CN109562144A

CN109562144A - 胰高血糖素类似物及其使用方法

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Publication number: CN109562144A
Application number: CN201780049092.4A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·H·B·斯托威尔; 米哈伊尔·普拉姆; 彭彦宇
Original assignee: Amid Biological Co Ltd
Current assignee: Amid Biological Co Ltd; AmideBio LLC
Priority date: 2016-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2019-04-02
Also published as: EP3468569A4; EP3888667B1; GB201900228D0; WO2017214543A8; US11179444B2; US20190298805A1; WO2017214543A1; EP3888667A1; EP3468569A1; GB2566228A

Abstract

本发明的主题涉及化学和热力学稳定的胰高血糖素类似物，其对脱酰胺作用和原纤维形成具有抗性。本发明进一步公开了用于胰高血糖素类似物的重组表达和纯化的改进方法。

Description

胰高血糖素类似物及其使用方法

交叉引用

本申请要求于2016年6月9日提交的第62/348,101号美国临时专利申请的权益，该临时申请的公开内容通过引用以其全文并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用以其全文并入本文。所述ASCII副本创建于2017年5月26日，被命名为39538-711_601_SL.txt，并且大小为11,052个字节。

背景技术

先天性高胰岛素血症(CH)是一种儿童和新生儿中的罕见病况，其特征在于持续性低血糖症，在美国活产婴儿中的发病率约为1/30,000。患有CH的新生儿中有超过60％在第一个月内发生低血糖症，而其余的将在第一年内或之后不久得以诊断。在不同类型的CH中，对二氮嗪无响应的严重持续性CH需要使用胰高血糖素和/或葡萄糖联合胰高血糖素来治疗。此外，在美国每年有超过20,000例低血糖急诊并且有超过2,000人死亡，其中许多是由于未能迅速治疗I型糖尿病患者的低血糖症所致，并且可以通过施用胰高血糖素来预防。

发明内容

本公开内容涉及用于治疗低血糖症的组合物及其使用方法。本文描述了在生理pH下的溶液中稳定的胰高血糖素类似物的组合物。在一些实施方案中，组合物包含胰高血糖素类似物，其中所述胰高血糖素类似物由天然存在的氨基酸组成；并且所述胰高血糖素类似物在pH为pH 6至pH 8的溶液中稳定。在多个方面，所述胰高血糖素类似物在pH为约7.4的溶液中稳定。

在一些方面，在溶液中稳定包括对原纤维形成具有抗性、对化学降解具有抗性或其组合。在其他方面，对原纤维形成具有抗性包括与天然胰高血糖素相比具有降低的计算聚集评分的聚集并且在溶液中至少7天的时间段后具有降低的实验聚集。在进一步的方面，所述胰高血糖素类似物在与天然胰高血糖素中的易聚集区域相对应的区域中包含突变。在更进一步的方面，天然胰高血糖素的氨基酸残基Phe6、Tyr10或Tyr13或其组合被另一氨基酸残基替代。

在多个方面，对化学降解具有抗性包括是热力学稳定的、化学稳定的或其组合。在一些方面，当至少80％的所述胰高血糖素类似物在溶液中至少7天后未降解或未聚集时，所述胰高血糖素类似物是热力学稳定的。在其他方面，如果所述胰高血糖素类似物的脱酰胺作用在至少7天的时间段后相对于天然胰高血糖素减少，则所述胰高血糖素类似物对化学降解具有抗性。在一些方面，所述胰高血糖素类似物在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变。在进一步的方面，在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变的所述胰高血糖素类似物的计算聚集评分低于天然胰高血糖素。在更进一步的方面，在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变的所述胰高血糖素类似物产生α-螺旋稳定化。

在一些方面，所述胰高血糖素类似物与SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:19中的任一个或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。在其他方面，所述胰高血糖素类似物包含SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:19中的任一个。在进一步的方面，所述胰高血糖素类似物是人胰高血糖素类似物。

在多个方面，所述胰高血糖素类似物的纯度为至少90％、95％、97％或99％。

在其他方面，所述胰高血糖素类似物的C-末端包含天然胰高血糖素C-末端的稳定化α-螺旋结构。在一些方面，所述胰高血糖素类似物包含相对于天然胰高血糖素的Phe22、Val23、Trp25、Leu26、Met27、Asp15或其组合。在一些方面，所述胰高血糖素类似物在相对于天然胰高血糖素的Phe22、Val23、Trp25、Leu26、Met27、Asp15或其组合处包含突变。在其他方面，所述胰高血糖素类似物具有天然胰高血糖素的胰高血糖素受体激动剂活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在一些方面，当在4℃下储存时，所述胰高血糖素类似物保持至少95％的效力达至少2年。

在进一步的方面，当在40℃下储存时，所述胰高血糖素类似物保持至少95％的效力达至少3个月。

在多个实施方案中，药物组合物包含任何前述方面的组合物和药学上可接受的稀释剂。在进一步的方面，所述药物组合物被配制用于皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内或经皮施用。

在一些实施方案中，多核苷酸包含编码根据任一前述组合物的胰高血糖素类似物的核酸序列。

在其他实施方案中，载体包含编码表达标记物的第一核苷酸序列；编码裂解标记物的第二核苷酸序列；以及编码根据任一前述组合物的胰高血糖素类似物的第三核苷酸序列，其中所述第一、第二和第三核苷酸序列以可操作的组合排列；其中所述表达标记物包含与SEQ ID NO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFPSDKPHHKKHHKKHHSSGSLE)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；并且其中所述裂解标记物包含Trp(W)氨基酸。在一些方面，所述表达标记物进一步包括亲和标记物。在其他方面，所述亲和标记物包含至少六个具有带电荷侧链的氨基酸。

在一些实施方案中，所述载体进一步包含编码包涵体指引肽的核苷酸序列。在多个方面，所述包涵体指引肽选自：类固醇异构酶(ketosteroid isomerase)、类固醇异构酶的包涵体指引功能片段、类固醇异构酶的包涵体指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵体指引功能片段，和BRCA2的包涵体指引功能同系物。

在其他实施方案中，所述载体进一步包含在细菌细胞或酵母细胞中有活性的核苷酸启动子序列。

在多个实施方案中，用于产生胰高血糖素类似物的方法包括在遗传修饰的细胞中表达异源融合肽，所述异源融合肽包含表达标记物、裂解标记物和任一前述组合物的胰高血糖素类似物，其中所述表达标记物包含与SEQ ID NO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFPSDKPHHKKHHKKHHSSGSLE)或其片段具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述裂解标记物包含Trp(W)氨基酸；以及裂解所述异源融合肽以从所述异源融合肽释放所述胰高血糖素类似物，从而产生所述胰高血糖素类似物。

在一些方面，所述胰高血糖素类似物的纯度为至少95％。在其他方面，所述胰高血糖素类似物的纯度为至少99％。在多个方面，所述表达标记物进一步包括亲和标记物。在进一步的方面，所述亲和标记物包含至少六个具有带电荷侧链的氨基酸。

在其他实施方案中，所述方法进一步包括通过所述亲和标记物将所述异源融合肽与亲和材料结合。在一些方面，在将所述异源融合肽与所述亲和材料结合之后，所述方法进一步包括洗涤所述亲和材料以去除未结合的材料。在多个实施方案中，当所述异源融合肽通过所述亲和标记物与所述亲和材料结合时，所述方法的第二部分中的裂解所述异源融合肽发生。在其他方面，在将所述异源融合肽与所述亲和材料结合之后，所述方法进一步包括使所述异源融合肽经受足以折叠目标肽的条件。

在其他方面，所述异源融合肽进一步包含包涵体指引肽。在一些方面，所述包涵体指引肽选自：类固醇异构酶、类固醇异构酶的包涵体指引功能片段、类固醇异构酶的包涵体指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵体指引功能片段和BRCA2的包涵体指引功能同系物。

在其他方面，在裂解所述异源融合肽之前，所述方法进一步包括从所述遗传修饰的细胞取出含有所述融合肽的包涵体，以及溶解所述包涵体中的所述融合肽。在一些方面，所述方法的第二部分的裂解使用选自NBS、NCS和Pd(H₂O)₄的试剂进行。

在其他方面，所述异源融合肽在表达后从所述遗传修饰的细胞中分泌。

在多个实施方案中，所述方法进一步包括在所述异源融合肽表达后裂解所述遗传修饰的细胞。在一些方面，所述遗传修饰的细胞是细菌细胞。在其他方面，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。在进一步的方面，所述遗传修饰的细胞是酵母细胞。在其他方面，所述异源融合蛋白进一步包含用于所述酵母细胞的分泌肽。

在其他实施方案中，治疗有需要的患者的低血糖症的方法包括向患者施用前述实施方案中任一项的组合物或前述实施方案中任一项的药物组合物。在一些方面，所述患者患有糖尿病。在其他方面，所述糖尿病是I型糖尿病。在进一步的方面，所述糖尿病是II型糖尿病。在多个方面，所述患者患有先天性高胰岛素血症。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过注射、贴剂或泵施用所述胰高血糖素类似物。在其他方面，所述注射是皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内或经皮注射。在进一步的方面，所述泵是闭环泵系统。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中详细阐述。通过参考以下阐述利用本发明原理的说明性实施方案的详述和附图，将获得对本发明的特征及优势的更好的理解，在附图中：

图1示出了在蛋白质(Kir6.2、SUR1、HNF4a、UCP2、HADH、GDH、MCT 1和GCK)中的至少7个基因突变，其最终导致胰岛素分泌的上调。用于调节Kir6.2通道的二氮嗪标准治疗对于具有Kir6.2突变的患者可能无效，但该患者可以用胰高血糖素治疗。

图2A示出了胰高血糖素序列，其中计算的原纤维形成序列以深灰色突出显示而Gln3和Asn28以浅灰色突出显示。图中公开了SEQ ID NO:20。

图2B示出了胰高血糖素(点线)和两种不同类似物(短划线和实线)的经计算的促淀粉状变性区域。

图2C示出了与天然胰高血糖素相比，一小组在AmideBio产生的预测的非促淀粉状变性胰高血糖素类似物在40℃下于PBS中的HPLC溶液稳定性测试。

图3示出了在计算的胰高血糖素促淀粉状变性区域内的置换的稀疏矩阵筛选。每种不同类型的方框代表单个胰高血糖素类似物。排除诸如Asn和Cys等氨基酸，因为其分别有脱酰胺作用和二硫键形成的可能。Gln和Met较少受到化学降解或修饰，即，氧化。

图4A示出了低成本肽生产平台的示意图，该平台结合了用于复杂或难以制备的肽的快速SAR的重组和化学方法。该过程实现了针对细菌或酵母表达而优化的表达载体文库与柱上化学裂解过程相结合，提供了高度正交的平台，使得能够快速高纯度地生产用于药物发现的多种肽和蛋白质。

图4B示出了使用专有化学裂解获得高纯度(>99％)肽的柱上纯化方法的示意图。

图4C示出了纯化过程后肽的HPLC色谱图，其表明用该方法获得了高纯度。

图4D示出了合成的淀粉样肽(底部)与使用AmideBio技术平台制备的材料(顶部)的聚集速率比较。如使用Th-T荧光法测量的，合成材料中的杂质显著改变聚集速率。

图5示出了胰岛素片段的LC-MS/MS原始光谱数据和峰分配(上图)，其表明在40℃温育30天后检测到肽片段中的脱酰胺作用，并且质量分配(下图)表明Q4或N3脱酰胺作用的质量相等。图中以出现的顺序分别公开了SEQ ID NO:30、30和30。

图6A：示出了胰高血糖素受体的3D结构(左)(Siu等人，2013)，其中胰高血糖素被模拟到该受体结构中，并且胰高血糖素的N-末端主要与7TM完整膜结构域相互作用，且C-末端与该受体的胞外结构域具有微小的相互作用。

图6B示出了将天然胰高血糖素活性与AmideBio类似物GLUC-22和GLUC-45进行比较的FLIPR试验。计算的类似物EC50是天然胰高血糖素的5倍。

具体实施方式

本文公开了胰高血糖素类似物的组合物及其使用方法。在多个实施方案中，胰高血糖素类似物可以在生理pH下的溶液中稳定。在一些实施方案中，生理pH为约pH 6.8至pH8。在其他实施方案中，胰高血糖素类似物可以在约pH 7.4的生理pH下的溶液中稳定。在多个实施方案中，胰高血糖素类似物在溶液中的稳定性可通过胰高血糖素类似物对原纤维形成的抗性、对化学降解的抗性或其组合来指示。胰高血糖素类似物可在残基22与残基27之间的区域中包含至少一个突变。在多个实施方案中，胰高血糖素类似物的纯度可以是至少90％、95％或99％。在多个实施方案中，胰高血糖素类似物可具有天然胰高血糖素的胰高血糖素受体激动剂活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在多个实施方案中，胰高血糖素类似物可以在具有药学上可接受的稀释剂的药物组合物中。可以配制药物组合物用于静脉内注射。

本文公开了产生能够纯化并裂解成胰高血糖素类似物的融合肽的方法，以及根据该方法产生的胰高血糖素类似物。在多个实施方案中，该方法包括诱导、包涵体分离、亲和柱纯化和化学裂解。在多个实施方案中，本文所述的方法和组合物利用表达载体来制备本文所述的胰高血糖素类似物。在一些方面，通过将使用遗传可塑性微生物如大肠杆菌细胞来合成胰高血糖素类似物的分子表达技术与表达后分离和修饰相组合，能够快速而有效地合成胰高血糖素类似物。在多个实施方案中，本文所述的方法和组合物可产生融合肽，该融合肽可通过亲和分离纯化并用化学试剂裂解以释放目标肽，包括胰高血糖素类似物。

在多个实施方案中，本文所述的方法和组合物涉及一种载体，其编码包涵体靶向序列，有助于纯化的亲和标记物，以及有助于选择性化学裂解的特定的氨基酸序列。个别地，包涵体靶向氨基酸序列可包含具有或不具有氨基酸置换的类固醇异构酶蛋白质的约1至约125个氨基酸或油质蛋白的残基，优选至多残基1-52的残基。这样的氨基酸置换可改善色谱纯化。亲和标记物序列可包含聚组氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸或聚谷氨酸。在一个实施方案中，所述载体还包含位于亲和标记物序列的5’端的表达启动子。在一个实施方案中，本文所述的方法和组合物涉及一种编码特定序列的载体，该序列有助于选择性化学裂解以在纯化后产生感兴趣的肽。这样的可化学裂解的氨基酸序列包括Trp、His-Met或Pro-Met。

在多个实施方案中，根据本文所述的方法和组合物的过程以高纯度提供了高产率的胰高血糖素类似物。与天然胰高血糖素相比，这些胰高血糖素类似物在溶液中还可以更稳定。在多个实施方案中，根据本文所述的方法和组合物产生的胰高血糖素类似物可以是研发级或临床级的。

肽和蛋白质激素可以参与内分泌系统。肽激素可以通过细胞表面和细胞内受体与不同细胞类型相互作用以调节各方面的生理机能，包括体内稳态(例如，葡萄糖稳态和钙稳态)和免疫系统调节。天然肽激素可以在各种器官和组织中产生，包括垂体(例如，催乳素、促肾上腺皮质激素和生长激素)；心脏(例如，心房利钠肽或心房利钠因子)；胰腺(例如，胰高血糖素、胰岛素和促生长素抑制素)；胃肠道(例如，胆囊收缩素、胃泌素和胰高血糖素样肽-1)；甲状旁腺(例如，甲状旁腺激素)；和脂肪组织储存(例如，瘦蛋白)。一些肽激素起到神经递质(例如，神经肽)的作用。肽激素与受体(例如，细胞表面受体或细胞内受体)的结合可以触发信号转导，从而导致细胞应答。

肽激素的无规律释放或错误调节可导致疾病病况，包括但不限于糖尿病、先天性高胰岛素血症(CH)、甲状腺疾病和肥胖症。在产生和/或释放的肽激素的量不足的一些情况下，可以施用合成或重组产生的肽激素以减轻与内源性肽激素的量不足相关的症状。

例如，血糖水平可主要由葡萄糖调节激素如胰岛素、胰高血糖素、胰淀素(amylin)和肠促胰岛素(例如，胰高血糖素样肽-1，GLP-1)来调节。葡萄糖调节激素可以起到将循环葡萄糖浓度维持在所需范围内的作用。低血糖水平可以刺激胰腺α细胞释放胰高血糖素。肝细胞响应于胰高血糖素可以在被称为糖酵解的过程中将糖原转化为葡萄糖。葡萄糖可以释放到血流中，从而提高血糖水平。然而，当无论是由于糖原转化还是食物消化而导致血糖水平升高时，胰岛素都可以从胰腺中释放。胰岛素可刺激肝细胞在被称为糖原生成的过程中将葡萄糖转化为糖原，从而降低血糖水平。胰高血糖素和胰岛素一起可以在反馈系统中起作用以将血糖水平维持在稳定水平。胰淀素，一种从胰腺与胰岛素共同分泌的肽，可通过减缓胃排空和抑制消化道分泌而在血糖调节中起作用。肠促胰岛素可以包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，是一组可以刺激血糖水平降低的代谢激素。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)可以响应于食物主要从肠L-细胞分泌，并通过在多种组织和细胞类型中发挥的作用来调节营养稳态。

任何上述肽激素的无规律释放或错误调节均可导致各种医学病况，包括高血糖症和低血糖症。这些激素水平的长期无规律可导致病况，包括1型糖尿病，也称为I型糖尿病。在一些情况下，可以施用葡萄糖调节肽如合成或重组产生的葡萄糖调节肽来治疗与葡萄糖调节激素的错误调节相关的病况。例如，可以施用胰岛素肽、胰高血糖素肽和/或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)肽、其类似物或片段来治疗与肽激素的无规律释放或错误调节相关的病况。

包括诸如胰高血糖素或其类似物等葡萄糖调节激素在内的肽激素可使用本文所述的方法产生并作为肽疗法施用。此外，随着新型溶液稳定的胰高血糖素的出现，开发人工胰腺的目标可以极大进展。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。

如本文所用，术语“类似物”可以指在结构上和/或功能上与天然蛋白质类似的蛋白质，例如，该天然蛋白质是诸如天然葡萄糖调节肽(例如，胰高血糖素)的蛋白质。类似物可以在结构上和/或功能上与天然蛋白质类似，但在其他多个方面，如蛋白质大小(例如，氨基酸数目、分子量、直径等)、氨基酸序列、氨基酸组成和三级结构上是不同的。

如本文所用，术语“肽”可以指包含通过肽键连接的氨基酸的任何聚合物。术语“肽”可包括使用核糖体组装的聚合物以及通过酶组装的聚合物(即，非核糖体肽)和合成组装的聚合物。在多个实施方案中，术语“肽”可以被认为与“蛋白质”或“多肽”同义。在多个实施方案中，术语“肽”可以限于具有大于50个氨基酸的聚合物，或者备选地具有50个或更少的氨基酸。在多个实施方案中，术语“肽”可仅包括作为聚合物的单体单元的氨基酸，而在多个实施方案中，术语“肽”可包括其他组分和/或对氨基酸骨架的修饰。例如，在多个实施方案中，术语“肽”可以应用于氨基酸的核心聚合物以及核心聚合物的衍生物，如具有修饰聚乙二醇基团的核心聚合物或在氨基酸链的氨基或羧基末端具有酰胺基团的核心聚合物。该术语可应用于天然存在的氨基酸聚合物以及包含一个或多个修饰的氨基酸的氨基酸聚合物。在一些情况下，该聚合物可被非氨基酸中断。该术语可包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质和具有或不具有二级和/或三级结构的蛋白质。该术语还可以包括经修饰的氨基酸聚合物，例如，该修饰是通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、氧化和任何其他操作，如与标记组分缀合。

如本文所用，术语“氨基酸”通常可以指天然和非天然氨基酸，包括但不限于修饰的氨基酸和氨基酸类似物。修饰的氨基酸可包括天然氨基酸和非天然氨基酸，这些氨基酸经化学修饰从而包括非天然存在于该氨基酸上的基团或化学部分。氨基酸类似物可以指氨基酸衍生物。术语“氨基酸”可包括D-氨基酸和L-氨基酸。可以将肽作为治疗分子(例如，肽治疗剂)研究，所述肽包括1)合成和重组产生的肽，其可以模拟天然存在的肽的功能和/或性质；和2)工程化肽，其与天然存在的肽相比可具有替代的生物学特性(例如，细胞受体的拮抗作用或激动作用)。肽治疗剂可包括例如为了治疗稳态失衡而施用的合成肽激素，如为了治疗血糖稳态失衡而施用的葡萄糖调节激素。

如本文所用，“基本上由……组成”可排除本文未列出的将会改变本文所述方法和组合物的操作的那些特征。然而，词语“基本上由……组成”的使用可以不排除不改变所需组分的操作的特征。

如本文所用，术语“患者”可包括动物界的成员，包括但不限于人。如本文所用，术语“哺乳动物宿主”可包括动物界的成员，包括但不限于人。术语“哺乳动物”是本领域已知的，并且示例性哺乳动物可包括人、灵长类动物、牛、猪、犬、猫和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。

如本文所用，术语“糖尿病”可以是激素紊乱，术语“I型糖尿病”可以指胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，而术语“II型糖尿病”可以指非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。

如本文所用，“启动子”可以是任何有活性的DNA序列，并控制真核细胞中的转录。启动子可以在哺乳动物细胞中有活性。启动子可以组成型表达或是诱导型的。启动子可以被外部刺激诱导。启动子可以被激素或代谢物诱导。启动子受葡萄糖调节。该启动子可以是丙酮酸激酶基因启动子。例如，该启动子可以是肝细胞特异性L型丙酮酸激酶基因启动子。

如本文所用，天然L-对映体氨基酸的缩写是常规的并且如下所示：丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天冬氨酸(D，Asp)；半胱氨酸(C，Cys)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gln)；甘氨酸(G，Gly)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，Ile)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；甲硫氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；缬氨酸(V，Val)。这些氨基酸也可称为天然存在的氨基酸。

胰高血糖素类似物

胰高血糖素可有效治疗涉及低胰岛素症或低血糖症的病况。例如，胰高血糖素对于严重形式的CH的短期和长期治疗都是有效的。然而，胰高血糖素在溶液中的不稳定性可能由于输液管堵塞而产生储存问题、施用问题和潜在并发症。

胰高血糖素在生理pH下的溶液中可能不稳定。胰高血糖素在溶液中的不稳定性可归因于热力学性质和化学性质；然而，胰高血糖素不稳定性的一个另外的方面可能是原纤维形成的倾向，这可能显著限制储存和使用。原纤维形成可以是经历不可逆的非共价聚合过程的倾向，该过程可以导致胰高血糖素分子聚集并形成不溶的线性原纤维。胰高血糖素中可称为促淀粉状变性区域或易聚集区域的区域可能与胰高血糖素的原纤维形成和聚集相关。胰高血糖素可以形成许多不同形态类型的原纤维，其可能取决于pH、温度、浓度和离子强度条件。

原纤维形成过程可以是多步骤的并且可以包含许多中间低聚物，它们从天然单体构象逐渐汇聚成类似于淀粉状蛋白的β折叠结构原纤维。此外，纤维前体(prefibrillar)低聚物可以重新排列成原纤维。

这种原纤维形成过程可能是胰高血糖素不能被配制成稳定溶液用于药物应用的主要原因之一，可能限制了胰高血糖素治疗多种病况的用途，因为原纤维形成过程可能导致药理学效力的逐渐衰减，导致剂量问题，以及由于输液管堵塞引起的施用问题。

胰高血糖素的长期热力学稳定性和化学稳定性可受pH和温度的影响。此外，还有许多能影响长期稳定性的次要因素。这些次要因素包括晶体结构的类型，抑菌剂(苯酚、间甲酚)、缓冲试剂(磷酸盐、TRIS)、等渗添加剂(葡萄糖、甘油、NaCl)以及添加用于延长胰高血糖素作用时间曲线的物质(硫酸鱼精蛋白和Zn⁺⁺)的存在。胰高血糖素稳定性的一个方面可以是胰高血糖素形成原纤维的趋势。胰高血糖素的原纤维形成可归因于N-和C-末端的疏水区域。这些疏水区域也可以称为天然胰高血糖素的易聚集区域。例如，“疏水性贴片”可包含残基Phe6、Tyr10、Tyr13或其组合(Unson,C.G.,Biopolymers,66(4):218-35(2002)；Sondergaard Pedersen,J.等人,Biochemistry45(48):14503-12(2006))。疏水性贴剂可以指一簇相邻的非极性原子或氨基酸残基，其可以在给定的肽表面上并且是溶剂可接触的。与天然胰高血糖素的原纤维形成相比，疏水性贴片中的突变可赋予对原纤维形成的抗性。与天然胰高血糖素的原纤维形成相比，易聚集区域中的突变可赋予对原纤维形成的抗性。在一些方面，与天然胰高血糖素的原纤维形成相比，Phe6、Tyr10、Tyr13或其组合中的突变可赋予对胰高血糖素类似物原纤维形成的抗性。胰高血糖素的化学稳定性可至少部分地取决于胰高血糖素的化学降解，该化学降解与胰高血糖素中的Asn和Gln侧链的脱酰胺作用有关。脱酰胺作用可能表明化学不稳定。

相反，如本文所述的胰高血糖素类似物可以在生理pH值下的溶液中稳定。胰高血糖素类似物可以在约pH 6至pH 8的生理pH下的溶液中稳定。胰高血糖素类似物可以在约pH7.4的生理pH下的溶液中稳定。胰高血糖素类似物可包括相对于天然胰高血糖素具有突变的一组结构相关的蛋白质。这些突变可以是置换、插入、缺失或其组合。可以用天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸进行置换或插入。例如，天然胰高血糖素中的残基可以突变成在胰高血糖素类似物中的Ala。天然胰高血糖素可具有序列SEQ ID NO:20(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT)。

可以基于稀疏矩阵确定更稳定的胰高血糖素类似物，该稀疏矩阵包括天然胰高血糖素中的两种类型的氨基酸置换。第一种类型的置换可以最小化原纤维形成的主要模式，而第二种类型的置换可以减少化学降解的主要模式，该化学降解主要模式可以是Asn和Gln侧链的脱酰胺作用。除Cys和Asn外的任何氨基酸残基均可用于进行置换，并且可以在天然胰高血糖素的残基22至27的6(r)个位置以随机顺序置换。可以使用以下两个初始规则确定初始矩阵：排除含有Asn、Gln、Cys或Met的序列；以及排除计算的聚集倾向大于1.0的序列，参见图2B。聚集倾向可以使用AGGRESCAN计算，该AGGRESCAN是基于源自体内实验的天然氨基酸聚集倾向，以及较短的特定序列延伸段调节蛋白质聚集这一假设(参见Conchillo-Sole,O.等人,BMC Bioinformatics,8:65(2007))。如果胰高血糖素类似物与天然胰高血糖素相比具有降低的计算聚集评分并且在溶液中一段时间后具有降低的实验聚集，则可以确定该胰高血糖素类似物具有更大的对原纤维形成的抗性。例如，计时器周期可以是至少7天。还可以通过胰高血糖素类似物在与天然胰高血糖素的易聚集区域相对应的区域中的突变来降低聚集倾向。然后，随后一组序列可以在第一轴上从低到高等电点且在另一轴上从低到高聚集倾向成矩阵排列。可以使用搅拌硫代黄素-T(Th-T)荧光试验(用于测试对原纤维形成/聚集的抗性)结合定量HPLC分析(用于检测热力学稳定性)，通过将为提高对原纤维形成的抗性而进行的置换与为提高对化学降解的抗性而进行的置换进行平行比较，来进一步优化这些具有改善的原纤维形成抗性的胰高血糖素类似物。可以通过在至少7至180天的时间段后回收至少80％的胰高血糖素类似物来表明热力学稳定性。例如，如果至少80％的胰高血糖素类似物在溶液中一段时间(如至少7天的时间段)后未降解或未聚集，则该胰高血糖素类似物可以是热力学稳定的。然后可以使用LC-MS/MS检测具有热力学稳定性的胰高血糖素类似物的化学稳定性，这可以测定胰高血糖素类似物的脱酰胺作用。这可以在至少7至180天的时间段后测量。低脱酰胺作用可表明对化学降解的抗性。低脱酰胺作用可以在相同的时间段内与天然胰高血糖素进行比较。例如，如果在溶液中一段时间(如至少7天的时间段)后，胰高血糖素类似物的脱酰胺作用相对于天然胰高血糖素降低，则胰高血糖素类似物可以是化学稳定的。最后，可以使用FLIPR试验针对胰高血糖素受体激动剂活性筛选显示出热力学稳定性和化学稳定性的类似物。在一个实施方案中，胰高血糖素类似物可具有天然胰高血糖素的胰高血糖素受体激动剂活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。胰高血糖素C-末端的α-螺旋结构可能与胰高血糖素与胰高血糖素受体结合的能力有关。用于维持α-螺旋结构并因此也维持胰高血糖素类似物与胰高血糖素受体的结合亲和力的重要残基可以是Phe22、Val23、Trp25、Leu26、Met27、Asp15或其组合。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物的C-末端维持天然胰高血糖素C-末端的稳定化α-螺旋结构。可通过用具有较高的形成α-螺旋倾向的其他氨基酸置换具有较差的形成α-螺旋倾向的某些氨基酸来稳定α-螺旋。例如，用丙氨酸氨基酸置换脯氨酸氨基酸。具有较差的形成α-螺旋倾向的氨基酸的其他非限制性实例可以是甘氨酸。相反，具有较高的形成α-螺旋倾向的氨基酸的其他非限制性实例可以是甲硫氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸。在一些实施方案中，在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变的胰高血糖素类似物产生α-螺旋稳定化。

表1.示例性胰高血糖素类似物序列。

SEQ ID NO:	序列
		1	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQELANT
2	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQKLANT
		3	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFAQELANT
4	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFAQKLANT
		5	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQDLANT
6	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQHLANT
		7	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQDLADT
8	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQDLAET
		9	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQKLENT
10	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVEKLENT
		11	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVEKLEST
12	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQKLLNT
		13	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQKLLST
14	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVEKLLST
		15	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVEKLEKT
16	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVEKLANT
		17	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVEKLAST
18	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVAKLANT
		19	HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVAKLAKT

在一个实施方案中，胰高血糖素类似物变体可以是SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:19中的任一个。在一些实施方案中，胰高血糖素类似物变体可以与SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:19中的任一个或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。

在一个实施方案中，具有示例性稳定性的胰高血糖素类似物可包括经计算被确定为具有小于1的计算聚集倾向的那些胰高血糖素类似物。在其他实施方案中，对原纤维形成的抗性可包括与天然胰高血糖素相比具有降低的计算聚集评分并且在溶液中至少7天的时间段后具有降低的实验聚集。在另一个实施方案中，具有减少的原纤维形成的胰高血糖素类似物在至少7天、至少14天、至少、至少21天、至少42天、至少63天、至少91天或至少180天的时间段后，可具有与天然胰高血糖素聚集相比减少的聚集。在一些实施方案中，当在4℃下储存时，胰高血糖素类似物保持至少95％的效力达至少两年。在其他实施方案中，胰高血糖素类似物在40℃下保持至少95％的效力达至少3个月。

相比于已知的肽产生方法，根据本文所述的方法和组合物产生的胰高血糖素类似物可以具有不同水平的残余组分。例如，与根据常规重组过程产生的具有相同序列的胰高血糖素类似物相比，可以预期根据本文所述的方法和组合物产生的胰高血糖素类似物在初始纯化后具有更少的残留细胞污染物。或者，与通过常规合成过程产生的具有相同序列的胰高血糖素类似物相比，可以预期根据本文所述的方法和组合物产生的胰高血糖素类似物在初始纯化后具有更少的残留化学污染物。如本文所述的经纯化的胰高血糖素类似物的纯度可以是至少90％、95％或99％。

载体

本文还提供了可以产生胰高血糖素类似物的载体。载体可以编码表达标记物、裂解标记物和/或胰高血糖素类似物序列。表达标记物可包含与SEQ ID NO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFPSDKPHHKKHHKKHHSSGSLE)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。表达标记物可包含与SEQ ID NO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFPSDKPHHKKHHKKHHSSGSLE)具有至少85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。表达标记物可进一步包括亲和标记物，如用于离子交换亲和色谱法或捕获的带电荷标记物。亲和标记物序列可包含聚组氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸或其组合。裂解标记物可促进选择性化学裂解以在纯化后产生感兴趣的肽。这种可化学裂解的氨基酸序列可包含Trp、His-Met和Pro-Met。载体可以进一步包含可编码包涵体指引肽的核苷酸序列。不同地，包涵体靶向氨基酸序列可包含衍生自类固醇异构酶、类固醇异构酶的包涵体指引功能片段、类固醇异构酶的包涵体指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵体指引功能片段和BRCA2的包涵体指引功能同系物的肽序列。在一些实施方案中，载体进一步包含位于亲和标记物序列5’末端的表达启动子。

一种使用载体产生肽的方法可包括以下步骤：a)用限制性内切酶切割载体以产生酶切载体；b)将切割位点连接至一个或多个核酸，其中该核酸可编码胰高血糖素类似物，在每一末端具有至少一个碱基突出端，该碱基突出端被配置并排列以便与酶切载体连接，以产生适合表达融合肽的第二载体；c)将第二载体转化至合适的宿主细胞中；d)在适合表达融合肽的条件下培养该宿主细胞；e)从该宿主细胞中分离包涵体；f)溶解包涵体并从包涵体中提取融合肽；g)融合肽与合适的亲和材料结合；h)任选地，洗涤结合的融合肽以除去杂质；和i)裂解融合肽以释放胰高血糖素类似物。载体可包括增强子元件。可以控制转录的增强子元件可以插入载体构建体中以供产生胰高血糖素类似物，并且可以用于增强载体中编码的胰高血糖素类似物的表达。

产生本文所述的胰高血糖素类似物的方法可以以高纯度，如至少95％、96％、97％、98％、99％或更高的纯度提供高产率的胰高血糖素类似物。产生的胰高血糖素类似物可以是研发级肽或临床级治疗剂。天然胰高血糖素也可以使用本文所述的方法产生。

载体中编码的胰高血糖素可以是天然胰高血糖素、天然存在的胰高血糖素类似物、非天然存在的胰高血糖素类似物或具有非天然置换、缺失或添加的天然存在的胰高血糖素类似物。天然胰高血糖素或胰高血糖素类似物可以在分离后以化学或生物方式进行修饰，以产生天然胰高血糖素或胰高血糖素类似物的衍生物。

包涵体指引肽

包涵体可由不溶性及变性形式的肽组成，其直径可约为0.5-1.3μm。这些稠密且多孔的聚集物可帮助简化重组蛋白生产，因为它们可具有高均一性的表达的蛋白质或肽，由于对细胞蛋白酶的蛋白水解攻击具有更高的抗性而可导致表达的蛋白质或肽具有更低的降解，并且由于其与其他细胞成分相比在密度和大小上不同而可易于从细胞的其他成分中分离出来。一旦分离，可以溶解该包涵体以允许进一步的操作和/或纯化。

包涵体指引肽可以是一种氨基酸序列，其可以帮助指引新翻译的蛋白质或肽进入宿主细胞内的不溶性聚集物。在最终分离之前，在多个实施方案中，胰高血糖素或胰高血糖素类似物可作为融合肽产生，其中该融合肽可包含作为其氨基酸序列一部分的包涵体指引肽。本文所述的方法和组合物适用于多种不同的作为表达的融合胰高血糖素或胰高血糖素类似物的组分的包涵体指引肽。

在多个实施方案中，包涵体指引肽可以是类固醇异构酶(KSI)序列、其功能片段或其功能同系物。在多个实施方案中，包涵体指引肽可以是BRCA-2序列、其功能片段或其功能同系物。

亲和标记物肽

根据本文所述的方法和组合物，可以使用众多的亲和标记物。亲和标记物可对于阳离子、阴离子、金属或任何其他适合于亲和柱的材料是特异性的。在一个实施方案中，任何不具有亲和标记物的肽可以从亲和柱上洗脱，留下通过亲和标记物与亲和柱结合的所需融合肽。

特异性亲和标记物可包括聚赖氨酸、聚组氨酸、聚谷氨酸、聚精氨酸肽。例如，亲和标记物可以是5-10个赖氨酸(SEQ ID NO:22)、5-10个组氨酸(SEQ ID NO:23)、5-10个谷氨酸(SEQ ID NO:24)或5-10个精氨酸(SEQ ID NO:25)。在多个实施方案中，亲和标记物是6个组氨酸的序列(SEQ ID NO:26)、6个赖氨酸的序列(SEQ ID NO:27)、6个谷氨酸的序列(SEQID NO:28)或6个精氨酸的序列(SEQ ID NO:29)。或者，也可使用HAT-标记物(Clontech)。在多个实施方案中，亲和标记物是His-Trp Ni-亲和标记物。也可以使用本领域已知的其他标记物。标记物的实例可包括但不限于Isopeptag、BCCP-标记物、Myc-标记物、钙调蛋白标记物、FLAG-标记物、HA-标记物、MBP-标记物、Nus-标记物、GST-标记物、GFP-标记物、硫氧还蛋白标记物、S-标记物、Softag、链霉亲和素标记物、V5-标记物、CBP-标记物和SBP-标记物。

聚组氨酸标记物的组氨酸残基可以与Ni-NTA或TALON树脂以高亲和力结合。这两种树脂皆可含有二价阳离子(Ni-NTA树脂包含Mg2+；TALON树脂包含Co2+)，该二价阳离子可以与His标记物形成高亲和力配位。

在多个实施方案中，亲和标记物的pI(等电点)与胰高血糖素或胰高血糖素类似物的pI相差至少一个pH单位。该差异可以是在胰高血糖素或胰高血糖素类似物的pI之上或之下。例如，在多个实施方案中，亲和标记物的pI至少低1个pH单位，至少低2个pH单位，至少低3个pH单位，至少低4个pH单位，至少低5个pH单位，至少低6个pH单位，或至少低7个pH单位。或者，亲和标记物的pI可以至少高1个pH单位，至少高2个pH单位，至少高3个pH单位，至少高4个pH单位，至少高5个pH单位，至少高6个pH单位，或至少高7个pH单位。

在多个实施方案中，亲和标记物包含在包涵体指引肽的天然序列内。或者，可以将包涵体指引肽修饰为包含亲和标记物。例如，在一个实施方案中，亲和标记物是修饰为包括额外的组氨酸、额外的赖氨酸、额外的精氨酸或额外的谷氨酸的KSI、油质蛋白N-末端或BRCA2序列。

在多个实施方案中，可使用诸如FLAG(Eastman Kodak)或myc(Invitrogen)的表位及其抗体对。

在亲和柱上从融合肽裂解胰高血糖素类似物

本文描述了许多可用于在亲和柱上裂解含有胰高血糖素类似物的融合肽的方法。通常，该裂解步骤可以通过引入裂解剂来进行，该裂解剂可以与融合肽的裂解标记物相互作用，并且可以导致融合肽的裂解和胰高血糖素类似物的释放。裂解后，可以冲洗亲和柱以洗脱胰高血糖素类似物，而含有亲和标记物的融合肽部分保持与亲和柱结合。在洗脱胰高血糖素类似物后，可以将洗脱溶液浓缩至所需浓度。胰高血糖素类似物可以进一步加工和/或包装以供分配或销售。

通过化学选择性可以控制裂解反应。例如，裂解标记物可以包括独特的化学部分，该化学部分可以不存在于融合肽的剩余部分中，使得裂解剂选择性地与裂解标记物的独特化学部分相互作用。

在多个实施方案中，裂解反应的控制可以通过独特的局部环境进行。可以使用多种裂解标记物。在一些情况下，该裂解标记物是胰高血糖素或胰高血糖素类似物的氨基末端的色氨酸。例如，该裂解标记物可包括存在于融合肽中其他位置的化学部分，但局部环境不同，从而导致裂解标记物处的选择性裂解反应。例如，在多个实施方案中，该裂解标记物包括色氨酸和在色氨酸的五个氨基酸以内的带电荷氨基酸侧链。在多个实施方案中，该带电荷氨基酸位于色氨酸氨基酸的氨基末端。在用裂解剂裂解后，将色氨酸连接至胰高血糖素或胰高血糖素类似物的酰胺键可以被裂解，并且胰高血糖素或胰高血糖素类似物可以从亲和柱上释放。

或者，所述裂解标记物可以是在胰高血糖素或胰高血糖素类似物的氨基末端的色氨酸，其中该裂解标记物在色氨酸的局部环境中，比如在色氨酸上游(即氨基)或下游(即羧基)侧的5个氨基酸以内，还可以包括具有带电荷侧链的氨基酸。在色氨酸氨基末端5个氨基酸之内存在氨基酸侧链可允许裂解可裂解标记物的色氨酸而不裂解其他任何可能存在于异源融合肽中的色氨酸(例如，作为包涵体指引肽的一部分或胰高血糖素或胰高血糖素类似物的一部分的色氨酸)的选择性。在一些情况下，具有带正电荷的侧链的氨基酸，例如赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸，距可裂解标记物的色氨酸在5、4、3或2个氨基酸单位以内，或在氨基末端与可裂解标记物的色氨酸相邻。在一些情况下，谷氨酸在距可裂解标记物的色氨酸的5、4、3或2个氨基酸单位以内，或在氨基末端与可裂解标记物的色氨酸相邻。

所述裂解标记物可以是His-Met或Pro-Met。在一些情况下，该裂解标记物是非天然氨基酸。可以修饰细胞以使得该细胞能够产生可含有非天然氨基酸的肽。例如，可以对大肠杆菌的蛋白质生物合成机制进行修饰，该修饰可允许响应于琥珀终止密码子(TAG)，位点特异性地引入非天然氨基酸O-甲基-L-酪氨酸(Wang等人,(2001)Science 292:498-500)。或者，可以向大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞的蛋白质中位点特异性地引入大量非天然氨基酸(Wang等人,(2009)Chem Biol.16(3):323-36)。引入一个或多个非天然氨基酸可以提供在融合肽的非天然氨基酸处裂解而不在融合肽的其他位点处非特异性裂解的额外的选择性。

通过本文所述的方法产生的异源融合肽可包含非天然氨基酸。在一些方面，具有对蛋白质生物合成机制的修饰的原核细胞产生这样的融合肽。这样的原核细胞的例子包括大肠杆菌。在一些方面，该修饰包括加入正交的tRNA/合成酶对。在一些方面，4个碱基密码子编码新的氨基酸。在一些方面，大肠杆菌允许响应于包括在表达载体中的琥珀终止密码子(TAG)，位点特异性地向肽内引入非天然氨基酸O-甲基-L-酪氨酸。

在多个实施方案中，裂解反应的控制可以通过含有胰高血糖素类似物的融合肽的二级或三级结构进行。例如，在多个实施方案中，当相同的部分存在于裂解标记物中和融合肽的其他位置中时，融合肽的其他部分可以折叠成二级或三级结构，如α-螺旋、β-折叠等，或通过二硫键连接来物理地保护易感部分，从而导致裂解标记物处的选择性裂解。

在多个实施方案中，可以通过控制裂解反应的动力学来扩大裂解标记物相对于融合肽中其他位置的裂解反应选择性方面的微小或甚至较大差异。例如，在多个实施方案中，通过调节含有裂解剂的洗脱溶剂的流速来控制裂解剂的浓度。在多个实施方案中，裂解剂的浓度维持在低水平以扩大选择性差异。在多个实施方案中，用于接收洗脱溶剂的储器含有猝灭剂，以终止已从该柱释放的胰高血糖素或胰高血糖素类似物的进一步裂解。

此外，可以排除多种从亲和柱上移取肽的方法。例如，在一些实施方案中，移取步骤可以特别地排除在没有裂解反应的情况下用具有竞争亲和力的化合物溶液洗涤亲和柱的步骤。在一个实施方案中，特别排除用咪唑溶液作为置换剂洗涤亲和柱以帮助从亲和柱上移取融合肽的步骤。咪唑的浓度可以变化。例如，用于洗涤该柱的咪唑浓度可包括约1-10mM、5-20mM、10-50mM、30-70mM、50-100mM、80-200mM、100-300mM、150-500mM。咪唑可以以固定浓度或以代表下限和上限的两个固定浓度之间的梯度施加。例如，可使用咪唑的梯度来洗涤该柱，该梯度从1mM开始并在一段时间内以500mM结束。

在一些情况下，可以发生多次裂解。例如，胰岛素是由胰岛素原前体天然产生的，需要两次裂解事件。为了使成熟胰岛素正确折叠，可能需要两次裂解事件。因此，设计用于胰岛素产生的载体可包含两个裂解标记物。优选地，当存在多于一个裂解标记物时，不同的裂解标记物是正交的，或者能够被不同的裂解剂特异性裂解。例如，一个裂解标记物可以是甲硫氨酸氨基酸，而另一个裂解标记物可以是色氨酸氨基酸。

裂解剂的非限制性实例可包括NBS、NCS、溴化氰、Pd(H₂O)₄、2-邻碘苯甲酸、DMSO/硫酸或蛋白水解酶。

在多个实施方案中，所述裂解剂可选自NBS、NCS、溴化氰、Pd(H₂O)₄、2-邻碘苯甲酸、DMSO/硫酸或蛋白水解酶。

在一个实施方案中，裂解反应可涉及使用温和的溴化剂N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，该溴化剂可以选择性地裂解胰高血糖素类似物肽的氨基末端的色氨酰肽键。例如，在水溶液和酸性条件下，NBS可氧化色氨酸侧链的暴露的吲哚环，从而引发化学转化，该化学转化可导致该位点处的肽键裂解。因此，活性溴离子可以卤化色氨酸残基的吲哚环，然后通过一系列水解反应自发脱卤。这些反应可导致羟吲哚衍生物的形成，该衍生物可促进裂解反应。

在一个实施方案中，裂解反应可以涉及使用温和的氧化剂N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)，该氧化剂可以选择性地裂解胰高血糖素或胰高血糖素类似物的氨基末端的色氨酰肽键。例如，在水溶液和酸性条件下，NCS可氧化色氨酸侧链的暴露的吲哚环，从而引发化学转化，该化学转化可导致该位点处的肽键裂解。

在一些情况下，可以使用酶来裂解融合蛋白。例如，可以分别与丝氨酸或苏氨酸结合的丝氨酸蛋白酶或苏氨酸蛋白酶可以引发能够导致蛋白水解的催化机制。其他酶可包括胶原酶、肠激酶因子X_A、凝血酶、胰蛋白酶、梭菌蛋白酶和alasubtilisin。

在一些情况下，所述裂解剂可以是化学试剂，如溴化氰、钯(II)水合物(如Pd(H₂O)₄)、甲酸或羟胺。例如，溴化氰可用于在胰高血糖素或胰高血糖素类似物的氨基末端的甲硫氨酸氨基酸处选择性裂解融合肽。

下游加工

可以进一步修饰根据本文所述的方法产生的胰高血糖素或胰高血糖素类似物。例如，胰高血糖素或胰高血糖素类似物的C-末端可以与α-羟基甘氨酸连接。在期望的时间，胰高血糖素或胰高血糖素类似物，作为分离的胰高血糖素或胰高血糖素类似物或作为融合肽的一部分，可以暴露于酸催化以在胰高血糖素或胰高血糖素类似物的羧基末端产生乙醇酸和羧酰胺基团。羧基末端的羧酰胺基团可以存在于多种神经肽中，并且被认为可以增加多种肽的体内半衰期。

可以进一步修饰根据本文所述的方法产生的胰高血糖素或胰高血糖素类似物以改变体内活性。例如，可以将聚乙二醇(PEG)基团添加到胰高血糖素或胰高血糖素类似物。

融合肽的核糖体合成

肽可以通过核糖体合成产生，其可以利用转录和翻译来表达肽。一些肽可以以其天然形式在真核细胞宿主中表达，该宿主例如是哺乳动物细胞系统(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞，包括HEK 293细胞和HEK 293F细胞、HeLa细胞、PC3细胞、Vero细胞和MC3T3细胞)；酵母细胞系统(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))；和昆虫细胞系统(例如，Sf9、Sf21和High Five株)。作为替代方案，可以使用细菌宿主表达系统，如使用大肠杆菌(E.coli)、棒状杆菌(Corynebacterium)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的系统。

可以在载体中提供核酸序列如DNA序列，其可用作核糖体合成中的转录模板。载体可以通过核糖体合成提供可用于蛋白质表达的其他核苷酸序列。载体通常可以指一个或多个可操作地连接的核苷酸序列。如本文所用，术语“可操作地连接的”可以指被放置成与另一核苷酸序列有功能关系的核苷酸序列。载体的核苷酸序列可以编码蛋白质(例如，蛋白质编码序列)，如目标肽，或者可以包含载体元件，如控制或调节序列、选择性标记、启动子(例如，诱导型和组成型)、核糖体结合位点、终止序列等。选择性标记如抗生素抗性可使得能够选择性地针对不含有带有感兴趣基因的构建载体的细胞进行筛选。载体可包括杂合启动子和用于掺入不同基因的多克隆位点。载体还可包括编码表达标记物和/或裂解标记物的核苷酸序列。表达载体的非限制性实例可包括pET系统和pBAD系统(例如，用于细菌表达系统)；pPIC系统和pYES系统(例如，用于酵母表达系统)；和pcDNA系统(例如，用于哺乳动物表达系统)。可以选择核酸载体和载体元件以与宿主表达系统相容。

例如，pET系统在标准pET载体上可包括超过40种不同的变异。在一些情况下，pET系统可采用可以被T7RNA聚合酶特异性识别的T7启动子。该聚合酶可以比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍地转录DNA，从而允许提高的转录水平。

可以将载体设计成包括编码包含表达标记物如SEQ ID NO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFPSDKPHHKKHHKKHHSSGSLE)、裂解标记物和目标肽的异源融合肽的序列。在一些情况下，该载体进一步包含编码包涵体指引肽和/或亲和标记物的核苷酸序列。亲和标记物也可以包括在表达标记物中并且可用于纯化过程，该亲和标记物诸如但不限于带电荷氨基酸序列(例如，聚组氨酸和/或聚赖氨酸)、AviTag、FLAG-标记物、HA-标记物、Myc-标记物、SBP-标记物或其组合。例如，待与细菌表达系统一起使用的pET-19b载体可包含这样的核苷酸序列，其编码表达标记物如SEQ ID NO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFPSDKPHHKKHHKKHHSSGSLE)或其片段、裂解标记物、目标肽如胰高血糖素或胰高血糖素类似物，和可选的包涵体指引肽和/或亲和标记物。类似地，待与酵母表达系统一起使用的pPIC载体或待与哺乳动物表达系统一起使用的pcDNA载体可包含这样的核苷酸序列，其编码表达标记物如SEQ ID NO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFPSDKPHHKKHHKKHHSSGSLE)或其片段、裂解标记物、目标肽如胰高血糖素或胰高血糖素类似物，和可选的包涵体指引肽和/或亲和标记物。

可以使用任何合适的方法将载体引入宿主细胞，如细菌细胞(例如，大肠杆菌、棒状杆菌和荧光假单胞菌)或酵母细胞(例如，酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和巴斯德毕赤酵母)，该方法包括转化、转染、电穿孔和显微注射。例如，可以将转化的大肠杆菌细胞平板接种到含有抗菌剂的琼脂上，以防止任何不含抗性基因的细胞生长，从而选择已经转化的细胞。从平板培养法得到的菌落可根据标准细胞培养技术在起子培养物或肉汤中生长。例如，从琼脂平板上选取的一个菌落在肉汤起子培养液中生长，其可任选地包含抗菌剂。通常，细胞可生长到预先选择的光密度，然后进一步加工以获得融合肽。例如，细胞可生长至光密度(OD)为约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8或约0.9。在一些实施方案中，细胞生长至光密度(OD)大约为0.5。

一旦载体被引入宿主细胞，该宿主细胞即可用于异源肽表达。对于包含组成型启动子的载体，异源融合肽的表达可以在载体被引入宿主细胞时发生。对于包含诱导型启动子的载体，可以在具有载体的细胞中诱导或激活所需异源融合肽的表达，例如使用可以激活诱导型启动子的分子。例如，在大肠杆菌细胞中，lac操纵子可作为在特定环境条件下可以激活的诱导型启动子。大肠杆菌可以能够代谢单糖葡萄糖。然而，为了代谢二糖乳糖，该细胞可能需要一种叫作α-半乳糖苷酶的酶。因此，低细胞外葡萄糖浓度和高乳糖浓度可诱导lac操纵子且α-半乳糖苷酶的基因可以得到转录。在一些情况下，诸如lac操纵子的诱导型启动子位于编码融合肽的序列的上游。在诱导lac操纵子后，可发生编码所需融合肽的序列的转录。

术语“激活”可以指去除阻抑蛋白。阻抑蛋白通常可以是变构的，意味着当其被诱导物分子结合后可以改变形状并从启动子上解离下来。这种解离可允许转录复合物在DNA上装配并启动启动子下游的任何基因的转录。因此，通过将在体外产生的基因剪接到细菌基因组中，人们可以控制新型基因的表达。在处理包涵体时，如果包涵体的产生及积累变得足够有毒性而杀死大肠杆菌，则可有利地利用该性状。例如，所需融合肽的表达可以推迟，直到培养出足够的细胞群体，然后可以诱导启动子以通过去除阻抑蛋白表达大量的融合肽。因此，可以激活L-阿拉伯糖操纵子，以便在所需时间点增加蛋白质表达。具体地，L-阿拉伯糖操纵子可通过将阿拉伯糖加入生长培养基中和加入IPTG来激活，IPTG是可作为激活剂来从操纵基因DNA上解离阻抑蛋白的分子。L-阿拉伯糖可与AraC二聚体结合，使蛋白质释放DNA上的O₂位点并与I₂位点结合。这些步骤可用于释放DNA环并可使其能够转录。此外，cAMP激活蛋白(CAP)复合物可刺激AraC与I₁和I₂的结合—可由IPTG启动的过程。

在一些情况下，仅表达具有表达标记物、裂解标记物和目标肽的融合肽的细胞可能无法产生大量融合肽。产量低的原因可能有所不同。例如，异源融合肽可能对宿主细胞(例如，细菌细胞)有毒性，因此导致宿主细胞在产生某些水平的融合肽后死亡。或者，胰高血糖素或胰高血糖素类似物可能在细菌系统中表达不良或快速降解。在一些情况下，胰高血糖素或胰高血糖素类似物可能被宿主细胞修饰，包括诸如糖基化等修饰。为了解决这些问题中的一些或全部，可以将所需的融合肽引导至包涵体，从而将胰高血糖素或胰高血糖素类似物与细胞质中的降解因子物理分离。此外，通过将融合肽在包涵体中物理地聚集，可以更容易或有效地进行融合肽与宿主细胞和培养基(即细胞培养物或肉汤)的成分的后续分离。在一些情况下，可以修饰宿主细胞以提高蛋白质表达效率。例如，可以将细菌细胞如大肠杆菌细胞修饰成蛋白酶缺陷型。

可通过作为异源融合肽的一部分的包涵体指引肽将胰高血糖素或胰高血糖素类似物引导至包涵体。在一些情况下，除没有包涵体指引肽外都相同的异源融合肽在表达系统中没有或具有最低的被引导入包涵体的趋势。或者，除没有包涵体指引肽外都相同的异源融合肽在表达系统中具有一定的被引导入包涵体的趋势，但是通过产生带有包涵体指引肽的融合肽可增加包涵体的数量、体积或重量。

例如，已经描述了允许在大肠杆菌中合成稳定形式的α-人心房钠尿肽(α-hANP)的方法。合成的α-hANP基因的8个拷贝串联连接，被编码含4个氨基酸的连接体的密码子隔开，该连接体具有赖氨酸残基，该赖氨酸残基位于含28个氨基酸的激素的真正N端和C端的侧翼。然后该序列与片段的3’端相连，该片段包含lac启动子及编码α-半乳糖苷酶的前7个N端氨基酸的前导序列。表达的多区域蛋白质在细胞内积累进入稳定的包涵体内，并通过尿素提取不溶性细胞成分而纯化。纯化的蛋白质通过用蛋白内切酶lys C消化而裂解为单体，并进行修整以通过羧肽酶B消化而暴露真正的C-端(Lennick等人,Gene,61:103-112(1987))。

通过产生作为融合肽的一部分的胰高血糖素或胰高血糖素类似物将胰高血糖素或胰高血糖素类似物引导至包涵体可导致更高的融合肽产量。例如，所需融合肽可以以大于100mg/L的浓度产生。所需融合肽可以以大于约200mg/L、250mg/L、300mg/L、350mg/L、400mg/L、450mg/L、500mg/L、550mg/L、600mg/L、650mg/L、700mg/L、750mg/L、800mg/L、850mg/L、900mg/L、950mg/L和1g/L的浓度产生，所有数字前都冠以“大于约”。在一些情况下，所需融合肽的产率大于约1.5g/L，大于约2g/L，或大于约2.5g/L。所需融合肽的产率可以在约500mg/L至约2g/L或约1g/L至约2.5g/L的范围内。在一些情况下，所需融合肽的产率等于或大于500mg/L培养基。

包涵体指引肽可以是类固醇异构酶(KSI)或其包涵体指引功能性片段。包涵体指引功能性片段可含有至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个氨基酸。类固醇异构酶还可包括类固醇异构酶的同系物。这样的同系物可以与类固醇异构酶的氨基酸序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。表达系统对于具有类固醇异构酶的功能片段或同系物的融合肽所产生的包涵体量可以是同一表达系统对于含有完整类固醇异构酶肽序列的融合肽所产生的包涵体量的至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于100％。

合成融合肽的合成

或者，异源融合肽可以通过固相肽合成(SPPS)或液相肽合成来制备。SPPS可以涉及以有序方式将氨基酸共价连接以形成具有所需氨基酸序列的合成肽。可以提供固体支持物作为肽延长(通常从C-末端至N-末端)的结构支持物，该固体支持物例如是聚苯乙烯树脂、聚酰胺树脂、聚乙烯(PEG)聚苯乙烯混合树脂或基于PEG的树脂。具有“临时”保护基团(例如，9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧羰基(Boc)保护基团)的氨基酸可以通过重复包括脱保护(例如，去除保护基团)和反应步骤(例如，形成肽键)在内的多个步骤而添加到生长肽链的N-末端。

类似地，液相肽合成可以有序的方式将氨基酸添加到生长的肽链中，不过没有借助于固体支持物。液相肽合成通常可能需要保护第一个氨基酸的C-末端，并且在每次氨基酸添加后将生长的肽链与反应试剂分离，使得一个氨基酸不会无意地两次或更多次掺入该肽链中。

在一个实施方案中，固相肽合成法使用Fmoc保护基团。Fmoc保护基团可使用碱不稳定的α-氨基保护基团。在一个替代实施方案中，固相肽合成法可使用Boc保护基团。Boc保护基团可以是酸不稳定的α-氨基保护基团。每种方法可包括独特的树脂添加，氨基酸侧链保护，以及随后的裂解/脱保护步骤。通常，Fmoc化学法比Boc化学法可产生更高质量和更高产率的肽。Boc-合成的肽中的杂质可主要归因于裂解问题、脱水及叔丁基化。一旦在固体支持物上装配，可使用强酸条件，通常使用三氟乙酸(TFA)，将该肽从树脂上切下。然后可使用反相高压液相色谱法(RP-HPLC)纯化，RP-HPLC是这样一个过程，其中，样品可通过紧密填充的柱挤出，并可记录不同样品通过该柱所花费的时间长度(称为保留时间)。于是，可根据较小的肽通过柱的保留时间较短而反之亦然的原理从样品中分离出杂质。因此，纯化的蛋白质可以与样品中其他杂质可能不同的特有的保留时间洗脱，从而提供所需蛋白质的分离。纯化技术的其他实例可包括大小排阻色谱法(SEC)和离子交换色谱法(IEC)。

固相肽合成通常可提供高产率，因为可使用过量的试剂推动反应完成。可溶性副产物的分离可通过在整个合成中将肽附接至不溶性支持物而得到简化。由于可在整个过程中在同一容器中发生合成，原料的机械损耗可能较低。

在多个实施方案中，可不包括包涵体指引肽。或者，可包括包涵体指引肽以提供有益的折叠性质和/或可溶性/聚集性质。

非核糖体融合肽的合成

融合肽可通过非核糖体合成产生。这样的融合肽可包括环肽和/或缩肽(depsipeptide)。非核糖体融合肽可通过一种或多种非核糖体肽合成酶(NRPS)合成。这些酶可独立于信使RNA。非核糖体融合肽可具有环状的和/或分支的结构，可以包含非蛋白质氨基酸(包括D-氨基酸)，可带有诸如N-甲基和N-甲酰基的修饰，或可被糖基化、酰化、卤化或羟基化。可进行氨基酸倚靠融合肽骨架的环化，形成噁唑啉和噻唑啉；这些可进一步被氧化或还原。有时，可对丝氨酸进行脱水反应以获得脱氢丙氨酸。

NRPS的酶可以组织在负责引入一个额外的氨基酸的模块中。每个模块可由几个具有限定的功能的结构域组成，这些结构域被大约15个氨基酸的短间隔区分开。典型的NRPS模块可如下组织：起始模块，一个或多个延长模块，和终止模块。针对某种肽的NRPS基因可以在细菌中组织在一个操纵子中，并且在真核生物中组织在基因簇中。

在一些情况下，可不包括包涵体指引肽。或者，可包括包涵体指引肽以提供有益的折叠性质和/或可溶性/聚集性质。

融合肽从生成培养基中的分离

在产生所需的异源融合肽(例如，在宿主细胞表达系统中)后，可能需要从生产培养基中分离。任选地，在分离后，可浓缩所需融合肽及载体以去除过量的液体。可以修改并使用许多从生成培养基中分离融合肽及后续处理的方法。

在一些情况下，可将融合肽引导至包涵体。可裂解用来产生所需融合肽的细胞以释放融合肽。例如，当所需融合肽聚集在包涵体中时，可以裂解细胞，然后将包涵体从生产培养基及细胞碎屑中分离出来。

可以使用任何合适的细胞裂解方法，包括化学裂解和机械裂解。例如，可以在裂解缓冲液中使用高功率超声处理来破坏细胞。可以在裂解前添加含有Tris、氯化钠、甘油和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液。在一些情况下，可以在裂解前添加含有约25mM Tris pH 8.0、约50mM NaCl、约10％甘油和蛋白酶抑制剂1000X PMSF的裂解缓冲液。可以使用一个或多个洗涤步骤和离心步骤收集不溶性包涵体。洗涤缓冲液可包括用于稳定和分离蛋白质的任何试剂。例如，所使用的洗涤缓冲液可含有不同浓度的Tris pH 8.0、NaCl和Triton X100。

将所需融合肽靶向至包涵体可在细胞裂解后导致较高的起始纯度。例如，裂解细胞和通过诸如离心的物理手段分离包涵体可导致所需融合肽的起始纯度大于约70％、大于约75％、大于约80％、大于约85％、大于约90％或大于约95％。在一些情况下，在细胞裂解后，包涵体形成小球并保持在小球而不是上清夜内直到溶解步骤。可将小球清洗干净其余的细胞成分，且不可溶的包涵体溶解于缓冲液中以便进一步处理。溶解缓冲液可包含尿素或任何其他溶解融合肽所必需的离液剂。溶解步骤可包括将包涵体溶于离液剂中，该离液剂可用来通过干扰任何稳定的分子内相互作用来破坏融合肽。

溶解缓冲液可包含尿素、胍盐或有机溶剂。例如，溶解缓冲液可包含约25mM TrispH 8.0、约50mM NaCl、约0.1mM PMSF以及约8M尿素。在一些情况下，当加入8M尿素作为唯一的离液剂时，可发生包涵体溶解，而可排除其他离液剂。或者，溶解缓冲液可不包含尿素或胍盐。例如，可不包含胍盐以避免干扰在离子交换柱上进一步的加工。作为另外一个例子，可不包含诸如约8M尿素的高浓度尿素以避免使可能包括在溶解缓冲液内的蛋白酶变性。

在一些情况下，可使用最少量的溶解缓冲液。当存在过量的溶解缓冲液时，可加工该溶液以便在进一步纯化前移除过量的溶剂。

在一些情况下，融合肽可未引导至包涵体内。融合肽可保留在细胞的胞质溶胶中，或者融合肽可从细胞中分泌出来。可溶性的融合肽可通过任何方法分离，例如离心、凝胶电泳、pH或离子交换色谱法、大小排阻色谱法、反向色谱法、透析、渗透、过滤或萃取。

通过亲和色谱法的纯化

在细胞裂解并初始分离和溶解融合肽后，可通过亲和色谱法进一步纯化融合肽，这是一个高度选择性的过程，它依赖于固定化的固定相与待纯化的融合肽之间的生物相关的相互作用。在一些情况下，固定化的固定相可以是树脂或基质。亲和色谱法可以通过将来自混合物的所需成分与固定化的固定相选择性结合，然后洗涤固定相以去除任何未结合的材料来运行。

可使用多种亲和色谱法系统。例如，聚组氨酸可以以高亲和力和特异性与镍结合，因此镍的亲和柱，如QIAGEN镍柱，可用于纯化。或者，可使用Ni-NTA亲和色谱树脂(可从Invitrogen购得)。金属亲和色谱法可作为蛋白质分离的基础使用，其中蛋白质N-或C-末端上的特异性金属螯合肽可用来通过使用固定化的金属离子亲和色谱法来纯化该蛋白质。

亲和柱可以首先用缓冲液平衡，该缓冲液可以与用于溶解融合肽的缓冲液相同。接下来可以向该柱装入溶解的融合肽，并可以在缓冲液流过该柱时收集缓冲液。在一些情况下，可以相继冲洗该柱以去除尿素和/或其他杂质，如内毒素、多糖和来自细胞表达系统的残余污染物。

胰高血糖素类似物的施用

本文所述的胰高血糖素类似物可以作为单一药剂或作为组合来施用，以治疗有需要的受试者。受试者可以是人。受试者可以是哺乳动物。可以施用胰高血糖素类似物以治疗疾病或病症，例如包括I型糖尿病和II型糖尿病在内的糖尿病、先天性高胰岛素血症、低血糖症、严重低血糖症、肥胖症、高血糖症、高胰岛素血症、高胆固醇血症、游离脂肪酸或甘油的血液水平升高、高脂血症、高甘油三酯血症、肥胖症、伤口愈合、组织缺血、动脉粥样硬化、高血压或AIDS。胰高血糖素类似物也可以作为药物组合物的一部分施用。该药物组合物可包含胰高血糖素类似物和药学上可接受的赋形剂或稀释剂。药学上可接受的赋形剂或稀释剂可包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂、多肽；蛋白质，如血清白蛋白或明胶；亲水聚合物；氨基酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物；和/或非离子表面活性剂或聚乙二醇。

可以通过各种途径施用胰高血糖素类似物以治疗各种疾病，该途径包括但不限于肠胃外途径，如静脉内注射、动脉内注射、骨内输注、肌肉内注射、脑内注射、鞘内注射和皮下注射；肠内途径，如口服施用和直肠施用局部施用；和局部途径，如表皮施用和经鼻施用。通过静脉内施用，胰高血糖素或胰高血糖素类似物可以在血流中直接且完全可用，并且可以通过体循环分布到可以发生药理学作用的点。胰高血糖素类似物可以通过贴剂或泵施用。胰高血糖素类似物可以通过闭环泵施用。

可以采用各种策略来增加所施用的药物的生物利用度，如化学修饰、配制媒介物和使用酶抑制剂、吸收促进剂和黏膜粘附聚合物。酶抑制剂可与肽治疗剂共同施用，以通过抑制以不同特异性裂解氨基酸侧链的蛋白酶(例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶和羧肽酶)的活性来提高生物利用度。由于小肠内蛋白酶的量和种类较多，因此相比于小肠，酶抑制剂可能在大肠中更有效。酶抑制剂的实例包括胰蛋白酶抑制剂，这是一类降低胰蛋白酶生物活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶抑制剂的实例包括大豆胰蛋白酶抑制剂——胰凝乳蛋白酶的抑制剂；来自豆科植物(例如，大豆、豌豆、小扁豆和鹰嘴豆)的Bowman-Birk抑制剂(BBI)蛋白质；牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI)；和卵黏蛋白(在蛋清例如鸡蛋清、鸭蛋清和火鸡蛋清中发现的胰蛋白酶抑制剂)。

在一些情况下，本文所述的胰高血糖素类似物可与天然胰高血糖素联合施用。在其他情况下，胰高血糖素类似物可与另一种胰高血糖素类似物联合施用。

在一些情况下，肽治疗剂可以在使用适当稀释剂的药物组合物中施用。

本文提供的组合物和方法可用于治疗多种疾病、病况，预防受试者的疾病或状况，或有需要的受试者的其他治疗应用。

在一个实施方案中，包含一种或多种根据本发明的胰高血糖素类似物的剂型可用于临床目的。临床目的包括但不限于诊断、预后、治疗、临床试验和临床研究。在一个实施方案中，胰高血糖素类似物被用于研究药代动力学/药效学。在一个实施方案中，剂型可被配制用于特定的递送途径。递送途径包括但不限于经口、经鼻、直肠、血管内、腹膜内、肌肉内、皮下、经眼、皮肤等。剂型可以包装成片剂、凝胶、气雾剂、流体、颗粒、胶囊、粉末、薄膜或包衣。剂型还可以通过支架或其他侵入性装置如植入物或通过泵或贴剂递送。在另一个实施方案中，胰高血糖素类似物是冻干的。在另一个实施方案中，胰高血糖素类似物在溶液中。在另一个实施方案中，胰高血糖素类似物作为带有适当的稀释溶液和说明书的浓缩物提供。在另一个实施方案中，胰高血糖素类似物是粉末形式。在另一个实施方案中，胰高血糖素类似物作为凝胶提供或在其他粘性材料如聚乙二醇中提供。在另一个实施方案中，胰高血糖素类似物以胶束如脂质体的形式提供。

胰高血糖素类似物试剂盒

在一个方面，本文所述的胰高血糖素类似物可以作为试剂盒提供。在另一个实施方案中，试剂盒包含编码胰高血糖素类似物的氨基酸、载体、宿主生物体和说明书手册。在另一个实施方案中，试剂盒包含编码胰高血糖素类似物的氨基酸、载体、宿主生物体、Ni+柱、咪唑和说明书手册。在另一个实施方案中，试剂盒包含描述本文公开的方法和组合物的说明书手册。在另一个实施方案中，试剂盒包含胰高血糖素类似物和用于将该胰高血糖素类似物递送至有需要的患者的医疗装置。

实施例

通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。

实施例1

建立和筛查针对热力学和化学稳定性优化的胰高血糖素类似物文库

该实施例描述了建立和筛查胰高血糖素类似物文库。用18种氨基酸(n)(不包括Cys和Asn)在残基22至27的6(r)个位置处以随机顺序进行置换，据估计有18⁶(n^r)或34,012,224个可能的胰高血糖素序列。

使用基于促淀粉状变性特性的计算定向序列搜索，结合用于选择待产生和测试的序列的稀疏矩阵方法。

产生溶液稳定的胰高血糖素类似物的策略基于天然胰高血糖素中残基22-27的经计算的原纤维形成倾向，图2A。使用几种计算工具来预测聚集和淀粉样蛋白形成，产生了胰高血糖素类似物文库。

实施稀疏矩阵抽样方法，图3，以选择用于实际产生的成员。使用以下两个初始原则确定初始矩阵：排除含有Asn、Gln、Cys或Met的序列，并且排除经计算的聚集倾向大于1.0的序列，参见图2B。

然后，将随后一组序列在第一轴上从低到高等电点且在另一轴上从低到高聚集倾向成矩阵排列。选择40个类似物的随机样本用于在随后的生物物理测试中产生。

实施例2

胰岛素类似物的产生

该实施例描述了胰岛素类似物的产生。用表达载体转化大肠杆菌细胞，以用1mMIPTG(GoldBio)启动胰高血糖素类似物肽的合成，用于产生胰高血糖素类似物。将平板接种的细胞在37℃温育过夜，然后使来自该平板的一个菌落在8mL LB+卡那霉素的起子培养物中生长过夜。第二天早晨，将起子培养物接种到1L LB+卡那霉素中，并生长至光密度(OD)为2.0。此时，用1mM IPTG(GoldBio)诱导该细胞，以启动胰高血糖素类似物的合成。

为了优化细菌中胰高血糖素类似物的产量，在诱导细菌前，然后在诱导后2、4、6和16小时(过夜生长)，采集1L接种的样品。使用丙烯酰胺凝胶来分析样品并选择最佳诱导时间。

在大肠杆菌中诱导胰高血糖素类似物产生后，添加含有50mM Tris pH 8.0、150mMNaCl、1mM EDTA和1％Triton X-100的裂解缓冲液，然后将细胞裂解。使用洗涤和离心来收集不溶性包涵体。使用含有不同浓度的Tris pH 8.0、NaCl和Triton X100的三种不同洗涤缓冲液。一旦剩余的细胞组分洗涤干净，将不溶性包涵体溶解于含有8M尿素、0.193M乙醇胺和2.5mM DTT的缓冲液中。8M尿素用作溶解蛋白质时的离液剂。

在丙烯酰胺凝胶上电泳从未诱导和诱导的细菌收集的培养基、由高输出超声处理产生的细胞裂解物和来自在包涵体制备期间每个洗涤步骤的上清液。用考马斯蓝试剂将凝胶染色，并且条带在适当分子量处出现提供了由诱导导致的包涵体合成的证据。示例性数据通过细胞的凝胶电泳显示了包涵体制备的阶段，该细胞经高功率超声处理裂解并经含有不同浓度的Tris、NaCl、PMSF、Triton-X100和尿素的一系列缓冲液洗涤。在连续步骤中条带的消失和在溶解包涵体后条带的再现表明正确制备了包涵体。因此，含有细胞裂解物的泳道几乎完全是蓝色的，因为细胞破裂并且相当大量的各种蛋白质被提取出来。随着反复洗涤裂解物的杂质，泳道变得更清晰。

通过Bradford试验测定溶解的包涵体中蛋白质的浓度。进行一系列NCS裂解反应以确定色氨酰肽键裂解的最佳条件。让购自TCI America的三种浓度(等摩尔、3X和6X)的NCS与胰高血糖素类似物反应不同的时间(0、15和30分钟)，然后用过量的N-乙酰甲硫氨酸(Sigma)猝灭。通过在丙烯酰胺凝胶上运行裂解产物并观察适当分子量处的条带来监测裂解。

将购自GE的SP Sepharose High Performance色谱树脂用重折叠缓冲液平衡。接下来，用重折叠的融合蛋白填充树脂并收集流通液。然后用5个柱体积的20mM Tris缓冲液(pH8.0)洗涤该柱以去除杂质、尿素和流通液。然后，加载NCS并流过色谱柱。然后用pH7.5的20mM Tris缓冲液洗涤该柱以洗脱剩余的感兴趣的蛋白质并收集流通液。如下所述用1mMIPTG(Invitrogen)和0.2％L-阿拉伯糖(Calbiotech)诱导细胞以启动胰高血糖素类似物肽的合成。平板接种的细胞在37℃温育过夜，然后来自该平板的一个菌落在8mL LB+氨苄青霉素的起子培养物中生长过夜。第二天早晨，将起子培养物接种到1L LB+氨苄青霉素中并生长至光密度(OD)为0.5。在此时，用1mM IPTG(Invitrogen)和0.2％L-阿拉伯糖(Calbiotech)诱导细胞以启动胰高血糖素类似物肽的合成。

为了优化细菌中胰高血糖素类似物肽的产量，在诱导细菌前，然后在诱导后2、4、6和16小时(过夜生长)，采集1L接种的样品。使用丙烯酰胺凝胶分析样品。

在诱导8小时后，用同样浓度的IPTG和L-阿拉伯糖及100mg氨苄青霉素再次诱导细胞，以防止任何新的大肠杆菌菌株的生长。

实施例3

用于选择原纤维形成抗性变体的针对产生的肽的搅拌ThT-试验

该实施例描述了用于选择胰高血糖素类似物的原纤维形成抗性变体的搅拌ThT-试验。使用搅拌Th-T试验，在pH值为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0以及40℃下，针对原纤维形成倾向筛选产生的胰高血糖素类似物变体，以天然胰高血糖素作为对照。该试验迅速完成并具有相对较高的通量，并为随后的研究确定最佳pH范围。每个试验仅需要数微克的材料，并且使用读板仪以96孔板形式进行，其中搅拌由读板仪控制。因此，完成该试验需要少于1毫克的任何给定的胰高血糖素类似物。

此外，该方法先前已用于比较使用AmideBio技术平台产生的重组淀粉样肽，图4，表明该方法能够进行该试验以及肽纯度在这些试验中的重要性。

实施例4

使用定量HPLC分析的搅拌试验

该实施例描述了胰高血糖素类似物的定量HPLC分析。使用定量HPLC测定温育时胰高血糖素损失的程度。对样品进行搅拌并将其保持在40℃下。使用甲酚的内标以及保持在4℃的比较样品进行样品定量。

实施例5

使用透射电子显微术的搅拌试验

该实施例描述了胰岛素类似物的透射电子显微术分析。作为监测聚集性质的进一步试验，使用负染色(1％醋酸铀)电子显微术来目测检查任何聚集的性质。在CU Boulder的EM设施通过安装在FEI/Phillips CM120上的Gatan Ultrascan CCD相机以数字方式采集数据。图像将在4800X下以1K x lK像素图像收集。评估胰高血糖素类似物的聚集。

实施例6

用于选择脱酰胺作用抗性变体的LC-MS

该实施例描述了用于选择脱酰胺作用抗性变体的针对胰高血糖素类似物的LC-MS/MS。进行LC-MS以选择胰高血糖素类似物的脱酰胺作用抗性变体。

将数微克的胰高血糖素类似物变体样品在40℃下在pH 6.0和8.0的缓冲液中储存30天，并通过LC-MS/MS进行分析，以测定在两个pH极值下脱酰胺作用(+1质量)或其他化学修饰的程度。

先前使用LC-MS/MS来确定单链胰岛素分子的脱酰胺作用速率，图5，表明了脱酰胺作用以及其他修饰如氧化的测定和定量。类似地确定胰高血糖素的脱酰胺作用。

实施例7

使用胰高血糖素受体荧光成像读板仪(FLIPR)试验进行的胰高血糖素活性的体外试验概况分析

该实施例描述了使用激动剂FLIPR试验和拮抗剂FLIPR试验进行的胰高血糖素活性的体外试验概况分析。在Ca⁺⁺FLIPR试验中表征了对原纤维形成和化学降解表现出增强的抗性的类似物。通过该试验测定了激动剂和拮抗剂活性，以确保胰高血糖素类似物具有适当的胰高血糖素受体激活，而没有任何残留的拮抗剂性质。

在激动剂FLIPR试验中，对于分析的每个浓度，将类似物一式三份地平板接种。以类似的方式制备参考激动剂(胰高血糖素)以用作以E_max(参考激动剂引发最大反应的浓度)包含的试验对照。

在FLIPRTETRA仪器上收集试验数据，其中在建立荧光/发光基线后将类似物、媒介物对照和参考胰高血糖素添加至试验板。试验时间通常为180秒，并且使用针对每个剂量归一化的响应来计算如图6中所示的结合曲线。选择具有至少10％天然胰高血糖素活性的胰高血糖素类似物用于进一步测试。

在拮抗剂FLIPR试验中，使用在激动剂试验期间测定的EC80效力值，并且在建立荧光/发光基线后用EC80浓度的天然胰高血糖素攻击所有预温育的胰高血糖素类似物孔。这用于确保没有活性类似物具有任何残留的非预期的拮抗剂活性，该拮抗剂活性可能使这些化合物用于治疗CH以及其他适应症的用途复杂化。

实施例8

使用胰高血糖素类似物治疗I型糖尿病

该实施例描述了使用胰高血糖素类似物治疗I型糖尿病。确定受试者患有低血糖症。通过静脉内注射向受试者施用有效量的胰高血糖素类似物。

实施例9

使用胰高血糖素类似物治疗先天性高胰岛素血症

该实施例描述了使用胰高血糖素类似物治疗先天性高胰岛素血症。受试者被诊断为患有先天性高胰岛素血症(CH)。通过泵向患者施用胰高血糖素类似物。受试者使用闭环泵系统来递送胰高血糖素类似物。

尽管在此已经显示和描述了本发明优选的实施方案，但对于本领域技术人员来说很明显，这样的实施方案只作为示例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到大量的变更、改变和替换。应当理解，在此描述的本发明实施方案的各种替代方案可用来实施本发明。

序列表

<110> 阿米德生物有限责任公司

<120> 胰高血糖素类似物及其使用方法

<130> 39538-711.601

<140>

<141>

<150> 62/348,101

<151> 2016-06-09

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 1

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Glu Leu Ala Asn Thr

20 25

<210> 2

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 2

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Lys Leu Ala Asn Thr

20 25

<210> 3

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 3

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Ala Gln Glu Leu Ala Asn Thr

20 25

<210> 4

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 4

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Ala Gln Lys Leu Ala Asn Thr

20 25

<210> 5

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 5

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Asp Leu Ala Asn Thr

20 25

<210> 6

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 6

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln His Leu Ala Asn Thr

20 25

<210> 7

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 7

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Asp Leu Ala Asp Thr

20 25

<210> 8

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 8

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Asp Leu Ala Glu Thr

20 25

<210> 9

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 9

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Lys Leu Glu Asn Thr

20 25

<210> 10

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 10

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Glu Lys Leu Glu Asn Thr

20 25

<210> 11

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 11

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Glu Lys Leu Glu Ser Thr

20 25

<210> 12

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 12

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Lys Leu Leu Asn Thr

20 25

<210> 13

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 13

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Lys Leu Leu Ser Thr

20 25

<210> 14

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 14

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Glu Lys Leu Leu Ser Thr

20 25

<210> 15

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 15

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Glu Lys Leu Glu Lys Thr

20 25

<210> 16

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 16

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Glu Lys Leu Ala Asn Thr

20 25

<210> 17

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 17

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Glu Lys Leu Ala Ser Thr

20 25

<210> 18

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 18

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Ala Lys Leu Ala Asn Thr

20 25

<210> 19

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 19

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Ala Lys Leu Ala Lys Thr

20 25

<210> 20

<211> 29

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> “未知”的描述：天然胰高血糖素序列

<400> 20

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 21

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 21

Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp Pro Glu

1 5 10 15

Phe Pro Ser Asp Lys Pro His His Lys Lys His His Lys Lys His His

20 25 30

Ser Ser Gly Ser Leu Glu

35

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(10)

<223> 该序列可包含5-10个残基

<400> 22

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(10)

<223> 该序列可包含5-10个残基

<400> 23

His His His His His His His His His His

1 5 10

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(10)

<223> 该序列可包含5-10个残基

<400> 24

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(10)

<223> 该序列可包含5-10个残基

<400> 25

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 26

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成6xHis标签

<400> 26

His His His His His His

1 5

<210> 27

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 27

Lys Lys Lys Lys Lys Lys

1 5

<210> 28

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 28

Glu Glu Glu Glu Glu Glu

1 5

<210> 29

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 29

Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 30

<211> 22

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> “未知”的描述：胰岛素序列

<400> 30

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg

20

Claims

1.一种包含胰高血糖素类似物的组合物，其中：

所述胰高血糖素类似物由天然存在的氨基酸组成；并且

所述胰高血糖素类似物在pH为pH 6至pH 8的溶液中稳定。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物在pH约为7.4的溶液中稳定。

3.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中在溶液中稳定包括对原纤维形成具有抗性、对化学降解具有抗性或其组合。

4.如权利要求2-3中任一项所述的组合物，其中对原纤维形成具有抗性包括与天然胰高血糖素相比具有降低的计算聚集评分并且在溶液中至少7天的时间段后具有降低的实验聚集。

5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物在与天然胰高血糖素中的易聚集区域相对应的区域中包含突变。

6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中天然胰高血糖素的氨基酸残基Phe6、Tyr10或Tyr13或其组合被另一氨基酸残基替代。

7.如权利要求2-6中任一项所述的组合物，其中对化学降解具有抗性包括是热力学稳定的、化学稳定的或其组合。

8.如权利要求7所述的组合物，其中当至少80％的所述胰高血糖素类似物在溶液中至少7天后未降解或未聚集时，所述胰高血糖素类似物是热力学稳定的。

9.如权利要求2-8中任一项所述的组合物，其中如果所述胰高血糖素类似物的脱酰胺作用在至少7天的时间段后相对于天然胰高血糖素减少，则所述胰高血糖素类似物对化学降解具有抗性。

10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变。

11.如权利要求10所述的组合物，其中在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变的所述胰高血糖素类似物的计算聚集评分低于天然胰高血糖素的计算聚集评分。

12.如权利要求10或11中任一项所述的组合物，其中在氨基酸残基22与氨基酸残基27之间的区域中包含至少一个突变的所述胰高血糖素类似物产生α-螺旋稳定化。

13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物与SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:19中的任一个或其片段具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。

14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物包含SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:19中的任一个。

15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物是人胰高血糖素类似物。

16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物的纯度为至少90％、95％、97％或99％。

17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物的C-末端包含天然胰高血糖素C-末端的稳定化α-螺旋结构。

18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物包含相对于天然胰高血糖素的Phe22、Val23、Trp25、Leu26、Met27、Asp15或其组合。

19.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物在相对于天然胰高血糖素的Phe22、Val23、Trp25、Leu26、Met27、Asp15或其组合处包含突变。

20.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述胰高血糖素类似物具有天然胰高血糖素的胰高血糖素受体激动剂活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

21.如权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中当在4℃下储存时，所述胰高血糖素类似物保持至少95％的效力达至少2年。

22.如权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中当在40℃下储存时，所述胰高血糖素类似物保持至少95％的效力达至少3个月。

23.一种药物组合物，其包含如权利要求1-22中任一项所述的组合物和药学上可接受的稀释剂。

24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内或经皮施用。

25.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求1-22中任一项所述的胰高血糖素类似物的核酸序列。

26.一种载体，其包含：

(a)编码表达标记物的第一核苷酸序列；

(b)编码裂解标记物的第二核苷酸序列；以及

(c)编码根据权利要求1-22中任一项所述的胰高血糖素类似物的第三核苷酸序列；

其中所述第一、第二和第三核苷酸序列以可操作的组合排列，

其中所述表达标记物包含与SEQ ID NO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFPSDKPHHKKHHKKHHSSGSLE)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且

其中所述裂解标记物包含Trp(W)氨基酸。

27.如权利要求26所述的载体，其中所述表达标记物进一步包括亲和标记物。

28.如权利要求27所述的载体，其中所述亲和标记物包含至少六个具有带电荷侧链的氨基酸。

29.如权利要求26所述的载体，其进一步包含编码包涵体指引肽的核苷酸序列。

30.如权利要求29所述的载体，其中所述包涵体指引肽选自：类固醇异构酶、类固醇异构酶的包涵体指引功能片段、类固醇异构酶的包涵体指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵体指引功能片段和BRCA2的包涵体指引功能同系物。

31.如权利要求26-30中任一项所述的载体，其进一步包含在细菌细胞或酵母细胞中有活性的核苷酸启动子序列。

32.一种用于产生胰岛素类似物的方法，所述方法包括：

a)在遗传修饰的细胞中表达异源融合肽，所述异源融合肽包含表达标记物、裂解标记物和如权利要求1-22中任一项所述的胰高血糖素类似物，其中所述表达标记物包含与SEQID NO:21(MKAIFVLKGSLDRDPEFPSDKPHHKKHHKKHHSSGSLE)或其片段具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述裂解标记物包含Trp(W)氨基酸；以及

b)裂解所述异源融合肽以从所述异源融合肽释放所述胰高血糖素类似物，从而产生所述胰高血糖素类似物。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述胰高血糖素类似物的纯度为至少95％。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述胰高血糖素类似物的纯度为至少99％。

35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述表达标记物进一步包括亲和标记物。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述亲和标记物包含至少六个具有带电荷侧链的氨基酸。

37.如权利要求35-36中任一项所述的方法，其进一步包括通过所述亲和标记物将所述异源融合肽与亲和材料结合。

38.如权利要求37所述的方法，其中在将所述异源融合肽与所述亲和材料结合之后，所述方法进一步包括洗涤所述亲和材料以去除未结合的材料。

39.如权利要求37-38中任一项所述的方法，其中当所述异源融合肽通过所述亲和标记物与所述亲和材料结合时，(b)中的裂解所述异源融合肽发生。

40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中在将所述异源融合肽与所述亲和材料结合之后，所述方法进一步包括使所述异源融合肽经受足以折叠目标肽的条件。

41.如权利要求32-40所述的方法，其中所述异源融合肽进一步包含包涵体指引肽。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述包涵体指引肽选自：类固醇异构酶、类固醇异构酶的包涵体指引功能片段、类固醇异构酶的包涵体指引功能同系物、BRCA2肽、BRCA2的包涵体指引功能片段和BRCA2的包涵体指引功能同系物。

43.如权利要求38-41所述的方法，其中在裂解所述异源融合肽之前，所述方法进一步包括从所述遗传修饰的细胞取出含有所述融合肽的包涵体，以及溶解所述包涵体中的所述融合肽。

44.如权利要求32-43中任一项所述的方法，其中(b)的所述裂解用选自NBS、NCS和P_d(H₂O)₄的试剂进行。

45.如权利要求32-44中任一项所述的方法，其中所述异源融合肽在表达后从所述遗传修饰的细胞中分泌。

46.如权利要求32-45中任一项所述的方法，其进一步包括在所述异源融合肽表达后裂解所述遗传修饰的细胞。

47.如权利要求32-46中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰的细胞是细菌细胞。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。

49.如权利要求32-48中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰的细胞是酵母细胞。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述异源融合蛋白进一步包含用于所述酵母细胞的分泌肽。

51.一种治疗有需要的患者的低血糖症的方法，其包括向所述患者施用如权利要求1-22中任一项所述的胰高血糖素类似物或如权利要求23-24中任一项所述的药物组合物。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述患者患有糖尿病。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述糖尿病是I型糖尿病。

54.如权利要求52所述的方法，其中所述糖尿病是II型糖尿病。

55.如权利要求51所述的方法，其中所述患者患有先天性高胰岛素血症。

56.如权利要求51-55中任一项所述的方法，其包括通过注射、贴剂或泵施用所述胰高血糖素类似物。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述注射是皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内或经皮注射。

58.如权利要求56所述的方法，其中所述泵是闭环泵系统。