所投与又は選択的取り込みの場合、抗原結合分子の有効局所濃度は、血漿濃度と関連づけられないこともある。当業者は、過度の実験を伴わずに治療有効局所投薬量を最適化することができるであろう。
本明細書に記載の抗原結合分子の治療有効用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療的恩恵をもたらすことになる。融合タンパク質の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物において標準薬学的手順により判定することができる。細胞培養アッセイ及び動物研究を使用して、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療に有効な用量）を決定することができる。毒性効果と治療効果の用量比が治療指数であり、例えば比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表される。大きい治療指数を呈示する抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明による抗原結合分子は、高い治療指数を呈示する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用に好適な投薬量範囲の公式化に使用することができる。投薬量は、毒性が殆ど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、様々な因子、例えば、用いられる剤形、用いられる投与経路、対象の状態等に依存して、この範囲内で変動し得る。的確な製剤、投与経路及び投薬量は、個々の医師が患者の状態を考慮して選択することができる（例えば、その全内容が本明細書に参照により援用される、The Pharmacological Basis of Therapeutics、第1章、p1におけるFingl等、1975を参照されたい）。
本発明の融合タンパク質での治療を受ける患者の主治医には、毒性、臓器不全等のために投与を終了、中断又は調整する方法及び時が分るであろう。逆に言えば、主治医には、臨床応答が（毒性を除外して）不適切であった場合、治療をより高レベルに調整する方法も分るであろう。目的の障害の管理の際に投与される用量の大きさは、治療されることになる状態の重症度、投与経路等に伴って変わることになる。状態の重症度は、例えば、一部は、標準的な予後評価方法により評価することができる。さらに、用量及び恐らく投薬頻度も、個々の患者の年齢、体重及び応答によって変わることになる。
他の薬剤及び治療
本発明の抗原結合分子を治療の際に１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、本発明の融合タンパク質を少なくとも１つのさらなる治療剤と共投与してもよい。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体において症候又は疾患を治療するために投与することができる任意の薬剤を包含する。そのようなさらなる薬剤は、治療することになる特定の適応症に好適な任意の活性成分、好ましくは、互いに有害に作用しない相補的活性を有するものを含み得る。ある特定の実施態様では、さらなる治療剤は、別の抗がん剤である。
そのような他の薬剤は、好適には、意図された目的に有効である量での組合せで存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害又は治療のタイプ、及び上で論じた他の因子に依存する。本発明の抗原結合分子は、一般に、本明細書に記載のものと同じ投薬量で及び同じ投薬経路で、又は本明細書に記載の投薬量の約１から９９％で、又は適切であると実験的に／臨床的に判定される、任意の投薬量で及び任意の経路により使用される。
上述のそのような併用療法は、併用投与（この場合、２つ以上の治療剤が同じ又は別々の組成物に含まれる）、及び別々の投与を包含し、別々の投与の場合、本発明の抗原結合分子の投与を、さらなる治療剤及び／又はアジュバントの投与より前に、投与と同時に、及び／又は投与の後に行うことができる。
製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、その容器上の又はその容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されたものであり得る。容器は、単独である組成物を保持するか、又は状態の治療、予防及び／若しくは診断に有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグであってもよく、又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、本発明の抗原結合分子である。
ラベル又は添付文書は、組成物が選ばれた状態の治療に使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗原結合分子を含む組成物が中に入っている第１の容器、及び（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又は別の治療剤を含む組成物が中に入っている第２の容器を含むことができる。本発明のこの実施態様での製造品は、特定の状態を治療するために組成物を使用することができることを示す添付文書をさらに含むことができる。
或いは、又は加えて、製造品は、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液等の、薬学的に許容されるバッファーを含む、第２の（又は第３の）容器をさらに含むことができる。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及び注射器を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
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ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、上で定義されたように、カバットによるＥＵ番号付けシステム（Kabat, E.A.等、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991)）に従って番号付けされ、言及される。
特定の実施態様
１． ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子。
２． ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする抗原結合分子。
３． （ｃ）安定的に結合することができる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
をさらに含む、実施態様１又は２のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
４． ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１若しくはＣＬドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＬ若しくはＣＨ１ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１若しくはＣＬドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＬ若しくはＣＨ１ドメインに接続されている、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン若しくはその断片を含む、又は
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ－ＣＬ若しくはＶＬ－ＣＨ１ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＶＬ－ＣＨ１ドメイン若しくはＶＨ－ＣＬドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ若しくはＶＬに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバー２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＶＬ若しくはＶＨに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、
実施態様１から３の何れか一実施態様の抗原結合分子。
５． ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが、ヒトＴ細胞活性化を共刺激する、実施態様１から４の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
６． ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが、４－１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される、実施態様１から５の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
７． ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが、４－１ＢＢＬである、実施態様１から６の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
８． ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１８３、配列番号１９２、配列番号１９３及び配列番号１９４からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に、配列番号１７２又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含む、実施態様１から７の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
９． ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む、実施態様１から８の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
１０． ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１７６、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７５及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、実施態様１から９の何れか一実施態様の抗原結合分子。
１１． ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
（ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ＣＨ１又はＣＬドメインを含有する第１のポリペプチド、及びＣＬ又はＣＨ１ドメインを含有する第２のポリペプチドと
をそれぞれ含み、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、
第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、実施態様１から１０の何れか一実施態様の抗原結合分子。
１２． ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される、実施態様１から１１の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
１３． ＴｎＣと特異的に結合することができる１つ又は２つの部分を含む、実施態様１から１２の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
１４． ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子である、実施態様１から１３の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
１５． ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、（ｉ）配列番号６７又は配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号６８又は配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号６９又は配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５５又は配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５６又は配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号５７又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、実施態様１から１４の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
１６． ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、配列番号４６のアミノ酸配列を含む可変重鎖と配列番号４５のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含むか、又はＴＮＣと特異的に結合することができる部分が、配列番号４８のアミノ酸配列を含む可変重鎖と配列番号４７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む、実施態様１から１５の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
１７． Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、実施態様３から１６の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
１８． Ｆｃドメインが、２３４及び２３５位（ＥＵ番号付け）並びに／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、実施態様３から１７の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
１９． ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子を両方が含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖と、第２のペプチドリンカーによりそのＣ末端で第２の重鎖又は軽鎖に融合されている、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む、第１のペプチドと、第３のペプチドリンカーによりそのＣ末端で第２の軽鎖又は重鎖に融合されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含む、第２のペプチドとをそれぞれ含む、実施態様１から１８の何れか一実施態様の抗原結合分子。
２０． 第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＬドメインに融合されている、実施態様１から１９の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
２１． 第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＬドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されている、実施態様１から２０の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
２２． 第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＶＨドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＶＬドメインに融合されている、実施態様１から２１の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
２３． ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメイン内の１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）に置換されており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）に置換されている、及び前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメイン内の１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）に置換されている、実施態様２０又は２１のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
２４． （ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子を両方が含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖、
（ｂ）配列番号１７６、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７５及び配列番号１８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、実施態様１から２３の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
２５． （ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と
を含む、実施態様１から２０の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
２６． （ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１０２、配列番号１０８、配列番号１１６及び配列番号１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１７及び配列番号１２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と
を含む、実施態様１から１９及び２１の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
２７． （ａ）ＴｎＣと特異的結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有すること、及び第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインを含有することをそれぞれ特徴とし、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン若しくはそれらの断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン若しくはその断片を含む、実施態様１から１８の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
２８． （ｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む１つの軽鎖
を含む、実施態様２７のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
２９． 標的細胞抗原と特異的に結合することができる２つの部分を含む、実施態様２７のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
３０． （ｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖
を含む、実施態様２７又は２９の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
３１． ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがＯＸ４０Ｌである、実施態様１から６、１１から２３、２７から２９の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
３２． ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号１８１又は配列番号１８２のアミノ酸配列、特に、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む、実施態様１から６、１１から２３、２７から２９の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
３３． （ａ）標的細胞抗原と特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号１９０又は配列番号１９１のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１８１又は配列番号１８２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、実施態様１から６、１１から２３、２７から２９、３１及び３２の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
３４． 標的細胞抗原がテネイシンＣ（ＴｎＣ）であり、ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、（ｉ）配列番号６７又は配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号６８又は配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号６９又は配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５５又は配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５６又は配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号５７又は配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、実施態様１から６、１１から２３、２７から２９及び３１から３３の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
３５． ＴｎＣと特異的に結合することができる抗原結合部分が、（ｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、実施態様１から６、１１から２３、２７から２９及び３１から３３の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
３６． ＴｎＣと特異的に結合することができる抗原結合部分が、（ｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、実施態様１から６、１１から２３、２７から２９及び３１から３３の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
３７． （ｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
（ｉｉｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖と
を含む、実施態様１から６、１１から２３、２７から２９及び３１から３６の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
３８． 抗原結合部分が、アフィニティーの向上を有する、実施態様１から３７の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
３９． 抗原結合部分がヒトＴｎＣと約１ｎＭ未満のＫＤ値で結合する、実施態様１から３８の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
４０． 抗原結合部分が、異種間反応性を有する、実施態様１から３９の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
４１． 抗原結合部分が、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのうちの少なくとも１つと約２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する、実施態様１から４０の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
４２． 抗原結合部分が、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣと結合する、実施態様１から４１の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
４３． 抗原結合部分が、指定された全ての種からの標的抗原と同様のアフィニティーで結合する、実施態様４０から４２の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
４４． 抗原結合部分が、指定された全ての種からの標的抗原と同様のアフィニティー、特に、１００倍のＫＤ範囲内、５０倍のＫＤ範囲内、２０倍のＫＤ範囲内、１０倍のＫＤ範囲内、５倍のＫＤ範囲内で結合する、実施態様４０から４３の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
４５． 抗原結合部分が、指定された全ての種からの標的抗原と同様の１０倍のＫＤ範囲内のアフィニティーで結合する、実施態様４０から４４の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
４６． 実施態様１から４５の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
４７． 実施態様４６の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター。
４８． 実施態様４６の分離されたポリヌクレオチド又は実施態様４７のベクターを含む宿主細胞。
４９． 実施態様１から４５の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を産生する方法であって、
（ｉ）実施態様４８の宿主細胞を抗原結合分子の発現に好適な条件下で培養するステップ、及び
（ｉｉ）抗原結合分子を回収するステップ
を含む方法
５０． 実施態様１から４５の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子と少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とを含む薬学的組成物。
５１． 医薬として使用するための、実施態様１から４５の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子、又は実施態様５０の薬学的組成物。
５２． がんの治療に使用するための、実施態様１から４５の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子、又は実施態様５０の薬学的組成物。
５３． がんの治療用の医薬を製造するための、実施態様１から４５の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の使用。
５４． 個体における疾患を治療する方法であって、薬学的に許容される形態の実施態様１から４５の何れか一実施態様のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を含む組成物の治療有効量を前記個体に投与することを含む方法。
５５． 前記疾患が、がんである、実施態様５４の方法。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。当然のことながら、上で提供した一般的な説明を考慮して様々な他の実施態様を実施することができる。
組換えＤＮＡ手法
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９に記載されているような標準的方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学試薬は、製造業者の説明書に従って使用した。ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定した。一部のケースでは、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が自動遺伝子合成により合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から所望の遺伝子セグメントを調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接している遺伝子セグメントを、記述のプラスミドにクローニングした。形質転換された細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により確認した。好適な制限部位を用いて、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にするように遺伝子セグメントを設計した。
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する遺伝子情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ出版番号９１－３２４２に与えられている。発現のために、全てのコンストラクトは、真核細胞においてタンパク質を分泌に導くリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含有した。それらをコードする例示的リーダーペプチド及びポリヌクレオチド配列を配列１６３から配列番号１７１に与える。
細胞培養手法
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ，Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ及びＹａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃに記載されているような、標準的な細胞培養手法を使用した。
タンパク質精製
標準的プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に言うと、抗体をプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出をｐＨ２．８で行い、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、モノマー抗体から、ＰＢＳ中又は２０ｍＭ ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．０中で、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により分離した。モノマー抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮器を（必要に応じて）使用して濃縮し、凍結し、－２０℃又は－８０℃で保管した。試料の一部は、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析による、後のタンパク質分析及び分析的特徴づけに供した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用した。具体的には、１０％又は４－１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を伴う）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
分析サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を判定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより行った。簡単に言うと、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５中のプロテインＡ精製抗体をＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システム上のＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、又は２ｘＰＢＳ中のプロテインＡ精製抗体をＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣシステム上のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供した。ＵＶ吸光度、及びピーク面積の積分により、溶出タンパク質を定量した。ＢｉｏＲａｄゲル濾過スタンダード１５１－１９０１が、標準として用いられた。
質量分析
このセクションは、ＶＨ／ＶＬ交換された多重特異性抗体（ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂｓ）の特徴づけを、それらの正しい構築に重点を置いて説明する。予想一次構造を、脱グリコシル化されたインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂについての及び脱グリコシル化／プラスミン消化された又は代替的に脱グリコシル化／限定ＬｙｓＣ消化されたＣｒｏｓｓＭａｂについてのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）により分析した。
Ｎ－グリコシダーゼＦを用いて、リン酸バッファー又はＴｒｉｓバッファー中３７℃で１７時間まで、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂを脱グリコシル化した。１００μｇの脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂを用いてＴｒｉｓバッファーｐＨ８中で、それぞれ、室温で１２０時間、及び３７℃で４０分間、プラスミン消化又は限定ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を行った。質量分析の前に、セファデックスＧ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＨＰＬＣにより試料を脱塩した。ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅソース（Ａｄｖｉｏｎ）を装備したｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）を用いてＥＳＩ－ＭＳにより総質量を決定した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた、多重特異性抗体のそれぞれの抗原への結合及び結合アフィニティーの判定（ＢＩＡＣＯＲＥ）
生成された抗体のそれぞれの抗原への結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、表面プラズモン共鳴により調査する。簡単に言うと、アフィニティー測定のために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ １０９－００５－０９８抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためにＣＭ５チップ上にアミンカップリングによって固定化する。結合を、ＨＢＳバッファー（ＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐｈ７．４）中、２５℃で（又は代替的に３７℃で）測定する。抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内で精製したもの）を溶液中の様々な濃度で添加する。８０秒から３分の抗原注入により結合を測定し、チップ表面をＨＢＳバッファーで３－１０分間洗浄することにより解離を測定し、１：１ラングミュア結合モデルを使用してＫＤ値を推定した。系固有のベースラインドリフトの補正のために、及びノイズシグナル低減のために、試料曲線からネガティブコントロールデータ（例えば、緩衝曲線）を減算する。センサーグラムの分析に、及びアフィニティーデータの計算に、それぞれのＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用する。
実施例１
ＴｎＣ抗原配列及び抗原の産生
表３及び表４の全てのコンストラクトをＧＳＴのＣ末端に融合させ、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させる。部位特異的ビオチン化のために、テネイシン配列のＣ末端にＡｖｉタグを付加させ、ＢｉｒＡビオチンリガーゼを別のプラスミド（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ）上で共発現させた。増殖培地は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する２ＹＴであった。ビオチンを添加して５０μＭの最終濃度にした。１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて２２℃で一晩、タンパク質発現を誘導した。細胞を遠心分離により回収し、Ｂ－ＰＥＲ試薬（ｐｉｅｒｃｅ ７８２６０）及び１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ Ｌ６８７６）の存在下での超音波処理により細胞溶解を行った。溶解物を遠心分離し、清澄化された溶解物をグルタチオンセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；製品番号１７－０７５６－０１）に負荷した。洗浄後、ＴｎＣ分子をトロンビン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号１０６０２４００００１）によって一晩、４℃でＧＳＴから切断した。溶出は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ及び１０％グリセロール中で行った。最終精製ステップは、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。試料は、処理するまで液体窒素で急速冷凍しておいた。
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実施例２
一般的Ｆａｂライブラリーからの抗ＴｎＣ抗体の選択
抗ＴｎＣ抗体を、ＤＰ８８－４（クローン１８Ｄ４）及びラムダＤＰ４７（クローン１１Ｃ７）という２つの異なる一般的ファージディスプレイライブラリーから選択した。
ライブラリー構築
Ｄｐ８８－４ライブラリーは、軽鎖（Ｌ３、３つの異なる長さ）のＣＤＲ３及び重鎖（Ｈ３、３つの異なる長さ）のＣＤＲ３内に無作為化配列スペースを含むＶｋ１＿５（カッパ軽鎖）及びＶＨ１＿６９（重鎖）のＶドメインペアリングを使用して、ヒト生殖細胞系遺伝子に基づいて構築した。ライブラリー生成は、オーバーラップ伸長スプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲによる３つのｐＰＣＲ増幅断片のアセンブリーによって行った。断片１は、無作為化Ｌ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２は、Ｌ３からＨ３に及ぶ中心コンストラクト断片であるのに対して、断片３は、無作為化Ｈ３、及び抗体遺伝子の３’部分を含む。次のプライマーの組合せをそれぞれ使用して、ＤＰ８８－４ライブラリー用のこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿Ｓ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＹ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＰＹと組み合わせたフォワードプライマーＬＭＢ３）、断片２（リバースプライマーＲＪＨ３２と組み合わせたフォワードプライマーＲＪＨ３１）及び断片３（リバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇと組み合わせたフォワードプライマーＤＰ８８－ｖ４－４又はＤＰ８８－ｖ４－６又はＤＰ８８－ｖ４－８）。ライブラリー断片の生成のためのＰＣＲパラメータは、９４℃での５分の初期変性、１分９４℃、１分５８℃、１分７２℃の２５サイクル、そして１０分間７２℃での末端伸長であった。等モル比のゲル精製された単一断片を鋳型として使用するアセンブリーＰＣＲのためのパラメータは、９４℃で３分の初期変性、そして３０秒９４℃、１分５８℃、２分７２℃の５サイクルであった。この段階で、外部プライマー（ＬＭＢ３及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、さらなる２０サイクルを行った後、１０分間７２℃で末端伸長を行った。十分な量の完全長無作為化Ｆａｂコンストラクトのアセンブリー後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターにライゲーションした。精製されたライゲーション体を、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への～６０回の形質転換に使用した。Ｆａｂライブラリーを呈示するファージミド粒子をレスキューし、選択に使用することができるようにＰＥＧ／ＮａＣｌ精製により精製した。これらのライブラリー構築ステップを３回繰り返して、４．４ｘ１０９の最終ライブラリーサイズを得た。機能性クローンのパーセンテージは、ドットブロットでのＣ末端タグ検出により判定して、それぞれ、軽鎖については９２．６％、重鎖については９３．７％であった。
ラムダＤＰ４７ライブラリーは、次のＶドメインペアリングを使用してヒト生殖細胞系遺伝子に基づいて構築した：Ｖｌ３＿１９ラムダ軽鎖とＶＨ３＿２３重鎖。ライブラリーを軽鎖（Ｌ３）のＣＤＲ３及び重鎖（Ｈ３）のＣＤＲ３に関して無作為化し、「オーバーラップ伸長によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲにより３つの断片からのアセンブリーを行った。断片１は、無作為化Ｌ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２は、Ｌ３の終点からＨ３の始点に及ぶ中心コンストラクト断片であるのに対して、断片３は、無作為化Ｈ３、及びＦａｂ断片の３’部分を含む。次のプライマーの組合せを使用して、ライブラリー用のライブラリー断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３－Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿Ｖ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＶ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＬＶ）、断片２（ＲＪＨ８０－ＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ））及び断片３（ＤＰ４７－ｖ４－４／ＤＰ４７－ｖ４－６／ＤＰ４７－ｖ４－８－ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。ライブラリー断片の産生のためのＰＣＲパラメータは、９４℃での５分の初期変性、６０秒９４℃、６０秒５５℃、６０秒７２℃の２５サイクル、そして１０分間７２℃での末端伸長であった。等モル比の３つの断片を鋳型として使用するアセンブリーＰＣＲのためのパラメータは、９４℃で３分の初期変性、そして６０秒９４℃、６０秒５５℃、１２０秒７２℃の５サイクルであった。この段階で、外部プライマーを添加し、さらなる２０サイクルを行った後、１０分間７２℃で末端伸長を行った。十分な量の完全長無作為化Ｆａｂコンストラクトのアセンブリー後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化し、並行してアクセプターファージミドベクターを同様に処理した。１５μｇのＦａｂライブラリーインサートを１３．３μｇのファージミドベクターとライゲーションした。精製されたライゲーション体を６０回の形質転換に使用し、その結果、１．５ｘ１０９の形質転換体を得た。Ｆａｂライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、選択に使用することができるようにＰＥＧ／ＮａＣｌ精製により精製した。
ファージディスプレイ選択及びＥＬＩＳＡスクリーニング
ファージディスプレイ選択のための抗原としてのヒトＧＳＴ融合ＴｎＣ ｆｎ５ Ａ１２３４ ＢＣ ｆｎ６を大腸菌において発現させ、融合タンパク質のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列でのＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現によりインビボで部位特異的にビオチン化した（抗原の産生は実施例１に従い、配列は表４から導かれる）。この抗原は、２つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン５と６の間に位置するヒトＴｎＣ追加スプライスドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ及びＣを含む。ファージディスプレイ選択は、これらの追加スプライスドメインの何れかへの結合物質の選択を目的とするものであった。後続のステップでより少数の追加スプライスドメインを含むさらなる抗原コンストラクトを使用して表面プラズモン共鳴によりドメイン特異性を判定する。
選択ラウンド（バイオパニング）は、次のパターンに従って溶液中で行った：１．３つの異なるタグを認識する抗体のライブラリーを枯渇させるための、無関係のＧＳＴ融合タンパク質を有し、ＴｎＣ標的細胞抗原と同様のａｖｉタグ及びＨｉｓ６タグも有する、～１０１２個のファージミド粒子の予備清浄化；２．総体積１ｍｌ中のタグ結合物質のさらなる枯渇のための、上清中の予備清浄化したファージミド粒子と、１００ｎＭ ビオチン化ヒトＧＳＴ融合ＴｎＣ ｆｎ５ Ａ１２３４ ＢＣ ｆｎ６との、無関係の非ビオチン化ＧＳＴ融合タンパク質の存在下で０．５時間のインキュベーション；３．ニュートラアビジン予備被覆マイクロタイタープレートの４ウェルへの１０分間の移入による、ビオチン化ヒトＧＳＴ融合ＴｎＣ ｆｎ５ Ａ１２３４ ＢＣ ｆｎ６及び付着した特異的に結合しているファージの捕捉（ラウンド１及び３）；４．５ｘＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５ｘＰＢＳを使用するそれぞれのウェルの洗浄；５．１０分間の１ウェル当り２５０μｌの１００ｍＭ ＴＥＡ（トリエチルアミン）の添加によるファージ粒子の溶出及び４ウェルからプールした溶出物への５００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和；６．溶出したファージ粒子の上清による対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、３０℃で一晩の振盪機でのインキュベーション、そして次の選択ラウンドで使用されることになるファージミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。１００ｎＭの一定抗原濃度を使用して３ラウンドにわたって選択を行った。ラウンド２では、ニュートラアビジンへの結合物質の濃縮を回避するために、５．４ｘ１０７個のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの添加により抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。ラウンド２及び３の後に次のようにＥＬＩＳＡにより特異的結合物質を同定した：１００μｌの１００ｍＭ ビオチン化ヒトＧＳＴ融合ＴｎＣ ｆｎ５ Ａ１２３４ ＢＣ ｆｎ６でニュートラアビジンプレートを被覆した。Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、抗Ｆｌａｇ／ＨＰＲ二次抗体を使用して結合ＦａｂをそれらのＦｌａｇタグによって検出した。ヒトＧＳＴ融合ＴｎＣ ｆｎ５ Ａ１２３４ ＢＣ ｆｎ６に関するシグナルを提示するクローンであって、標的と同じタグを有する無関係のＧＳＴ融合タンパク質に関してネガティブであるクローンを、さらなる分析の最終選考に残した。それらを培養体積０．５リットルで細菌により発現させ、アフィニティー精製し、マウスＴｎＣとの交差反応性を試験するために、及び抗体が認識する追加スプライスドメインを決定するために、ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用するＳＰＲ分析によりさらに特徴を明らかにした。
ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用するＳＰＲ分析
ニュートラアビジン捕捉によりＮＬＣチップ上に固定化したビオチン化ヒト及びマウスＴｎＣ抗原に関して２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により選択クローンのアフィニティー（ＫＤ）を測定した。抗原（リガンド）の固定化：組換え抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭ リン酸塩、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いで３０μｌ／分で垂直の向きに注入した。被分析物の注入：「ワンショット動態（one-shot kinetics）」測定のために、注入方向を水平の向きに変え、精製Ｆａｂの２倍希釈系列を別々のチャネル１－５に沿って同時に注入し、２００秒の結合時間及び２４０秒の解離時間をそれぞれ用いた。参照用の「インライン」ブランクを得るために、バッファー（ＰＢＳＴ）を第６のチャネルに沿って注入した。ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純１対１ラングミュア結合モデルを使用して、結合センソグラムと解離センソグラムの同時フィッティングにより、結合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。表５は、種及び追加スプライスドメインの組成が異なる幾つかのＴｎＣ抗原についての２つの選択クローン１８Ｄ４及び１１Ｃ７の平衡解離定数（ＫＤ）を収載するものである。
Figure 0007285076000024
Figure 0007285076000025
Figure 0007285076000026
Figure 0007285076000027
Figure 0007285076000028
下線付きの塩基:60%所与の配列及び40%N;イタリック体の塩基:60%所与の配列及び40%M。
1: G/D = 20%, E/V/S = 10%, A/P/R/L/T/Y=5%; 2: G/Y/S=15%, A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E = 4,6%; 3: G/A/Y = 20%, P/W/S/D/T = 8%; 4: F = 46%, L/M = 15%, G/I/Y = 8%.
Figure 0007285076000029
Figure 0007285076000030
Figure 0007285076000031
Figure 0007285076000032
無作為化プライマー中のトリヌクレオチド混合物:1 (G/D=20%, E/V/S=10%, A/P/R/L/T/Y=5%); 2 (G/Y/S=15%, A/D/T/R/P/L/V/N/W/F/I/E=4,6%); 3 (G/A/Y=20, P/W/S/D/T=8%); 4 (F=46%, L/M=15%, G/I/Y=8%); 5 (K=70%, R=30%)
実施例３
可変抗体ドメインの発現ベクターへのクローニング
選択抗ＴｎＣ結合物質（表１４から表１９）の重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域をヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖のどちらかと共にインフレームでサブクローニングした。抗体を、野生型ヒトＩｇＧ１骨格として調製したか、又は特許出願公開番号・国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載の方法に従ってＦｃガンマ受容体への結合を妨げるために導入されるＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含有する変異体として調製した。
抗ＴｎＣ結合物質のＣＤＲ配列を表１６から表１９に示す。抗ＴｎＣ ＩｇＧの塩基対及びアミノ酸配列を表２０及び表２１に示す。抗ＴｎＣ Ｐ３１９ＧＬＡＬＡ ＩｇＧの塩基対及びアミノ酸配列を表２２及び表２３に示す。キメラＭＰＳＶプロモーターでインサートの転写を駆動する発現ベクターであって、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含有する発現ベクターに、抗体をコードする配列全てをクローニングした。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。
ファージディスプレイにより選択される１１Ｃ７クローンのＬＣＤＲ３（ＮＳＩＮＳＴＲＮＥＶ）は、潜在的Ｎグリコシル化部位、すなわちＮＳＴを含有し、これは、均一な産物の産生を助長するためにアミノ酸置換により除去され得る可能性がある。それでもやはり、標的への結合を保持しなければならない。Ｎ（１位）をＱ、Ｓ又はＴによって優先的に置換することができるだろう。或いは、Ｓ（２位）をＰに置換することができるだろう。或いは、Ｔ（３位）を、Ｇ若しくはＮに、又はＳ若しくはＣを除く任意の他のタンパク質構成アミノ酸に、優先的に置換することができるだろう。何れにせよ最良であろう置換を当業者は実験によって決定することができる。
Figure 0007285076000033
Figure 0007285076000034
Figure 0007285076000035
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Figure 0007285076000043
Figure 0007285076000044
実施例４
抗ＴｎＣ ＩｇＧの精製
ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で全ての遺伝子を一過性に発現させた。発現ベクターは、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス核抗原）含有宿主細胞におけるエピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域も含有する。
抗ＴｎＣ ＩｇＧは、ポリエチレンイミンを使用して哺乳動物発現ベクターをＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞にコトランスフェクトすることにより産生させた。対応する発現ベクターを１：１比（「ベクターＨＣ」：「ベクターＨＬＣ」）で細胞にトランスフェクトした。
５００ｍＬ震盪フラスコ内での２００ｍＬの産生のために、サプリメントを含有するＥｘｃｅｌｌ培地に２億５千万個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を５分間、２１０ｘｇで遠心分離し、上清を予温ＣＤ－ＣＨＯ培地に置換した。ＤＮＡの最終量が２００μｇになるように発現ベクターを２０ｍＬ ＣＤ－ＣＨＯ培地に混入した。５４０μＬ ＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）の添加後、溶液を１５秒間ボルテックスし、１０分間、室温でインキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬ震盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気を有する、１６５ｒｐｍで震盪するインキュベーターの中で、３時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含有する１６０ｍＬのＥｘｃｅｌｌ培地を添加し、細胞を２４時間培養した。この時点で、バルプロ酸濃度は１ｍＭである（培地は、ｇ／ＬのＰｅｐＳｏｙ及び６ｍＭのＬ－グルタミンをさらに含む）。トランスフェクションの２４時間後、細胞にアミノ酸及びグルコースフィードを１２％最終体積（２４ｍＬ）で補充し、３ｇ／Ｌのグルコース（５００ｇ／Ｌのストックからの１．２ｍＬ）を補充する。７日間の培養後、細胞上清を４５分間の２０００－３０００ｘｇでの遠心分離により収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるようにアジ化ナトリウムを補充し、４℃で保持した。
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅを使用してアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清からの抗ＴｎＣ ＩｇＧの精製を行った。タンパク質を濃縮し、濾過し、その後、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０の０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０溶液で平衡させたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。
アフィニティークロマトグラフィーのために、３６ｍＬの２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡させたＰｒｏｔＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を負荷した。２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５を含有する、６－１０カラム容積のバッファーで洗浄することにより、非結合タンパク質を除去した。２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０の、１５ＣＶの塩化ナトリウム（２０から１００％）の線形ｐＨ勾配を使用して、非結合タンパク質を溶出した。次いで、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０を含有する、４カラム容積の溶液でカラムを洗浄し、その後、再平衡ステップを行った。
収集した画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０の添加により調整した。タンパク質を濃縮し、濾過し、その後、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で平衡させたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。
アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍでＯＤを測定することにより精製ＩｇＧのタンパク質濃度を決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在及び非存在下でのＣＥ－ＳＤＳにより、ＩｇＧの純度及び分子量を分析した。精製タンパク質の凝集物含有量は、２５℃で２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｌ－アルギニン・一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中で平衡させたＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（東ソー株式会社）を使用して分析した（表２４）。
Figure 0007285076000045
実施例５
表面プラズモン共鳴（ＴｎＣ結合）
ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣ（表４による抗原）への、抗ＴｎＣ ＩｇＧ １８Ｄ４の結合、抗ＴｎＣ ＩｇＧ １１Ｃ７の結合、及び抗ＴｎＣ １８Ｄ４のＦａｂ断片の結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評定した。全てのＳＰＲ実験は、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。
固定化ウィザード機能を使用して１００ＲＵまでの固定化を目指して、ビオチン化ヒト、マウス又はカニクイザルＴｎＣの２０μｇ／ｍｌの保存液をＳＡチップに注入した。最終固定化レベルは、７９－４００ＲＵの間であった。
次いで直ちに、抗ＴｎＣ ＩｇＧ １８Ｄ４（ＰＧＬＡＬＡ及びｗｔＦｃ）、抗ＴｎＣ ＩｇＧ １１Ｃ７（ｒｂ ＩｇＧ）、及び１８Ｄ４ Ｆａｂ断片に、０．０２－１２．５ｎＭの範囲の濃度（ＩｇＧ）及び０．０２－５０ｎＭの範囲の濃度（Ｆａｂ断片）で、１８０秒間、３０μｌ／分の流量でチップ表面を通過させ、その後、１８０秒の解離ステップを行った。最高濃度のＩｇＧについては、１８００秒のさらなる解離ステップを行った。各ステップ後、６０秒間の１０ｍＭ グリセリン ｐＨ２．１の２回の逐次的注入の結果として表面を再生した。ＴＮＣのない参照フローセルで得た応答を減算することにより、バルク屈折率差を補正した。ラングミュア１：１動態モデルを使用して、アフィニティー及び親和力を計算した。しかし、二価相互作用の１：１フィッティングについてのＫＤは、見掛けの値に過ぎないので、比較にしか使用するべきでない。
Figure 0007285076000046
抗ＴｎＣ結合物質１８Ｄ４は、ｐＭ範囲の同様の親和力でマウス及びカニクイザルＴｎＣと交差反応する。１８Ｄ４ Ｆａｂ断片のＴｎＣへの一価結合は、低ｎＭ範囲のＫＤをもたらす。抗ＴＮＣ結合物質１１Ｃ７もまたｐＭ範囲でヒトＴｎＣに結合する。このＢｉａｃｏｒｅ実験で使用したマウス及びカニクイザルＴＮＣコンストラクトにはＣドメインが存在しなかったため、結合物質１１Ｃ７については種間交差反応性を評定することができなかった（表２６）。
熱安定性
静的光散乱（ＳＬＳ）により、及び加えた温度ストレスに対する固有タンパク質蛍光を測定することにより、熱安定性をモニターした。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する３０μｇの濾過したタンパク質試料をＯｐｔｉｍ ２装置（Ａｖａｃｔａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｔｄ）に２回ずつ適用した。半径及び全散乱強度を収集しながら、温度を０．１℃／分で２５℃から８５℃に上昇させた。固有タンパク質蛍光の決定のために、試料を２６６ｎｍで励起させ、放出を２７５ｎｍと４６０ｎｍの間で収集した。両方のＩｇＧは、６２℃の凝集温度を有する（表２６）。
Figure 0007285076000047
実施例６
ＬＳ１７４Ｔ異種移植片由来腫瘍組織及びヒト組織アレイにおけるＴｎＣ染色の結果
免疫組織化学手法でのＴｎＣの検出のために、ＬＳ１７４Ｔ異種移植片由来腫瘍組織及びヒト組織アレイにおいてウサギＩｇＧ抗体としての抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４及び１１Ｃ７を試験した。
ＬＳ１７４Ｔ結腸直腸がん凍結腫瘍試料をクリオスタットで１２μｍ厚の切片にし、スーパーフロスト（ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ）スライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にマウントした。ペアの正常試料と腫瘍試料を含むヒト組織アレイの凍結試料をＢｉｏｃｈａｉｎ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＵＳＡ）から購入した。組織切片を３０分間放置して解凍した。スライドをＰＢＳで洗浄し、冷アセトンで１０分間固定し、水中の０．０３％水素ペルオキシダーゼのインキュベーションステップを行って、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。次いで、切片をＰＢＳ中の５％ヤギ血清と共に１時間インキュベートし、その後、０．５μｇ／ｍｌの抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４若しくは１１Ｃ７又はアイソタイプコントロール抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に４℃で一晩インキュベートした。その後、切片をＰＢＳで３回、各々５分間洗浄し、ペルオキシダーゼＲａｂｂｉｔ Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ ＡＢＣキット（ＰＫ－６１０１、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用して現像した。次いで、漸増濃度のエタノールでスライドを脱水し、２分間、キシレン中でインキュベートした。１滴のＰｅｒｍｏｕｎｔ封入剤（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を切片及びカバースリップに添加した。ＯｌｙｍｐｕｓスキャナーＶＳ１２０（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で画像を得て分析した。
ＬＳ１７４Ｔ異種移植片腫瘍における組織学的染色のパターンは、特定のＴｎＣ間質線維に対応した（図１）。クローン１８Ｄ４とクローン１１Ｃ７両方についてのＴｎＣ染色は、全体的に見て中等度の強度で発現される。ネガティブアイソタイプコントロールシグナルは、この手法の特異性を確証する。ウサギアイソタイプコントロールでの対応する組織学的染色におけるネガティブアイソタイプコントロールシグナルによって、染色の特異性を確証する（図２）。抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４でのヒト腫瘍アレイにおける組織学的染色は、特定のＴｎＣ間質線維に対応する。ＴｎＣ染色は、殆どの腫瘍組織においてコントロール正常ペア組織と比較して高レベルで発現される（図３）。抗ＴｎＣクローン１１Ｃ７でのヒト腫瘍アレイにおける組織学的染色は、特定のＴｎＣ間質線維に対応する。ＴｎＣ染色は、殆どの腫瘍組織においてコントロール正常ペア組織と比較して高レベルで発現される（図４）。
実施例７
４－１ＢＢの調製、精製及び特徴づけ
ヒト、マウス又はカニクイザル４－１ＢＢのエクトドメインをコードするＤＮＡ配列（表２７）をヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインと共にインフレームでノブ上にサブクローニングした（Merchant等、1998）。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を抗原エクトドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。ビオチン化の指向のためにＡｖｉタグを抗原－ＦｃノブのＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含有する抗原－Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含有するＦｃホール鎖の組合せにより、４－１ＢＢエクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成が可能になり、かくてモノマー形態のＦｃ結合抗原を作出する。表２８は、抗原Ｆｃ融合コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
Figure 0007285076000048
Figure 0007285076000049
Figure 0007285076000050
Figure 0007285076000051
Figure 0007285076000052
ＭＰＳＶプロモーターからインサートの転写を駆動するプラスミドベクターであって、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含有するプラスミドベクターに、４－１ＢＢ－Ｆｃ融合分子をコードする配列全てをクローニングした。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。
ビオチン化モノマー抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数増殖期の懸濁ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞に、融合タンパク質の２つの成分（ノブ鎖及びホール鎖）及びＢｉｒＡ（ビオチン化反応に必要な酵素）をコードする３つのベクターをコトランスフェクトした。対応するベクターを２：１：０．０５比（「抗原ＥＣＤ－ＡｃＴＥＶ－Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
５００ｍＬ震盪フラスコ内でのタンパク質産生のために、４億個のＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を５分間、２１０ｇで遠心分離し、上清を予温ＣＤ ＣＨＯ培地に置換した。２００μｇのベクターＤＮＡを含有する２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に発現ベクターを再懸濁させた。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加後、溶液を１５秒間ボルテックスし、１０分間、室温でインキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬ震盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気を有するインキュベーターの中で、３時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、１６０ｍＬのＦ１７培地を添加し、細胞を２４時間培養した。産生培地に５ｍＭ キフネンシンを補充した。トランスフェクションの翌日、１ｍＭ バルプロ酸とサプリメントを含有する７％フィード１とを培養物に添加した。７日の培養後、１５分、２１０ｇでの細胞回転沈降により細胞上清を収集した。その溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるようにアジ化ナトリウムを補充し、４℃で保持した。
プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーにより、分泌タンパク質を細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、４０ｍＬの２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡させたＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎｔＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を負荷した。１０カラム容積の２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．５Ｍ 塩化ナトリウム含有バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することにより、非結合タンパク質を除去した。２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０の２０カラム容積にわたって生じさせた塩化ナトリウム（０から５００ｍＭ）の線形ｐＨ勾配を使用して、結合タンパク質を溶出した。次いで、１０カラム容積の２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０で、カラムを洗浄した。
収集した画分のｐＨを１／４０（ｖ／ｖ）の２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０の添加により調整した。タンパク質を濃縮し、濾過し、その後、２ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．４の０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液で平衡させたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。
ヒト受容体に対するアフィニティー判定のために、ヒト４－１ＢＢのエクトドメインをまたａｖｉ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）及びヘキサヒスチジンタグと共にインフレームでサブクローニングした。
タンパク質産生は、Ｆｃ融合タンパク質について上で説明した通りに行った。分泌タンパク質を、細胞培養上清から、キレーティングクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。第１のクロマトグラフィーステップは、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、５００ｎＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．４中で平衡させた、ＮｉＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。溶出バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、５００ｎＭ 塩化ナトリウム、５００ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．４）の１２カラム容積にわたっての５％から４５％への勾配を利用することにより溶出を行った。タンパク質を濃縮し、濾過し、その後、２ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．４の０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液で平衡させたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した（表２９）。
Figure 0007285076000053
実施例８
ＴｎＣ標的スプリットトリマー４－１ＢＢリガンドＦｃ融合分子の調製
ヒト４－１ＢＢリガンドのエクトドメインの一部（アミノ酸７１－２５４及び７１－２４８）をコードするＤＮＡ配列をＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＰ４１２７３配列に従って合成した。トリマー４－１ＢＢリガンドを標的指向化するために使用したＴｎＣ結合物質は、クローン１８Ｄ４であった。
コンストラクト６．１：ＣＨ－ＣＬクロス及び荷電残基を有する、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体
（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより隔てられた４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）の２つのエクトドメインを含有し、ヒトＩｇＧ１－ＣＬドメインに融合されているポリペプチドを、図５ａ［ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ］に示されているようにクローニングした。４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）の１つのエクトドメインを含有し、ヒトＩｇＧ１－ＣＨドメインに融合されているポリペプチドを、図５ｂ［ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ］に示されているようにクローニングした。
正しいペアリングを増進するために、クロスしたＣＨ－ＣＬ内に次の突然変異を導入した。ヒトＣＬに融合されているダイマー４－１ＢＢリガンドには、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ。ヒトＣＨ１に融合されているモノマー４－１ＢＢリガンドには、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
テネイシン（ＴｎＣ）に特異的な結合物質であるクローン１８Ｄ４をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又は定常軽鎖のどちらかと共にインフレームでサブクローニングした。
Ｆｃガンマ受容体との結合を妨げるために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を（国際特許出願公開国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように）ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した。
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含有するダイマーリガンドＦｃノブ鎖と、モノマーＣＨ１融合体と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含有する標的指向性抗ＴｎＣ－Ｆｃホール鎖と、抗ＴｎＣ軽鎖との組合せ（米国特許第５７３１１６８号、同第７６９５９３６号に記載されているようなもの）により、集合トリマー４－１ＢＢリガンドとＴｎＣ結合Ｆａｂとを含むヘテロ二量体の生成が可能になる（図２）。
表３０及び表３１は、ＣＨ－ＣＬクロス及び荷電残基を有する、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007285076000054
Figure 0007285076000055
Figure 0007285076000056
Figure 0007285076000057
コンストラクト６．２：ＣＨ－ＣＬクロスを含有し、荷電残基を有さない、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体
（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより隔てられた４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）の２つのエクトドメインを含有し、ヒトＩｇＧ１－ＣＬドメインに融合されているポリペプチドを、図７ａ［ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ］に示されているようにクローニングした。
４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）の１つのエクトドメインを含有し、ヒトＩｇＧ１－ＣＨドメインに融合されているポリペプチドを、図７ｂ［ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ］に示されているようにクローニングした。
ＴｎＣに特異的な結合物質であるクローン１８Ｄ４をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又は定常軽鎖のどちらかと共にインフレームでサブクローニングした。
Ｆｃガンマ受容体との結合を妨げるために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した（特許寄託番号）。
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含有するダイマーリガンドＦｃノブ鎖と、モノマーＣＨ１融合体と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含有する標的指向性抗ＴｎＣ－Ｆｃホール鎖と、抗ＴｎＣ軽鎖との組合せにより、集合トリマー４－１ＢＢリガンドとＴｎＣ結合Ｆａｂとを含むヘテロ二量体の生成が可能になる（図８）。
表３２及び表３３は、ＣＨ－ＣＬクロスを含有し、荷電残基を有さない、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．２）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007285076000058
Figure 0007285076000059
Figure 0007285076000060
コンストラクト６．３：二価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体
（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより隔てられた４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）の２つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖のＣ末端に、図９ａ［ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド］に示されているように、融合させた。
図９ｂ［ヒトヒトＩｇＧ１Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド］に記載の、４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）の１つのエクトドメインを含有し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合されている、ポリペプチド。
ＴｎＣに特異的な結合物質であるクローン１８Ｄ４をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホール、ノブの定常重鎖、又は定常軽鎖のどちらかと共にインフレームでサブクローニングした。
Ｆｃガンマ受容体との結合を妨げるために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をＦｃガンマ受容体に導入した（国際特許出願公開国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている）。
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含有する抗ＴｎＣ ｈｕＩｇＧ１ホールダイマーリガンド鎖と、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含有する抗ＴｎＣ ｈｕＩｇＧ１ノブモノマーリガンド鎖と、抗ＴｎＣ軽鎖との組合せにより、集合トリマー４－１ＢＢリガンドと２つのＴｎＣ結合Ｆａｂとを含むヘテロ二量体の生成が可能になる（図１０）。
表３４及び表３５は、二価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．３）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007285076000061
Figure 0007285076000062
Figure 0007285076000063
Figure 0007285076000064
コンストラクト６．４：ＣＨ－ＣＬクロスと荷電残基を含有する、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体
（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより隔てられた４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）の２つのエクトドメインを含有し、ヒトＩｇＧ１－ＣＬドメインに融合されているポリペプチドを、図１１ａ［ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ］に示されているようにクローニングした。４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）の１つのエクトドメインを含有し、ヒトＩｇＧ１－ＣＨドメインに融合されているポリペプチドを、図１１ｂ［ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ］に示されているようにクローニングした。
正しいペアリングを増進するために、クロスしたＣＨ－ＣＬ内に次の突然変異を導入した。ヒトＣＬに融合されているダイマー４－１ＢＢリガンドには、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ。ヒトＣＨ１に融合されているモノマー４－１ＢＢリガンドには、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
ＴｎＣに特異的な結合物質であるクローン１８Ｄ４をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホール、ノブの定常重鎖、又は定常軽鎖のどちらかと共にインフレームでサブクローニングした。
Ｆｃガンマ受容体との結合を妨げるために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した（特許寄託番号）。
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含有するダイマーリガンドＦｃノブ鎖と、モノマーＣＨ１融合体と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含有する標的指向性抗ＴｎＣ－Ｆｃホール鎖と、抗ＴｎＣ軽鎖との組合せにより、集合トリマー４－１ＢＢリガンドとＴｎＣ結合Ｆａｂとを含むヘテロ二量体の生成が可能になる（図１２）。
表３６及び表３７は、ＣＨ－ＣＬクロスと荷電残基を含有する、一価のＴｎＣ標的スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．４）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007285076000065
Figure 0007285076000066
Figure 0007285076000067
コンストラクト６．５：ＣＨ－ＣＬクロスを含有し、荷電残基を有さない、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体
（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより隔てられた４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）の２つのエクトドメインを含有し、ヒトＩｇＧ１－ＣＬドメインに融合されているポリペプチドを、図１３ａ［ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ］に示されているようにクローニングした。
４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）の１つのエクトドメインを含有し、ヒトＩｇＧ１－ＣＨドメインに融合されているポリペプチドを、図１３ｂ［ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ］に示されているようにクローニングした。
ＴｎＣに特異的な結合物質であるクローン１８Ｄ４をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホール、ノブの定常重鎖、又は定常軽鎖のどちらかと共にインフレームでサブクローニングした。
Ｆｃガンマ受容体との結合を妨げるために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した（特許寄託番号）。
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含有するダイマーリガンドＦｃノブ鎖と、モノマーＣＨ１融合体と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含有する標的指向性抗ＴｎＣ－Ｆｃホール鎖と、抗ＴｎＣ軽鎖との組合せにより、集合トリマー４－１ＢＢリガンドとＴｎＣ結合Ｆａｂとを含むヘテロ二量体の生成が可能になる（図１４）。
表３８及び表３９は、ＣＨ－ＣＬクロスＦｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．５）における、荷電残基を有する、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）の、ｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007285076000068
Figure 0007285076000069
Figure 0007285076000070
コンストラクト６．６：二価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体
（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより隔てられた４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）の２つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図１５ａ［ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド］に示されているように、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させた。
図１５ｂ［ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド］に記載の、４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）の１つのエクトドメインを含有し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合されている、ポリペプチド。
ＴｎＣに特異的な結合物質であるクローン１８Ｄ４をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホール、ノブの定常重鎖、又は定常軽鎖のどちらかと共にインフレームでサブクローニングした。
Ｆｃガンマ受容体との結合を妨げるために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した（特許寄託番号）。
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含有する抗ＴｎＣ ｈｕＩｇＧ１ホールダイマーリガンド鎖と、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含有する抗ＴｎＣ ｈｕＩｇＧ１ノブモノマーリガンド鎖と、抗ＴｎＣ軽鎖との組合せにより、集合トリマー４－１ＢＢリガンドと２つのＴｎＣ結合Ｆａｂとを含むヘテロ二量体の生成が可能になる（図１６）。
表４０及び表４１は、二価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．６）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007285076000071
Figure 0007285076000072
Figure 0007285076000073
Figure 0007285076000074
コンストラクト６．１１及び６．１２：一価のＴｎＣ標的（ノブ）のトリマーＣ末端４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体
（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより隔てられた４－１ＢＢリガンドの２つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図１７ａ［ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド］に示されているように、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール又はノブ鎖のＣ末端にインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu等、1998）。４－１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図１７ｂ［ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド］に示されているように、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ又はホール鎖のＣ末端にインフレームでサブクローニングした。
ＴｎＣに特異的な結合物質であるクローン１８Ｄ４をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のノブの定常重鎖又は定常軽鎖のどちらかと共にインフレームでサブクローニングした。
Ｆｃガンマ受容体との結合を妨げるために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した（国際特許出願公開国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている）。
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含有するｈｕＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖と、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含有する抗ＴｎＣ ｈｕＩｇＧ１ノブ鎖と、抗ＴｎＣ軽鎖との組合せにより、集合トリマー４－１ＢＢリガンドと１つのＴｎＣ結合Ｆａｂとを含むヘテロ二量体の生成が可能になる（図１８）。
表４２及び表４３は、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマーＣ末端４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．１１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007285076000075
Figure 0007285076000076
Figure 0007285076000077
表４４及び表４５は、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマーＣ末端４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．１２）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007285076000078
Figure 0007285076000079
Figure 0007285076000080
Figure 0007285076000081
コンストラクト６．１３及び６．１４：一価のＴｎＣ標的（ホール）のトリマーＣ末端４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体
（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより隔てられた４－１ＢＢリガンドの２つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図１７ａ［ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド］に示されているように、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール又はノブ鎖のＣ末端にインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu等、1998）。４－１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを含有するポリペプチドを、図１７ｂ［ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４－１ＢＢリガンド］に示されているように、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ又はホール鎖のＣ末端にインフレームでサブクローニングした。
ＴｎＣに特異的な結合物質であるクローン１８Ｄ４をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１のホールの定常重鎖又は定常軽鎖のどちらかと共にインフレームでサブクローニングした。
Ｆｃガンマ受容体との結合を妨げるために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入した（国際特許出願公開国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている）。
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含有する抗ＴｎＣ ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖と、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含有するｈｕＩｇＧ１ノブ鎖と、抗ＴｎＣ軽鎖との組合せにより、集合トリマー４－１ＢＢリガンドと１つのＴｎＣ結合Ｆａｂとを含むヘテロ二量体の生成が可能になる（図１９）。
表４６及び表４７は、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマーＣ末端４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．１３）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007285076000082
Figure 0007285076000083
表４８及び表４９は、一価のＴｎＣ標的（１８Ｄ４）スプリットトリマーＣ末端４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．１４）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007285076000084
Figure 0007285076000085
Figure 0007285076000086
Figure 0007285076000087
コントロール分子としての非標的指向性スプリットトリマー４－１ＢＢリガンドＦｃ融合体及びヒトＩｇＧの調製
抗ＴｎＣ結合物質（ＶＨ－ＶＬ）が、ＤＰ４７と称される抗原と結合しない生殖系列コントロールに置き換えたことのみが異なる、ＴｎＣ標的コンストラクト６．１のコントロール分子（コントロールＢと名付けた）、６．３のコントロール分子（コントロールＣと名付けた）及び６．５のコントロール分子（コントロールＥと名付けた）を、上述の通り調製した。
表５０は、クロスしたＣＨ－ＣＬと荷電残基を含有する、一価ＤＰ４７－非標的指向性スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体、コントロールＢのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
表５１は、二価ＤＰ４７－非標的指向性スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体、コントロールＣのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
表５２は、ＣＨ－ＣＬクロスと荷電残基を含有する、一価ＤＰ４７－非標的指向性スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体、コントロールＤのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
表５３は、ＣＨ－ＣＬクロス内に荷電残基を有さない一価ＤＰ４７－非標的指向性スプリットトリマー４－１ＢＢリガンド（７１－２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体、コントロールＥのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。
Figure 0007285076000088
Figure 0007285076000089
Figure 0007285076000090
Figure 0007285076000091
Figure 0007285076000092
Figure 0007285076000093
Figure 0007285076000094
Figure 0007285076000095
ＰＧＬＡＬＡを含有する２つのコントロールヒトＩｇＧ１分子を調製した。表５４は、生殖系列コントロールＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（コントロールＦ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸を示す。表５５は、抗ＴｎＣ（１８Ｄ４）重鎖（ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ、すなわちコントロールＬ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸を示す。
Figure 0007285076000096
Figure 0007285076000097
Figure 0007285076000098
Figure 0007285076000099
実施例９
ＴｎＣ標的スプリットトリマーＣ末端４－１ＢＢリガンドＦｃ融合体及びそれらのコントロールの産生
ＭＰＳＶプロモーターからインサートの発現を駆動するプラスミドベクターであって、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡ配列を含有するプラスミドベクターに、標的指向性及び非標的指向性トリマー４－１ＢＢリガンドＣ末端Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体配列をクローニングした。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含有する。スプリットトリマー４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子は、ポリエチレンイミンを使用して哺乳動物発現ベクターをＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞にコトランスフェクトすることにより産生させた。対応する発現ベクターを細胞にトランスフェクトした。コンストラクト６．１、６．２、６．４、６．６並びにそのコントロールＢ、Ｄ及びＥについては、１：１：１：１比（「ベクターＦｃホール鎖」：「ベクターＰＤ１軽鎖」：「ベクターＦｃノブ鎖」：「ベクター４－１ＢＢＬ軽鎖」）で。コンストラクト６．３、６．６、６．１１、６．１２、６．１３、６．１４及びそのコントロールＣについては、１：１：１比（「ベクターＦｃホール鎖」：「ベクターＦｃノブ鎖」：「ベクター抗ＰＤ１軽鎖」）で。アッセイにおいてコントロールとして使用したヒトＩｇＧは、二重特異性コンストラクトの場合と同様に産生させた（トランスフェクションには、軽鎖用のベクター及び重鎖用のベクターのみを１：１比で使用した）。
５００ｍＬ震盪フラスコ内での産生のために、３億個のＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を１０分間、２１０ｘｇで遠心分離し、上清を２０ｍＬの予温ＣＤ－ＣＨＯ培地に置換した。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を２０ｍＬ ＣＤ ＣＨＯ培地と混合した。５４０μＬ ＰＥＩの添加後、溶液を１５秒間ボルテックスし、１０分間、室温でインキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬ震盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気を有するインキュベーターの中で、３時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、６ｍＭ Ｌ－グルタミン、５ｇ／ＬのＰＥＰＳＯＹ、及び１．２ｍＭ バルプロ酸を補充した１６０ｍＬのＥｘｃｅｌｌ培地を添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの翌日、１２％フィードを添加した。７日間の培養後、上清を３０－４０分間の少なくとも４００ｘｇでの遠心分離により収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、０．０１％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるようにアジ化ナトリウムを補充し、４℃で保持した。
プロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーにより、分泌タンパク質を細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、クエン酸ナトリウム（２０ｍＭ）バッファー（ｐＨ７．５）で平衡させたＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５－１５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからの樹脂）に上清を負荷した。同バッファーの少なくとも６カラム容積で洗浄することにより、非結合タンパク質を除去した。２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンバッファー（ｐＨ２．５）での、線形勾配（２０ＣＶ）又は段階的溶出（８ＣＶ）のどちらかを使用して、結合タンパク質を溶出した。線形勾配には、さらなる４カラム容積の段階的溶出を適用した。
収集した画分のｐＨを１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ８．０の添加により調整した。タンパク質を濃縮し、その後、２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．０の０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０溶液で平衡させたＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。
アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍで光学濃度（ＯＤ）を測定することにより、タンパク質濃度を決定した。標的指向性トリマー４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭ １，４－ジチオトレイトール）の存在及び非存在下でＣｏｏｍａｓｓｉｅ ＳｍｐｌｅＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵＳＡ）で染色するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、又はＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用するＣＥ－ＳＤＳによって分析した。試料の凝集物含有量は、２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｌ－アルギニン・一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中、２５℃で平衡させたＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析用サイズ排除カラム（東ソー株式会社）を使用して分析した。
表５６は、ＴｎＣ標的スプリットトリマー４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体の収量及び最終モノマー含有量をまとめたものである。
Figure 0007285076000100
実施例１０
ＴｎＣ標的４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドＦｃ融合抗原結合分子の表面プラズモン共鳴による同時結合
ヒト４－１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＴｎＣに同時に結合する能力を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評定した。全てのＳＰＲ実験は、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で行った。
ビオチン化ＴｎＣ－抗原をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接カップリングした。５００レゾナンスユニット（ＲＵ）以下の固定化レベルを使用した。ＴｎＣ標的４－１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子を１００ｎＭの濃度範囲で、３０μＬ／分の流量で９０秒にわたってフローセルに通し、解離をゼロ秒に設定した。ヒト４－１ＢＢ ａｖｉ Ｈｉｓを第２の被分析物として１０００ｎＭの濃度で、３０μＬ／分の流量で９０秒にわたってフローセルに注入した（図２０）。解離を１２０秒間モニターした。タンパク質を固定化しなかった参照フローセルにおいて得た応答を減算することにより、バルク屈折率差を補正した。全ての二重特異性コンストラクトは、ヒト４－１ＢＢ及びヒトＴｎＣに同時に結合することができた（図２０）。
実施例１１
一価のＴｎＣ標的４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドＦｃ融合抗原結合分子の表面プラズモン共鳴によるアフィニティー判定
ＴｎＣ標的４－１ＢＢリガンドトリマー含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の組換えＴｎＣへの結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評定した。全てのＳＰＲ実験は、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５ ％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００で行った。
アフィニティー測定のために、標準的アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ｐＨ５．０で、約５００レゾナンスユニット（ＲＵ）の組換えヒト、カニクイザル及びマウスＴｎＣのＣＭ５チップ上への直接カップリングを行った。ＴｎＣ標的４－１ＢＢリガンドトリマー含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の希釈系列（０．０５－５０ｎＭ）に両方のフローセル上を３０μｌ／分で１２０秒間通過させて、結合相を記録した。解離相を１８０秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰに切り替えることにより誘発した。６０秒の１０ｍＭ グリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．１の二重注入を使用して、毎サイクル後にチップ表面を再生させた。参照フローセル１で得た応答を減算することにより、バルク屈折率差を補正した。ＴｎＣ標的４－１ＢＢリガンドトリマー含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子と組換えＴｎＣとの間の相互作用のついてのアフィニティー定数は、Ｂｉａｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する１：１ラングミュア結合曲線へのフィッティングにより速度定数から導いた（表５７）。
Figure 0007285076000101
実施例１２
ＴｎＣ標的４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドＦｃ融合抗原結合分子の機能的特徴づけ
Ａ）ＴｎＣ標的スプリットトリマー４－１ＢＢリガンドの新鮮及び活性化ヒトＰＢＭＣに対する結合
バフィーコートをチューリッヒ献血センター（Zurich blood donation center）から入手した。新鮮抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同体積のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０ ３２６）で希釈した。５０ｍＬポリプロピレン製遠心分離管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に、１５ｍＬ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（ＳＩＧＭＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、密度１．０７７ｇ／ｍＬに調整された、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム）を供給し、希釈バフィーコート含有量をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７の上に積層した。管を３０分間、４５０ｘｇで遠心分離した。次いで、ＰＢＭＣを接触面から収集し、ＤＰＢＳで３回洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、原産地米国、ＰＡＮ ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐ３０－２００９、ロットＰ１５０３０７ＧＩ、ガンマ線照射によりマイコプラズマ不含、３５分間５６℃で熱不活化済み）と、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０ ０３８）と、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）と、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）と、５０μＭ β－メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）とを補充した、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１－０４２）からなるＴ細胞培地に再懸濁させた。
ＰＢＭＣを単離後直ちに使用した（新鮮ヒトＰＢＭＣに対する結合）、又はＰＢＭＣを刺激してＴ細胞の細胞表面での４－１ＢＢ発現を誘導した（活性化ヒトＢＰＭＣに対する結合）。ヒトＴ細胞上での４－１ＢＢ発現増加を誘導するために、１０％ＰＢＳと、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）と、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉと、１％ＭＥＭ－非必須アミノ酸溶液（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）と、５０μＭ ベータ－メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）と、２００Ｕ／ｍＬのプロロイキン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｈｗｅｉｚ ＡＧ）と、２μｇ／ｍＬのＰＨＡ－Ｌ（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｌ２７６９）とを補充したＲＰＭＩ １６４０中で３日間培養して、細胞１ｘ１０６個／ｍＬの最終濃度にした。予備活性化後、細胞を回収し、１０％ＰＢＳと、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）と、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉと、１％ＭＥＭ－非必須アミノ酸溶液（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）と、５０μＭ ベータ－メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）とを補充したＰＲＭＩ １６４０培地に再懸濁させ、一晩、４℃で、１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、マウスＩｇＧ２ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３１５）及び２ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、マウスＩｇＧ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２９２３）で被覆した６ウェル組織培養プレート（ＴＴＰ、カタログ番号９２００６）に播種した。細胞を３日間、３７℃及び５％ＣＯ２でさらにインキュベートした。
結合アッセイのために、０．１ｘ１０６個の新鮮又は活性化ＰＢＭＣを、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。プレートを５分、３５０ｘｇで、４℃で遠心分離し、上清を廃棄した。その後、１：５０００希釈した固定可能な生存細胞識別色素ｅＦ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８６４－１８）を含有する１００μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中で３０分間、４℃で、暗所で細胞を染色した。細胞を２００μＬの冷ＤＰＢＳバッファーで１回洗浄した。次に、滴定濃度のコンストラクト６．５及びコンストラクト６．６並びにコントロールとしてコントロールＥ、コントロールＦ及びコントロールＬを含有する、５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番後Ｅ１７７）及び７．５ｍＭ アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ２００２）を補充したＤＰＢＳ）を添加し、細胞を６０分間、４℃でインキュベートし、２００μＬ／ウェルの４℃ ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ４５－ＡＦ４８８（クローンＨＩ３０、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４０１９）と、０．３３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８ａ－ＢＶ５１０（クローンＳＫ１、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４４７３２）と、０．２３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ４－ＢＶ４２１（クローンＯＫＴ４、マウスＩｇＧ２ｂκ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）と、０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローンＵＣＨＴ１、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００４３０）と、０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ１９－ＰＥ／Ｃｙ７（クローンＨＩＢ１９、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２２１６）と、５μｇ／ｍＬの、ＰＥがコンジュゲートされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９ １１６ ０９８）とを含有する５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳバッファーに細胞をさらに再懸濁させ、３０分間、４℃でインキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃ ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、次いで、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０－９．５Ｌ）を補充したＤＰＢＳで固定した。細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して捕捉した。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ， ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ）を使用してデータを解析した。
生存ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４ｎｅｇ Ｃｄ８ｎｅｇ γδ Ｔ細胞及びＣＤ４５＋ＣＤ３ｎｅｇ ＣＤ１９＋Ｂ細胞にゲートを設定し、ＰＥがコンジュゲートされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ ＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の幾何平均を、滴定濃度の、ＴｎＣ標的４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドＦｃ融合抗原結合分子又はＤＰ４７非標的指向性４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドＦｃ融合抗原結合分子及びそれらのコントロールに対してプロットした。図２１に示されているように、試験した、ＴｎＣ標的４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドＦｃ融合抗原結合分子の何れも、又はそれらの対照の何れも、単離したてのＰＢＭＣの細胞と結合しない。
図２２に示されているように、活性化後、生存ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４ｎｅｇ Ｃｄ８ｎｅｇ γδ Ｔ細胞は、ヒト４－１ＢＢを発現する。抗ＴｎＣ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡコントロールＬ及びＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡコントロールＦは、活性化ヒトＰＢＭＣと結合しなかった。コンストラクト６．５、コンストラクト６．６及びコントロールＥのような、４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドを含有する全ての分子は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びγδ Ｔ細胞と結合する。表５８に、活性化ヒトＰＢＭＣへの結合曲線のＥＣ５０値をまとめる。
Figure 0007285076000102
Ｂ）ヒトＴｎＣ発現腫瘍細胞の結合
ＴｎＣ発現腫瘍細胞に関する結合アッセイには、ヒト膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７－ＭＧ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１４）を使用した。
冷ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０ ３２６）に再懸濁させた０．２ｘ１０６個の腫瘍細胞を丸底浮遊細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄した。１：５０００希釈した固定可能な生存細胞識別色素ｅＦｌｕｏｒ ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５－０８６４－１８）を含有する１００μＬ／ウェルの４℃冷ＤＰＢＳバッファーに細胞を再懸濁させ、プレートを３０分間、４℃でインキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃冷ＤＰＢＳバッファーで１回洗浄し、一連の濃度の、ＴｎＣ標的４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドＦｃ融合抗原結合分子又はそれらのコントロールを含有する、５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳと、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）と７．５ｍＭ アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ２００２）とを補充したＤＰＢＳ）に再懸濁させ、その後、１時間、４℃でインキュベートした。入念な洗浄後、５μｇ／ｍＬの、ＰＥがコンジュゲートされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９ １１６ ０９８）を含有する、５０μＬ／ウェルの４℃冷ＦＡＣＳバッファーで、３０分間、４℃でさらに細胞を染色した。細胞を２００μＬ／ウェルの４℃ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０－９．５Ｌ）を含有する５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで細胞を固定した。細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して捕捉した。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を使用してデータを解析した。
生存腫瘍細胞にゲートを設定し、ＰＥがコンジュゲートされたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ ＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片の蛍光強度の幾何平均を、滴定濃度の、ＴｎＣ標的４－１ＢＢスプリットトリマーリガンドＦｃ融合抗原結合分子又はそれらのコントロールに対してプロットした。図２３に示されているように、ＴｎＣを標的としないコントロールＥ及びコントロールＦは腫瘍細胞と結合しなかった一方で、ＴｎＣ標的分子であるコンストラクト６．５、コンストラクト６．６及びコントロールＬだけがＴｎＣ発現Ｕ８７－ＭＧと結合した。表５９に曲線のＥＣ５０値を収載する。
Figure 0007285076000103
Ｃ）生物活性：ヒト４－１ＢＢ発現ＨｅＬａレポーター細胞株のＮＦ－κＢ活性化
ヒト４－１Ｂ及びＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞の生成
ＣＭＶ－プロモーターの制御下にあるヒト４－１ＢＢの配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ寄託Ｑ０７０１１）とピューロマイシン耐性遺伝子とを含有する発現ベクターｐＥＴＲ１０８２９に基づくプラスミドを用いて、ヒトパピローマウイルス１８誘発子宮頚がん細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）に形質導入した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１６０００－０４４、ロット番号９４１２７３、ガンマ線照射によりマイコプラズマ不含、３５分間５６℃で熱不活化済み）と、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（ＧＩＢＣＯ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０－０３８）と、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ａｎｔ－ｐｒ）とを補充した、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４３０－０２５）で、細胞を培養した。４－１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞をフローサイトメトリーにより４－１ＢＢ発現について試験した：０．１μｇ ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５がコンジュゲートされた抗ヒト４－１ＢＢマウスＩｇＧ１κクローン４Ｂ４－１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号３０９８１４）又はそのアイソタイプコントロール（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５がコンジュゲートされたマウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール抗体クローンＭＯＰＣ ２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号４００１５０）を含有する、１００μＬ ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳと、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）と７．５ｍＭ アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ２００２）とを補充したＤＰＢＡ）に、０．２ｘ１０６個の生存細胞を再懸濁させ、３０分間４℃でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、０．０６μｇのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号Ｓｃ－３５９８）を含有する３００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、５レーザー搭載ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＤＩＶＡ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して捕捉した。次のように、限界希釈を行って単一クローンを生成した：ヒト４－１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を培地に再懸濁させて細胞１０、５及び２．５個／ｍＬの濃度にし、２００μＬの細胞懸濁液を丸底組織培養処理９６ウェルプレート（６プレート／細胞濃度、ＴＰＰカタログ番号９２６９７）に移した。単一クローンを回収し、増殖させ、４－１ＢＢ発現について上で説明したように試験した。４－１Ｂｂの最高発現を有したクローン（クローン５）を、ＮＦκＢ－ルシフェラーゼ発現ベクター５４９５ｐ Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ ＨｙｇＢを用いるその後のトランスフェクションに選択した。このベクターは、トランスフェクトされた細胞に、ハイグロマイシンＢに対する耐性と、ＮＦｋＢ応答エレメント（Ｐａｎｏｍｉｃｓ、カタログ番号ＬＲ００５１）の制御下でルシフェラーゼを発現する能力との両方を付与する。ヒト４－１ＢＢ ＨｅＬａクローン５細胞を培養して７０％コンフルエンスにした。５０μｇ（４０μＬ）の直線化（制限酵素ＡｓｅＩ及びＳａｌＩ）５４９５ｐ Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ ＨｙｇＢ発現ベクターを、滅菌０．４ ｃｍ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５－２０８１）に添加した。４００μｌのサプリメント不含ＤＭＥＭ中の２．５Ｘ１０６個のヒト４－１ＢＢ ＨｅＬａクローン５を添加し、注意深くプラスミド溶液と混合した。Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６５ ２６６０）を、次の設定のもとで使用して細胞のトランスフェクションを行った：指数パルス、キャパシタンス５００μＦ、電圧１６０Ｖ、抵抗∞。パルス後直ちに、トランスフェクト細胞を、１０％ＦＢＳと１％ＧｌｕｔａａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０ ０３８）とを補充した１５ｍＬ ３７℃温ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号４２４３０－０２５）が入っている組織培養フラスコ７５ｃｍ２（ＴＰＰ、カタログ番号９００７５）に移した。翌日、３μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号ａｎｔ ｐｒ）及び２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１０８４３５５５００１）を含有する培地を添加した。生存細胞を増殖させ、上で説明したように限界希釈を行って、単一クローンを生成した。クローンを４－１ＢＢ発現については上で説明したように、ＮＦκＢ－ルシフェラーゼ活性については次のように試験した。クローンを選択培地に採取し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｖｉ－ｃｅｌｌ ｘｒ ２．０３（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号７３１０５０）を使用して計数した。細胞を、細胞０．３３ｘ１０６個／ｍＬの細胞密度に設定し、翌日、この細胞懸濁液の１５０μＬを、蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）に移して、及びコントロールとして通常の９６ウェル平底組織培養プレート（ＴＰＰカタログ番号９２０９６）に移して、生存及び細胞密度について試験した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の組換えヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｒｈＴＮＦα、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３００ ０１Ａ）を含有する培地５０μＬを、結果として１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び０ｎｇ ｒｈＴＮＦα／ウェルの最終濃度になるように、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。細胞を６時間、３７℃及び５ ％ＣＯ２でインキュベートし、その後、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで３回洗浄した。レポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルの添加し（３０μＬ）、プレートを－２０℃で一晩保管した。翌日、凍結細胞プレート及び検出バッファー（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ １０００ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を解凍して室温にした。１００ｕＬの検出バッファーを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してできる限り迅速にプレートを測定した。コントロール（ｒｈＴＮＦ－αの添加なし）より上の測定ＵＲＬをルシフェラーゼ活性とみなした。最高ルシフェラーゼ活性及びかなりのレベルの４－１ＢＢ発現を呈示するＮＦκＢ－ｌｕｃ－４－１ＢＢ－ＨｅＬａクローン２６を、さらなる使用に選択した。
ＴｎＣを発現するＵ８７ＭＧ及びＳｋＫ－ｍｅｌ５細胞と共培養したヒト４－１ＢＢを発現するＨｅＬａレポーター細胞のＮＦ－κＢ活性化
接着ヒト膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１４）をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０ ３２６）で洗浄し、酵素不含、ＰＢＳベースの細胞解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１３１５１－０１４）で１０分間、３７℃で処理した。その後、細胞を回収し、細胞計数器Ｖｉ－ｃｅｌｌ ｘｒ ２．０３を使用して計数した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、原産地米国、ＰＡＮ ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐ３０－２００９、ロットＰ１５０３０７ＧＩ、ガンマ線照射によりマイコプラズマ不含、３５分間５６℃で熱不活化済み）と１％ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（ＧＩＢＣＯ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０ ０３８）とを補充したＤＭＥＭ培地（（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号４２４３０ ０２５）に細胞を再懸濁させて細胞１ｘ１０６個／ウェルにし、１００μＬを蓋付き滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）のウェルに添加した。ネガティブコントロールについては、１００μＬの培地を添加した。プレートを３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
翌日、異なる滴定のスプリットトリマー４－１ＢＢリガンド含有融合タンパク質分子及びそれらのコントロールを添加した。その後、ＮＦκＢ－ｌｕｃ－４－１ＢＢ－ＨｅＬａクローン２６細胞をＤＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリプシンＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号２５３００ ０５４）で５分間、３７℃で処理した。細胞を回収し、１０％ウシ胎児血清と１％ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉとを補充したＤＭＥＭ培地に再懸濁させた。細胞計数器Ｖｉ－ｃｅｌｌ ｘｒ ２．０３（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号７３１０５０）を使用して細胞を計数し、細胞０．４ｘ１０６個／ｍＬの細胞密度に設定した。この細胞懸濁液の５０μＬ（細胞２ｘ１０４個）を各ウェルに移した。プレートを６時間、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。白色平底９６ウェルプレートを２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで３回洗浄した。４０μＬの調製したてのレポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し、プレートを－２０℃で一晩保管した。翌日、凍結プレート及び検出バッファー（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ １０００ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０）を解凍して室温にした。１００ｕＬの検出バッファーを各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を次の設定で使用して、できる限り迅速にプレートを測定した：ルシフェラーゼ（ＲＬＵ）について、積分時間５００ｍｓ、フィルターなし、全波長収集、トップリーディング。
Figure 0007285076000104
Ｄ）ＴｎＣ発現腫瘍細胞の存在下でのヒトＰＢＭＣの活性化アッセイ
ＴｎＣ結合媒介架橋のために、ＴｎＣ発現接着ヒト膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７－ＭＧ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１４）を使用した。Ｕ８７ＭＧ細胞をＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０ ３２６）で洗浄し、酵素不含、ＰＢＳベースの細胞解離バッファー（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１３１５１－０１４）で１０分間、３７℃で処理した。細胞を回収し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、原産地米国、ＰＡＮ ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐ３０－２００９、ロットＰ１５０３０７ＧＩ、ガンマ線照射によりマイコプラズマ不含、３５分間５６℃で熱不活化済み）と、１％Ｌ－ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（ＧＩＢＣＯ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５０－０３８）と、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８６３６）と、１％ＭＥＭ－非必須アミノ酸溶液（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ７１４５）と、５０μＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｙｔ．－Ｎｏ．Ｍ３１４８）とを補充したＲＰＭＩ １６４０（ＧＩＢＣＯ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４２４０１－０４２）からなるＴ細胞培地に再懸濁させ、５０Ｇｙを照射した（Ｘ－Ｒａｙ Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ ＲＳ ２０００、Ｒａｄ ｓｏｕｒｃｅ）。５０μＬ Ｔ細胞培地中の２ｘ１０４個のＵ８７ＭＧ細胞を丸底組織培養９６ウェルプレート（ＴＴＰ、カタログ番号９２６９７）に播種した。異なる滴定濃度のコンストラクト６．５及び６．６又は適合するコントロール（コントロールＦ、コントロールＬ及びコントロールＥ）を含有する、５０μＬのＴ細胞培地を添加した。４０ｎＭ ＣＦＤＡ－ＳＥ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２１８８８－２５ＭＧ－Ｆ）を含有する３７℃温ＤＰＢＳ中でヒトＰＢＭＣを１５分間、３７℃で標識した。ＣＦＳＥへの標識づけをＦＢＳの添加により停止させ、ＰＢＭＣを２回洗浄し、Ｔ細胞培地に再懸濁させて、細胞１．５ｘ１０６個／ｍＬの最終濃度にした。このＰＢＭＣ細胞溶液の５０μＬを各ウェルに播種した、例えば、７．５ｘ１０４個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを各ウェルに添加した。最後に、８ｎＭ アゴニスト抗ヒトＣＤ３ヒトＩｇＧ１クローンＶ９を含有するＴ細胞培地の保存液を調製し、５０μＬ／ウェルを各ウェルに添加して、２ｎＭ 抗ヒトＣＤ３ヒトＩｇＧ１クローンＶ９の最終濃度を得た。
プレートを４日間、３７℃でインキュベートした。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、１００μＬ／ウェルのＤＰＢＳ含有１：１０００希釈ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ死細胞染色キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号Ｌ３４９５７）で３０分間、４℃で染色した。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで１回洗浄し、０．１μｇ／ｍＬの、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５がコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ１３７マウスＩｇＧ１ κ（クローン４Ｂ４－１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）、０．１μｇ／ｍＬの、ＰＥ／Ｃｙ７がコンジュゲートされた抗ヒトＰＤ－１マウスＩｇＧ１ κ（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９１８）、０．０３μｇ／ｍＬの、ＡＰＣがコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ２５マウスＩｇＧ１κ（クローンＢＣ９６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２６１０）、０．０６μｇ／ｍＬの、ＡＰＣ／Ｃｙ７がコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ８マウスＩｇＧ１ κ（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３０１０１６）、ＢＶ４２１がコンジュゲートされた抗ヒトＣＤ４マウスＩｇＧ１ κ（クローンＲＰＡ－Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）を含有する、５０μＬ ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳと、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）と７．５ｍＭ アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ２００２））で、３０分間、４℃で染色した。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、５０μＬ／ウェルの調製したてのＦｏｘＰ３ Ｐｅｒｍ／Ｆｉｘバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ カタログ番号００－５１２３）と共に３０分間、４℃でインキュベートした。細胞を２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥがコンジュゲートされた１：２５０希釈抗ヒトグランザイムＢマウスＩｇＧ１ κ（クローンＧＢ１１、ロット４２６９８０３、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５６１１４２）を補充した５０μＬ／ウェルの調製したてのＰｅｒｍバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ カタログ番号００－８３３３）に再懸濁させ、１時間、４℃でインキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０－９．５Ｌ）を含有するＤＰＢＳで１５分間、細胞を固定した。細胞を１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、ＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して捕捉した。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を使用してデータを解析した。
図２７に示されているように、ＴｎＣ標的スプリットトリマー４－１ＢＢ融合分子コンストラクト６．６及びより少ない程度にコンストラクト６．５のみが、ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ２５及び４－１ＢＢの濃度依存性表面発現増加を誘導した。ネガティブコントロール分子（コントロールＦ、コントロールＬ及びコントロールＥ）は、活性化マーカーのこの発現増加を誘導しなかった。相関するＥＣ５０値を表６１に収載する。
Figure 0007285076000105
引用
Ascierto, P. A., E. Simeone, M. Sznol, Y. X. Fu, and I. Melero (2010), Clinical experiences with anti-CD137 and anti-PD1 therapeutic antibodies. Semin Oncol 37:508-516.
Aggarwal B.B. (2003), Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nat. Rev. Immunol. 3(9),745-56.
Banner D. et al (1993), Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation. Cell 73, 431-445.
Berg et al. (2007), Enforced covalent trimerization increases the activity of the TNF ligand family members TRAIL and CD95L. Cell Deatch and Differentiation 14(12), 2021-2034.
Bodmer J., Schneider P. and Tschopp, J. (2002), The molecular architecture of the TNF superfamily. Trends in Biochemical Sciences 27(1), 19-26.
Broll, K., Richter, G., Pauly, S., Hofstaedter, F., and Schwarz, H. (2001). CD137 expression in tumor vessel walls. High correlation with malignant tumors. Am J Clin Pathol 115, 543-549.
Buechele, C., Baessler, T., Schmiedel, B.J., Schumacher, C.E., Grosse-Hovest, L., Rittig, K., and Salih, H.R. (2012). 4-1BB ligand modulates direct and Rituximab-induced NK-cell reactivity in chronic lymphocytic leukemia. Eur J Immunol 42, 737-748.
Choi, B.K., Kim, Y.H., Kwon, P.M., Lee, S.C., Kang, S.W., Kim, M.S., Lee, M.J., and Kwon, B.S. (2009). 4-1BB functions as a survival factor in dendritic cells. J Immunol 182, 4107-4115.
Cuadros, C., Dominguez, A.L., Lollini, P.L., Croft, M., Mittler, R.S., Borgstrom, P., and Lustgarten, J. (2005). Vaccination with dendritic cells pulsed with apoptotic tumors in combination with anti-OX40 and anti-4-1BB monoclonal antibodies induces T cell-mediated protective immunity in Her-2/neu transgenic mice. Int J Cancer 116, 934-943.
Curran, M.A., Kim, M., Montalvo, W., Al-Shamkhani, A., and Allison, J.P. (2011). Combination CTLA-4 blockade and 4-1BB activation enhances tumor rejection by increasing T-cell infiltration, proliferation, and cytokine production. PLoS One 6, e19499.
Diehl, L., van Mierlo, G.J., den Boer, A.T., van der Voort, E., Fransen, M., van Bostelen, L., Krimpenfort, P., Melief, C.J., Mittler, R., Toes, R.E., and Offringa, R. (2002). In vivo triggering through 4-1BB enables Th-independent priming of CTL in the presence of an intact CD28 costimulatory pathway. J Immunol 168, 3755-3762.
Dubrot, J., Milheiro, F., Alfaro, C., Palazon, A., Martinez-Forero, I., Perez-Gracia, J.L., Morales-Kastresana, A., Romero-Trevejo, J.L., Ochoa, M.C., Hervas-Stubbs, S., et al. (2010). Treatment with anti-CD137 mAbs causes intense accumulations of liver T cells without selective antitumor immunotherapeutic effects in this organ. Cancer Immunol Immunother 59, 1223-1233.
Futagawa, T., Akiba, H., Kodama, T., Takeda, K., Hosoda, Y., Yagita, H., and Okumura, K. (2002). Expression and function of 4-1BB and 4-1BB ligand on murine dendritic cells. Int Immunol 14, 275-286.
Guo, Z., Cheng, D., Xia, Z., Luan, M., Wu, L., Wang, G., and Zhang, S. (2013). Combined TIM-3 blockade and CD137 activation affords the long-term protection in a murine model of ovarian cancer. J Transl Med 11, 215.
Heinisch, I.V., Daigle, I., Knopfli, B., and Simon, H.U. (2000). CD137 activation abrogates granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-mediated anti-apoptosis in neutrophils. Eur J Immunol 30, 3441-3446.
Hornig, N., Kermer, V., Frey, K., Diebolder, P., Kontermann, R.E., Mueller, D. (2012), Combination of a bispecific antibody and costimulatory antibody-ligand fusion proteins for targeted cancer immunotherapy. J. Immunother. 35, 418-429.
Ju, S.A., Cheon, S.H., Park, S.M., Tam, N.Q., Kim, Y.M., An, W.G., and Kim, B.S. (2008). Eradication of established renal cell carcinoma by a combination of 5-fluorouracil and anti-4-1BB monoclonal antibody in mice. Int J Cancer 122, 2784-2790.
Kienzle, G., and von Kempis, J. (2000). CD137 (ILA/4-1BB), expressed by primary human monocytes, induces monocyte activation and apoptosis of B lymphocytes. Int Immunol 12, 73-82.
Kim, D.H., Chang, W.S., Lee, Y.S., Lee, K.A., Kim, Y.K., Kwon, B.S., and Kang, C.Y. (2008). 4-1BB engagement costimulates NKT cell activation and exacerbates NKT cell ligand-induced airway hyperresponsiveness and inflammation. J Immunol 180, 2062-2068.
Kim, Y.H., Choi, B.K., Oh, H.S., Kang, W.J., Mittler, R.S., and Kwon, B.S. (2009). Mechanisms involved in synergistic anticancer effects of anti-4-1BB and cyclophosphamide therapy. Mol Cancer Ther 8, 469-478.
Kwon, B.S., and Weissman, S.M. (1989). cDNA sequences of two inducible T-cell genes. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 1963-1967.
Lee, H., Park, H.J., Sohn, H.J., Kim, J.M., and Kim, S.J. (2011). Combinatorial therapy for liver metastatic colon cancer: dendritic cell vaccine and low-dose agonistic anti-4-1BB antibody co-stimulatory signal. J Surg Res 169, e43-50.
Levitsky, V., de Campos-Lima, P.O., Frisan, T., and Masucci, M.G. (1998). The clonal composition of a peptide-specific oligoclonal CTL repertoire selected in response to persistent EBV infection is stable over time. J Immunol 161, 594-601.
Li, F., and Ravetch, J.V. (2011). Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies. Science 333, 1030-1034.
Lin, W., Voskens, C.J., Zhang, X., Schindler, D.G., Wood, A., Burch, E., Wei, Y., Chen, L., Tian, G., Tamada, K., et al. (2008). Fc-dependent expression of CD137 on human NK cells: insights into "agonistic" effects of anti-CD137 monoclonal antibodies. Blood 112, 699-707.
Melero, I., Johnston, J.V., Shufford, W.W., Mittler, R.S., and Chen, L. (1998). NK1.1 cells express 4-1BB (CDw137) costimulatory molecule and are required for tumor immunity elicited by anti-4-1BB monoclonal antibodies. Cell Immunol 190, 167-172.
Melero, I., Shuford, W.W., Newby, S.A., Aruffo, A., Ledbetter, J.A., Hellstrom, K.E., Mittler, R.S., and Chen, L. (1997). Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 3, 682-685.
Merchant, A.M., Zhu, Z., Yuan, J.Q., Goddard, A., Adams, C.W., Presta, L.G., and Carter, P. (1998). An efficient route to human bispecific IgG. Nat Biotechnol 16, 677-681.
Morales-Kastresana, A., Sanmamed, M.F., Rodriguez, I., Palazon, A., Martinez-Forero, I., Labiano, S., Hervas-Stubbs, S., Sangro, B., Ochoa, C., Rouzaut, A., et al. (2013). Combined immunostimulatory monoclonal antibodies extend survival in an aggressive transgenic hepatocellular carcinoma mouse model. Clin Cancer Res 19, 6151-6162.
Mueller, D., Frey, K., Kontermann, R.E. (2008), A novel antibody-4-1BBl fusion protein for targeted costimulation in cancer immunotherapy, J. Immunother. 31, 714-722.
Murillo, O., Dubrot, J., Palazon, A., Arina, A., Azpilikueta, A., Alfaro, C., Solano, S., Ochoa, M.C., Berasain, C., Gabari, I., et al. (2009). In vivo depletion of DC impairs the anti-tumor effect of agonistic anti-CD137 mAb. Eur J Immunol 39, 2424-2436.
Narazaki, H., Zhu, Y., Luo, L., Zhu, G., and Chen, L. (2010). CD137 agonist antibody prevents cancer recurrence: contribution of CD137 on both hematopoietic and nonhematopoietic cells. Blood 115, 1941-1948.
Nishimoto, H., Lee, S.W., Hong, H., Potter, K.G., Maeda-Yamamoto, M., Kinoshita, T., Kawakami, Y., Mittler, R.S., Kwon, B.S., Ware, C.F., et al. (2005). Costimulation of mast cells by 4-1BB, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, with the high-affinity IgE receptor. Blood 106, 4241-4248.
Olofsson, P.S., Soderstrom, L.A., Wagsater, D., Sheikine, Y., Ocaya, P., Lang, F., Rabu, C., Chen, L., Rudling, M., Aukrust, P., et al. (2008). CD137 is expressed in human atherosclerosis and promotes development of plaque inflammation in hypercholesterolemic mice. Circulation 117, 1292-1301.
Palazon, A., Teijeira, A., Martinez-Forero, I., Hervas-Stubbs, S., Roncal, C., Penuelas, I., Dubrot, J., Morales-Kastresana, A., Perez-Gracia, J.L., Ochoa, M.C., et al. (2011). Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res 71, 801-811.
Schwarz, H., Valbracht, J., Tuckwell, J., von Kempis, J., and Lotz, M. (1995). ILA, the human 4-1BB homologue, is inducible in lymphoid and other cell lineages. Blood 85, 1043-1052.
Shao, Z., and Schwarz, H. (2011). CD137 ligand, a member of the tumor necrosis factor family, regulates immune responses via reverse signal transduction. J Leukoc Biol 89, 21-29.
Shi, W., and Siemann, D.W. (2006). Augmented antitumor effects of radiation therapy by 4-1BB antibody (BMS-469492) treatment. Anticancer Res 26, 3445-3453.
Simeone, E., and Ascierto, P.A. (2012). Immunomodulating antibodies in the treatment of metastatic melanoma: the experience with anti-CTLA-4, anti-CD137, and anti-PD1. J Immunotoxicol 9, 241-247.
Snell, L.M., Lin, G.H., McPherson, A.J., Moraes, T.J., and Watts, T.H. (2011). T-cell intrinsic effects of GITR and 4-1BB during viral infection and cancer immunotherapy. Immunol Rev 244, 197-217.
Stagg, J., Loi, S., Divisekera, U., Ngiow, S.F., Duret, H., Yagita, H., Teng, M.W., and Smyth, M.J. (2011). Anti-ErbB-2 mAb therapy requires type I and II interferons and synergizes with anti-PD-1 or anti-CD137 mAb therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 7142-7147.
Teng, M.W., Sharkey, J., McLaughlin, N.M., Exley, M.A., and Smyth, M.J. (2009). CD1d-based combination therapy eradicates established tumors in mice. J Immunol 183, 1911-1920.
von Kempis, J., Schwarz, H., and Lotz, M. (1997). Differentiation-dependent and stimulus-specific expression of ILA, the human 4-1BB-homologue, in cells of mesenchymal origin. Osteoarthritis Cartilage 5, 394-406.
Wei, H., Zhao, L., Li, W., Fan, K., Qian, W., Hou, S., Wang, H., Dai, M., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E., and Guo, Y. (2013). Combinatorial PD-1 blockade and CD137 activation has therapeutic efficacy in murine cancer models and synergizes with cisplatin. PLoS One 8, e84927.
Wilcox, R.A., Chapoval, A.I., Gorski, K.S., Otsuji, M., Shin, T., Flies, D.B., Tamada, K., Mittler, R.S., Tsuchiya, H., Pardoll, D.M., and Chen, L. (2002). Cutting edge: Expression of functional CD137 receptor by dendritic cells. J Immunol 168, 4262-4267.
Wilcox, R.A., Tamada, K., Flies, D.B., Zhu, G., Chapoval, A.I., Blazar, B.R., Kast, W.M., and Chen, L. (2004). Ligation of CD137 receptor prevents and reverses established anergy of CD8+ cytolytic T lymphocytes in vivo. Blood 103, 177-184.
Wyzgol. A., Muller. N., Fick, A., Munkel, S., Grigoleit, G.U., Pfizenmaier, K. and Wajant, H. (2009). Trimer Stabilization, Oligomerization, and Antibody-Mediated Cell Surface Immobilization Improve the Activity of Soluble Trimers of CD27L, CD40L, 41BBL, and Glucocorticoid-Induced TNF Receptor Ligand. J Immunol 183, 1851-1861
Zhang, N., Sadun, R.E., Arias, R.S., Flanagan, M.L., Sachsman, S.M., Nien, Y, Khawli, L.A., Hu, P., Epstein, A.L. (2007). Targeted and untargeted CD137L fusion proteins for the immunotherapy of experimental solid tumors. Clin. Cancer Res. 13, 2758-2767.
Zhang, X., Voskens, C.J., Sallin, M., Maniar, A., Montes, C.L., Zhang, Y., Lin, W., Li, G., Burch, E., Tan, M., et al. (2010). CD137 promotes proliferation and survival of human B cells. J Immunol 184, 787-795.

Claims (24)

  1. ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
    （ａ）テネイシンＣ（ＴｎＣ）と特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分と、
    （ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
    を含み、
    第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメインを含むことを特徴とするＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  2. 請求項１に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
    （ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
    （ｂ）ジスルフィド結合により互いに連結されている第１及び第２のポリペプチドと
    を含み、
    （ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１若しくはＣＬドメインを、及び第２のポリペプチドがＣＬ若しくはＣＨ１ドメインをそれぞれ含有し、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続され且つペプチドリンカーによりＣＨ１若しくはＣＬドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記第２のポリペプチドのＣＬ若しくはＣＨ１ドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含むこと、又は
    （ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、及び第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインをそれぞれ含有し、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続され且つペプチドリンカーによりＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記第２のポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメインを含むこと、又は
    （ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ－ＣＬ若しくはＶＬ－ＣＨ１ドメインを、及び第２のポリペプチドがＶＬ－ＣＨ１ドメイン若しくはＶＨ－ＣＬドメインをそれぞれ含有し、第２のポリペプチドが、第１のポリペプチドのＶＨ－ＣＬドメインと第２のポリペプチドのＶＬ－ＣＨ１ドメインとの間若しくは第１のポリペプチドのＶＬ－ＣＨ１ドメインと第２のポリペプチドのＶＨ－ＣＬドメインとの間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されており、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続され且つペプチドリンカーにより第１のポリペプチドのＶＨ－ＣＬドメイン若しくはＶＬ－ＣＨ１ドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって第２のポリペプチドのＶＬ－ＣＨ１ドメイン若しくはＶＨ－ＣＬドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含むこと
    を特徴とする、ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  3. ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが、ヒトＴ細胞活性化を共刺激する、請求項１又は２に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  4. ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが、４－１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される、請求項１から３の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  5. ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが４－１ＢＢＬである、請求項１から４の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  6. 請求項１から５の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子であって、
    （ａ）ＴｎＣと特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分、及び
    （ｂ）ＣＨ１又はＣＬドメインを含有する第１のポリペプチド及びＣＬ又はＣＨ１ドメインを含有する第２のポリペプチドであって、第２のポリペプチドがＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間のジスルフィド結合により第１のポリペプチドと連結されている、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド
    を含み、
    第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに接続され且つペプチドリンカーによりＣＨ１又はＣＬドメインに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記第２のポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインに接続されている前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つだけのエクトドメインを含むことを特徴とする、
    ＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  7. ＴｎＣと特異的に結合することができる部分が、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ及び足場抗原結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１から６の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  8. ＴｎＣと特異的に結合することができる１つ又は２つの部分を含む、請求項１から７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  9. ＴｎＣと特異的に結合することができる抗原結合部分が、ＴｎＣと特異的に結合することができるＦａｂ分子である、請求項１から８の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  10. ＴｎＣと特異的に結合することができる抗原結合部分が、（ｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、請求項１から９の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  11. ＴｎＣと特異的に結合することができる抗原結合部分が、（ｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、（ｉｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを含むＶＨドメイン、及び（ｉｖ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、（ｖ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、（ｖｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを含むＶＬドメインを含む、請求項１から９の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  12. Ｆｃドメインが、２３４及び２３５位（ＥＵ番号付け）、並びに／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項２から１１の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  13. ＴｎＣに特異的に結合することができるＦａｂ分子を含む第１の重鎖及びＴｎＣに特異的に結合することができるＦａｂ分子を含む第１の軽鎖；
    第２の重鎖及び第２の軽鎖；並びに
    （ｉ）Ｃ末端で第２のペプチドリンカーにより第２の重鎖に融合されている第１のペプチドであって、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含む第１のペプチド及びＣ末端で第３のペプチドリンカーにより第２の軽鎖に融合されている第２のペプチドであって、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含む第２のペプチド、又は、
    （ｉｉ）Ｃ末端で第２のペプチドリンカーにより第２の軽鎖に融合されている第１のペプチドであって、第１のペプチドリンカーによって互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含む第１のペプチド及びＣ末端で第３のペプチドリンカーにより第２の重鎖に融合されている第２のペプチドであって、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含む第２のペプチド
    を含む、
    請求項１から１２の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  14. 第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＬドメインに融合されている、請求項１から１３の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  15. 第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＬドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されている、請求項１から１３の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  16. 第１のペプチドリンカーにより互いに接続されているＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＶＨドメインに融合されており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメインを含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＶＬドメインに融合されている、請求項１から１３の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  17. 抗原結合部分が、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣと結合する、請求項１から１６の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  18. 抗原結合部分が、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのうちの少なくとも１つと２ｎＭ未満のＫＤ値で結合する、請求項１から１７の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子。
  19. 請求項１から１８の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子と少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤とを含む薬学的組成物。
  20. 医薬としての使用のための、請求項１から１８の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子、又は請求項１９に記載の薬学的組成物。
  21. がんの治療における使用のための、請求項１から１８の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子、又は請求項１９に記載の薬学的組成物。
  22. がんの治療のための医薬の製造のための、請求項１から１８の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子の使用。
  23. 個体における疾患を治療するための医薬であって、薬学的に許容される形態の請求項１から１８の何れか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンドトリマー含有抗原結合分子を含む組成物の治療有効量を含む医薬。
  24. 前記疾患ががんである、請求項２３に記載の医薬。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX391388B (es) 2014-11-14 2025-03-21 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de tnf.
EP3277305B1 (en) 2015-03-31 2021-07-21 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
MX2018003820A (es) 2015-10-02 2018-12-10 F Hoffmann ­La Roche Ag Anticuerpos biespecificos especificos para un receptor de tnf coestimulador.
ES2886569T3 (es) 2015-10-02 2021-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecíficos específicos para PD1 y TIM3
EP3243832A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
EP3559034B1 (en) 2016-12-20 2020-12-02 H. Hoffnabb-La Roche Ag Combination therapy of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and 4-1bb (cd137) agonists
MX2019007795A (es) 2017-01-03 2019-08-16 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno biespecificas que comprenden el clon 20h4.9 anti-4-1bb.
WO2018178055A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
JP7426825B2 (ja) 2017-04-03 2024-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｐｄ－１抗体と突然変異ｉｌ－２とまたはｉｌ－１５とのイムノコンジュゲート
CA3053358A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific antigen binding molecules capable of specific binding to cd40 and to fap
TWI690538B (zh) 2017-04-05 2020-04-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 特異性結合至pd1至lag3的雙特異性抗體
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
AR114284A1 (es) * 2018-04-13 2020-08-12 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno dirigidas a her2 que comprenden 4-1bbl
MX2021003548A (es) 2018-10-01 2021-05-27 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno biespecificas que comprenden el clon 212 anti-fap.
EP3898682A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
JP7600656B2 (ja) * 2019-12-16 2024-12-17 東ソー株式会社 抗体分離のための溶液
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
BR112022025632A2 (pt) * 2020-06-23 2023-01-17 Kadmon Corp Llc Anticorpos anti-pd-1 e proteínas de fusão
AU2022280269A1 (en) * 2021-05-27 2023-11-30 Beijing Anxinhuaide Biotech. Co., Ltd A super-trail molecule comprising two trail trimers

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009000538A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Apogenix Gmbh Trimeric death ligands with enhanced activity (tenascin)
WO2012130831A1 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
JP2013543373A (ja) 2010-08-13 2013-12-05 ロシュ グリクアート アーゲー 抗テネイシンｃａ２抗体及び使用の方法

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4186567A (en) 1977-04-18 1980-02-05 Hitachi Metals, Ltd. Ornament utilizing rare earth-cobalt magnet
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
DE69334351D1 (de) 1992-02-06 2011-05-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches Bindeprotein für Tumormarker
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
IT1307864B1 (it) 1999-04-20 2001-11-19 Istituto Naz Per La Ricerca Su Metodo diagnostico per il riconoscimento di neoplasie umane attraversola determinazione dell'isoforma ctn-c della tn-c, frammenti di
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
EP1332209B1 (en) 2000-09-08 2009-11-11 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
WO2003011878A2 (en) 2001-08-03 2003-02-13 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
ES2319426T3 (es) 2003-07-04 2009-05-07 Affibody Ab Polipeptidos que presentan afinidad de union por her-2.
AU2003275958A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
HUE042914T2 (hu) 2003-11-05 2019-07-29 Roche Glycart Ag CD20 antitestek fokozott fc receptorkötõ affinitással és effektorfunkcióval
AU2004296376B2 (en) 2003-12-05 2010-03-04 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
EP2374817B1 (en) 2004-04-13 2017-09-06 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
BRPI0516284A (pt) 2004-09-23 2008-09-02 Genentech Inc anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
DE602005014665D1 (de) 2004-11-09 2009-07-09 Philogen Spa Antikörper gegen tenascin-c
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
AU2009204501B2 (en) 2008-01-07 2015-02-12 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
WO2009089998A1 (en) 2008-01-15 2009-07-23 Philochem Ag Binding members for tenascin-c domain a2
NZ703653A (en) 2010-08-13 2016-09-30 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
MX391388B (es) * 2014-11-14 2025-03-21 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de tnf.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009000538A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Apogenix Gmbh Trimeric death ligands with enhanced activity (tenascin)
JP2013543373A (ja) 2010-08-13 2013-12-05 ロシュ グリクアート アーゲー 抗テネイシンｃａ２抗体及び使用の方法
WO2012130831A1 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Roche Glycart Ag Antibody fc variants

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