CN109481403A

CN109481403A - 一种壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体及制备方法

Info

Publication number: CN109481403A
Application number: CN201811474276.8A
Authority: CN
Inventors: 曲毅; 程同杰; 李靳
Original assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Current assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: CN109481403B

Abstract

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液及制备方法。本发明提供了一种醋酸钙梯度法制备的壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体，将大豆卵磷脂、胆固醇制备脂膜，加入醋酸钙溶液制备空白脂质体，加入醋酸曲安奈德后获得一种醋酸曲安奈德脂质体，经壳聚糖包覆得到壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体。该脂质体具有良好的药剂学性质，脂质体表面呈现正电荷，将其与玻璃酸钠溶液配制为滴眼液，可以提高醋酸曲安奈德的水溶性，对角膜的吸附性，并可降低其药物毒性，与注射剂型相比，使用更为简便、安全。

Description

一种壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体及制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体及制备方法。

背景技术

醋酸曲安奈德是一种长效糖皮质激素，该药物具有强而持久的抗炎和抗变态反应作用，在眼科领域主要用于治疗葡萄膜炎、黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性等疾病。醋酸曲安奈德的给药方式主要为局部给药，包括结膜下注射、球后注射及玻璃体内注射，需长期、多次给药，并发症包括高眼压、眼内炎、眼内出血、白内障、视网膜毒性等。在眼科临床用药实践中，滴眼液使用方便、耐受性好，是眼科用药的首选剂型。但由于醋酸曲安奈德为脂溶性药物、稳定性及渗透性差，直接溶于水制成的滴眼液不能有效通过眼部屏障结构到达眼后节，无法治疗眼后节疾病。而且，已有文献证明，醋酸曲安奈德浓度与药物毒性呈正相关，通过提高其浓度，既增加毒性，亦无法达到眼内有效药量。

脂质体具有生物可降解性及生物相容性，包载运输药物可提高药物溶解度，促进极性大分子穿透细胞膜；具有缓释性，可延长药物在眼内的半衰期；可保护药物分子免受代谢酶的攻击；降低药物的毒副作用。但临床常用的阴性脂质体和中性脂质体角膜表面吸附力差；且存在稳定性较差,易出现絮凝、粒径变大，不能长期保存，包封率低等问题。脂质体包载药物制备的滴眼液无法应用于临床。

壳聚糖作为一种正性多糖，具有良好的生物膜粘附性、生物相容性及抗菌活性，可促进药物吸收，应用于滴眼液可显著提高药物性能，本领域既往研究中，还未公开过壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液。

发明内容

针对上述技术问题，本发明结合壳聚糖与脂质体的优点，提供一种壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体，提高醋酸曲安奈德的溶解度、稳定性、吸附性以及渗透性，具有缓释特性，毒副作用小，有效治疗眼后节疾病，减少并发症，增加患者顺应性。

为了实现上述技术效果，本申请提供以下技术方案：

本申请第一方面，提供一种壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体，该醋酸曲安奈德脂质体以卵磷脂、胆固醇为原料通过醋酸钙梯度法制备，醋酸曲安奈德脂质体制备完成后包裹壳聚糖得到该壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体。

本领域公知，胆固醇是一种中性脂类，采用卵磷脂与胆固醇制备的脂质体为中性脂质体，透皮性能尚可，但是稳定性不佳。本申请通过壳聚糖对该脂质体进行修饰，加入阳离子表面活性剂，产生协同结合转变的效果：修饰后脂质体呈正电性，具有表面电荷排斥作用，可防止聚集；透皮效果良好，易与负电荷丰富的角膜和结膜糖蛋白结合。本申请通过壳聚糖的修饰获得一种呈正电荷的脂质体，经电位检测，本申请中脂质体表面电位为(+13.2±0.7)mV。

本申请第二方面，提供上述壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体的制备方法，该制备方法步骤如下：

(1)将大豆卵磷脂与胆固醇溶于氯仿中，旋转蒸发除去有机溶剂成脂膜；

(2)加入醋酸钙溶液，超声水化获得蓝色乳光脂质体混悬液，反复冻融并经微孔器过滤后获得透明脂质体悬液；

(3)将步骤(2)中得到的透明脂质体悬液放入透析袋中，以生理盐水作为透析液进行孵育，获得空白脂质体悬液；

(4)将醋酸曲安奈德以一定的药脂比加入空白脂质体悬液中，恒温水浴孵育一段时间，通过高压均质机粉碎后得到醋酸曲安奈德脂质体；

(5)称取一定量的壳聚糖溶于冰醋酸水溶液，获得壳聚糖溶液；

(6)将步骤(5)中的壳聚糖溶液边滴加边搅拌的方式加入步骤(4)中持续搅拌一段时间得到壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体。

醋酸钙梯度法作为一种主动载药型的脂质体制备方法，通过醋酸钙的跨膜运动产生浓度梯度，使得大量质子从脂质体内部转运到外部产生pH梯度，使药物自发性的向脂质体内部聚集，从而大大提高药物的包封效果，通常状况下，由于钙离子的膜渗透系数较小，起到储库的作用，浓度过低时，往往不能形成有效的醋酸钙梯度。本申请研究过程中发现，针对醋酸曲安奈德的脂质体制备，加入一定浓度的醋酸钙溶液，通过透析将溶液中游离的钙离子除去有利于醋酸曲安奈德主动进入脂质层。

优选的，步骤(1)中大豆卵磷脂与胆固醇的摩尔比为7～9:0.5～1.5。

优选的，步骤(1)中旋蒸条件为30～40℃，150～250转/分钟旋转除去氯仿。

优选的，步骤(1)中还包括将脂膜置于真空环境中过夜，彻底除去残留有机溶剂。

优选的，步骤(2)中醋酸钙溶液浓度为110～130mM，40～50℃超声2.5～3.5h。

优选的，步骤(2)中将混悬液反复冻融后通过0.22μm微孔器，循环该步骤8～12次。

优选的，步骤(3)中以生理盐水为透析液在常温下孵育，每隔1.5～2.5小时更换透析液，彻底除去游离的钙离子。

优选的，步骤(4)中醋酸曲安奈德与脂膜的质量比为0.8～1.2:18～22。

优选的，步骤(4)中将加入醋酸曲安奈德的空白脂质体悬液置于48～52℃孵育13～17min。

优选的，步骤(4)中孵育完成后的脂质体加入高压均质机中，400～600bar压力下循环4～6次粉碎，1400～1600bar压力下循环12～17次进行粉碎。

优选的，步骤(5)中壳聚糖溶液的浓度为0.45～0.65％(w/v)。

优选的，步骤(6)所述壳聚糖溶液加入脂质体悬液后，持续搅拌0.8～1.2h，并在4℃孵育过夜。

本申请第三方面，提供一种醋酸曲安奈德滴眼液，该滴眼液通过上述壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体与玻璃酸钠滴眼液混合制成。

优选的，上述滴眼液中，醋酸曲安奈德浓度为1.4～1.6mg/mL。

本发明第四方面，提供醋酸曲安奈德脂质体、或上述制备方法得到的壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体在制备抗炎或抗变态反应制剂方面的应用。

本发明第五方面，提供上述壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德滴眼液在治疗眼后节疾病方面的应用。

本发明的有益效果

1.本申请提供一种壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体，该脂质体通过醋酸钙梯度法制备。现有技术中尚未报道过通过醋酸钙梯度法制备醋酸曲安奈德脂质体，本申请研究过程中发现，加入一定浓度的醋酸钙，在制备过程中除去游离的钙离子，有利于药物主动进入脂质层，提高药物的包封率，经测量，本申请中脂质体平均DL％(载药率)≥80％，平均EE％(包封率)≥90％。

2.本申请中的壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体可作为眼部用药，通过壳聚糖修饰，改善脂质体表面电性，使之成为一种带有正电荷的脂质体颗粒，在防止脂质颗粒聚集，增加稳定性的同时，有利于药物与角膜、结膜的结合，提高药物生物利用度。初步稳定性考察实验结果表明，本申请中的脂质体45d内包封率稳定不发生变化。应用于大鼠视网膜水肿模型，表现出良好的治疗效果。

3.本领域公知，高浓度的脂质体药物作用于眼部具有一定的毒性，本申请中的脂质体经细胞毒性试验证明，相同浓度下，壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体组的细胞活性均比醋酸曲安奈德组高，随浓度的增高，细胞活性差距越大，证明本申请中的壳聚糖脂质体有降低药物毒性的作用。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液透射电镜图

图2为醋酸曲安奈德体外释放曲线

图3为壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液细胞毒性实验

图4为壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液药效实验结果

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是实施例，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中针对醋酸曲安奈德的眼部给药具有诸多弊端，醋酸曲安奈德为脂溶性药物，给药剂量难以提升，且渗透作用差。传统的醋酸曲安奈德脂质体与角膜结膜亲和力低，载药效果不理想。为了解决以上的技术问题，本申请提出一种壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体，该脂质体通过醋酸钙梯度法制备，具有良好的载药效果及包封率。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。

实施例1壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体制备

将大豆卵磷脂与胆固醇按照8：1摩尔比溶解于氯仿中，用旋转蒸发仪35℃，转速200转/分钟，15min，旋转蒸发成膜。置于真空环境中过夜，彻底除去残留有机溶剂。

加入醋酸钙溶液(120mM)，45℃，常压下超声水化3h，制得有蓝色乳光的空白脂质体混悬液。

将混悬液反复冻融，并在氮气压力≤200psi的情况下，用0.22微米微孔滤器过滤，该步骤循环10次，得到透明脂质体悬液。

将悬液放入透析袋，以0.9％氯化钠溶液为透析液，在室温下进行孵育过夜，每间隔2小时更换一次透析液，彻底除去游离钙离子。

将醋酸曲安奈德以1:20药脂比加入空白脂质体混悬液中，在磁力搅拌器上恒温水浴中50℃孵育15min，通过高压均质机进行整粒，先用500bar压力循环5次进行初次粉碎，后用1500bar压力循环15次进行细化粉碎。

将一定质量的壳聚糖溶解于冰醋酸水溶解，得到0.5％(w/v)的壳聚糖溶液。

室温下，将壳聚糖溶液以边滴加边搅拌的方式加入上述步骤制得的醋酸曲安奈德脂质体悬液中，持续搅拌1小时后，4℃孵育过夜，得到壳聚糖包裹的醋酸曲安奈德脂质体。

实施例2壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液的制备

将实施例1中的壳聚糖包裹的醋酸曲安奈德脂质体悬液与玻璃酸钠滴眼液混匀，调整药物浓度，控制醋酸曲安奈德浓度为1.5mg/mL，制得壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液。4℃保存。

实施例3载药率和包封率测定

色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS柱(250mm×4.6mm,5μm)，甲醇-水-乙醚(体积比68∶32∶4)为流动相，紫外检测波长240nm，柱温30℃,流速1.0mL·min^-1，进样量为20μL，内标法定量。

吸取壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液1ml于10mL的容量瓶中,加入甲醇分散溶解完全，0.22μm微孔滤膜过滤,转入到10mL容量瓶中并用流动相定容至刻度，摇匀即得样品溶液，进样20μL进行色谱分析，测定醋酸曲安奈德药物总质量m_药。

另吸取等量的壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液1ml，以0.1mol·L^-1盐酸溶液调节水分散液的pH≈2.5，使脂质体纳米粒凝聚，离心分离纳米粒(离心条件：4℃、12000r/min、15min，纯化蒸馏水洗涤纳米粒2次，离心分离，上清液合并定容，0.22μm微孔滤膜过滤，续滤液进样20μL进行色谱分析,测定游离药物的质量m_药。

经换算后按下式计算载药率(DL％)和包封率(EE％):

DL％(载药率)＝(m_药-m_游)/m_总×100％

EE％(包封率)＝(m_药-m_游)/m_药×100％；

m_总：醋酸曲安奈德的总质量。

重复三次以上步骤，测得平均DL％(载药率)≥80％，平均EE％(包封率)≥90％。

实施例4理化性质的考察

1.粒径和电位的测定

取适量的壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体,用PBS稀释至适当浓度，用Mastersizer-2000测定其粒径分布和表面电位。得到其平均粒径为100nm，均为单峰分布；表面电位为(+13.2±0.7)mV。

2.外观形态考察

取壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体适量，纯水稀释,滴加于铜网上，用2％磷钨酸钠负染，在透射电镜下观察其形态。从电镜照片上可以看出其呈球形，有较好的形貌，分散性良好，大小均匀一致(图1)。

实施例5体外释放实验

取壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体3.5mL装入透析袋(截留相对分子质量14000)中，将透析袋置于200mL的释放介质(pH 6.2磷酸盐缓冲液/乙醇＝80/20)，于37.0℃慢速搅拌下进行体外释放实验。每隔30min取透析介质1.0mL，同时补加1.0mL释放介质溶液。采用高效液相色谱法，在240nm波长下测定释放出的醋酸曲安奈德含量。累积释放率：药物释放率＝(m/m₀)×100％.式中，m为释放介质中醋酸曲安奈德的质量，m₀为滴眼液中醋酸曲安奈德的质量。根据不同时间段的释放率绘制体外释放曲线(图2)。由体外释放曲线可以看出，在5h内，可有80％醋酸曲安奈德从壳聚糖脂质体中释放，10-12h基本完全释放。

实施例6稳定性实验

取壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体5ml，置于4℃环境中，分别于0,1,15,30,45d测定其包封率与粒径，测得其在45d内包封率稳定，药物无泄露，且粒径不变，分布均匀，无聚集发生。

实施例7细胞毒性实验

应用CCK-8法评价壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液的细胞毒性。分别取人角膜上皮细胞细胞(HCEC)与人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)(1×10⁴个/孔)接种于96孔培养板，过夜培养，至细胞完全贴壁,融合度为60％～80％。PBS洗涤后加入含不同量的醋酸曲安奈德或壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体无血清培养液100μl/孔，空白对照组加100μl无血清培养液，每组设置5个复孔。继续培养4h。之后移去培养液，换成含10％小牛血清的完全培养基，继续培养24h。每孔加入20μl CCK-8，4h后振摇1min，在酶标仪上，于570nm测定A值。按以下公式计算细胞生存率。

细胞生存率(％)＝(Asample/Acontrol)×100％

根据结果绘制柱状图(图3)，如图所示，相同浓度下，壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体组的细胞活性均比醋酸曲安奈德组高，随浓度的增高，细胞活性差距越大，证明壳聚糖脂质体有降低药物毒性的作用。

实施例8药效实验

利用577nm激光诱导建立视网膜水肿的BN大鼠动物模型，使用光学相干断层扫描(OCT)技术观察视网膜水肿情况的变化。

设置实验组：壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液组，将壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体用玻璃酸钠稀释1.5mg/mL的滴眼液，每天3次，每次点眼量20μl，持续1w。

设置对照组：醋酸曲安奈德混悬液玻璃体内注射组，利用无菌微量进样器，向模型玻璃体注射2μl混悬液，每周1次。

在0,3,7,10d记录每只大鼠眼底视网膜水肿的OCT图像。结果如图4所示，正常大鼠视网膜分层明显，结构清晰；视网膜水肿模型建立后3d，仍可观察到视网膜增厚，水肿明显。治疗后7d，实验组与对照组的视网膜水肿均有明显的缓解，10d之后视网膜厚度已经恢复到正常状态，且两组并无差异。而在无干预组中，视网膜水肿模型建立后，10天的观察中水肿持续存在，并无缓解。该结果表明，壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体滴眼液具有良好的药效，通过点眼途径给药，即可得到与玻璃体内注射相同的效果。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体，其特征在于，所述醋酸曲安奈德脂质体以卵磷脂、胆固醇为原料通过醋酸钙梯度法制备，醋酸曲安奈德脂质体制备完成后包裹壳聚糖得到该壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体。

2.权利要求1所述壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤如下：

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述大豆卵磷脂与胆固醇的摩尔比为7～9:0.5～1.5；优选的，所述旋蒸条件为30～40℃，150～250转/分钟旋转除去氯仿；优选的，还包括将脂膜置于真空环境中过夜，彻底除去残留有机溶剂。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述醋酸钙溶液浓度为110～130mM，40～50℃超声2.5～3.5h；优选的，混悬液反复冻融后过0.22μm微孔器，循环该步骤8～12次。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中以生理盐水为透析液在常温下孵育，每隔1.5～2.5小时更换透析液，彻底除去游离的钙离子。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述醋酸曲安奈德与脂膜的质量比为0.8～1.2:18～22；优选的，加入醋酸曲安奈德的空白脂质体悬液置于48～52℃孵育13～17min；优选的，所述孵育完成后的脂质体加入高压均质机中，400～600bar压力下循环4～6次粉碎，1400～1600bar压力下循环12～17次进行粉碎。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述壳聚糖溶液的浓度为0.45～0.65％(w/v)；优选的，步骤(6)中所述壳聚糖溶液加入脂质体悬液后，持续搅拌0.8～1.2h，并在4℃孵育过夜。

8.一种醋酸曲安奈德滴眼液，其特征在于，所述醋酸曲安奈德滴眼液通过权利要求1中所述醋酸曲安奈德脂质体与玻璃酸钠滴眼液混合制成；优选的，所述滴眼液中，醋酸曲安奈德的浓度为1.4～1.6mg/mL。

9.权利要求1所述醋酸曲安奈德脂质体或权利要求2-7任一项制备方法得到的壳聚糖修饰的醋酸曲安奈德脂质体在制备抗炎或抗变态反应制剂方面的应用。

10.权利要求8所述醋酸曲安奈德滴眼液在制备抗眼后节疾病方面的应用。