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CN107108712A - 提高重组蛋白产量的方法 - Google Patents

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CN107108712A
CN107108712A CN201580073185.1A CN201580073185A CN107108712A CN 107108712 A CN107108712 A CN 107108712A CN 201580073185 A CN201580073185 A CN 201580073185A CN 107108712 A CN107108712 A CN 107108712A
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refolding
protein
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buffers
amino acid
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J·S·K·陈
B·H·根森
J·B·穆姆
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Armo BioSciences Inc
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Abstract

描述了通过例如优化重折叠条件来提高例如IL‑10等细胞因子的产量的方法。所述方法提供了以商业规模高效、成本有效地制造IL‑10的方式。

Description

提高重组蛋白产量的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月23日提交的美国申请序列号62/096,359的优先权权益，所述申请以引用的方式整体并入本文中。
技术领域
本公开涉及提高细胞因子大规模生产，包括优化蛋白质重折叠的方法。
简介
重组生产对于产生大量用于治疗和研究目的的目标蛋白质来说非常重要。常用的蛋白质表达系统包括来源于细菌(例如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisia)、杆状病毒/昆虫(例如Sf9和Sf21)和哺乳动物细胞的蛋白质表达系统。细菌蛋白质表达系统是有利的，因为细菌容易培养，生长迅速且产生高产量的重组蛋白。然而，一些蛋白质呈包涵体形式变得不溶，在没有苛刻变性剂和随后繁重的蛋白质重折叠程序的情况下，这些蛋白质常常难以回收。
在重组蛋白生产过程中，例如培养条件、分子伴侣的共同表达和折叠促进剂的使用等参数对于此过程来说常常是极为重要的。具体地说，折叠促进剂的利用有助于产生功能性重组蛋白。不幸地，需要针对每种目标蛋白质，鉴别和优化用于从包涵体回收蛋白质的技术。[参见Fahnert,B.,Methods in Molecular Biology,第824卷(“Using FoldingPromoting Agents in Recombinant Protein Production:A Review”(2012)]。
主要的重折叠技术包括基质辅助的重折叠、稀释重折叠、压力驱动的重折叠和连续重折叠。对于特定蛋白质来说，在实验室中优化的重折叠技术和条件(例如在基质辅助的重折叠方法中使用组氨酸标记的蛋白质)可能由于例如其成本和复杂性而不适用于大规模生产。[参见Jungbauer,A.和Kaar,W.,J.Biotech.(“Current Status of TechnicalProtein Refolding”(2006)]。无法以高效、成本有效的方式生产蛋白质可能导致在其它方面适用的治疗剂未能进入市场。由于在大规模生产中提高治疗性蛋白质的产量(包括从包涵体回收蛋白质)是极为重要的，所以在生产过程中关键参数的优化非常重要。
发明概述
本公开涵盖通过例如优化重折叠条件来提高例如IL-10等细胞因子和相关IL-10药剂的生产的方法。所述方法提供了一种高效、成本有效地在商业规模上制造IL-10的方式。此类优化生产的IL-10可以进行修饰(例如聚乙二醇化)并用于治疗和/或预防各种疾病、病症和病状和/或其症状的组合物中。
在最基础水平下，合成蛋白质并基于细胞的功能需求来调控。DNA包含蛋白质的“蓝图(blueprint)”并通过高度调控的转录过程来解码，以产生信使RNA(mRNA)。接着由mRNA编码的信息被翻译成多肽链。在翻译后，多肽以多种方式进行修饰，以使其结构完整，指定其位置或调控其在细胞内的活性。此类翻译后修饰的实例包括在分子伴侣蛋白的帮助下多肽折叠成球状蛋白；修饰已存在的氨基酸(例如去除第一个甲硫氨酸残基)；以及形成或还原二硫桥键。
若干机制可以用于产生大量用于例如治疗或研究目的的目标蛋白质。化学蛋白质合成(例如固相蛋白质合成(SPPS))产生高度纯的蛋白质，但仅仅对小型蛋白质和肽适用。化学合成的产量一般低，并且对于较长多肽来说，此方法过于昂贵。
体外(无细胞)蛋白质表达和体内蛋白质表达提供了产生蛋白质的替代方法。无细胞蛋白质表达为使用与翻译相容的全细胞的提取物，在体外合成蛋白质。当补充辅因子、核苷酸和特定基因模板时，这些提取物可以在几小时内合成目标蛋白质。虽然无法支撑大规模生产，但无细胞蛋白质表达系统允许快速合成重组蛋白，同时避免细胞培养的不便。
基于细胞的系统一般主要是由于能够产生高产量的目标蛋白质而用于蛋白质生产。传统的重组蛋白表达策略包括将细胞用含有模板的DNA载体转染，接着培养细胞，以便其转录并翻译所需蛋白质。通常，接着使细胞溶解，以提取所表达的蛋白质，用于随后纯化。
广泛使用原核生物与真核生物体内蛋白质表达系统。系统的选择取决于蛋白质的类型、功能活性的需求和所需产量。原核细菌大肠杆菌由于其生长迅速、生产成本低和产品产量高而成为最常用的蛋白质表达宿主。常常蛋白质沉积为不溶的包涵体，其随后需要重折叠来实现生物活性。由于错折叠和聚集，所以重折叠为许多蛋白质生产中的产量限制步骤。来源于大肠杆菌的蛋白质可以在重折叠后通过聚(乙二醇)(PEG)的共价缀合进行进一步修饰。
本公开部分涉及用于优化大(例如商业)规模IL-10生产的方式。本公开的一个方面源于以下发现，即IL-10重折叠不取决于体积(如先前所报道)，而是取决于IL-10浓度。在GMP生产中，观测到重折叠中IL-10浓度从0.7mg/mL减少至约0.3mg/mL使IL-10产量加倍。
在一些实施方案中，重折叠缓冲液中未折叠的IL-10单体的浓度为约0.01g/mL至约0.5g/mL、约0.02g/mL至约0.45g/mL、约0.03g/mL至约0.4g/mL、约0.04g/mL至约0.35g/mL、约0.05g/mL至约0.3g/mL、约0.06g/mL至约0.25g/mL、约0.07g/mL至约0.25g/mL、约0.08g/mL至约0.2g/mL、约0.09g/mL至约0.2g/mL、约0.1g/mL至约0.2g/mL或约0.15g/mL。在其它实施方案中，重折叠缓冲液中未折叠的IL-10单体的浓度超过约0.01g/mL、超过约0.02g/mL、超过约0.03g/mL、超过约0.04g/mL、超过约0.05g/mL、超过约0.06g/mL、超过约0.07g/mL、超过约0.08g/mL、超过约0.09g/mL、超过约0.1g/mL、超过约0.15g/mL、超过约0.2g/mL、超过约0.25g/mL或超过约0.3g/mL。在其它实施方案中，重折叠缓冲液中未折叠的IL-10单体的浓度低于约0.5g/mL、低于约0.45g/mL、低于约0.4g/mL、低于约0.35g/mL、低于约0.3g/mL、低于约0.25g/mL、低于约0.2g/mL或低于约0.1g/mL。如实验部分中所述，重折叠中最佳IL-10浓度确定为约0.15mg/mL；浓度大于约0.15mg/mL时，物质消失，因为IL-10聚集并变成不溶性沉淀物。
本公开的其它方面涉及用于重折叠过程中的精氨酸的存在和量。添加L-精氨酸进行重折叠产生超过两倍更大量的适当折叠的IL-10。在本公开的具体方面，精氨酸的浓度在0.01M-0.1M精氨酸范围内。如实验部分中所述，还发现超滤/渗滤(UFDF)缓冲液(例如20mMBis-Tris pH 6.5)中约0.1M精氨酸的存在是有益的，使产量增加估计两倍。
在一些实施方案中，精氨酸的浓度在约0.001M至约1.0M、约0.002M至约0.9M、约0.003M至约0.8M、约0.004M至约0.7M、约0.005M至约0.6M、约0.006M至约0.5M、约0.007M至约0.4M、约0.008M至约0.3M、约0.009M至约0.2M、约0.01M至约0.1M、约0.02M至约0.09M、约0.03M至约0.08M、约0.04M至约0.07M或约0.05M至约0.06范围内。在其它实施方案中，精氨酸的浓度超过约0.001M、超过约0.002M、超过约0.003M、超过约0.004M、超过约0.005M、超过约0.006M、超过约0.007M、超过约0.008M、超过约0.009M、超过约0.01M、超过约0.02M、超过约0.03M、超过约0.04M、超过约0.05M、超过约0.06M、超过约0.07M、超过约0.08M、超过约0.09M、超过约0.1M、超过约0.15M、超过约0.2M、超过约0.3M、超过约0.4M或超过约0.5M。在其它实施方案中，精氨酸的浓度低于约1.0M、低于约0.9M、低于约0.8M、低于约0.7M、低于约0.6M、低于约0.5M、低于约0.4M、低于约0.3M、低于约0.2M、低于约0.15M、低于约0.1M、低于约0.095M、低于约0.09M、低于约0.08M、低于约0.07M、低于约0.06M、低于约0.05M、低于约0.04M、低于约0.03M、低于约0.02M或低于约0.01M。
总体来说，本文所述的方法产生最佳的IL-10重折叠条件，其中rHuIL-10浓度为0.05至0.3mg/mL，其中精氨酸浓度介于0.01与0.1M之间。实际上，重折叠缓冲液和UFDF缓冲液中0.1M精氨酸的存在一致地使重折叠和回收的总IL-10增加两至四倍。在一个实施方案中，将最终重折叠环境最佳维持在pH 8.3下，在20％蔗糖、0.1M L-精氨酸、50mM Tris、0.45mM氧化型谷胱甘肽和0.05mM还原型谷胱甘肽存在下。
在具体实施方案中，本公开涵盖产生重折叠的IL-10的方法，所述方法包括：(a)获得包含未折叠的IL-10单体的混合物；和(b)使混合物与重折叠缓冲液接触以产生包含重折叠IL-10的掺和物；其中重折叠缓冲液中未折叠的IL-10单体的浓度为0.05g/mL至0.3g/mL。在一些实施方案中，重折叠缓冲液中未折叠的IL-10单体的浓度为0.1g/mL至0.25g/mL、0.1g/mL至0.2g/mL或约0.15g/mL。在某些实施方案中，IL-10为重组产生的人IL-10(rhIL-10)。RhIL-10可以在细菌(例如大肠杆菌)中表达。在一些实施方案中，上述混合物通过将多个包含IL-10的包涵体与悬浮缓冲液组合来产生。其它实施方案还包括将氧化还原体系，例如包含氧化型和还原型谷胱甘肽的氧化还原体系添加至重折叠缓冲液。
本公开涵盖其中将至少一种天然存在或非天然存在的氨基酸添加至重折叠缓冲液的实施方案。在一些实施方案中，氨基酸为精氨酸。在某些实施方案中，将0.005至0.3M精氨酸添加至重折叠缓冲液，将0.0075至0.25M精氨酸添加至重折叠缓冲液，将0.05M至0.2M精氨酸添加至重折叠缓冲液，或将0.01M至0.15M精氨酸添加至重折叠缓冲液。在其它实施方案中，本公开涵盖将约0.1M精氨酸和约0.15g/mL未折叠的IL-10单体添加至重折叠缓冲液。
在某些实施方案中，涵盖在使混合物与重折叠缓冲液接触以产生包含重折叠的IL-10的掺和物的步骤前，对上述混合物进行洗涤澄清。本公开涵盖其中对掺和物进行超滤/渗滤(UFDF)的实施方案。
本公开涵盖有助于实施本文阐述的公开内容的任何值的重折叠缓冲液pH。在某些实施方案中，pH可以小于约7.5、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8或大于约8.9。在具体实施方案中，重折叠缓冲液的pH为约pH 8.3。
本公开还涵盖一种IL-10重折叠缓冲液，其包含∶(a)包含0.05g/mL至0.3g/mL的浓度的未折叠的IL-10单体的混合物；和(b)0.005至0.3M的摩尔浓度的精氨酸。在一些实施方案中，重折叠缓冲液包含0.0075至0.25M精氨酸、0.05至0.2M精氨酸或约0.01至0.15M精氨酸。本文中公开精氨酸的其它可能浓度。
在某些实施方案中，未折叠的IL-10单体以约0.001g/mL至约1.0g/mL、约0.0025g/mL至约0.9g/mL、约0.005g/mL至约0.8g/mL、约0.0075g/mL至约0.7g/mL、约0.01g/mL至约0.6g/mL、约0.02g/mL至约0.5g/mL、约0.03g/mL至约0.4g/mL、约0.04g/mL至约0.35g/mL或约0.05至约0.3g/mL的浓度存在。在其它实施方案中，未折叠的IL-10单体的浓度为约0.05g/mL至约0.25g/mL、约0.1g/mL至约0.2g/mL或约0.15g/mL。在具体实施方案中，未折叠的IL-10单体的浓度为约0.05g/mL至约0.25g/mL、约0.1g/mL至约0.2g/mL或约0.15g/mL。
本公开涵盖其中未折叠的IL-10单体以超过约0.001g/mL、超过约0.0025g/mL、超过约0.005g/mL、超过约0.0075g/mL、超过约0.01g/mL、超过约0.02g/mL、超过约0.03g/mL、超过约0.04g/mL或超过约0.05g/mL的浓度存在的实施方案。在一些方面，本公开涵盖其中未折叠的IL-10单体以低于约1.0g/mL、低于约0.9g/mL、低于约0.8g/mL、低于约0.7g/mL、低于约0.6g/mL、低于约0.5g/mL、低于约0.4g/mL、低于约0.35g/mL、低于约0.3g/mL、低于约0.25g/mL、低于约0.2g/mL、低于约0.15g/mL或低于约0.1g/mL的浓度存在的实施方案。
一个具体实施方案涵盖一种重折叠缓冲液，其包含约0.1M精氨酸和约0.15g/mL未折叠的IL-10单体。
如此后进一步论述，人IL-10为同二聚体且每个单体包含178个氨基酸，其中前18个氨基酸构成信号肽。本公开的具体实施方案包含缺乏信号肽的成熟人IL-10多肽(参见例如美国专利No.6,217,857)。在其它具体实施方案中，IL-10药剂为成熟人IL-10的变体。变体可以展现小于成熟人IL-10的活性、与成熟人IL-10的活性相当或大于成熟人IL-10的活性的活性；在某些实施方案中，活性与成熟人IL-10的活性相当或大于成熟人IL-10的活性。
术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“药剂”等等意图从广义上解释，并包括例如人和非人IL-10相关多肽，包括同源物、变体(包括突变蛋白)和其片段，以及具有例如前导序列(例如信号肽)的IL-10多肽，和上述各者的修饰型式。在其它具体实施方案中，术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“药剂”为激动剂。具体实施方案涉及聚乙二醇化IL-10，其在本文中又称为“PEG-IL-10”。
本公开中所述的IL-10药剂可以包含至少一种修饰以形成经修饰的IL-10药剂，其中修饰不改变IL-10药剂的氨基酸序列。本公开的某些实施方案涵盖此类修饰以增强一种或多种特性(例如药代动力学参数、功效等)。在一些实施方案中，经修饰的IL-10药剂为PEG-IL-10药剂。PEG-IL-10药剂可以包含共价连接于IL-10的至少一个亚单元的至少一个氨基酸残基的至少一个PEG分子或在其它实施方案中包含单聚乙二醇化与二聚乙二醇化IL-10的混合物。PEG-IL-10药剂的PEG组分可以具有超过约5kDa、超过约10kDa、超过约15kDa、超过约20kDa、超过约30kDa、超过约40kDa或超过约50kDa的分子质量。在一些实施方案中，分子质量为约5kDa至约10kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。在具体实施方案中，上述修饰为位点特异性的，且在其它实施方案中，其包含接头。
本公开涵盖药物组合物，其包含药学有效量的一种或多种上述药剂和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。一般来说，此类组合物适于人施用。这些药物组合物可以包含一种或多种额外的预防剂或治疗剂，本文中描述了预防剂或治疗剂的实例。
本公开还涵盖治疗或预防受试者(例如人)中的IL-10相关疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向受试者施用(例如肠胃外，包括皮下)治疗有效量的IL-10药剂。
本文中描述了本公开的其它实施方案，同时熟练技术人员在回顾本公开后将设想另外其它实施方案。
详述
在进一步描述本公开前，应了解，本公开不限于本文中阐述的具体实施方案，且还应了解，本文所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，而不意图限制。
在提供值的范围的情况下，应了解除非上下文另外清楚规定，否则本发明内涵盖介于该范围的上限与下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一，以及所述范围内的任何其它所述或中间值。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，且也涵盖于本发明内，经受所述范围内的任何特别排除的界限。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些所包括的界限的一者或两者的范围也包括在本发明内。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
必须注意，如本文所用和在随附权利要求书中，除非上下文另外清楚规定，否则单数形式“一种(a/an)”和“所述”包括复数指示物。进一步注意，权利要求书可以设计成排除任何任选的要素。因而，此声明意图用作例如“只是”、“仅仅”等此类排除性术语结合权利要求要素的叙述使用或“负面”限制使用的前提基础。
本文论述的公布只是提供其在本申请的提交日期前的公开内容。此外，所提供的公布的日期可以不同于实际公布日期，实际公布日期需要独立确定。
综述
本公开涵盖提高细胞因子(例如IL-10)大规模(例如商业)生产的方法，所述方法包括优化蛋白质重折叠。细胞因子(例如IL-10)可用于治疗和/或预防广泛的疾病、病症和病状和/或其症状，包括癌症和免疫、炎性和病毒相关的病症。
本文中阐述的一些实施方案和描述是在IL-10药剂(例如PEG-IL-10药剂)的背景下描述的。应了解，根据其使用的上下文，适当时，IL-10药剂的叙述还可以更广泛地指代细胞因子剂。
应注意，结合本公开的多肽和核酸分子的对“人”的任何提及不意指限制获得多肽或核酸的方式或来源，而是在其可能对应于天然存在的人多肽或核酸分子的序列时，仅仅提及序列。除人多肽和编码其的核酸分子外，本公开涵盖来自其它物种的IL-10相关的多肽和对应核酸分子(且在某些情况下，细胞因子多肽和对应核酸分子)。
定义
除非另有指示，否则以下术语意图具有以下阐述的含义。贯穿本说明书，在其它地方定义其它术语。
术语“患者”或“受试者”可以互换使用以指代人或非人动物(例如哺乳动物)。
术语“施用(administration)”、“施用(administer)”等在应用于例如受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指例如IL-10或PEG-IL-10)、核酸(例如编码天然人IL-10的核酸)、包括上述各者的药物组合物或诊断剂与受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。在细胞背景下，施用包括试剂与细胞接触(例如体外或离体)，以及试剂与流体接触，其中流体与细胞接触。
术语“治疗(treat、treating、treatment)”等是指在已经诊断、观测到疾病、病症或病状或其症状等等后开始的作用过程(例如施用IL-10或包含IL-10的药物组合物)，以便暂时或永久地消除、减少、遏制、减轻或改善折磨受试者的疾病、病症或病状的至少一种潜在原因，或与折磨受试者的疾病、病症、病状有关的至少一种症状。因此，治疗包括抑制活跃疾病(例如阻止疾病、病症或病状或与其相关的临床症状的发展或进一步发展)。所述术语还可以用于其它背景下，例如在例如流体相或胶体相中IL-10或PEG-IL-10接触IL-10受体的情况。
如本文所用，术语“需要治疗”是指医师或其它护理者作出的受试者需要治疗或将受益于治疗的判断。此判断是基于医师或护理者专业知识领域中的多种因素作出的。
术语“预防(prevent、preventing、prevention)”等等是指一般在倾向于患上具体疾病、病症或病状的受试者的背景下，以暂时或永久地预防、遏制、抑制或减少受试者发展疾病、病症、病状等的风险(如通过例如临床症状的缺乏所确定)或延迟其发作的方式(例如在疾病、病症、病状或其症状发作前)开始的作用过程(例如施用IL-10或包含IL-10的药物组合物)。在某些情况下，所述术语还指减缓疾病、病症或病状的进展或抑制其进展至有害的或在其它方面不希望的状态。
如本文所用，术语“需要预防”是指医师或其它护理者作出的受试者需要预防性护理或将受益于预防性护理的判断。此判断是基于医师或护理者专业知识领域中的多种因素作出的。
短语“治疗有效量”是指药剂单独或作为药物组合物的一部分并以单一剂量或作为一系列剂量的一部分，以在施用于受试者时能够对疾病、病症或病状的任何症状、方面或特征具有任何可检测的积极作用的量施用于受试者。治疗有效量可以通过测量相关的生理作用来确定，且其可以结合给药方案和对受试者的病状的诊断分析等等来进行调整。举例来说，测量在施用后产生的炎性细胞因子的量可以指示是否已经使用治疗有效量。
短语“足够实现改变的量”意指在施用具体的疗法前(例如基线水平)和施用具体的疗法后测量的指示物的水平之间存在可检测的差异。指示物包括任何客观参数(例如IL-10的血清浓度)或主观参数(例如受试者的健康感觉)。
术语“小分子”是指分子量小于约10kDa、小于约2kDa或小于约1kDa的化合物。小分子包括(但不限于)无机分子、有机分子、含有无机组分的有机分子、包含放射性原子的分子和合成分子。在治疗学上，小分子可能比大分子更可透过细胞，更不易降解，且更太不可能引起免疫反应。
术语“配体”是指例如可以充当受体的激动剂或拮抗剂的肽、多肽、膜相关分子或膜结合分子或其复合物。“配体”涵盖天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和来源于抗体的结合组合物。“配体”还涵盖小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。该术语还涵盖既不是激动剂也不是拮抗剂，但可以结合于受体，却不显著地影响其生物特性(例如信号传导或附着)的试剂。此外，该术语包括已经例如通过化学或重组方法变成膜结合配体的可溶型式的膜结合配体。配体或受体可以完全在细胞内，即，其可以存在于细胞溶质、细胞核或一些其它细胞内隔室中。配体与受体的复合物被称为“配体-受体复合物”。
术语“抑制剂”和“拮抗剂”或“活化剂”和“激动剂”分别是指例如用于活化例如配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的抑制或活化分子。抑制剂为减少、阻断、预防例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞、延迟其活化、使其失活、使其脱敏或下调的分子。活化剂为增加、活化、促进例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞、增强其活化、使其敏化或上调的分子。抑制剂也可以定义为减少、阻断组成性活性或使组成性活性失活的分子。“激动剂”为与靶标相互作用以引起或促进靶标活化增加的分子。“拮抗剂”为与激动剂的作用相反的分子。拮抗剂预防、减少、抑制或中和激动剂的活性，且即使在不存在鉴别的激动剂的情况下，拮抗剂还可以预防、抑制或减少例如靶标受体等靶标的组成性活性。
术语“调节(modulate、modulation)”等是指分子(例如活化剂或抑制剂)直接或间接地增加或降低药剂(例如IL-10药剂)(或编码其的核酸分子)的功能或活性的能力；或增强分子产生与药剂(例如IL-10药剂)的作用相当的作用的能力。术语“调节剂”意指广泛地指代可以实现上述活性的分子。举例来说，例如基因、受体、配体或细胞的调节剂为改变基因、受体、配体或细胞的活性的分子，其中活性在其调控特性上可以活化、抑制或改变。调节剂可以单独起作用，或其可以使用辅因子，例如蛋白质、金属离子或小分子。术语“调节剂”包括通过与药剂(例如IL-10药剂)相同的作用机制起作用(即，以类似于药剂(例如IL-10药剂)的方式调节与其相同的信号传导通路的药剂)并能够引起与药剂(例如IL-10药剂)的生物反应相当(或超过)的生物反应的药剂。
调节剂的实例包括小分子化合物和其它生物有机分子。小分子化合物的许多文库(例如组合文库)可商购获得并可以用作鉴别调节剂的起点。熟练技术人员能够开发一种或多种测定法(例如生物化学或基于细胞的测定法)，其中可以筛选此类化合物文库，以鉴别具有所需特性的一种或多种化合物；此后，熟练的药物化学家能够通过例如合成和评估其类似物和衍生物来优化此类一种或多种化合物。还可以利用合成和/或分子模型研究来鉴别活化剂。
分子的“活性”可以描述或指分子与配体或与受体的结合；催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性；其它分子的活性的调节等等。该术语还可以指调节或维持细胞与细胞的相互作用(例如附着)的活性或维持细胞结构(例如细胞膜)的活性。“活性”还可以意指比活性，例如[催化活性]/[蛋白质毫克数]或[免疫活性]/[蛋白质毫克数]、生物隔室中的浓度等等。术语“增殖活性”涵盖促进例如正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移和血管生成等这些所需或特别与这些相关的活性。
如本文所用，“相当的”、“相当的活性”、“活性相当于”、“相当的作用”、“作用相当于”等等为可以定量和/或定性地观察的相对术语。此类术语的含义常常取决于其使用的上下文。举例来说，从定性观点看，都使受体活化的两种药剂可以视为具有相当的作用，但从定量观点看，如果如在本领域公认的测定法(例如剂量-反应测定法)或本领域公认的动物模型中测定，一种药剂仅仅能够实现另一种药剂活性的20％，那么该两种药剂可以视为缺乏相当的作用。当一种结果与另一种结果(例如，一种结果与参考标准)比较时，“相当的”常常意指一种结果偏离参考标准不到35％、不到30％、不到25％、不到20％、不到15％、不到10％、不到7％、不到5％、不到4％、不到3％、不到2％或不到1％。在具体实施方案中，如果一种结果偏离参考标准不到15％、不到10％或不到5％，那么一种结果与参考标准相当。举例来说(但不限制)，活性或作用可指功效、稳定性、溶解性或免疫原性。
术语例如细胞、组织、器官或生物体的“反应”涵盖生物化学或生理学行为的变化，例如生物隔室内的浓度、密度、附着或迁移、基因表达速率或分化状态，其中变化与活化、刺激或治疗或与例如遗传程序化等内部机制相关。在某些背景下，术语“活化”、“刺激”等是指如通过内部机制以及通过外部或环境因素调控的细胞活化；而术语“抑制”、“下调”等是指相反的作用。
在本文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可以包括基因编码和非基因编码的氨基酸、经化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有经修饰的多肽主链的多肽。所述术语包括融合蛋白，包括(但不限于)具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合蛋白；有或无N端甲硫氨酸残基的融合蛋白；具有免疫标记的蛋白质的融合蛋白；等等。
应了解，贯穿本公开，根据单字母或三字母码提及氨基酸。为了便于读者，以下提供了单字母和三字母氨基酸码：
G 甘氨酸 Gly P 脯氨酸 Pro
A 丙氨酸 Ala V 缬氨酸 Val
L 亮氨酸 Leu I 异亮氨酸 Ile
M 甲硫氨酸 Met C 半胱氨酸 Cys
F 苯丙氨酸 Phe Y 酪氨酸 Tyr
W 色氨酸 Trp H 组氨酸 His
K 赖氨酸 Lys R 精氨酸 Arg
Q 谷氨酰胺 Gln N 天冬酰胺 Asn
E 谷氨酸 Glu D 天冬氨酸 Asp
S 丝氨酸 Ser T 苏氨酸 Thr
如本文所用，术语“变体”涵盖天然存在的变体和非天然存在的变体。天然存在的变体包括同源物(在一种物种与另一种物种之间，氨基酸或核苷酸序列分别不同的多肽和核酸)和等位基因变体(在一种物种内的一名个体与另一名个体之间，氨基酸或核苷酸序列分别不同的多肽和核酸)。非天然存在的变体包括分别包含氨基酸或核苷酸序列变化的多肽和核酸，其中人工引入序列变化(例如突变蛋白)；例如，在实验室中通过人介入(“人手”)来产生变化。因此，本文中“突变蛋白”广泛地指代突变的重组蛋白，其通常携带单个或多个氨基酸取代并常常来源于已经经受定点或随机突变诱发的克隆基因或来源于完全合成的基因。
术语“DNA”、“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换使用，以指代任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物形式或其类似物。多核苷酸的非限制性实例包括线性和环形核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等等。
如本文所用，在多肽结构的上下文中，“N端”(或“氨基端”)和“C端”(或“羧基端”)分别是指多肽的末端氨基和羧基端，而术语“N端的”和“C端的”分别是指多肽的氨基酸序列中相对于N端和C端的位置并可以分别包括处于N端和C端的残基。“近N端”或“近C端”是指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，其中第一和第二氨基酸残基共价结合以提供连续的氨基酸序列。
在氨基酸序列或多核苷酸序列的上下文中(例如“来源于”IL-10多肽的氨基酸序列)，“来源于”意味着指示多肽或核酸的序列是基于参考多肽或核酸(例如天然存在的IL-10多肽或IL-10编码核酸)的序列，且不意味限制制备蛋白质或核酸的来源或方法。举例来说，术语“来源于”包括参考氨基酸或DNA序列的同源物或变体。
在多肽的上下文中，术语“分离”是指如果天然存在，那么处于与天然存在时所处的环境不同的环境中的目标多肽。“分离”意图包括在样品内大量富集目标多肽和/或其中目标多肽部分或基本上纯化的多肽。在多肽不天然存在的情况下，“分离”指示多肽已经与通过合成或重组方式制成其的环境分离。
“富集”意指样品非天然操控(例如通过科学家)，使得目标多肽以a)大于例如生物样品等起始样品(例如多肽天然存在或在施用后多肽存在的样品)中的多肽浓度(例如至少大3倍、至少大4倍、至少大8倍、至少大64倍或更多)；或b)超过制成多肽的环境(例如如细菌细胞中)的浓度的浓度存在。
“基本上纯”指示组分(例如多肽)占组合物总含量的超过约50％，并通常超过总多肽含量的约60％。更通常，“基本上纯”是指其中总组合物的至少75％、至少85％、至少90％或更多为目标组分的组合物。在一些情况下，多肽将占组合物总含量的超过约90％或超过约95％。
在提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时术语“特异性结合”或“选择性结合”指示决定蛋白质的异源群体和其它生物制剂中蛋白质的存在的结合反应。因此，在指定条件下，指定配体结合于特定受体且不大量结合于样品中存在的其它蛋白质。所涵盖的方法的抗体或来源于抗体的抗原结合位点的结合组合物结合于其抗原或其变体或突变蛋白，其中亲和力比任何其它抗体或来源于其的结合组合物的亲和力大至少两倍、至少十倍、至少20倍或至少100倍。在一个具体实施方案中，抗体将具有如例如通过斯卡查德分析(Scatchard analysis)所测定，超过约109升/摩尔的亲和力(Munsen等人,1980Analyt.Biochem.107:220-239)。
IL-10和PEG-IL-10
抗炎性细胞因子IL-10又称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，被分类为2型(类)细胞因子，2型(类)细胞因子是一组包括IL-19、IL-20、IL-22、IL-24(Mda-7)和IL-26、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-κ、IFN-Ω和IFN-τ)和干扰素样分子(限制素(limitin)、IL-28A、IL-28B和IL-29)的细胞因子。
IL-10为在免疫调控和炎症中具有多效性作用的细胞因子。虽然主要在巨噬细胞中表达，但在活化T细胞、B细胞、肥大细胞和单核细胞中也检测到IL-10表达。其由肥大细胞产生，抵抗这些细胞在过敏反应部位上的具有的炎性作用。虽然IL-10主要限制促炎性细胞因子响应于toll样受体激动剂的产生和分泌，但其也刺激某些T细胞和肥大细胞并刺激B细胞成熟、增殖和抗体产生。IL-10可以阻断NF-κB活性且参与调控JAK-STAT信号传导通路。其还诱发CD8+T细胞的细胞毒活性和B细胞的抗体产生，且其抑制巨噬细胞活性和促进肿瘤的炎症。CD8+T细胞的调控为剂量依赖性的，其中剂量越高，诱发的细胞毒反应越强。
作为其多效性活性的结果，IL-10与大量疾病、病症和病状有关，包括炎性病状、免疫相关病症、纤维化病症、包括胆固醇调控在内的代谢病症和癌症。针对大量此类疾病、病症和病状，IL-10的临床和临床前评估已经确定了其治疗潜能。
人IL-10为分子质量为37kDa的同二聚体，其中每个18.5kDa单体包含178个氨基酸，其中前18个氨基酸构成信号肽。每个单体包含形成两个分子内二硫键的四个半胱氨酸残基。IL-10二聚体在两个单体亚单元之间的非共价相互作用被破坏时变成生物学上非活性的。从公开的IL-10晶体结构中获得的数据指示功能二聚体展现与IFN-γ某些相似之处(Zdanov等人(1995)Structure(Lond)3:591-601)。本文中的描述一般是指同二聚体；然而，论述的某些方面还可以应用于单体，如从上下文将显而易见。
本公开的多种实施方案涵盖展现80％同源性的人IL-10(NP_000563)和鼠类IL-10(NP_034678)和其用途。另外，本公开的范围包括来自其它哺乳动物物种，包括大鼠(登记NP_036986.2；GI 148747382)；奶牛(登记NP_776513.1；GI 41386772)；绵羊(登记NP_001009327.1；GI 57164347)；犬(登记ABY86619.1；GI 166244598)；和兔(登记AAC23839.1；GI 3242896)的IL-10直系同源物和其修饰形式。
如上所指出，术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“IL-10分子”、“IL-10药剂”等等意图广泛地解释并包括例如人和非人IL-10相关多肽，包括同源物、变体(包括突变蛋白)和其片段以及具有例如前导序列(例如信号肽)的IL-10多肽和上述各者的经修饰的型式。在其它具体实施方案中，IL-10、IL-10多肽和IL-10药剂为激动剂。
IL-10受体为II型细胞因子受体，由α和β亚单元组成，α和β亚单元还分别称为R1和R2。受体活化需要结合于α与β二者。IL-10多肽的一种同二聚体结合于α且同一IL-10多肽的另一同二聚体结合于β。
重组人IL-10的效用常常受其相对较短的血清半衰期限制，血清半衰期相对较短可以归因于例如肾清除、蛋白降解和血流中的单体化。结果，已经探索多种方法来改善IL-10的药代动力学特征而不破坏其二聚结构，因此不会不利地影响其活性。IL-10的聚乙二醇化导致改善某些药代动力学参数(例如血清半衰期)和/或增强活性。
如本文所用，术语“聚乙二醇化IL-10”和“PEG-IL-10”是指一个或多个聚乙二醇分子一般经由使连接稳定的接头共价连接于IL-10蛋白质的至少一个氨基酸残基的IL-10分子。术语“单聚乙二醇化IL-10”和“单-PEG-IL-10”指示一个聚乙二醇分子一般经由接头共价连接于IL-10二聚体的一个亚单元上的单个氨基酸残基。如本文所用，术语“二聚乙二醇化IL-10”和“二-PEG-IL-10”指示至少一个聚乙二醇分子一般经由接头连接于IL-10二聚体的每个亚单元上的单个残基。
在某些实施方案中，本公开中所用的PEG-IL-10为单-PEG-IL-10，其中一至九个PEG分子经由接头共价连接于IL-10二聚体的一个亚单元的N端的氨基酸残基的α氨基。一个IL-10亚单元上的单聚乙二醇化一般由于亚单元改组而产生非聚乙二醇化、单聚乙二醇化和二聚乙二醇化IL-10的非均质混合物。此外，允许聚乙二醇化反应进行到结束一般将产生非特异性和多聚乙二醇化IL-10，因此降低其生物活性。因此，本公开的具体实施方案包括施用通过本文中描述的方法产生的单聚乙二醇化IL-10与二聚乙二醇化IL-10的混合物。
在一些实施方案中，可以使用N端聚乙二醇化化学策略，此策略在确定的时间段内(例如少于18小时)以大约99％特异性将N端聚乙二醇化。允许化学反应超过该时间继续进行会导致增加赖氨酸侧链聚乙二醇化。若干聚乙二醇化方法描述于实验部分中。
在具体实施方案中，PEG部分的平均分子量介于约5kDa与约50kDa之间。虽然PEG连接IL-10的方法或位点不是关键，但在某些实施方案中，聚乙二醇化不改变或仅仅最低程度地改变IL-10药剂的活性。在某些实施方案中，半衰期的增加超过任何生物活性的下降。PEG-IL-10的生物活性通常通过评估用细菌抗原(脂多糖(LPS))激发并用PEG-IL-10处理的受试者的血清中炎性细胞因子(例如TNF-α或IFN-γ)的水平来测量，如美国专利No.7,052,686中所描述。
可以制备具有多种所需目标的IL-10变体(未通过例如聚乙二醇化进行修饰)，包括增加血清半衰期、减少针对IL-10的免疫反应、促进纯化或制备、减少IL-10转变成其单体亚单元、改善治疗功效和减轻在治疗使用期间副作用的严重程度或发生。氨基酸序列变体通常为在自然界中未发现的预定变体，但一些变体可以为翻译后变体，例如糖基化变体。可以使用IL-10的任何变体，条件是其保留IL-10活性的适合水平。如同野生型IL-10一样，如本文中描述，可以修饰这些IL-10变体(通过例如聚乙二醇化或Fc融合)。
短语“保守氨基酸取代”是指通过用具有类似侧链酸性、碱性、电荷、极性或尺寸的侧链的氨基酸替换蛋白质中的氨基酸来保存蛋白质活性的取代。保守氨基酸取代一般需要以下各组内的氨基酸残基的取代：1)L、I、M、V、F；2)R、K；3)F、Y、H、W、R；4)G、A、T、S；5)Q、N；和6)D、E。关于取代、插入或缺失的指导可以基于不同的变体蛋白或来自不同物种的蛋白质的氨基酸序列的比对。因此，除任何天然存在的IL-10多肽外，本公开涵盖具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，通常至多20个、10个或5个氨基酸取代，其中取代通常为保守氨基酸取代。
本公开还涵盖含有来源于成熟IL-10的连续氨基酸残基的成熟IL-10的活性片段(例如子序列)。肽或多肽子序列的连续氨基酸残基的长度取决于子序列所来源于的特定的天然存在的氨基酸序列而变化。一般来说，肽和多肽可以为约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸至多达全长肽或多肽。
另外，在确定的连续氨基酸长度(例如“比较窗口”)上，IL-10多肽可以具有确定的与参考序列比较的序列一致性。用于比较的序列比对方法为本领域中已知。用于比较的最佳序列比对可以例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包(Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过人工比对和肉眼观察(参见例如Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人编辑,1995增刊))进行。
举例来说，合适的IL-10多肽可以包含与约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸至多达全长肽或多肽的连续区段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
如下文进一步论述，IL-10多肽可以自非天然来源(例如除其天然存在的环境外的环境)分离，且还可以重组制备(例如在经遗传修饰的宿主细胞中，例如细菌、酵母、毕赤氏酵母属(Pichia)、昆虫细胞等等)，其中经遗传修饰的宿主细胞用包含编码多肽的核苷酸序列的核酸修饰。IL-10多肽还可以合成产生(例如通过无细胞的化学合成)。
本公开涵盖编码IL-10药剂的核酸分子，包括其天然存在的和非天然存在的同种型、等位基因变体和剪接变体。本公开还涵盖在一个或多个碱基上不同于天然存在的DNA序列，但由于遗传密码的简并性而仍然被翻译成对应于IL-10多肽的氨基酸序列的核酸序列。
本公开还涵盖基因疗法结合本文中的教义使用。基因疗法通过递送通常包装在载体中的遗传物质至受试者内的内源性细胞以引入新颖基因、引入预先存在的基因的其它拷贝、削弱已存在的基因的功能或修复已存在但无功能的基因来实现。一旦在细胞内部，核酸就由细胞机构表达，导致产生目标蛋白质。在本公开的上下文中，基因疗法用作治疗剂来递送编码IL-10药剂的核酸，用于治疗或预防本文中描述的疾病、病症或病状。
如上所提到，对于基因疗法的用途和方法，受试者中的细胞可以在体内用编码如本文中阐述的IL-10相关多肽的核酸转化。或者，细胞可以在体外用转基因或多核苷酸转化，接着移植至受试者的组织中以实现治疗。另外，原代细胞分离物或确立的细胞系可以用转基因或编码IL-10相关多肽的多核苷酸转化，接着任选地移植至受试者的组织中。
IL-10的产生方法
本公开的多肽可以通过任何合适的方法，包括非重组(例如化学合成)和重组方法产生。
A.化学合成
在多肽化学合成的情况下，可以经由液相或固相进行合成。固相肽合成(SPPS)允许非天然氨基酸和/或肽/蛋白质主链修饰的并入。例如9-芴基甲氧羰基(Fmoc)和叔丁氧羰基(Boc)等SPPS的多种形式可用于合成本公开的多肽。化学合成的细节为本领域中已知(例如Ganesan A.(2006)Mini Rev.Med.Chem.6:3-10；和Camarero J.A.等人(2005)ProteinPept Lett.12:723-8)。
固相肽合成可以如此后所述来进行。α官能团(Nα)和任何反应性侧链用酸不稳定性或碱不稳定性基团保护。保护基在用于连接酰胺键的条件下为稳定的，但在不削弱已经形成的肽链下容易裂解。α-氨基官能团的合适的保护基包括(但不限于)以下：Boc、苯甲氧羰基(Z)、O-氯苯甲氧羰基、联苯基异丙氧基羰基、叔戊氧基羰基(Amoc)、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基-苯甲氧羰基、o-硝基亚磺酰基、2-氰基-叔丁氧基-羰基、Fmoc、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代基环己-1-亚基)乙基(Dde)等等。
合适的侧链保护基包括(但不限于)：乙酰基、烯丙基(All)、烯丙氧基羰基(Alloc)、苯甲基(Bzl)、苯甲氧羰基(Z)、叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲氧基甲基(Bom)、邻溴苯甲氧羰基、叔丁基(tBu)、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苯甲基、2-氯苯甲氧羰基、2,6-二氯苯甲基、环己基、环戊基、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代基环己-1-亚基)乙基(Dde)、异丙基、4-甲氧基-2,3-6-三甲基苯甲基磺酰基(Mtr)、2,3,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、新戊酰基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、2,4,6-三甲氧基苯甲基、三甲基甲硅烷基和三苯甲基(Trt)。
在固相合成中，C端氨基酸与合适的载体材料偶联。合适的载体材料为对合成过程的逐步缩合和裂解反应的试剂和反应条件为惰性的且不溶于所用的反应介质的材料。可商购获得的载体材料的实例包括已经用反应基团和/或聚乙二醇改性的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；氯甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；羟甲基化或氨基甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物等等。当需要制备肽酸(peptidic acid)时，可以使用用4-苯甲氧基苯甲醇(王氏锚(Wang-anchor))或2-氯三苯甲基氯衍生化的聚苯乙烯(1％)-二乙烯基苯或在肽酰胺的情况下，可以使用用5-(4'-氨基甲基)-3',5'-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL-锚)或对(2,4-二甲氧基苯基-氨基甲基)-苯氧基(瑞克酰胺锚(Rink amideanchor))衍生化的聚苯乙烯(1％)二乙烯基苯或
与聚合物载体的连接可以通过在室温或高温(例如，40℃与60℃之间)下在乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮或类似溶剂中添加活化试剂，使C端Fmoc保护的氨基酸与载体材料反应例如2至72小时的反应时间来实现。
Nα保护的氨基酸(例如Fmoc氨基酸)与PAL、王氏或瑞克锚的偶联可以例如借助于例如N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC)或其它碳化二亚胺、四氟硼酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲脲(TBTU)或其它脲阳离子盐、O-酰基-脲、六氟磷酸苯并三唑-1-基-三-吡咯烷子基-(PyBOP)或其它盐、N-羟基琥珀酰亚胺、其它N-羟基酰亚胺或肟等偶联试剂，在1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑存在或不存在下，例如借助于TBTU，在添加HOBt的情况下，在添加或不添加诸如例如二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺或N-甲基吗啉，例如二异丙基乙胺等碱的情况下来进行，反应时间为2至72小时(例如在1.5至3倍过量的氨基酸与偶联试剂中，例如在2倍过量中和在约10℃与50℃之间，例如25℃的温度下，在例如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷，例如二甲基甲酰胺等溶剂中3小时)。
代替偶联试剂，还可能在上述条件下使用活性酯(例如五氟苯基、对硝基苯基等等)、Nα-Fmoc-氨基酸的对称酸酐、其酰基氯或酰基氟。
Nα保护的氨基酸(例如Fmoc氨基酸)可以与2-氯三苯甲基树脂在二氯甲烷中通过添加DIEA来偶联，且反应时间为10至120分钟，例如20分钟，但不限于此溶剂和此碱的使用。
经保护的氨基酸的连续偶联可以根据肽合成中，通常自动化肽合成器中的常规方法进行。在通过在二甲基甲酰胺中用例如哌啶(10％至50％)处理5至20分钟，例如在DMF中用50％哌啶处理2×2分钟并在DMF中用20％哌啶处理1×15分钟使固相上偶联的氨基酸的Nα-Fmoc保护基裂解后，使3至10倍过量，例如10倍过量的下一经保护的氨基酸与先前的氨基酸在惰性、非水性、极性溶剂(例如二氯甲烷、DMF或两者的混合物)中并在约10℃与50℃之间，例如在25℃的温度下偶联。先前关于第一Nα-Fmoc氨基酸与PAL、王氏或瑞克锚偶联所提及的试剂适合作为偶联试剂。经保护的氨基酸的活性酯或其氯化物或氟化物或对称酸酐也可以用作替代物。
在固相合成结束时，肽从载体材料裂解，同时使侧链保护基裂解。可以用三氟乙酸或其它强烈酸性介质，通过添加5％-20％V/V例如二甲硫醚、乙基甲硫醚、茴香硫醚、硫代甲酚、间甲酚、苯甲醚乙二硫醇、苯酚或水等清除剂，例如15％v/v二甲硫醚/乙二硫醇/间甲酚1:1:1，在0.5至3小时，例如2小时内，进行裂解。具有完全保护的侧链的肽通过用冰醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷2:2:6使2-氯三苯甲基锚裂解来获得。经保护的肽可以通过硅胶色谱法来纯化。如果肽经由王氏锚连接于固相且如果意图获得具有C端烷基酰胺化的肽，那么可以通过用烷基胺或氟烷基胺氨解来进行裂解。在约-10℃与50℃之间(例如约25℃)的温度下进行氨解且反应时间在约12与24小时之间(例如约18小时)。另外，可以通过例如用甲醇再酯化，从载体裂解肽。
获得的酸性溶液可以与3至20倍量的冷醚或正己烷，例如10倍过量的乙醚混合，以使肽沉淀，并由此分离保持在醚中的清除剂和裂解的保护基。进一步纯化可以通过将肽从冰醋酸再沉淀若干次来进行。获得的沉淀物可以溶解于水或叔丁醇或两种溶剂的混合物，例如叔丁醇/水的1:1混合物中，并冻干。
获得的肽可以通过多种色谱法来纯化，包括在弱碱性树脂上以乙酸盐形式进行离子交换；疏水性吸附色谱法，在未衍生化聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物(例如XAD)上；硅胶吸附色谱法；离子交换色谱法，例如在羧甲基纤维素上；分配色谱法，例如在G-25上；逆流分配色谱法；或高压液相色谱法(HPLC)，例如反相HPLC，在辛基或十八基甲硅烷基二氧化硅(ODS)相上。
B.重组产生
描述人和小鼠IL-10制备的方法可见于例如美国专利No.5,231,012中，该专利教导用于产生具有IL-10活性的蛋白质的方法，包括重组和其它合成技术。IL-10可以来源于病毒，且病毒IL-10从艾勃斯坦因巴尔病毒(Epstein Barr virus)(BCRF1蛋白质)的克隆和表达在Moore等人,(1990)Science 248:1230中公开。可以使用本领域中已知的标准技术，例如本文中描述的技术，用许多方式获得IL-10。重组人IL-10还可以从PeproTech,Inc.(Rocky Hill,N.J.)商购获得。
在使用重组技术产生多肽的情况下，可以使用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞来以细胞内蛋白质形式或分泌蛋白质形式产生多肽，所述宿主细胞可以为原核或真核细胞，分别为例如细菌(例如大肠杆菌)或酵母宿主细胞。可以用作宿主细胞的真核细胞的其它实例包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。在使用哺乳动物宿主细胞的情况下，其可以包括人细胞(例如HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如NIH3T3、L细胞和C127细胞)；灵长类动物(例如Cos 1、Cos 7和CV1)；和仓鼠细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。
适于表达多肽的多种宿主-载体系统可以根据本领域中已知的标准程序采用。参见例如Sambrook等人,1989Current Protocols in Molecular Biology Cold SpringHarbor Press,New York；和Ausubel等人1995Current Protocols in MolecularBiology,编辑Wiley and Sons。用于将遗传物质引入宿主细胞中的方法包括例如转化、电穿孔、缀合、磷酸钙法等。可以选择转移方法，以便提供所引入的多肽编码核酸的稳定表达。多肽编码核酸可以呈可遗传的附加元件(例如质粒)提供或可以进行基因组整合。可商购获得用于产生目标多肽的多种适当载体。
载体可以提供宿主细胞中染色体外维持或可以提供整合至宿主细胞基因组中。表达载体提供转录和翻译调控序列，并可以提供诱导型或组成型表达，其中编码区在转录起始区以及转录和翻译终止区的转录控制下可操作地连接。一般来说，转录和翻译调控序列可以包括(但不限于)启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和强化子或活化子序列。启动子可以为组成型或诱导型的，且可为强组成型启动子(例如T7)。
表达构建体一般具有位于启动子序列附近的方便限制性位点，以提供编码目标蛋白质的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中可操作的可选择标记物以促进含有载体的细胞的选择。此外，表达构建体可以包括其它元件。举例来说，表达载体可以具有一个或两个复制系统，因此允许其维持在生物体中，例如维持在哺乳动物或昆虫细胞中进行表达，以及在原核宿主中进行克隆和扩增。另外，表达构建体可以含有可选择标记物基因以允许选择转化的宿主细胞。可选择基因是本领域众所周知的并将随所用的宿主细胞而变。
蛋白质的分离和纯化可以根据本领域中已知的方法实现。举例来说，蛋白质可以自经遗传修饰以组成性和/或在诱导后表达蛋白质的细胞的溶解产物分离，或通过免疫亲和纯化从合成反应混合物分离，免疫亲和纯化一般包括使样品与抗蛋白质抗体接触，洗涤以去除非特异性结合的物质，以及洗脱特异性结合的蛋白质。分离的蛋白质可以通过渗析和通常用于蛋白质纯化的其它方法进一步纯化。在一个实施方案中，蛋白质可以使用金属螯合物色谱法分离。蛋白质可以含有修饰以促进分离。
多肽可以呈基本上纯或分离的形式制备(例如不含其它多肽)。多肽可以存在于相对于可以存在的其它组分(例如其它多肽或其它宿主细胞组分)富集多肽的组合物中。举例来说，可以提供纯化多肽，以使得多肽存在于基本上不含其它表达的蛋白质，例如少于约90％、少于约60％、少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％或少于约1％的组合物中。
可以使用重组技术产生IL-10多肽，以操控本领域中已知的不同的IL-10相关核酸，从而提供能够编码IL-10多肽的构建体。应了解，当提供特定氨基酸序列时，普通的技术人员将鉴于其在例如分子生物学的背景和经验认识到编码此类氨基酸序列的多种不同的核酸分子。
酰胺键取代
在一些情况下，IL-10包括一个或多个肽键以外的键，例如至少两个相邻的氨基酸经由酰胺键以外的键接合。举例来说，为减少或消除不合乎需要的蛋白水解作用或其它降解方式，和/或为增加血清稳定性，和/或为限制或增加构象灵活性，可以取代IL-10的主链内的一个或多个酰胺键。
在另一实例中，IL-10中的一个或多个酰胺键(-CO-NH-)可以经作为酰胺键的电子等排物的键置换，例如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-(顺与反)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-或-CH2SO-。IL-10中的一个或多个酰胺键还可以例如经还原的电子等排物假肽键置换。参见Couder等人(1993)Int.J.Peptide Protein Res.41:181-184。此类置换和其实现方式为本领域普通技术人员已知。
氨基酸取代
可以在IL-10多肽中进行一个或多个氨基酸取代。以下为非限制性实例：
a)经烷基取代的疏水性氨基酸的取代，包括经C1-C10碳的脂族侧链取代的丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、(S)-2-氨基丁酸、(S)-环己基丙氨酸或其它简单α-氨基酸，包括支链、环状和直链烷基、烯基或炔基取代；
b)经芳族取代的疏水性氨基酸的取代，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、磺基酪氨酸、联苯基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-苯并噻吩基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、组氨酸，包括以上列出的芳族氨基酸经氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氮杂、卤代(氟代、氯代、溴代或碘代)或烷氧基(C1-C4)取代的形式，其例示性实例为：2-氨基苯丙氨酸、3-氨基苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸、2-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸或4-氯苯丙氨酸、2-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸或4-甲基苯丙氨酸、2-甲氧基苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸或4-甲氧基苯丙氨酸、5-氨基-色氨酸、5-氯-色氨酸、5-甲基-色氨酸或5-甲氧基色氨酸、2'-氨基-丙氨酸、3'-氨基-丙氨酸或4'-氨基-丙氨酸、2'-氯-丙氨酸、3'-氯-丙氨酸或4'-氯-丙氨酸、2-联苯基丙氨酸、3-联苯基丙氨酸或4-联苯基丙氨酸、2'-甲基-丙氨酸、3'-甲基-丙氨酸或4'-甲基-丙氨酸、2-联苯基丙氨酸、3-联苯基丙氨酸或4-联苯基丙氨酸和2-吡啶基丙氨酸或3-吡啶基丙氨酸；
c)含有碱性侧链的氨基酸的取代，包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、高精氨酸，包括先前氨基酸的经烷基、烯基或芳基取代(C1-C10支链、直链或环状)的衍生物，无论取代基是否在杂原子上(例如α氮，或远端一个或多个氮，或α碳上，例如R前位置中)。用作例示性实例的化合物包括：N-ε-异丙基-赖氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-甘氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-丙氨酸、N,N-γ,γ'-二乙基-高精氨酸。还包括例如α-甲基-精氨酸、α-甲基-2,3-二氨基丙酸、α-甲基-组氨酸、α-甲基-鸟氨酸等其中烷基占据α-碳的R前位置的化合物。还包括由烷基、芳族、杂芳族(其中杂芳族基团具有一个或多个单独或组合的氮、氧或硫原子)、羧酸或许多众所周知的活化衍生物中任一者(例如酰基氯、活性酯、活性N-酰吖唑(azolide)和相关衍生物)与赖氨酸、鸟氨酸或2,3-二氨基丙酸形成的酰胺；
d)酸性氨基酸的取代，包括天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、酪氨酸、2,4-二氨基丙酸、鸟氨酸或赖氨酸的烷基、芳基、芳基烷基和杂芳基磺酰胺和经四唑取代的烷基氨基酸；
e)侧链酰胺残基的取代，包括天冬酰胺、谷氨酰胺和天冬酰胺或谷氨酰胺经烷基或芳族取代的衍生物；和
f)含羟基的氨基酸的取代，包括丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、2,3-二氨基丙酸和丝氨酸或苏氨酸经烷基或芳族取代的衍生物。
在一些情况下，IL-10包含一个或多个天然存在的非基因编码的L-氨基酸、合成L-氨基酸或氨基酸的D-对映异构体。举例来说，IL-10可以仅仅包含D-氨基酸。举例来说，IL-10多肽可以包含以下残基中的一者或多者：羟基脯氨酸、β-丙氨酸、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、间氨基甲基苯甲酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸、4-氟苯基丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、β-2-噻吩基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2,4-二氨基丁酸、ρ-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、ε-氨基己酸、ω-氨基己酸、ω-氨基庚酸、ω-氨基辛酸、ω-氨基癸酸、ω-氨基十四烷酸、环己基丙氨酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、δ-氨基戊酸和2,3-二氨基丁酸。
额外修饰
可以将半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物引入IL-10多肽中以提供经由二硫键与另一肽的连接或提供IL-10多肽的环化。引入半胱氨酸或半胱氨酸类似物的方法为本领域中已知；参见例如美国专利No.8,067,532。
IL-10多肽可以环化。可以将一种或多种半胱氨酸或半胱氨酸类似物引入IL-10多肽中，其中引入的半胱氨酸或半胱氨酸类似物可以与第二次引入的半胱氨酸或半胱氨酸类似物形成二硫键。其它环化方式包括肟接头或羊毛硫氨酸接头的引入；参见例如美国专利No.8,044,175。可以使用和/或引入可以形成环化键的任何氨基酸组合(或非氨基酸部分)。可以用具有允许桥引入的官能团的氨基酸(或氨基酸和-(CH2)n-CO-或-(CH2)n-C6H4-CO-)的任何组合产生环化键。一些实例为二硫化物、二硫化物模拟物(例如-(CH2)n-卡巴桥(carba bridge))、硫缩醛、硫醚桥(胱硫醚或羊毛硫氨酸)和含有酯和醚的桥。在这些实例中，n可以为任何整数，但常常小于十。
其它修饰包括例如N-烷基(或芳基)取代(Ψ[CONR])或构建内酰胺和其它环状结构的主链交联。其它衍生物包括C端羟甲基衍生物、o修饰的衍生物(例如C端羟甲基苯甲醚)、N端修饰的衍生物，包括经取代的酰胺，例如烷基酰胺和酰肼。
在一些情况下，IL-10多肽中的一个或多个L-氨基酸经一个或多个D-氨基酸置换。
在一些情况下，IL-10多肽为逆反类似物(参见例如Sela和Zisman(1997)FASEBJ.11:449)。逆反肽类似物为线性多肽的异构体，其中氨基酸序列的方向相逆(逆向)且其中一个或多个氨基酸的手性D或L反转(反转)，例如使用D-氨基酸而非L-氨基酸。(参见例如Jameson等人(1994)Nature 368:744；和Brady等人(1994)Nature 368:692)。
IL-10多肽可以包括“蛋白质转导结构域”(PTD)，其是指帮助穿过脂双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或有机或无机分子。连接另一分子的PTD帮助分子穿过膜，例如从细胞外间隙到细胞内空间，或从细胞溶质到细胞器内。在一些实施方案中，PTD共价连接IL-10多肽的氨基端，而在其它实施方案中，PTD共价连接IL-10多肽的羧基端。示例性蛋白质转导结构域包括(但不限于)最低十一肽蛋白质转导结构域(对应于包含YGRKKRRQRRR的HIV-1TAT的残基47-57；SEQ ID NO:1)；包含大量足够直接进入细胞中的精氨酸残基的聚精氨酸序列(例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10-50个精氨酸)；VP22结构域(Zender等人(2002)Cancer Gene Ther.9(6):489-96)；果蝇触角足蛋白质转导结构域(Noguchi等人(2003)Diabetes 52(7):1732-1737)；截短的人降钙素肽(Trehin等人(2004)Pharm.Research 21:1248-1256)；聚赖氨酸(Wender等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13003-13008)；RRQRRTSKLMKR(SEQ ID NO:2)；运输蛋白(Transportan)GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:3)；KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(SEQ ID NO:4)；和RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:5)。示例性PTD包括(但不限于)YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)、RKKRRQRRR(SEQ ID NO:6)；3个精氨酸残基至50个精氨酸残基的精氨酸均聚物；示例性PTD结构域氨基酸序列，包括(但不限于)以下任一者：YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)；RKKRRQRR(SEQ ID NO:7)；YARAAARQARA(SEQ ID NO:8)；THRLPRRRRRR(SEQ ID NO:9)；和GGRRARRRRRR(SEQ ID NO:10)。
在IL-10多肽的C端末端的氨基酸的羧基COR3可以呈游离形式(R3＝OH)或呈生理学上容许的碱金属或碱土金属盐(例如钠、钾或钙盐)形式存在。羧基还可以用伯醇、仲醇或叔醇，诸如例如甲醇、支化或未支化的C1-C6烷基醇，例如乙醇或叔丁醇来酯化。羧基还可以用伯胺或仲胺，例如氨、支化或未支化的C1-C6烷基胺或C1-C6二烷基胺，例如甲胺或二甲胺酰胺化。
在IL-10多肽的N端的氨基酸NR1R2的氨基可以呈游离形式(R1＝H并且R2＝H)或呈生理学上容许的盐(诸如例如氯化物或乙酸盐)形式存在。氨基还可以用酸乙酰化，使得R1＝H并且R2＝乙酰基、三氟乙酰基或金刚烷基。氨基可以呈经通常用于肽化学中的氨基保护基，例如以上提供的氨基保护基(例如Fmoc、苄氧基羰基(Z)、Boc和Alloc)保护的形式存在。氨基可以经N烷基化，其中R1和/或R2＝C1-C6烷基或C2-C8烯基或C7-C9芳烷基。烷基残基可以为直链、支链或环状(分别例如乙基、异丙基和环己基)。
关于IL-10产生的因素
如果IL-10在细菌(例如大肠杆菌)表达系统中的包涵体中产生，那么其必须变性、重折叠并纯化以除去污染物。此类污染物包括宿主蛋白、IL-10的修饰变体(例如在一个或多个赖氨酸残基处乙酰化的IL-10单体)、此类变体的杂二聚体(例如结合于非乙酰化IL-10单体的乙酰化IL-10单体)和共价键结的IL-10同二聚体。因此，IL-10必须进行纯化，以获得不含乙酰化同二聚体、杂二聚体变体和共价二聚体的基本上纯的非共价键结的二聚IL-10。USP 5,710,251描述了可以在细菌表达系统中的包涵体中产生的IL-10变性和重折叠后采用的纯化方法。
为了成功，纯化方法必须部分导致以高产量地回收生物学上活性和/或可溶性蛋白质。此通过优化包涵体中的蛋白质所经历的溶解和/或重折叠过程来实现。蛋白质从包涵体重折叠受若干因素影响，所述因素包括变性剂对包涵体的溶解、变性剂的去除和某些小分子添加剂对重折叠的辅助。与溶解和重折叠过程相关的多种方法可见于例如Rudolph R.和Lilie,H.(1996)FASEB 10:49-56；Lilie,H.等人,(1998)Current OpinionBiotechnol.9:497-501；Middelberg,A.(2002)Trends Biotechnol.20(10):437-443；Hevehan,D.L.和Clark,E.D.B.(1997)Biotechnol.Bioeng.54(3):221-30；De BernardezClark,E.(1998)Current Opinion Biotechnol.9:157-63；Tsumoto,K.等人(2003)ProteinExpression&Purification 28:1-8。
溶解和重折叠过程可以分三阶段进行：
1)包涵体的分离。包涵体具有相对较高的密度，因此可以通过离心沉淀。细胞通常通过高压均质化(任选地在溶菌酶处理后)进行破坏。细胞溶解必须完全，以免含有包涵体的完整细胞呈沉降物形式一起累积。在离心后，为了从沉淀去除污染物，可以用含有低浓度的离液剂(例如0.5-1M盐酸胍或尿素)或清洁剂(例如1％Triton X-100或者1mg/mL脱氧胆酸钠)的缓冲液洗涤。
2)聚集蛋白质的溶解。溶解必须引起单分子分散和最小的非天然的链内或链间相互作用。例如尿素、盐酸胍或清洁剂等增溶剂的选择在溶解效率中、在变性状态的蛋白质的结构中和在随后重折叠中起关键作用。
在一种方法中，上述洗涤的包涵体可以再悬浮并在含有强变性剂和还原剂(例如20mM DTT或b-巯基乙醇)的缓冲液中孵育。还原剂保持所有半胱氨酸处于还原状态并使制备期间形成的二硫键裂解。通常，超过30℃的孵育温度用于促进溶解过程。溶解的最优条件为蛋白质特定的，因此必须针对每种蛋白质，通过例如进行小规模实验(1-2mL)筛选不同变量来确定。具体的溶解变量以及潜在的起始值(在括号中列出)包括以下：a)缓冲液组成，例如pH和离子强度(50mM Tris-HCl，pH 7.5)；b)孵育温度(30℃)；c)孵育时间(60min)；d)增溶剂浓度(6M盐酸胍或8M尿素；e)总蛋白质浓度(1-2mg/mL)；以及f)增溶剂与目标蛋白质的比率。
在溶解后，溶液可以离心(例如在>100,000g下30min)以去除在重折叠期间可能充当核而触发聚集的剩余聚集物。通常，超速离心提供最佳结果。
3)溶解蛋白质的重折叠。蛋白质重折叠不是单一反应且与例如错折叠和聚集等产生非活性蛋白质的其它反应竞争。重折叠和其它反应的速率都由用于减少变性剂浓度的程序与溶剂条件来决定。若干蛋白质重折叠试剂盒和相关技术可商购获得(例如Pierce蛋白质重折叠试剂盒(Pierce Protein Refolding Kit)(Thermo Fisher Scientific；Rockford,IL)和蛋白质折叠筛选(Hampton Research Inc.；Aliso Viejo,CA))并为熟练技术人员已知。
溶解蛋白质的重折叠由变性剂的去除来起始。重折叠的效率取决于正确的折叠与聚集之间的竞争。为了减慢聚集过程，重折叠通常在低蛋白浓度(例如10-100mg/mL)下进行。包括缓冲液组成(例如pH和离子强度)、温度和添加组分在内的用于重折叠的条件必须针对每种个别蛋白质进行优化。某些小分子添加剂有效地在体外与体内促进蛋白质折叠和稳定或增加溶解性。因此，小分子添加剂有时被称为化学分子伴侣，可以增加活性蛋白质的回收和蛋白质折叠效率。
如果蛋白质含有二硫键，那么重折叠缓冲液必须补充有氧化还原体系。举例来说，添加低分子量硫醇试剂的还原与氧化形式的混合物(1-3mM还原硫醇和5:1至1:1比率的还原硫醇与氧化硫醇)一般提供适当的氧化还原电位以允许二硫键的形成和改组。最常用的氧化还原改组试剂为还原型和氧化型谷胱甘肽；其它包括半胱氨酸和半胱胺。或者，蛋白质可以在大量过剩的氧化型谷胱甘肽存在下完全氧化,接着在含有催化量的还原型谷胱甘肽的重折叠缓冲液中稀释。
熟练技术人员熟悉蛋白质重折叠的不同方法，包括以下：
(a)渗析：在渗析(最常用的去除增溶剂的方法)期间，增溶剂的浓度缓慢降低，此使得蛋白质最佳重折叠。样品与渗析缓冲液的体积比率应使得在增溶剂的平衡浓度下蛋白质完全重折叠。
(b)缓慢稀释：利用此过程，通过稀释来减少增溶剂的浓度，使得蛋白质重折叠。此稀释过程通常通过逐步添加缓冲液或通过使用泵连续添加来缓慢进行。
(c)快速稀释：一般来说，在渗析和缓慢稀释过程期间，蛋白质长时间暴露于中等浓度的增溶剂(例如2-4M尿素或盐酸胍)，其中蛋白质尚未折叠，但不再变性，因此极其倾向于聚集。此聚集倾向常常可以通过用重折叠缓冲液快速稀释溶解蛋白质溶液来预防。还可以通过添加例如非清洁性磺基甜菜碱等温和增溶剂至重折叠缓冲液来限制聚集。
(d)脉冲复性：为维持低浓度未折叠的蛋白质并因此限制聚集，变性蛋白的等分试样(“脉冲”)可以在确定的时间点添加至重折叠缓冲液。两个脉冲之间的时间间隔必须针对每种个别蛋白质进行优化。当变性剂的浓度达到相对于特定蛋白质重折叠的临界水平时，可以终止该过程。
(e)色谱法：使用此方法，使用色谱步骤去除增溶剂。可以使用不同的色谱法，包括尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法和亲和色谱法。去除变性剂，同时蛋白质缓慢移过柱或结合至基质。此通常得到高产量的活性蛋白质，甚至是在mg/mL范围内的蛋白质浓度下。或者，可以在蛋白质重折叠前在变性条件下进行色谱法。
氨基酸
已经观测到在重折叠过程期间将特定氨基酸添加至重折叠缓冲液具有若干有益的作用，包括提高蛋白质的溶解性和抑制蛋白质聚集。示例性氨基酸包括脯氨酸、盐酸精氨酸(ArgHCl)、精氨酸(Arg)、精氨酰胺和甘氨酰胺。虽然这些氨基酸产生其作用的根本作用机制未完全弄清楚，但实践本公开无需理解其机制。[参见Yamaguchi,H.等人,Biomolecules 2014,4:235-51]。
精氨酸已经用于重折叠大量来自包涵体的蛋白质，包括酪蛋白激酶II、γ干扰素、p53肿瘤抑制蛋白和白细胞介素-21。精氨酸一般被认为是体积扩大剂，可以通过因适度结合蛋白质而抑制聚集来发挥其作用。已经报道精氨酰胺和甘氨酰胺为结合位点不同于精氨酸，从而导致抑制能力不同的中度离液剂。相比之下，已经提出脯氨酸能够通过经由结合折叠中间物并用脯氨酸将折叠中间物捕获在超分子装配体中来抑制蛋白质聚集，使蛋白质重折叠成其天然构象(Samuel,D.等人,Protein Sci.2000,9:344-52)。
如实验部分中详述，尽管精氨酸常常用于通过渗析或稀释使蛋白质重折叠的溶剂中的事实，但科学或专利文献中很少论述关于将精氨酸添加至重折叠缓冲液中用于产生IL-10。(参见例如Tsumoto,K.等人(2004)Biotechnol.Prog.20:1301-08)。实施例2中的数据指示发现低浓度的L-精氨酸正面影响IL-10产量。具体地说，添加0.01-0.1M精氨酸至含有0.15mg/mL未折叠的rHuIL-10的重折叠缓冲液引起适当折叠的二聚IL-10至少增加两倍。
增强和/或模拟IL-10功能的特定修饰
改善本文公开的治疗方式(例如IL-10)的一种或多种物理特性和/或其施用的方式常常是有益的，且有时是急需的。物理特性的改善包括例如调节免疫原性；增加水溶性、生物可用性、血清半衰期和/或治疗半衰期的方法；和/或调节生物活性。某些修饰还可以用于例如产生抗体用于检测测定法中(例如表位标签)以及使蛋白质纯化容易进行。此类改善一般必须在不会不利地影响治疗方式的生物活性和/或增加其免疫原性下给予。
IL-10的聚乙二醇化为本公开涵盖的一种特定修饰，而其它修饰包括(但不限于)糖基化(N和O连接)；聚唾液酸化；包含血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)、食蟹猕猴血清白蛋白或牛血清白蛋白(BSA))的白蛋白融合分子；通过例如缀合的脂肪酸链(酰化)的白蛋白结合；和Fc融合蛋白。
聚乙二醇化：蛋白质治疗剂的临床有效性常常受短的血浆半衰期和对蛋白酶降解的敏感性限制。多种治疗性蛋白质(例如非格司亭(filgrastim))的研究已经显示可以通过多种修饰来克服此类困难，包括将多肽序列缀合或连接于多种非蛋白质聚合物中的任一者，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。此常常通过共价结合于蛋白质与非蛋白质聚合物(例如PEG)二者的连接部分来实现。此类PEG缀合的生物分子已经显示具有临床适用的特性，包括更佳的物理和热稳定性、避免对酶促降解敏感、溶解性增加、体内循环半衰期更长以及清除率降低、免疫原性和抗原性减少以及毒性减少。
除聚乙二醇化对药代动力学参数的有益作用外，聚乙二醇化本身可以增强活性。举例来说，PEG-IL-10已经显示对某些癌症比非聚乙二醇化的IL-10更有效(参见例如EP206636A2)。本公开的某些实施方案涵盖相对较小的PEG(例如5kDa)的使用，所述PEG改善IL-10分子的药代动力学特征，而不引起不良副作用；此类PEG-IL-10分子尤其有效用于长期使用。
适于缀合于多肽序列的PEG一般在室温下可溶于水，并具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R为氢或保护基，例如烷基或烷醇基，且其中n为1至1000的整数。当R为保护基时，其一般具有1至8个碳。缀合于多肽序列的PEG可以为线性或支化的。本公开涵盖支化的PEG衍生物、“星形PEG(star-PEG)”和多臂PEG。用于本公开中的PEG的分子量不局限于任何特定范围，且实例在本文中的其它地方予以阐述；举例来说，某些实施方案具有介于5kDa与20kDa之间的分子量，而其它实施方案具有介于4kDa与10kDa之间的分子量。
本公开还涵盖其中PEG具有不同n值的缀合物的组合物，并因此不同的PEG以特定比率存在。举例来说，一些组合物包含其中n＝1、2、3和4的缀合物的混合物。在一些组合物中，其中n＝1的缀合物的百分比为18-25％，其中n＝2的缀合物的百分比为50-66％，其中n＝3的缀合物的百分比为12-16％，且其中n＝4的缀合物的百分比高达5％。此类组合物可以通过本领域中已知的反应条件和纯化方法来产生。说明书通篇描述示例性反应条件。阳离子交换色谱法可以用于分离缀合物，且接着鉴别含有连接有例如所需数目PEG的缀合物的级分，纯化以除去未修饰的蛋白质序列和连接有其它数目的PEG的缀合物。
聚乙二醇化最常发生在多肽N端的α氨基、赖氨酸残基侧链上的ε氨基以及组氨酸残基侧链上的咪唑基。因为大部分的重组多肽具有单个α氨基和大量ε氨基和咪唑基，所以可以产生许多位置异构体，这取决于接头化学。本文中可以应用本领域中已知的通用聚乙二醇化策略。PEG可以经由末端反应基团(“间隔子”)结合本公开的多肽，该末端反应基团介导多肽序列中一者或多者的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间的键结。具有可以结合游离氨基的间隔子的PEG包括N-羟基丁二酰亚胺聚乙二醇，其可以通过用N-羟基丁二酰亚胺活化聚乙二醇的丁二酸酯来制备。可以结合游离氨基的另一活化聚乙二醇为2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可以通过使聚乙二醇单甲醚与氰尿酰氯反应来制备。结合游离羧基的活化聚乙二醇包括聚氧乙二胺。
本公开的多肽序列中的一者或多者与具有间隔子的PEG的缀合可以通过多种常规方法进行。举例来说，缀合反应可以在溶液中在5至10的pH下，在4℃至室温的温度下，利用4:1至30:1的试剂与蛋白质的摩尔比，进行30分钟至20小时。可以选择反应条件以将反应引向主要产生所需程度的取代。一般来说，低温、低pH(例如pH＝5)和短的反应时间往往会降低所连接的PEG的数目，而高温、中性至高pH(例如pH≥7)和较长的反应时间往往会增加所连接的PEG的数目。本领域中已知的多种方式可以用于终止反应。在一些实施方案中，反应通过酸化反应混合物并在例如-20℃下冷冻来终止。在例如美国专利No.5,252,714、5,643,575、5,919,455、5,932,462和5,985,263中论述多种分子的聚乙二醇化。例如美国专利No.7,052,686中描述PEG-IL-10。实验部分中阐述预期用于本文中的特定反应条件。
本公开还涵盖PEG模拟物的使用。已经开发重组PEG模拟物，所述PEG模拟物保留PEG的属性(例如延长的血清半衰期)，同时赋予若干额外的有利特性。举例来说，可以重组产生能够形成类似于PEG的延伸构象的简单多肽链(包含例如Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr)，其已经与目标肽或蛋白质药物融合(例如Amunix'XTEN technology；Mountain View,CA)。此避免了在制造工艺期间对额外缀合步骤的需要。此外，已建立的分子生物学技术能够控制多肽链的侧链组成，允许优化免疫原性和制造特性。
糖基化：出于本公开的目的，“糖基化”意在泛指将聚糖连接至蛋白质、脂质或其它有机分子的酶促过程。术语“糖基化”结合本公开的使用一般意图指添加或除去一个或多个碳水化合物部分(通过去除潜在糖基化位点或通过用化学和/或酶促方式除去糖基化)和/或添加一个或多个在天然序列中可能存在或者可能不存在的糖基化位点。另外，该短语包括天然蛋白质糖基化的质变，包括存在的多个碳水化合物部分的性质和比例的变化。
糖基化会显著地影响例如IL-10等多肽的物理特性(例如溶解性)，且在蛋白质稳定性、分泌和亚细胞定位中也具有重要意义。糖基化的多肽还可能展现增强的稳定性或可能改善一种或多种药代动力学特性，例如半衰期。另外，溶解性改善例如能够产生比包含非糖基化的多肽的制剂更适于药用的制剂。
糖基化位点的添加可以通过改变氨基酸序列来实现。可以例如通过一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(对于N连接的糖基化位点)的添加或取代对多肽进行改变。N连接和O连接的寡糖的结构和在每种类型中发现的糖残基可以不同。在两者中常发现的一种类型糖为N-乙酰神经氨酸(下文称为唾液酸)。唾液酸通常为N连接与O连接的寡糖的末端残基，且根据其具有负电荷，可以赋予糖蛋白以酸性。本公开的一特定实施方案包括N-糖基化变体的产生和使用。
本公开的多肽序列可以任选地通过核酸水平上的变化，尤其通过在预选碱基处使编码多肽的核酸突变以便产生将翻译成所需氨基酸的密码子来改变。
聚唾液酸化：本公开还涵盖聚唾液酸化的使用，即多肽与天然存在的生物可降解的α-(2→8)连接的聚唾液酸(“PSA”)缀合，以提高多肽的稳定性和体内药代动力学。
白蛋白融合：其它的适合缀合的组分和分子包括白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、食蟹猕猴血清白蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。
根据本公开，白蛋白可以在羧基端、氨基端、羧基与氨基端以及在内部与药物分子(例如本文描述的多肽)缀合(参见例如USP 5,876,969和USP 7,056,701)。
在本公开涵盖的HSA-药物分子缀合物中，可以使用多种形式的白蛋白，例如白蛋白分泌前序列和其变体、片段和其变体以及HSA变体。此类形式一般具有一种或多种所需白蛋白活性。在其它实施方案中，本公开包括融合蛋白，所述融合蛋白包含直接或间接与白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等融合的多肽药物分子，其中融合蛋白的血浆稳定性高于未融合的药物分子，和/或融合蛋白保留未融合的药物分子的治疗活性。在一些实施方案中，间接融合通过例如肽接头等接头或其经修饰的型式实现。
如上所提到，白蛋白与本公开的一种或多种多肽的融合可以例如通过遗传操控以便使编码HSA的核酸或其片段与编码该一种或多种多肽序列的核酸接合来实现。
替代白蛋白结合策略：已经开发若干白蛋白结合策略作为直接融合的替代策略，且可以用于本文描述的IL-10药剂。举例来说，本公开涵盖通过缀合的脂肪酸链(酰化)的白蛋白结合和包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和本文描述的一种或多种多肽的序列的融合蛋白。
与其它分子缀合：其它适合缀合的组分和分子包括例如甲状腺球蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；聚氨基酸，例如聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸)；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血球凝集素、流感病毒核蛋白；钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)(KLH)；和乙型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或上述各者的任何组合。
因此，本公开涵盖一种或多种其它组分或分子在多肽序列的N和/或C端的缀合，例如另一多肽(例如具有与主题多肽异源的氨基酸序列的多肽)或载体分子。因此，示例性多肽序列可以呈与另一组分或分子的缀合物提供。
IL-10多肽还可以缀合于大的代谢缓慢的大分子，例如蛋白质；多糖，例如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素或纤维素珠粒；聚合氨基酸，例如聚谷氨酸或聚赖氨酸；氨基酸共聚物；失活病毒粒子；失活细菌毒素，例如来自白喉、破伤风、霍乱或白细胞毒素分子的类毒素；失活细菌；以及树突状细胞。必要时，此类缀合形式可以用于产生针对本公开的多肽的抗体。
用于缀合的其它候选组分和分子包括适于分离或纯化的组分和分子。具体非限制性实例包括结合分子，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体载体的分子，包括例如塑料或聚苯乙烯珠粒、板或珠粒、磁性珠粒、试验条和膜。
Fc-融合分子：在某些实施方案中，本公开的多肽序列的氨基端或羧基端可以与免疫球蛋白Fc区(例如人Fc)融合以形成融合缀合物(或融合分子)。Fc融合缀合物已经展示增加生物药剂的全身性半衰期，因此生物药品需要的施用频率可能更低。
Fc在内衬于血管的内皮细胞中结合于新生Fc受体(FcRn)，且在结合后，Fc融合分子避免降解和重新释放到循环中，保持分子循环更长时间。相信此Fc结合为内源性IgG保留其长久的血浆半衰期的机制。更新的Fc融合技术将单个拷贝的生物药剂与抗体的Fc区连接以与传统的Fc融合缀合物相比，优化生物药剂的药代动力学和药效特性。
其它修饰：本公开涵盖目前已知或将来开发的IL-10的其它修饰的使用以改善一种或多种特性。一种此类方法包括通过羟乙基淀粉化(hesylation)来修饰多肽序列，羟乙基淀粉化利用与其它分子连接的羟乙基淀粉衍生物以改变多肽序列的特征。羟乙基淀粉化的多个方面在例如美国专利申请No.2007/0134197和2006/0258607中描述。
本公开还涵盖包含小泛素样调节剂(SUMO)作为融合标签的融合分子(LifeSensors,Inc.；Malvern,PA)。本文描述的多肽与SUMO的融合可以传达若干有益的作用，包括增强表达、提高溶解性和/或协助开发纯化方法。SUMO蛋白酶识别SUMO的三级结构并在SUMO的C端使融合蛋白裂解，因此释放具有所需N端氨基酸的本文描述的多肽。
本公开还涵盖PASylationTM(XL-Protein GmbH(Freising,Germany))的使用。此技术扩大了目标蛋白质的表观分子大小超过肾小球的孔径，而对蛋白质的治疗生物活性无消极影响，由此降低蛋白质的肾清除率。
接头：用于修饰本公开的多肽序列的任何上述组分和分子可以任选地经由接头缀合。合适的接头包括“柔性接头”，所述接头一般长度足够允许所修饰的多肽序列与所连接的组分和分子之间进行一定移动。接头分子一般为约6-50个原子长。接头分子也可以为例如芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可以容易选择并可具有任何合适的长度，例如1个氨基酸(例如Gly)、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、10-20个、20-30个、30-50个或超过50个氨基酸。
柔性接头的实例包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如(GmSo)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:11)、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n(SEQ ID NO:12)、(GSGGSm)n(SEQ ID NO:13)、(GSGSmG)n(SEQ ID NO:14)和(GGGSm)n(SEQ ID NO:15)和其组合，其中m、n和o各自独立地选自至少1至20，例如1-18、2-16、3-14、4-12、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数)和其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对未结构化，因此可以用作组分之间的中性系链。柔性接头的实例包括(但不限于)GGSG(SEQ ID NO:16)、GGSGG(SEQ ID NO:17)、GSGSG(SEQ ID NO:14)、GSGGG(SEQID NO:18)、GGGSG(SEQ ID NO:19)和GSSSG(SEQ ID NO:20)。
柔性接头的其它实例包括甘氨酸聚合物(G)n或甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:11)、(GGGS)n(SEQ ID NO:21)和(GGGGS)n(SEQ ID NO:22)，其中n＝1至50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50)。示例性柔性接头包括(但不限于)GGGS(SEQ ID NO:21)、GGGGS(SEQ ID NO:22)、GGSG(SEQ ID NO:16)、GGSGG(SEQ ID NO:17)、GSGSG(SEQ ID NO:12)、GSGGG(SEQ ID NO:18)、GGGSG(SEQ ID NO:19)和GSSSG(SEQ IDNO:20)。这些接头序列的多聚体(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可以连接在一起以提供可以用于将异源氨基酸序列缀合于本文公开的多肽的柔性接头。如本文中描述，异源氨基酸序列可以是信号序列和/或融合配偶体，例如白蛋白、Fc序列等等。
治疗和预防用途
本公开涵盖本文描述的IL-10多肽(例如PEG-IL-10)在治疗或预防大量疾病、病症和/或病状和/或其症状中的用途。虽然后面描述具体的用途，但应了解本公开不限于此。此外，虽然后面阐述具体疾病、病症和病状的总类别，但一些疾病、病症和病状可为超过一种类别的一员(例如癌症和纤维化相关病症)，且其它可不为任何公开类别的一员。
纤维化病症和癌症。根据本公开，IL-10分子可以用于治疗或预防增生性病状或病症，包括癌症，例如子宫、子宫颈、乳房、前列腺、睾丸、胃肠道(例如食道、口咽、胃、小肠或大肠、结肠或直肠)、肾、肾细胞、膀胱、骨骼、骨髓、皮肤、头或颈、肝、胆囊、心脏、肺、胰腺、唾液腺、肾上腺、甲状腺、脑(例如神经胶质瘤)、神经节、中枢神经系统(CNS)和外周神经细胞(PNS)的癌症以及造血系统和免疫系统(例如脾或胸腺)的癌症。本公开还提供了治疗或预防其它癌症相关疾病、病症或病状的方法，所述癌症相关疾病、病症或病状包括例如免疫原性肿瘤、非免疫原性肿瘤、休眠肿瘤、病毒诱发的癌症(例如上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌和乳头状瘤病毒)、腺癌、淋巴瘤、癌瘤、黑色素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化学诱发的癌症、转移和血管生成。本公开涵盖例如通过调节调控T细胞和/或CD8+T细胞的活性来降低对肿瘤细胞或癌细胞抗原的耐受性(参见例如Ramirez-Montagut等人,(2003)Oncogene 22:3180-87；和Sawaya等人,(2003)New Engl.J.Med.349:1501-09)。在具体实施方案中，肿瘤或癌症为结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、神经胶母细胞瘤或白血病。术语癌症相关疾病、病症和病状的使用意在泛指直接或间接与癌症相关的病状，且包括例如血管生成和癌症前期病状，例如发育异常。
在一些实施方案中，本公开提供了用IL-10分子和至少一种其它治疗剂或诊断剂治疗增生性病状、癌症、肿瘤或癌症前期病状的方法，治疗剂或诊断剂的实例在本文中的其它地方阐述。
心血管疾病。在具体实施方案中，本公开涵盖本文描述的IL-10多肽(例如PEG-IL-10)治疗和/或预防由高胆固醇血症和异常脂质分布引起的心血管疾病、病症和病状以及与其相关的病症的用途。
如本文所用，术语“心血管疾病”、“心脏疾病”等等是指影响心血管系统的任何疾病，主要是心脏病、脑和肾的血管疾病和外周动脉疾病。心血管疾病为包括冠状动脉性心脏病(例如缺血性心脏病或冠状动脉病)、动脉粥样硬化、心肌病、高血压、高血压性心脏病、肺原性心脏病、心脏节律障碍、心内膜炎、脑血管疾病和外周动脉疾病的一组疾病。心血管疾病为全世界死亡的主要原因，且虽然其通常影响老年人，但心血管疾病、特别是动脉粥样硬化的前因在早年就开始。
本公开尤其涵盖其中心血管疾病包括高脂血症(或高脂蛋白血症)(特征为血液脂质和/或脂蛋白的水平异常升高的病状)的实施方案。高脂血症的非限制性实例包括血脂障碍、高胆固醇血症(例如家族性高胆固醇血症)、高甘油酯血症、高甘油三酯血症、高脂蛋白血症、高乳糜微粒血症和混合型高脂血症。高脂蛋白血症包括例如Ia型高脂蛋白血症、Ib型高脂蛋白血症、Ic型高脂蛋白血症、IIa型高脂蛋白血症、IIb型高脂蛋白血症、III型高脂蛋白血症、IV型高脂蛋白血症和V型高脂蛋白血症。
血栓症和血栓形成病状。在其它实施方案中，本公开涵盖本文描述的IL-10多肽(例如PEG-IL-10)治疗和/或预防由高胆固醇血症和异常脂质分布引起的血栓症和血栓形成疾病、病症和病状以及与其相关的病症的用途。
血栓症一般被分类为静脉或动脉，其各自都可以呈现若干亚型。静脉血栓症包括深静脉血栓症(DVT)、门静脉血栓症、肾静脉血栓症、颈静脉血栓症、巴德-基亚里综合征(Budd-Chiari syndrome)、佩吉特-施勒特病(Paget-Schroetter disease)和颅内静脉窦血栓症。动脉血栓症包括中风和心肌梗塞。
免疫和炎性病状。如本文所用，例如“免疫疾病”、“免疫病状”、“免疫病症”、“炎性疾病”、“炎性病状”、“炎性病症”等术语意在广泛地涵盖任何免疫或炎性相关病状(例如病理性炎症和自身免疫疾病)。此类病状常常与其它疾病、病症和病状紧密相连。举例来说，“免疫病状”可指增生性病状，例如癌症、肿瘤和血管生成；包括抵抗免疫系统根除的感染(急性和慢性)、肿瘤和癌症。
可能例如由炎性细胞因子引起的免疫和炎性相关的疾病、病症和病状的非限制性清单包括关节炎(例如类风湿性关节炎)、肾衰竭、狼疮、哮喘、牛皮癣、结肠炎、胰腺炎、过敏、纤维化、手术并发症(例如其中炎性细胞因子阻止痊愈)、贫血和纤维肌痛。可能与慢性炎症相关的其它疾病和病症包括充血性心脏衰竭、中风、主动脉狭窄、动脉硬化、骨质疏松症、感染、炎性肠病(例如克罗恩氏病(Crohn's disease)和溃疡性结肠炎)、过敏性接触性皮炎和其它湿疹、系统性硬化症、移植、多发性硬化和神经退化性病症(例如阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)和帕金森氏病(Parkinson's disease))。
本公开包括其中本文描述的IL-10药剂(例如PEG-IL-10)用于治疗和/或预防血管炎的实施方案，血管炎包括(不限于)伯格氏病(Buerger’s disease)(血栓性脉管炎)、脑血管炎(中枢神经系统血管炎)、许尔-斯特劳斯动脉炎(Churg-Strauss arteritis)、冷球蛋白血症、原发性冷球蛋白性血管炎、巨细胞(颞)动脉炎、亨诺克-舍恩莱因紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、超敏反应血管炎(过敏性血管炎)、川崎氏病(Kawasaki disease)、微观多动脉炎/多血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛(PMR)、类风湿性血管炎、桥本氏动脉炎(Takayasu arteritis)、血栓静脉炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)；和如全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、复发性多软骨炎、白塞氏病(Behcet’s disease)或其它结缔组织病症等结缔组织病症的继发性血管炎；和病毒感染继发性血管炎。
其它实施方案是有关炎性心脏病，包括心内膜炎、炎性心脏肥大和心肌炎。
病毒性疾病。本公开涵盖IL-10多肽在治疗和/或预防用IL-10治疗可为有益的任何病毒性疾病、病症或病状方面的用途。所涵盖的病毒性疾病、病症和病状的实例包括乙型肝炎、丙型肝炎、HIV、疱疹病毒和巨细胞病毒(CMV)。
许多病毒性疾病(例如HIV)的治疗包括施用药剂的组合，包括通过不同的作用机制起作用的药剂，且本公开涵盖本文描述的IL-10多肽用作此类组合疗法的组分的用途。
纤维化病症：本公开还提供了治疗或预防纤维化疾病、病症和病状的方法。如本文所用，短语“纤维化疾病、病症和病状”和类似术语(例如“纤维性病症”)和短语将广泛地解释，以便其包括可以导致形成纤维化组织或瘢痕组织(例如一种或多种组织中的纤维化)的任何病状。举例来说，可以产生瘢痕组织的损伤(例如伤口)包括皮肤、眼睛、肺、肾、肝、中枢神经系统和心血管系统的伤口。该短语还涵盖由中风产生的瘢痕组织形成，以及例如由损伤或手术引起的组织粘连。
如本文所用，术语“纤维化”是指作为修复性或反应性过程而非作为器官或组织的正常成分的纤维组织形成。纤维化的特征为任何特定组织中超过正常沉积的成纤维细胞累积和胶原蛋白沉积。
纤维化病症包括(但不限于)由伤口愈合引起的纤维化、全身性和局部硬皮病、动脉粥样硬化、再狭窄、肺部炎症和纤维化、特发性肺纤维化、间质性肺病、肝硬化、由慢性乙型或丙型肝炎感染引起的纤维化、肾病(例如血管球性肾炎)、由瘢痕组织、瘢痕瘤和肥厚性瘢痕引起的心脏病以及眼部疾病(例如黄斑变性和视网膜和玻璃体视网膜病)。其它纤维化疾病包括化学治疗药物诱发的纤维化、辐射诱发的纤维化以及损伤和烧伤。
纤维化病症常常与肝相关，且在此类病症与肝胆固醇和甘油三酯在肝细胞和枯否细胞(Kupffer cell)内的不当累积之间常常存在联系。此累积似乎产生促炎性反应，引起肝纤维化和肝硬化。具有纤维化组分的肝病包括非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)。NAFLD发生在存在并非由过度酒精使用引起的脂肪变性(肝中脂肪积贮)时。其与胰岛素抗性和代谢综合征有关。NASH为NAFLD的最极端形式，且被认为是未知原因的肝硬化的主要原因。
药物组合物
本公开的IL-10多肽可以呈适于向受试者施用的组合物的形式。一般来说，此类组合物为包含IL-10和一种或多种药学上可接受或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的“药物组合物”。在某些实施方案中，IL-10多肽以治疗可接受的量存在。药物组合物可以用于本公开的方法中；因此，举例来说，药物组合物可以离体或体内向受试者施用，以实践本文描述的治疗性和预防性方法和用途。
本公开的药物组合物可以被配制成与预期施用方法或途径相容；本文中阐述示例性施用途径。此外，药物组合物可以与如本文中描述的其它治疗活性剂或化合物组合使用以治疗或预防本公开所涵盖的疾病、病症和病状。
药物组合物通常包含治疗有效量的本公开所涵盖的IL-10多肽和一种或多种药学上和生理学上可接受的配制剂。合适的药学上可接受或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括(但不限于)抗氧化剂(例如抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、清洁剂、缓冲液、媒介物、稀释剂和/或佐剂。举例来说，合适的媒介物可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，可能补充有在药物组合物中肠胃外施用所常见的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水为进一步的示例性媒介物。所属领域的技术人员容易认识到可用于本文中涵盖的药物组合物和剂型的多种缓冲液。典型缓冲液包括(但不限于)药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。举例来说，缓冲组分可以为水溶性物质，例如磷酸、酒石酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸和其盐。可接受的缓冲剂包括例如Tris缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙烷磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉基)乙烷磺酸(MES)、2-(N-吗啉基)乙烷磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉基)丙烷磺酸(MOPS)和N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)。
在已经配制药物组合物后，其可以呈溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干粉末状存储在无菌小瓶中。此类制剂可以呈备用形式、需要在使用前复原的冻干形式、需要在使用前稀释的液体形式或者其它可接受的形式存储。在一些实施方案中，药物组合物提供于一次性容器(例如一次性小瓶、安瓿、注射器或自动注射器(类似于例如))中，而在其它实施方案中提供多用容器(例如多用小瓶)。任何药物递送装置都可以用于递送IL-10，包括植入物(例如可植入的泵)和导管系统、缓慢注射泵和装置，这些都为熟练技术人员众所周知。一般皮下或肌肉内施用的长效注射剂也可以用于在确定时段内释放本文公开的多肽。长效注射剂通常基于固体或者油，且一般包含本文中阐述的配制组分中的至少一者。本领域技术人员熟悉长效注射剂的可能制剂和用途。
药物组合物可以呈无菌可注射水性或油性悬浮液形式。此悬浮液可以根据已知的技术，使用本文中提及的那些合适的分散或润湿剂和助悬剂配制。无菌可注射制剂也可以为于无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如于1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、等渗氯化钠溶液、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)以及其合适的混合物。此外，无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成单酸甘油酯或甘油二酯。此外，例如油酸等脂肪酸用于制备注射剂。可以通过包括延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝或明胶)来实现特定可注射制剂的延长吸收。
含有活性成分的药物组合物可以呈适于口服的形式，例如片剂、胶囊、锭剂、糖锭剂、水性或油性悬浮剂、可分散性粉剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂或糖浆剂、溶液剂、微珠或酏剂。在具体实施方案中，与本文中描述的IL-10药剂共同施用的药剂的活性成分呈适于口服的形式。意图口服的药物组合物可以根据制造药物组合物的领域已知的任何方法来制备，且此类组合物可以含有一种或多种试剂，诸如例如甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以提供药学上精致和适口的制剂。片剂、胶囊等含有活性成分与适于制造片剂的药学上可接受的无毒赋形剂混合。这些赋形剂可以是例如稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
适于经口施用的片剂、胶囊等可以无包衣或可以通过已知的技术包覆包衣以延迟在胃肠道中崩解和吸收，从而提供持续作用。举例来说，可以采用时间延迟物质，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。其还可以通过本领域中已知的形成用于控制释放的渗透性治疗性片剂的技术包覆包衣。其它试剂包括生物可降解的或生物相容的粒子或聚合物，例如聚酯、多胺酸、水凝胶、聚乙烯基吡咯烷酮、聚酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物，以控制所施用的组合物的递送。举例来说，经口药剂可以包埋在通过凝聚技术或通过界面聚合，分别通过使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊而制备的微胶囊中或在胶体药物递送系统中。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球体、微珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。所属领域的技术人员将显而易见上述制剂的制备方法。
口服制剂还可以呈其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙、高岭土或微晶纤维素)混合的硬明胶胶囊形式或呈其中活性成分与水或油类介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合的软明胶胶囊形式存在。
水性悬浮液含有活性物质与适于制造水性悬浮液的赋形剂混合。此类赋形剂可以为助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯胶；分散或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol))，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂。
油性悬浮液可以通过使活性成分悬浮在例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油等植物油或例如液体石蜡等矿物油中来配制。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可添加例如以上阐述的甜味剂等甜味剂以及调味剂，以提供美味的口服制品。
适于通过添加水来制备水性悬浮液的可分散性粉剂和颗粒提供活性成分与分散剂或润湿剂、助悬剂和一种或多种防腐剂混合。本文中例示合适的分散剂或润湿剂和助悬剂。
本公开的药物组合物还可以呈水包油乳液形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡或这些物质的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯胶或黄芪胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂；和衍生自脂肪酸的酯或偏酯；己糖醇酐，例如脱水山梨糖醇单油酸酯；和偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。
制剂还可以包括保护组合物以免从身体快速降解或消除的载体，例如控释制剂，包括植入物、脂质体、水凝胶、前药和微囊封的递送系统。举例来说，可以采用时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯，单独或与蜡组合。
本公开涵盖施用呈栓剂形式的IL-10多肽用于直肠施用。所述栓剂可以通过将药物与合适的无刺激性的赋形剂混合来制备，所述赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此在直肠中融化，从而释放药物。此类物质包括(但不限于)可可油和聚乙二醇。
本公开所涵盖的IL-10多肽可以呈目前已知或将来开发的任何其它合适的药物组合物形式(例如用于鼻或吸入使用的喷雾)。
多肽或其片段在制剂中的浓度可以广泛地变化(例如以重量计小于约0.1％，通常在或至少约2％至多达20％至50％或更多)，并通常主要基于流体体积、粘度和基于受试者的因素，根据例如所选的具体施用模式进行选择。
施用途径
本公开涵盖以任何适当的方式施用IL-10(例如IL-10多肽)和其组合物。合适的施用途径包括肠胃外(例如肌肉内、静脉内、皮下(例如注射液或植入物)、腹膜内、脑池内、关节内、腹膜内、脑内(实质内)和脑室内)、经口、经鼻、经阴道、舌下、眼内、经直肠、局部(例如经皮)、舌下和吸入。一般皮下或肌肉内施用的长效注射剂也可以用于在确定时段内释放本文公开的IL-10多肽。
本公开的具体实施方案涵盖肠胃外施用。在一些具体实施方案中，肠胃外施用为静脉内，且在其它具体实施方案中，肠胃外施用为皮下。
组合疗法
本公开涵盖IL-10分子与一种或多种活性治疗剂(例如细胞因子)或其它预防或治疗方式(例如放射线)组合使用。在此类组合疗法中，多种活性剂常常具有不同的互补作用机制。通过允许减少一种或多种药剂的剂量，由此减少或消除与一种或多种药剂相关的副作用，此类组合疗法尤其有利。此外，此类组合疗法对潜伏的疾病、病症或病状可以具有协同的治疗或预防作用。
如本文所用，“组合”意在包括可以分开施用，例如分开配制用于分开施用(例如可以提供于试剂盒中)的疗法和可以一起在单个制剂中施用的疗法(即“共同配制”)。
在某些实施方案中，IL-10多肽和一种或多种活性治疗剂或其它预防或治疗方式连续施用或应用，例如其中一种药剂在一种或多种其它药剂前施用。在其它实施方案中，IL-10多肽和一种或多种活性治疗剂或其它预防或治疗方式同时施用，例如其中两种或更多种药剂在或大致在相同时间施用；两种或更多种药剂可以以两种或更多种分开的制剂存在或组合成单个制剂(即共同配制)。无论两种或更多种药剂是否连续或同时施用，对本公开的目的来说，其都被视为组合施用。
本公开的IL-10多肽可以与至少一种其它(活性)药剂以在所述情况下适当的任何方式组合使用。在一个实施方案中，在一段时间内维持用至少一种活性剂和至少一种本公开的IL-10多肽治疗。在另一个实施方案中，减少或中断用至少一种活性剂治疗(例如当受试者稳定时)，同时用本公开的IL-10多肽治疗维持在恒定给药方案下。在另一实施方案中，减少或中断用至少一种活性剂治疗(例如当受试者稳定时)，同时减少用本公开的IL-10多肽治疗(例如剂量更低、给药更不频繁或治疗方案更短)。在又一实施方案中，减少或中断用至少一种活性剂治疗(例如当受试者稳定时)，并增加用本公开的IL-10多肽治疗(例如剂量更高、给药更频繁或治疗方案更长)。在又一实施方案中，维持用至少一种活性剂治疗，并减少或中断用本公开的IL-10多肽治疗(例如剂量更低、给药更不频繁或治疗方案更短)。在又一实施方案中，减少或中断用至少一种活性剂治疗和用本公开的IL-10多肽治疗(例如剂量更低、给药更不频繁或治疗方案更短)。
虽然后面阐述适于与本文公开的IL-10多肽(例如PEG-IL-10)组合使用的具体药剂，但应了解本公开不限于此。此后，在示例性疾病、病症和病状的特定类别中阐述某些药剂；然而，应了解，一种或多种类别之间常常存在重叠(例如某些药剂可以具有心血管与抗炎性两种作用)。
纤维化病症和癌症。本公开提供了用IL-10分子和至少一种其它治疗或诊断剂治疗和/或预防增生性病状；纤维化疾病、病症或病状；癌症、肿瘤或癌症前期疾病、病症或病状的方法。
化学治疗剂的实例包括(但不限于)烷基化剂；烷基磺酸酯；氮丙啶；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺；氮芥；亚硝基脲；抗生素；叶酸类似物；嘌呤类似物；嘧啶类似物；雄激素；抗肾上腺剂；叶酸补充剂；羟基脲；长春地辛(vindesine)；达卡巴辛(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；阿拉伯糖苷(arabinoside，Ara-C)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替派(thiotepa)；紫杉烷类(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)和多西紫杉醇(doxetaxel)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂和铂配位络合物；长春花碱(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺威本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂；卡培他滨(capecitabine)和抗激素剂；抗雄激素；激素和相关激素剂；和以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
可以与IL-10多肽组合使用的其它治疗方式包括细胞因子或细胞因子拮抗剂，例如IL-12、INFα或抗表皮生长因子受体、放射疗法、针对另一肿瘤抗原的单克隆抗体、单克隆抗体与毒素的复合物、T细胞佐剂、骨髓移植或抗原呈递细胞(例如树突状细胞疗法)。本文还提供了疫苗(例如呈可溶蛋白或呈编码蛋白质的核酸)。
本公开涵盖以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
胆固醇体内平衡剂。本公开的具体实施方案包括IL-10多肽与胆固醇体内平衡相关的药剂组合。许多这些药剂靶向涉及胆固醇吸收、合成、输送、存储、分解代谢和排泄的不同途径，因此为组合疗法尤其适用的候选者。
可用于组合疗法中以治疗高胆固醇血症(因此常常例如动脉粥样硬化)的治疗剂的实例包括他汀(statin)；胆汁酸树脂(螯合剂)；依泽替米贝(ezetimibe)(ZETIA)；纤维酸(例如TRICOR)和纤维酸酯；烟酸(例如NIACOR)；胆固醇吸收抑制剂；脂肪吸收抑制剂；PCSK9调节剂；和/或上述各者的组合(例如VYTORIN(依泽替米贝与辛伐他汀(simvastatin))。可以为与本文描述的IL-10多肽组合使用的候选者的替代胆固醇治疗包括多种补充剂和草药(例如大蒜、普利醇(policosanol)和印度香胶树(guggul))。
本公开涵盖以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
免疫和炎性病状。本公开提供了用IL-10多肽(例如PEG-IL-10)和至少一种具有免疫和/或炎性相关特性的其它药剂治疗和/或预防免疫和/或炎性相关疾病、病症和病状以及与其相关的病症的方法。举例来说，IL-10多肽可以与在具有炎性组分的心血管病症中具有功效的药剂一起施用。
可用于组合疗法中的治疗剂的实例包括(但不限于)非类固醇抗炎性药；乙酸衍生物；芬那酸衍生物；联苯基羧酸衍生物；昔康(oxicam)；水杨酸酯；和吡唑啉酮。其它组合包括选择性环加氧酶-2(COX-2)抑制剂、选择性环加氧酶1(COX 1)抑制剂和非选择性环加氧酶(COX)抑制剂。
用于组合的其它活性剂包括类固醇，例如泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)或氢化可的松(hydrocortisone)。当与本发明的IL-10多肽组合来治疗患者时所需的剂量。
组合用于治疗例如类风湿性关节炎的活性剂的其它实例包括抑制细胞因子的抗炎性药(CSAID)；例如TNF、LT、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF等其它人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂。
活性剂的特定组合可能干扰自身免疫和随后炎性级联中的不同点，并包括TNF拮抗剂，如嵌合、人源化或人TNF抗体、REMICADE、抗TNF抗体片段(例如CDP870)和可溶性p55或p75TNF受体、其衍生物、p75TNFRIgG(ENBREL.)或p55TNFR1gG(LENERCEPT)、可溶性IL-13受体(sIL-13)以及TNFα转化酶(TACE)抑制剂；类似地，IL-1抑制剂(例如白细胞介素-1转化酶抑制剂)可以是有效的。其它组合包括白细胞介素11、抗P7s和p-选择素糖蛋白配体(PSGL)。适用于与本文描述的IL-10多肽组合的药剂的其它实例包括干扰素-β1a(AVONEX)；干扰素-β1b(BETASERON)；考帕松(copaxone)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨(clabribine)；和其它人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂(例如CD40配体和CD80的抗体)。
本公开涵盖以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
抗糖尿病和抗肥胖剂。一些需要胆固醇相关病症的药理学治疗的患者还服用抗糖尿病和/或抗肥胖剂。本公开涵盖与许多抗糖尿病剂(和其类别)的组合疗法，所述抗糖尿病剂包括1)胰岛素、胰岛素模拟物和需要刺激胰岛素分泌的药剂；2)双胍和通过促进葡萄糖利用、减少肝葡萄糖产生和/或减弱肠葡萄糖输出起作用的其它药剂；3)α-葡糖苷酶抑制剂和减慢碳水化合物消化并因此减慢从消化道吸收且减少餐后高血糖症的其它药剂；4)噻唑烷二酮；5)胰高血糖素样肽，包括DPP-IV抑制剂、GLP-1和GLP-1激动剂和类似物；6)和DPP-IV抗性类似物(肠促胰岛素模拟物)、PPARγ激动剂、双重作用PPAR激动剂、全面作用(pan-acting)PPAR激动剂、PTP1B抑制剂、SGLT抑制剂、胰岛素促分泌剂、糖原合酶激酶-3抑制剂、免疫调节剂、β-3肾上腺素能受体激动剂、11β-HSD1抑制剂、糊精类似物；和核受体结合剂(例如视黄酸受体(RAR)结合剂、类视黄醇X受体(RXR)结合剂、肝X受体(LXR)结合剂和维生素D结合剂)。
此外，本公开涵盖与促进重量减轻的药剂和方法，例如刺激代谢或降低食欲的药剂和促进重量减轻的改变饮食和/或运动方案的组合疗法。
本公开涵盖以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
给药
可以向受试者施用一定量的本公开的IL-10多肽，所述量取决于例如施用目标(例如所需的解决程度)；受试者的年龄、体重、性别和健康状态和身体状态；施用途径；以及疾病、病症、病状或其症状的性质。给药方案还可以考虑与所施用的药剂相关的任何副作用的存在、性质和程度。容易通过例如安全性和剂量扩大试验、体内研究(例如动物模型)和熟练技术人员已知的其它方法确定有效剂量和给药方案。
一般来说，给药参数规定剂量小于对受试者来说可为不可逆毒性的量(即最大耐受剂量，“MTD”)且不小于对受试者产生可测量的作用的量。此类量通过例如与ADME相关的药代动力学和药效参数，考虑到施用途径和其它因素来确定。
有效剂量(ED)为药剂在服用药剂的一部分受试者中产生治疗反应或所期望的作用的剂量或量。药剂的“半数有效剂量”或ED50为药剂在其施用的50％群体中产生治疗反应或所期望的作用的剂量或量。虽然ED50通常用作药剂作用的合理预期的量度，但临床医师考虑到所有相关因素，不一定认为此剂量适当。因此，在一些情况下，有效量超过计算的ED50，在其它情况下，有效量小于计算的ED50，且在其它情况下，有效量与计算的ED50相同。
另外，本公开的IL-10多肽的有效剂量可以是当以一种或多种剂量施用于受试者时相对于健康受试者产生所需结果的量。举例来说，对于经历具体病症的受试者，有效剂量可以是改善该病症的诊断参数、量度、标记物等达至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％的剂量，其中100％定义为正常受试者所展现的诊断参数、量度、标记物等。
当IL-10多肽为PEG-IL-10时，治疗本文描述的疾病、病症或病状所需的PEG-IL-10的量基于缀合的蛋白质的IL-10活性，如上所指出，活性可以通过本领域中已知的IL-10活性测定法测定。举例来说，在肿瘤背景下，合适的IL-10活性包括例如CD8+T细胞浸润到肿瘤位点，例如IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-L等炎性细胞因子从这些浸润细胞进行表达，以及生物样品中TNF-α或IFN-γ的水平增加。
如许多药物一样，静脉内IL-10施用与两隔室动力学模型有关(参见Rachmawati,H.等人(2004)Pharm.Res.21(11):2072-78)。血浆药物浓度以多指数方式下降。在静脉内施用后，药物立即迅速地遍布初始空间(最低限度定义为血浆体积)，接着较缓慢地平衡分布到血管外空间(例如某些组织)。也已经研究了皮下重组hIL-10的药代动力学(Radwanski,E.等人(1998)Pharm.Res.15(12):1895-1901)。当评估适当IL-10给药相关的参数时，分布体积和其它药代动力学因素为相关的。此外，可证明利用IL-10药代动力学和给药原则对于将IL-10药剂靶向特定细胞类型的工作的成功来说非常重要(参见例如Rachmawati,H.(2007年5月)Drug Met.Dist.35(5):814-21)。
本公开涵盖施用产生所需治疗结果的任何剂量和给药方案。举例来说(但不限制)，当受试者为人时，非聚乙二醇化的hIL-10可以以超过0.5μg/kg/天、超过1.0μg/kg/天、超过2.5μg/kg/天、超过5μg/kg/天、超过7.5μg/kg、超过10.0μg/kg、超过12.5μg/kg、超过15μg/kg/天、超过17.5μg/kg/天、超过20μg/kg/天、超过22.5μg/kg/天、超过25μg/kg/天、超过30μg/kg/天或超过35μg/kg/天的剂量施用。另外，举例来说(但不限制)，当受试者为人时，包含相对较小的PEG(例如5kDa单-二PEG-hIL-10)的聚乙二醇化的hIL-10可以以超过0.5μg/kg/天、超过0.75μg/kg/天、超过1.0μg/kg/天、超过1.25μg/kg/天、超过1.5μg/kg/天、超过1.75μg/kg/天、超过2.0μg/kg/天、超过2.25μg/kg/天、超过2.5μg/kg/天、超过2.75μg/kg/天、超过3.0μg/kg/天、超过3.25μg/kg/天、超过3.5μg/kg/天、超过3.75μg/kg/天、超过4.0μg/kg/天、超过4.25μg/kg/天、超过4.5μg/kg/天、超过4.75μg/kg/天或超过5.0μg/kg/天的剂量施用。
PEG-IL-10的治疗有效量可以在约0.01至约100μg蛋白质/kg体重/天、约0.1至20μg蛋白质/kg体重/天、约0.5至10μg蛋白质/kg体重/天或约1至4μg蛋白质/kg体重/天的范围内。在一些实施方案中，PEG-IL-10通过连续输注来施用以递送约50至800μg蛋白质/kg体重/天(例如约1至16μg蛋白质/kg体重/天的PEG-IL-10)。输注速率可以基于例如副作用和血细胞计数的评估来改变。
对于经口药剂的施用，组合物可以呈含有1.0至1000毫克活性成分，具体为1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克活性成分的片剂、胶囊等形式提供。
在某些实施方案中，所公开的IL-10多肽(例如PEG-IL-10)的剂量含于“单位剂型”中。短语“单位剂型”是指物理离散单元，每个单元含有足够产生所期望的作用的预定量的本公开的IL-10多肽，其单独或与一种或多种其它药剂组合。应了解单位剂型的参数将取决于具体的药剂和待实现的作用。
试剂盒
本公开还涵盖包含IL-10多肽(例如PEG-IL-10)和其药物组合物的试剂盒。试剂盒一般呈容纳如下所述的多种组分的物理结构形式，且可以用于例如实践上述方法(例如IL-10多肽施用于需要恢复胆固醇体内平衡的受试者)。
试剂盒可以包括一种或多种本文公开的IL-10多肽(提供于例如无菌容器中)，IL-10多肽可以呈适于施用于受试者的药物组合物形式。IL-10多肽可以呈备用的形式或呈需要例如在施用前复原或稀释的形式提供。当IL-10多肽呈需要使用者复原的形式时，试剂盒还可以包括缓冲液、药学上可接受的赋形剂等，与IL-10多肽一起或分开包装。当涵盖组合疗法时，试剂盒可以分开含有若干药剂或其可以已经组合于试剂盒中。试剂盒的每种组分可以封闭在个别容器内，且所有多个容器都可以在单个包装内。可以针对适当维持其中容纳的组分所需的条件(例如冷藏或冷冻)，设计本公开的试剂盒。
试剂盒可以含有标签或包装插页，标签或包装插页包括关于其中组分的识别信息和关于其使用的说明书(例如给药参数、活性成分的临床药理学(包括作用机制、药代动力学和药效学)、副作用、禁忌症等)。标签或插页可以包括制造商信息，例如批号和终止日期。标签或包装插页可以例如整合到容纳组分的物理结构中，分开含于物理结构内或附着到试剂盒的组件(例如安瓿、管或小瓶)。
标签或插页可以另外包括或并入计算机可读媒体，例如磁盘(例如硬盘、卡、存储磁盘)、光盘(例如CD-或DVD-ROM/RAM)、DVD、MP3、磁带或电子存储介质，例如RAM和ROM，或这些的混杂物，例如磁性/光存储介质、FLASH媒体或存储器类型卡。在一些实施方案中，实际指令不存在于试剂盒中，而是提供例如经由因特网，从远端源获得说明书的方式。
实验
提出以下实施例以便为本领域的普通技术人员提供关于如何进行和使用本发明的完整公开内容和描述，且不意图限制本发明者视为其发明的内容的范围，也不意图表示以下实验都进行或是可以进行的所有实验。应了解，不一定进行以现在时书写的示例性描述，而是可以进行所述描述以产生其中描述的数据等等。努力确保关于所使用的数字(例如量、温度等等)的准确性，但应说明一些实验误差和偏差。
除非另外指示，否则份是重量份，分子量是重量平均分子量，温度以摄氏度(℃)计，且压力为大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括以下：bp＝碱基对；kb＝千碱基；pl＝皮升；s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；aa＝氨基酸；kb＝千碱基；nt＝核苷酸；pg＝皮克；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dL＝分升；μl或μL＝微升；ml或mL＝毫升；l或L＝升；μM＝微摩尔；mM＝毫摩尔；M＝摩尔；kDa＝千道尔顿；IB＝包涵体；HPLC＝高效液相色谱法；BW＝体重；U＝单位；ns＝统计上不显著；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；IHC＝免疫组织化学；EDTA＝乙二胺四乙酸；SDS-PAGE＝十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；RLU＝相对光单位；nm＝纳米；LOD＝检测极限；LOQ＝定量极限。
材料与方法
在指示时使用以下通用材料与方法，或可以用于以下实例中：
分子生物学程序。分子生物学中的标准方法描述于科学文献中(参见例如Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning,第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.；和Ausubel 等人,(2001)Current Protocols inMolecular Biology,第1-4卷,John Wiley and Sons,Inc.New York,N.Y.，其描述细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷))。
抗体相关的过程。描述多克隆抗体和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(例如Harlow和Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY)；可利用用于表征配体/受体相互作用的标准技术(参见例如Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology,第4卷,John Wiley,Inc.,NY)；可利用用于流式细胞术的方法，包括荧光激活细胞分选术(FACS)(参见例如Shapiro(2003)PracticalFlow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)；且可利用适于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体(例如用作诊断剂)的荧光试剂(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR.；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO.)。抗体的进一步论述出现在本文中的其它地方。
软件。可利用用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库(参见例如GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；和DeCypherTM(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,NV)。
聚乙二醇化。本文描述的聚乙二醇化的IL-10可以通过熟练技术人员已知的任何方式合成。已经描述用于产生单-PEG-IL-10和单-/二-PEG-IL-10的混合物的示例性合成方案(参见例如美国专利No.7,052,686；美国专利公布No.2011/0250163；WO 2010/077853)。本公开的具体实施方案包括选择性聚乙二醇化的单-PEG-IL-10和二-PEG-IL-10的混合物。除利用适合实践本公开的PEG的产生和使用的自身熟悉的技能(和其它药物递送技术)外，熟练技术人员熟悉PEG相关技术的许多商业供应商(例如NOF America Corp(Irvine,CA)和Parchem(New Rochelle,NY))。
MC/9体外测定法。本文描述的IL-10分子的相对功效(生物活性)可以使用领域公认的任何测定法或方法，例如MC/9生物测定法来确定(一般参见Gomi,K.等人,J.Immuno.165(11):6545-52(2000年12月1日))。MC/9为表达内源性MuIL-10受体(R1和R2)的鼠类肥大细胞系。响应于rMuIL-10和rHuIL-10刺激，发生MC/9细胞增殖。测定试剂和材料可从许多来源商购获得(例如R&D Systems,USA；和Cell Signaling Technology,Danvers,MA)。
在本文中使用的MC/9生物测定法中，以1×104个细胞/孔涂铺并与rHuIL-10标准品的3倍稀释液和测试样品一起孵育。将细胞在37℃、5％CO2下培养40-56小时。孵育后，将板平衡至室温，历时20-40分钟，接着将100μL CellTiter GLO(Promega Corp；Madison,WI)添加到所有孔。接着在震荡的同时将板在室温下孵育20-40分钟，接着在荧光板读数器上在395nm的波长下读取。对于每个组，测定每种浓度的平均RLU。使用平均RLU对比浓度对数，产生每个系列样品的拟合约束且独立的4参数对数(logistic)反应曲线。结果相对于参考功效标准报道为相对功效％，其中参考标准具有100％的功效。报道的数值由至少3次测定(例如3个板)的平均值产生。
重组hIL-10的蛋白质活性还可以通过短期增殖生物测定法，利用MC/9细胞系评估。可以通过比色方法，使用Alamar Blue(一种生长指示染料)，基于代谢活性的检测来测量增殖。重组hIL-10的生物活性可以通过EC50值或在剂量反应曲线中观测到半数最大刺激所在的蛋白质浓度来评估。
文献中描述的示例性IL-10纯化方法。科学文献描述用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱法、电泳、离心和结晶，以及化学分析、化学改性、翻译后修饰、产生融合蛋白和蛋白质糖基化(参见例如Coligan等人,(2000)Current Protocols in ProteinScience,第1-2卷,John Wiley and Sons,Inc.,NY)。本文中阐述用于或可以用于本公开的方法中的具体方法。
科学和专利文献描述IL-10纯化方法，且此类方法为熟练技术人员已知。举例来说，美国专利No.5,710,251描述一种将hIL-10从CHO细胞系培养基纯化的方法。简单地说，该方法使CHO细胞培养上清液进行一系列色谱法步骤，包括阳离子交换色谱法(利用柱)、阴离子交换色谱法(利用柱)、羟磷灰石色谱法和凝胶过滤色谱法(利用柱)。
另外，美国专利No.5,710,251描述从大肠杆菌纯化hIL-10。简单地说，将大肠杆菌用表达构建体转化，以便在细胞内产生rhIL-10，且其作为不溶包涵体的一种组分存在。发酵后，通过离心将含有IL-10的包涵体沉淀与细胞物质的其余部分分离。接着将包涵体沉淀经历洗涤澄清并溶解成变性蛋白质。利用通常用于特性类似于IL-10的蛋白质的程序进行重折叠。此后，进行一系列色谱法步骤(类似于以上针对IL-10从CHO细胞系培养基纯化所述的色谱法步骤)：阳离子交换色谱法(利用柱)、阴离子交换色谱法(利用柱)、羟磷灰石色谱法和凝胶过滤色谱法(利用柱)。如下所述，本公开的实施方案包括某些上述步骤的修改和优化。
SDS-PAGE电泳。在12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上，在1x MES SDS操作缓冲液(Invitrogen)中，在200伏下将蛋白质样品跑胶37分钟。为制备用于电泳的样品，将16μL重折叠物质与6μL 4x LDS样品缓冲液(Invitrogen)和2.4μL 10x NuPage样品还原剂(Invitrogen)混合。为制备用于电泳的未折叠的样品，将1μL未折叠的物质与15μL水、6μL4x LDS样品缓冲液和2.4μL 10x NuPage样品还原剂混合。电泳后，Simply Blue用以将分开的蛋白质染色，且使用GE的ImageQuant LAS 500成像仪(GE Healthcare Bio-sciences,Pittsburgh,PA)捕获影像。使用1μg、0.5μg和0.25μg可商购获得的IL-10作为浓度标准品进行密度测定法。程序按照制造商的方案。
实施例1
重折叠缓冲液中的IL-10浓度
此实例表明，与先前描述的其中重折叠与体积相关且IL-10浓度不明确的方法相反，事实上，蛋白质重折叠取决于IL-10浓度。
包涵体在环境温度下解冻，并以每10mL包涵体悬浮缓冲液(50mM Tris、4mM DTT(Acro Biotech；Rancho Cucamonga,CA)、7M胍和pH 8.25)2g包涵体的密度再悬浮。溶解的包涵体保持在摇摆平台上在室温下3-20小时，且通过在环境温度下在最大速度(16000g)下离心15分钟，将含有IL-10的溶解物质与不溶解碎片分离。上清液含有呈天然状态的未折叠的IL-10。在开始重折叠过程前，经由SDS-PAGE，分析1μL溶解的包涵体悬浮液，以测定包涵体的纯度和溶解物质中IL-10的量(数据未示)。还进行分光光度法以测量溶解的物质在波长260nm、280nm和320nm下的吸光度(数据未示)。
在洗涤澄清后，包涵体溶解成变性蛋白质，接着进行重折叠程序。简单地说，Dynamax蠕动泵用以通过17cm内径管以大约重折叠缓冲液再循环速率1/15下添加未折叠的IL-10。重折叠设备用以将未折叠的IL-10中的胍浓度从7M胍逐渐稀释到0.45M胍。在添加时，未折叠的IL-10保持在中间胍浓度下6秒，接着其完全添加至主体重折叠腔室中，处于0.45M胍的最终浓度下。用Masterflex L/S Easy-Load II泵将重折叠缓冲液以每10分钟1体积的速率再循环。在Corning搅拌板上将重折叠混合物用搅拌棒以约6的速度轻轻搅动。
进行实验矩阵，并评估条件，以确定最佳IL-10重折叠环境。简单地说，评估4℃、25℃和37℃的温度；评估在0.05至10mg IL-10/L的重折叠缓冲液范围内的浓度；通过测试重折叠缓冲液中不同比率的氧化型与还原型谷胱甘肽，来评估氧化还原电位；并检查不同氨基酸的特定范围(0mM-2M)以鉴别重折叠缓冲液组分。
使用重折叠设备，将足够量的未折叠的IL-10在促进IL-10适当折叠的重折叠缓冲液和氧化还原环境中连续脉冲稀释。在350mL重折叠缓冲液下，重折叠1mg、4mg和11mg变性的IL-10产生相同量的适当折叠物质。另外，确定未折叠的rHuIL-10单体以0.15mg/mL浓度的添加使适当折叠的二聚IL-10的产量相对于3mg/mL IL-10或更高浓度的重折叠增加1.5倍至3倍。具体地说，当在较高IL-10浓度下进行重折叠时，大部分IL-10作为不溶聚集物而丧失，且当在较低IL-10浓度下进行重折叠时，适当折叠的IL-10的最终产量降低且下游加工时间增加。
重折叠缓冲液中IL-10浓度与总产量之间的关系在表1中所示的cGMP制造规模下最显著。
表1
如表1中所描绘，重折叠缓冲液中高浓度的IL-10产生最差的产量，而接近0.15mg/mL的浓度引起最大的回收百分比。在较大生产规模下也观测到此实例中描述的发现结果(数据未示)。
实施例2
将精氨酸添加至重折叠缓冲液
此实例表明将L-精氨酸添加至重折叠缓冲液对所产生的适当折叠的IL-10的量具有积极作用。
为促进从包涵体获得的重组蛋白质的重折叠，0.1至1M精氨酸常常用于溶剂中以供通过渗析或稀释使蛋白质重折叠(参见例如Tsumoto,K.等人,(2004)Biotechnol.Prog.20:1301-08)。然而，科学和专利文献中很少论述关于将精氨酸添加至重折叠缓冲液用于产生IL-10。举例来说，美国专利No.5,710,251中公开的IL-10生产方法在重折叠缓冲液中未利用精氨酸。当论述使用精氨酸作为IL-10的重折叠缓冲液的组分时，建议0.5M L-精氨酸和100mM尿素用作重折叠缓冲液(Arora等人,REFOLD数据库)。
发现添加低浓度的L-精氨酸正面影响IL-10产量。如表2中所示，添加0.01-0.1M精氨酸至含有0.15mg/mL未折叠的rHuIL-10的重折叠缓冲液引起适当折叠的二聚IL-10至少增加两倍。精氨酸的此浓度比Arora等人报道的浓度低得多。
表2
因此，观测到添加0.1M精氨酸可用于使重折叠IL-10的产量比缺乏精氨酸的情况下进行的重折叠的产量增加大约两倍。
实施例3
UFDF缓冲液的优化
在制造工艺期间，发现在重折叠后IL-10蛋白质立刻大量丧失，其中折叠和未折叠的蛋白质的混合物浓缩并交换到有助于经由SP柱进行纯化的缓冲液中。此步骤常常称为超滤/渗滤(UFDF)。
为增强蛋白质溶解性并防止IL-10由于浓度依赖性沉淀而大量丧失，评估将精氨酸和氯化钠添加至UFDF缓冲液或添加至重折叠缓冲液交换的缓冲液的影响。发现UFDF缓冲液(20mM Bis-Tris pH 6.5)中0.1M精氨酸的存在使产量增加估计两倍。
总之，本文中描述的实验产生最佳IL-10重折叠条件，其中rHuIL-10浓度为0.05至0.3mg/mL，其中精氨酸浓度介于0.01与0.1M之间。实际上，重折叠缓冲液中和UFDF缓冲液中0.1M精氨酸的存在一致地使总重折叠和回收的IL-10增加两至四倍。最终重折叠环境最佳维持在pH 8.3下，在20％蔗糖(Amesco)、0.1M L-精氨酸(Sigma)、50mM Tris(Corning)、0.45mM氧化型谷胱甘肽(Sigma)和0.05mM还原型谷胱甘肽(Sigma)存在下。
实施例4
IL-10从商业制造工艺的回收
此实例表明在商业cGMP制造工艺中回收的重折叠IL-10的量受IL-10输入影响。
本文中利用在实施例1中描述的通用方法。简单地说，使包涵体溶解于悬浮缓冲液中，并通过离心将含有线性化的未折叠的IL-10的溶解物质与不溶碎片分离，这产生含有处于天然未折叠的状态下的未折叠的IL-10的上清液。在开始重折叠过程前，经由SDS-PAGE，分析溶解的包涵体悬浮液，以测定溶解物质中IL-10的量。还进行分光光度法以测量溶解物质在包括280nm在内的若干波长下的吸光度。此后，进行洗涤澄清步骤，且包涵体溶解成变性蛋白质，接着进行重折叠程序。
如在实施例1中所示，在制造工艺期间，在重折叠后IL-10蛋白质一般立刻大量丧失，其中折叠和未折叠的蛋白质的混合物浓缩并交换到有助于经由SP柱进行纯化的缓冲液中(如上所指出，此步骤可以称为超滤/渗滤(UFDF))。如先前所指示，当rHuIL-10浓度在0.05至0.3mg/mL之间时，观测到最佳IL-10重折叠条件；重折叠缓冲液中高浓度的IL-10因未折叠的和聚集的单体IL-10的沉淀而引起产量较低。
表3
表3阐述商业制造工艺的每个步骤的IL-10的产量。参见表3，六批IL-10物质进行未折叠、重折叠、UFDF-1和SP柱上纯化的步骤。六批中的每一批在分开天数进行本文中描述的工艺步骤，并将来自六批中两批的产量组合，用于进一步下游加工；也就是说，将批号15-0540-A和15-0540-B的产量组合(组合重折叠1)，将批号15-0751-A和15-0751-B的产量组合(组合重折叠2)，且将批号15-1069-A和15-1069-B的产量组合(组合重折叠3)。
在表3中，“IB输入”表示经洗涤的包涵体的总重量(以千克计)；“来自IB的IL-10输入”表示从未折叠的步骤获得的rHuIL-10的质量(以克计)，将其添加至约1000升重折叠缓冲液以使二聚rHuIL-10重折叠；“UFDF-1回收”表示从第一次过滤和浓缩步骤回收的rHuIL-10的质量(以克计)；以及“SP回收”表示从初始捕获柱回收的rHuIL-10的质量(以克计)。
参见批号15-0540-A，从未折叠的步骤获得的64.47g从重折叠步骤得到174.63g。从重折叠步骤回收的IL-10的假定质量超过从未折叠的步骤回收的质量，因为从重折叠步骤回收的假定质量包括来自包涵体的非IL-10蛋白质和在SP纯化步骤期间去除的280nm吸收分子。
这些数据说明当IL-10输入超过大约80克总量或大约0.09mg/mL时，回收基本上由于沉淀而减弱。此结果可以在最后一列中说明，其中93.68克的IL-10输入产生低于其它IL-10输入重量任一者的SP回收(11.54g)。这些数据与在本文中的其它地方(例如实施例3)描述的数据一致，其中当rHuIL-10浓度为0.05至0.3mg/mL时观测到最佳IL-10重折叠条件。
本文中描述本发明的具体实施方案，包括本发明者已知进行本发明的最佳方式。在阅读以上描述时，在本领域中工作的个体可以显而易见所公开的实施方案的变化方案，且预计熟练技术人员可以视情况采用此类变化方案。因此，意图本发明以除本文中特别描述外的方式实践，且本发明包括在适用法律允许下在随附权利要求书中叙述的主题的所有修改和同等物。此外，除非本文中另外指明或上下文另外清楚地矛盾，否则本发明涵盖其所有可能的变化方案形式的以上描述的要素的任何组合。
本说明书中所引用的所有公开、专利申请、登录编号和其它参考文献都以引用的方式并入本文中，其程度如同特别且个别地指示每个个别公开或专利申请以引用的方式并入一般。
序列表
<110> J·S·K·陈
B·H·根森
J·B·穆姆
<120> 提高重组蛋白产量的方法
<130> ARMO-013WO
<150> US 62/096,359
<151> 2014-12-23
<160> 22
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 12
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<223> 合成多肽
<400> 2
Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg
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Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
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<210> 4
<211> 33
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽
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Lys Ala Leu Ala Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala
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Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Cys Glu
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Ala
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<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

Claims (36)

1.一种产生重折叠的白细胞介素-10(IL-10)的方法，所述方法包括：
(a)获得包含未折叠的IL-10单体的混合物，以及
(b)使所述混合物与重折叠缓冲液接触以产生包含重折叠的IL-10的掺和物；
其中所述重折叠缓冲液中未折叠的IL-10单体的浓度为0.05g/mL至0.3g/mL。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述重折叠缓冲液中未折叠的IL-10单体的浓度为0.1g/mL至0.25g/mL。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述重折叠缓冲液中未折叠的IL-10单体的浓度为0.1g/mL至0.2g/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述重折叠缓冲液中未折叠的IL-10单体的浓度为约0.15g/mL。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述IL-10为重组产生的人IL-10(rhIL-10)。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述rhIL-10在细菌中表达。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述细菌为大肠杆菌。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合物通过将多个包含IL-10的包涵体与悬浮缓冲液组合来产生。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将氧化还原体系添加至所述重折叠缓冲液。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述氧化还原体系包含氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将至少一种天然存在或非天然存在的氨基酸添加至所述重折叠缓冲液。
12.如权利要求11所述的方法，其中将0.005至0.3M精氨酸添加至所述重折叠缓冲液。
13.如权利要求11所述的方法，其中将0.0075至0.25M精氨酸添加至所述重折叠缓冲液。
14.如权利要求12所述的方法，其中将0.05M至0.2M精氨酸添加至所述重折叠缓冲液。
15.如权利要求13所述的方法，其中将0.01M至0.15M精氨酸添加至所述重折叠缓冲液。
16.如权利要求14所述的方法，其中将约0.1M精氨酸和约0.15g/mL未折叠的IL-10单体添加至所述重折叠缓冲液。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前对所述混合物进行洗涤澄清。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中对所述掺和物进行超滤/渗滤(UFDF)。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重折叠缓冲液的pH为约pH 8.3。
20.一种IL-10重折叠缓冲液，其包含：
(a)包含浓度为0.05g/mL至0.3g/mL的未折叠的IL-10单体的混合物；以及
(b)摩尔浓度为0.005至0.3M的精氨酸。
21.如权利要求20所述的重折叠缓冲液，其中未折叠的IL-10单体的浓度为0.05g/mL至0.25g/mL。
22.如权利要求20所述的重折叠缓冲液，其中未折叠的IL-10单体的浓度为0.1g/mL至0.2g/mL。
23.如权利要求20所述的重折叠缓冲液，其中未折叠的IL-10单体的浓度为约0.15g/mL。
24.如权利要求20-23中任一项所述的重折叠缓冲液，其中所述IL-10为rhIL-10。
25.如权利要求24所述的重折叠缓冲液，其中所述rhIL-10在细菌中表达。
26.如权利要求25所述的重折叠缓冲液，其中所述细菌为大肠杆菌。
27.如权利要求20-26中任一项所述的重折叠缓冲液，其中所述未折叠的IL-10单体从包涵体的悬浮液中获得。
28.如权利要求20-27中任一项所述的重折叠缓冲液，其还包含氧化还原体系。
29.如权利要求28所述的重折叠缓冲液，其中所述氧化还原体系包含氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽。
30.如权利要求29所述的重折叠缓冲液，其包含约0.45mM氧化型谷胱甘肽和约0.05mM还原型谷胱甘肽。
31.如权利要求20所述的重折叠缓冲液，其包含0.0075至0.25M精氨酸。
32.如权利要求31所述的重折叠缓冲液，其包含0.05至0.2M精氨酸。
33.如权利要求32所述的重折叠缓冲液，其包含0.01至0.15M精氨酸。
34.如权利要求33所述的重折叠缓冲液，其包含约0.1M精氨酸和约0.15g/mL未折叠的IL-10单体。
35.如权利要求20-34中任一项所述的重折叠缓冲液，其中所述混合物从包含IL-10的包涵体的悬浮液的洗涤澄清获得。
36.如权利要求20-35中任一项所述的重折叠缓冲液，其中所述重折叠缓冲液的pH为约pH 8.3。
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