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CN109477128A - 在重组宿主中甜菊醇糖苷的生产 - Google Patents

在重组宿主中甜菊醇糖苷的生产 Download PDF

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CN109477128A
CN109477128A CN201780030752.4A CN201780030752A CN109477128A CN 109477128 A CN109477128 A CN 109477128A CN 201780030752 A CN201780030752 A CN 201780030752A CN 109477128 A CN109477128 A CN 109477128A
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CN
China
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polypeptide
seq
amino acid
acid sequence
steviol
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CN201780030752.4A
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艾弗·克拉夫斯·里谢德·汉森
韦罗尼克·杜尚
延斯·霍顿-拉森
埃斯本·哈尔克谢尔·汉森
安格利卡·塞姆莱尔
劳拉·奥基平蒂
基姆·奥尔森
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Evolva Holding SA
Original Assignee
Evolva AG
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明涉及用于生产甜菊醇糖苷、甜菊醇前体的糖苷和甜菊醇糖苷前体的重组微生物和方法。

Description

在重组宿主中甜菊醇糖苷的生产
背景技术
技术领域
本公开涉及在重组宿主中甜菊醇糖苷、甜菊醇前体的糖苷以及甜菊醇糖苷前体的重组生产。特别地，本公开涉及在重组宿主中甜菊醇糖苷的生产，所述甜菊醇糖苷包含甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜茶苷、瑞鲍迪苷A(RebA)、瑞鲍迪苷B(RebB)、瑞鲍迪苷D(RebD)、瑞鲍迪苷M(RebM)、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊醇糖苷、四糖基化甜菊醇糖苷、五糖基化甜菊醇糖苷、六糖基化甜菊醇糖苷、七糖基化甜菊醇糖苷或其异构体。
相关技术说明
甜味剂是众所周知最常用于食品、饮料或糖果行业的成分。甜味剂可以在生产中掺入最终食物产品，或在适当稀释时单独用作桌面甜味剂或在烘焙中作为糖的家庭替代品。甜味剂包括天然甜味剂(诸如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)以及人造甜味剂(如阿斯巴甜、糖精和三氯蔗糖)。甜叶菊提取物是可以从多年生灌木甜叶菊(Steviarebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜叶菊通常生长在南美洲和亚洲，用于商业生产甜叶菊提取物。经过不同程度纯化的甜叶菊提取物在商业上作为高强度甜味剂用于食品中，且以共混物或单独用作桌面甜味剂。
图1中示出了几种甜菊醇糖苷的化学结构，包括二萜甜菊醇和各种甜菊醇糖苷。甜叶菊植物的提取物通常包含有助于甜味的甜菊醇糖苷，但每种甜菊醇糖苷的量通常不同，尤其是在不同生产批次之间。
因为从甜叶菊植物中回收和纯化甜菊醇糖苷已被证明是费力且低效的，所以仍然需要能够积累高产率的期望甜菊醇糖苷如RebD和RebM的重组生产系统。为了商用，还需要改进重组宿主中甜菊醇糖苷的生产。
发明内容
与上述背景相对而言，本发明提供了优于现有技术的某些优点和进步。
尽管本文公开的本发明不限于特定的优点或功能，但本发明提供了能够生产一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的重组宿主细胞，其包含：
(a)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；
(b)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；
(c)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽的基因；和/或
(d)编码能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽的基因；
其中这些基因中至少一个是重组基因。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面：
(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase多肽、UDPG1多肽、UN1671多肽、UGT74F1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽；
(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73C7多肽、UGT73E1多肽和/或UGT76E12多肽；
(c)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽是UGT73C6多肽、CaUGT3多肽、UN32491多肽和/或UN1671多肽；和/或
(d)能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT74D1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、UGT76E12多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase、UDPG1多肽、UGT74F1多肽、UGT75D1多肽、UGT84B2多肽、CaUGT2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面：UGT73C1多肽包含与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C3多肽包含与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C5多肽包含与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C6多肽包含与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73E1多肽包含与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT74D1多肽包含与SEQ ID NO：143中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT75B1多肽包含与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75L6多肽包含与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，UGT76E12多肽包含与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，OleI多肽包含与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT5多肽包含与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽，SA Gtase多肽包含与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UDPG1多肽包含与SEQID NO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UN1671多肽包含与SEQ IDNO：201中所列氨基酸序列具有至少45％同一性的多肽，UGT74F1多肽包含与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75D1多肽包含与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT84B2多肽包含与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性的多肽，UGT74F2样UGT多肽包含与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT73C7多肽包含与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，CaUGT3多肽包含与SEQ ID NO：169中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UN32491多肽包含与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，和/或CaUGT2多肽包含与SEQ ID NO：209中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，重组宿主细胞还包含：
(a)编码能够由法呢基二磷酸(FPP)和异戊烯二磷酸(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的多肽的基因；
(b)编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；
(c)编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；
(d)编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸的多肽的基因；
(e)编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；
(f)编码能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；
(g)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；
(h)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；
(i)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；和/或
(k)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽的基因；
其中这些基因中至少一个是重组基因。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面：
(a)能够合成GGPP的多肽包含与SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：116中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(b)能够合成内根-柯巴基二磷酸的多肽包含与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：120中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(c)能够合成内根-贝壳杉烯的多肽包含与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(d)能够合成内根-贝壳杉烯酸的多肽包含与SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQID NO：117、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(e)能够还原细胞色素P450复合物的多肽包含与SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(f)能够合成甜菊醇的多肽包含与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ IDNO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(g)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽包含与SEQ IDNO：7中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(h)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：9中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；
(i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽包含与SEQ IDNO：4中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；和/或
(k)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：11中所列氨基酸序列具有80％或更大同一性的多肽；与SEQ ID NO：13中所列氨基酸序列具有80％或更大同一性的多肽；或与SEQ ID NO：16中所列氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，相对于缺少一个或多个重组基因的相应宿主而言，该一个或多个重组基因的表达增加了细胞积聚的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的量。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，相对于缺少一个或多个重组基因的相应宿主而言，该一个或多个重组基因的表达使细胞积聚的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的量增加至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约100％。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，相对于缺少一个或多个重组基因的相应宿主而言，该一个或多个重组基因的表达增加了细胞积聚的内根-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、瑞鲍迪苷A(RebA)、瑞鲍迪苷B(RebB)、甜菊醇+4Glc(#36)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+7Glc(异构体2)、和/或内根-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)的量。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，者一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体是以下各项，或其组合物包含以下各项：13-SMG、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、RebA、RebB、瑞鲍迪苷C(RebC)、瑞鲍迪苷D(RebD)、瑞鲍迪苷E(RebE)、瑞鲍迪苷F(RebF)、瑞鲍迪苷M(RebM)、瑞鲍迪苷Q(RebQ)、瑞鲍迪苷I(RebI)、杜克苷A、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯醇、二糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊醇糖苷、四糖基化甜菊醇糖苷、五糖基化甜菊醇糖苷、六糖基化甜菊醇糖苷、七糖基化甜菊醇糖苷或其异构体。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，单糖基化内根-贝壳杉烯酸包含表1的KA1.58，和/或五糖基化甜菊醇包含表1的化合物5.24。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，重组宿主细胞包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。
本发明还提供了一种在细胞培养物中生产一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的方法，其包括在表达所述基因的条件下，在细胞培养物中培养本文公开的重组宿主细胞，且其中由重组宿主细胞生产该一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
在本文公开的方法的一个方面，所述基因进行组成型表达，和/或所述基因进行诱导型表达。
在本文公开的方法的一个方面，相对于缺少一个或多个重组基因的相应宿主而言，重组宿主细胞积聚的内根-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、13-SMG、RebA、RebB、甜菊醇+4Glc(#36)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+7Glc(异构体2)、和/或内根-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)的量增加至少约5％。
在一个方面，本文公开的方法还包括从细胞培养物分离一种或多种由此生产的甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
在本文公开的方法的一个方面，分离步骤包括：
(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得包含所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)提供一种或多种吸附树脂，包括在填充柱中提供所述吸附树脂；和
(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一种或多种吸附树脂接触，以获得至少一部分所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物，从而分离所生产的一种或多种甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物；
或
(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得包含所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)提供一种或多种离子交换或离子交换或反相色谱柱；和
(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一种或多种离子交换或离子交换或反相色谱柱接触，以获得至少一部分所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物，从而分离所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物；
或
(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得包含所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)结晶出或提取所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物，从而分离所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
在一个方面，本文公开的方法还包括从细胞培养物回收一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物，其中该细胞培养物相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含一种或多种甜菊醇糖苷和/或甜菊醇前体的糖苷或其组合物，且相对于植物衍生的甜叶菊提取物具有水平降低的甜叶菊植物衍生的组分。
在本文公开的方法的一个方面，回收的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物以不同于从甜叶菊植物回收的甜菊醇糖苷组合物的相对量存在，且相对于植物衍生的甜叶菊提取物具有水平降低的甜叶菊植物衍生的组分。
本发明还提供了一种生产一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的方法，其包括在利用以下基因的重组宿主的细胞培养基中进行植物衍生的或合成的甜菊醇、甜菊醇前体和/或甜菊醇糖苷的全细胞生物转化：
(a)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；
(b)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；
(c)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽的基因；和/或
(d)编码能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽的基因；
其中所述多肽中的至少一种是在所述重组宿主细胞中表达的重组多肽；并由此生产所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
在本文公开的方法的一个方面：
(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase多肽、UDPG1多肽、UN1671多肽、UGT74F1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽；
(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73C7多肽、UGT73E1多肽和/或UGT76E12多肽；
(c)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽是UGT73C6多肽、CaUGT3多肽、UN32491多肽和/或UN1671多肽；和/或
(d)能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、UGT76E12多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase、UDPG1多肽、UGT74F1多肽、UGT75D1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽。
在本文公开的方法的一个方面，UGT73C1多肽包含与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C3多肽包含与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C5多肽包含与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C6多肽包含与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73E1多肽包含与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT74D1多肽包含与SEQ ID NO：143中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT75B1多肽包含与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75L6多肽包含与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，UGT76E12多肽包含与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，OleI多肽包含与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT5多肽包含与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽，SA Gtase多肽包含与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UDPG1多肽包含与SEQ IDNO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UN1671多肽包含与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％同一性的多肽，UGT74F1多肽包含与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75D1多肽包含与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT84B2多肽包含与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性的多肽，UGT74F2样UGT多肽包含与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT73C7多肽包含与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，CaUGT3多肽包含与SEQ ID NO：169中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UN32491多肽包含与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，或CaUGT2多肽包含与SEQ ID NO：209中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽。
在本文公开的方法的一个方面，重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。
本发明还提供了生产一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的体外方法，其包括将：
(a)与SEQ ID NO：7中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的UGT85C2多肽；
(b)与SEQ ID NO：9中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的UGT76G1多肽；
(c)与SEQ ID NO：4中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的UGT74G1多肽；
(d)UGT91D2功能同源多肽，其包含与SEQ ID NO：11中所列氨基酸序列具有90％或更大同一性的UGT91D2e多肽或与SEQ ID NO：13中所列氨基酸序列具有90％或更大同一性的UGT91D2e-b多肽；
(e)与SEQ ID NO：16中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的EUGT11多肽；和/或
(f)UGT73C1多肽包含与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C3多肽包含与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C5多肽包含与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C6多肽包含与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73E1多肽包含与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT74D1多肽包含与SEQ ID NO：143中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT75B1多肽包含与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75L6多肽包含与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，UGT76E12多肽包含与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，OleI多肽包含与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT5多肽包含与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽，SA Gtase多肽包含与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UDPG1多肽包含与SEQ IDNO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UN1671多肽包含与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％同一性的多肽，UGT74F1多肽包含与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75D1多肽包含与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT84B2多肽包含与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性的多肽，UGT74F2样UGT多肽包含与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT73C7多肽包含与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，CaUGT3多肽包含与SEQ ID NO：169中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UN32491多肽包含与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，或CaUGT2多肽包含与SEQ ID NO：209中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；
以及植物衍生的或合成的甜菊醇糖苷前体或植物衍生的或合成的甜菊醇前体添加至反应混合物；
其中所述多肽中的至少一种是重组多肽；和
由此生产所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
在本文公开的方法的一个方面，反应混合物包含：
(a)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(b)反应缓冲液和/或盐。
在本文公开的方法的一个方面，一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体是以下各项，或其组合物包含以下各项：13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebM、RebQ、RebI、杜克苷A、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯醇、二糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊醇糖苷、四糖基化甜菊醇糖苷、五糖基化甜菊醇糖苷、六糖基化甜菊醇糖苷、七糖基化甜菊醇糖苷和/或其异构体。
在本文公开的方法的一个方面，单糖基化内根-贝壳杉烯酸包含表1的KA1.58，和/或五糖基化甜菊醇包含表1的化合物5.24。
本发明还提供了一种细胞培养物，其包含本文公开的重组宿主细胞，该细胞培养物还包含：
(a)由所述重组宿主细胞生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物，
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和
(c)包含痕量金属、维生素、盐、酵母氮源(YNB)和/或氨基酸的补充营养物；
其中所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物是以至少1mg/升所述细胞培养物的浓度存在；
其中相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物，所述细胞培养物富含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或甜菊醇前体的糖苷或其组合物，且相对于植物衍生的甜叶菊提取物具有水平降低的甜叶菊植物衍生的组分。
本发明还提供了来自生长在细胞培养物中的本文公开的重组宿主细胞的细胞裂解物，其包含：
(a)由所述重组宿主细胞生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物；
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(c)包含痕量金属、维生素、盐、酵母氮源、YNB和/或氨基酸的补充营养物；
其中由所述重组宿主细胞生产的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物是以至少1mg/升所述细胞培养物的浓度存在。
本发明还提供了一种反应混合物，其包含：
(a)与SEQ ID NO：7中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的UGT85C2多肽；
(b)与SEQ ID NO：9中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的UGT76G1多肽；
(c)与SEQ ID NO：4中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的UGT74G1多肽；
(d)UGT91D2功能同源多肽，其包含与SEQ ID NO：11中所列氨基酸序列具有90％或更大同一性的UGT91D2e多肽或与SEQ ID NO：13中所列氨基酸序列具有90％或更大同一性的UGT91D2e-b多肽；
(e)与SEQ ID NO：16中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的EUGT11多肽；和/或
(f)UGT73C1多肽包含与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C3多肽包含与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C5多肽包含与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C6多肽包含与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73E1多肽包含与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT75B1多肽包含与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75L6多肽包含与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，UGT76E12多肽包含与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，OleI多肽包含与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT5多肽包含与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽，SA Gtase多肽包含与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UDPG1多肽包含与SEQ IDNO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UN1671多肽包含与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％同一性的多肽，UGT74F1多肽包含与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75D1多肽包含与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT84B2多肽包含与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性的多肽，UGT74F2样UGT多肽包含与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT73C7多肽包含与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，CaUGT3多肽包含与SEQ ID NO：169中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，或UN32491多肽包含与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；
且还包含：
(g)一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物；
(h)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(i)反应缓冲液和/或盐。
本发明还提供由本文公开的重组宿主细胞生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体的组合物；其中由重组宿主细胞生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体以不同于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物的相对量存在，且相对于植物衍生的甜叶菊提取物具有水平降低的甜叶菊植物衍生的组分。
本发明还提供由本文公开的方法生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体的组合物；其中由重组宿主细胞生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体以不同于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物的相对量存在，且相对于植物衍生的甜叶菊提取物具有水平降低的甜叶菊植物衍生的组分。
本发明还提供了一种甜味剂组合物，其包含由重组宿主细胞和/或本文公开方法生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体。
本发明还提供了一种食物产品，其包含本文公开的甜味剂组合物。
本发明还提供了一种饮料或饮料浓缩物，其包含本文公开的甜味剂组合物。
本发明还提供了一种编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的分离多肽或其催化活性部分的分离核酸分子，其中所编码的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽或其催化活性部分与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性，与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％序列同一性，与SEQID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性，与SEQ ID NO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％序列同一性，与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性，或与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性。
本发明还提供了一种编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的分离多肽或其催化活性部分的分离核酸分子，其中所编码的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，或与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性。
本发明还提供了一种编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽或其催化活性部分的分离核酸分子，其中所编码的能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽或其催化活性部分与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：169中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，或与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％序列同一性。
本发明还提供了一种编码能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分的分离核酸分子，其中所编码的能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性，与SEQID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％序列同一性，与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性，与SEQ ID NO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性，或与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性。
在本文公开的分离的核酸的一个方面，该核酸是cDNA。
结合所附权利要求书，从以下具体实施方式将更充分地理解本发明的这些和其他特征和优点。应注意，权利要求书的范围是由其中的叙述限定，而不是由本说明书中所列关于特征和优点的具体论述限定。
附图说明
当结合以下附图阅读时，可以最好地理解本发明的实施方案的以下详细描述，其中相同的结构用相同的附图标记表示，并且其中：
图1示出了由合适尿苷5′-二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)催化的代表性初级甜菊醇糖苷糖基化反应以及存在于甜叶菊提取物中的几种化合物的化学结构。
图2示出了利用香叶基香叶基焦磷酸合成酶(GGPPS)、内根-柯巴基二磷酸合成酶(CDPS)、内根-贝壳杉烯合成酶(KS)、内根-贝壳杉烯氧化酶(KO)和内根-贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽从香叶基香叶基焦磷酸产生甜菊醇的生物化学途径。
图3示出了甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+7Glc(异构体2)的结构。
图4示出了甜菊醇+4Glc(#26)和内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)的结构。
图5示出了内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)和内根-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)的结构。
图6A、图6B和图6C示出了内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)的1H NMR光谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm计)。图6D、图6E和图6F示出了内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)的1H NMR光谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm计)。图6G、图6H和图6I示出了内根-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)的1H NMR光谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm计)。图6J、图6K、图6L和图6M示出了甜菊醇+6Glc(异构体1)的1H NMR光谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm计)。图6N、图6O、图6P和图6Q示出了甜菊醇+7Glc(异构体2)的1H NMR光谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm计)。图6R、图6S、图6T和图6U示出了甜菊醇+4Glc(#26)的1H NMR光谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm计)。
技术人员将理解，图中的元素为了简明清晰而说明，且不一定按比例绘制。例如，图中的一些元件的尺寸可能相对于其他元素有所夸张，以帮助提高对本发明的实施方案的理解。
具体实施方式
本文引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的通过引用明确并入本文。
在详细描述本发明之前，将定义许多术语。如本文所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确规定。例如，提及“核酸”意指一种或多种核酸。
应注意，如“优选地”、“通常地”和“典型地”的术语在本文中不用于限制所要求保护的发明的范围或暗示某些特征对于所要求保护的发明的结构或功能是关键的、必要的或甚至重要的。相反，这些术语仅旨在突出可以或不可以在本发明的特定实施方案中使用的替代或附加特征。
为了描述和定义本发明，应注意，术语“基本上”在本文中用于表示可归因于任何定量比较、值、测量或其他表示的固有不确定度。术语“基本上”在本文中也用于表示定量表示可以与所述参考的差异，而不会导致所讨论主题的基本功能的变化的程度。
本领域技术人员熟知的方法可用于构建根据本发明的遗传表达构建体和重组细胞。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内重组技术和聚合酶链反应(PCR)技术。参见，例如，Green&Sambrook，2012，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Ausubel等人，1989，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NewYork，以及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis等人，1990，Academic Press，San Diego，CA)中所述的技术。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，指代包括DNA、RNA、其衍生物或其组合的核酸，根据技术人员理解的背景，可以是单链或双链实施方案。
如本文所用，术语“微生物”、“微生物宿主”和“微生物宿主细胞”可互换使用。如本文所用，术语“重组宿主”和“重组宿主细胞”和互换使用。本领域普通技术人员将理解，术语“微生物”、“微生物宿主”和“微生物宿主细胞”，当用于描述包含重组基因的细胞时，可以被认为是指“重组宿主”或“重组宿主细胞”。如本文所用，术语“重组宿主”意指宿主，其基因组已被至少一种DNA序列增强。此类DNA序列包括但不限于天然的基因、一般未转录为RNA或翻译为蛋白质(“表达”)的DNA序列以及期望引入宿主的其他基因或DNA序列。应当理解，通常通过稳定引入一种或多种重组基因来增强本文所述重组宿主的基因组。通常，引入的DNA最初不是驻留在作为DNA接受者的宿主中，但是从给定宿主中分离DNA片段并随后将该DNA的一个或多个另外的拷贝引入相同宿主也在本公开的范围内，例如，以增加基因产物的生产或改变基因的表达模式。在某些情况下，引入的DNA将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替换内源基因或DNA序列。合适的重组宿主包括微生物。
如本文所用，术语“重组基因”是指引入受体宿主的基因或DNA序列，无论相同或相似的基因或DNA序列是否已经存在于这样的宿主中。在这种情况下，“引入”或“增强”在本领域中已知意味着由人的手引入或增强。因此，重组基因可以是来自另一物种的DNA序列，或者可以是源自或存在于相同物种中但通过重组方法掺入宿主中以形成重组宿主的DNA序列。应当理解，引入宿主的重组基因可以与通常存在于被转化宿主中的DNA序列相同，并且被引入以提供DNA的一个或多个另外的拷贝，从而允许该DNA的基因产物过表达或修饰表达。在某些方面，所述重组基因由cDNA编码。在其他实施方案中，重组基因是合成的和/或经密码子优化以在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达。
如本文所用，术语“工程化生物合成途径”是指在重组宿主中发生的生物合成途径，如本文所述。在一些方面，生物合成途径的一个或多个步骤不会在未修饰的宿主中天然发生。在一些实施方案中，将基因的异源形式引入宿主中，所述宿主包含基因的内源形式。
如本文所用，术语“内源”基因是指源自特定生物、组织或细胞内并在其中产生或合成的基因。在一些实施方案中，内源基因是酵母基因。在一些实施方案中，该基因对于酿酒酵母是内源的，包括但不限于酿酒酵母菌株S288C。在一些实施方案中，内源酵母基因过表达。如本文所用，术语“过表达”用于指生物体中基因的表达水平高于野生型生物中基因表达的水平。参见，例如Prelich，2012，Genetics 190：841-54。在一些实施方案中，缺失内源酵母基因，例如ADH。参见，例如Giaever&Nislow，2014，Genetics 197(2)：451-65。如本文所用，术语“缺失”、“缺失的”、“敲除”和“敲除的”可互换使用，是指经操纵以不再在生物(包括但不限于酿酒酵母)中表达的内源基因。
如本文所用，术语“异源序列”和“异源编码序列”是用于描述衍生自除重组宿主之外的物种的序列。在一些实施方案中，重组宿主是酿酒酵母细胞，且异源序列衍生自除酿酒酵母以外的生物。例如，异源编码序列可以来自不同于表达异源序列的重组宿主的原核微生物、真核微生物、植物、动物、昆虫或真菌。在一些实施方案中，编码序列是原产自宿主的序列。
“选择性标记”可以是补充宿主细胞营养缺陷，提供抗生素抗性或导致颜色变化的任何数量的基因之一。然后使用本领域熟知的方法将基因置换载体的线性化DNA片段引入细胞中(参见下文)。可以基于选择标记确定线性片段整合到基因组中和基因的破坏，并且可以通过例如PCR或Southern印迹分析来验证。在用于选择之后，可以通过例如Cre-LoxP系统从宿主细胞的基因组移除选择性标记(参见例如Gossen等人，2002，Ann.Rev.Genetics36：153-173和U.S.2006/0014264)。可选地，可以如此方式构建基因置换载体，以诱导破坏一部分基因，其中该部分缺乏任何内源基因启动子序列，且不编码该基因的编码序列或其失活片段。
如本文所用，术语“变体”和“突变体”用于描述与特定蛋白质的野生型序列相比在一个或多个氨基酸处被修饰的蛋白质序列。
如本文所用，术语“失活片段”是编码这样一种蛋白质的基因片段，该蛋白质具有由该基因的全长编码序列产生的蛋白质的例如小于约10％(例如，小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％或0％)的活性。以这样一种方式将这一部分基因插入载体，使得没有已知的启动子序列与该基因序列可操作地连接，但终止密码子和转录终止序列与该部分基因序列可操作地连接。随后该载体可以在该部分基因序列中线性化并转化到细胞中。通过单一同源重组，然后将该线性化载体整合到基因的内源对应物中，使其失活。
如本文所用，术语“甜菊醇糖苷”是指瑞鲍迪苷A(RebA)(CAS#58543-16-1)、瑞鲍迪苷B(RebB)(CAS#58543-17-2)、瑞鲍迪苷C(RebC)(CAS#63550-99-2)、瑞鲍迪苷D(RebD)(CAS#63279-13-0)、瑞鲍迪苷E(RebE)(CAS#63279-14-1)、瑞鲍迪苷F(RebF)(CAS#438045-89-7)、瑞鲍迪苷M(RebM)(CAS#1220616-44-3)、甜茶苷(CAS#63849-39-4)、杜克苷A(CAS#64432-06-0)、瑞鲍迪苷I(RebI)(MassBank记录：FU000332)、瑞鲍迪苷Q(RebQ)、1，2-甜菊苷(CAS#57817-89-7)、1，3-甜菊苷(RebG)、甜菊醇-1，2-二糖苷(MassBank记录：FU000299)、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、三-葡糖基化甜菊醇糖苷、四糖基化甜菊醇糖苷、五-葡糖基化甜菊醇糖苷、六-葡糖基化甜菊醇糖苷、七-葡糖基化甜菊醇糖苷及其异构体。参见图1；也参见Steviol Glycosides Chemicaland Technical Assessment 69th JECFA，2007，由Harriet Wallin制备，Food Agric.Org。本文公开的甜菊醇糖苷异构体的核磁共振(NMR)谱可在图6中找到。
如本文所用，术语“甜菊醇糖苷前体”和“甜菊醇糖苷前体化合物”用于指甜菊醇糖苷生物合成途径中的中间化合物。甜菊醇糖苷前体包括但不限于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)、内根-柯巴基二磷酸、内根-贝壳杉烯、内根-贝壳杉烯醇、内根-贝壳杉烯醛、内根-贝壳杉烯酸和甜菊醇。参见图2。同样如本文所用，术语“甜菊醇前体”和“甜菊醇前体化合物”用于指甜叶醇生物合成途径中的中间化合物(即，最终可合成甜菊醇的化合物)。甜菊醇前体包括但不限于香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)、内根-柯巴基二磷酸、内根-贝壳杉烯、内根-贝壳杉烯醇、内根-贝壳杉烯醛和内根-贝壳杉烯酸。在一些实施方案中，甜菊醇前体可以被糖基化，例如，三糖基化内根-贝壳杉烯酸(内根-贝壳杉烯酸+3Glc)、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、二糖基化内根-贝壳杉烯醇(内根-贝壳杉烯醇+2Glc)或单糖基化内根-贝壳杉烯醇(内根-贝壳杉烯醇+1Glc)。本领域普通技术人员将理解，甜菊醇前体可以是甜菊醇糖苷前体。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷前体本身是甜菊醇糖苷化合物。例如，19-SMG、甜茶苷、甜菊苷和RebE是RebM的甜菊醇糖苷前体。参见图1。
如本文所用，术语“接触”用于指代两个物体之间的任何物理相互作用。例如，术语“接触”可以指酶和底物之间的相互作用。在另一个实例中，术语“接触”可以指液体(例如，上清液)和吸附树脂之间的相互作用。
甜菊醇糖苷、甜菊醇糖苷前体和/或甜菊醇前体的糖苷可以在体内(即，在重组宿主中)、在体外(即，酶促方式)或通过全细胞生物转化产生。如本文所用，术语“生产”和“积聚”可互换使用以描述体内、体外或通过全细胞生物转化合成甜菊醇糖苷、甜菊醇前体的糖苷和甜菊醇糖苷前体。
重组的产甜菊醇糖苷酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株描述在WO2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中。在重组宿主中通过全细胞生物转化以及在体外生产甜菊醇糖苷的方法也描述在WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中。
如本文所用，术语“培养液”、“培养基”和“生长介质”可以互换使用，指支持细胞生长的液体或固体。培养液可以包含葡萄糖、果糖、蔗糖、痕量金属、维生素、盐、酵母氮源(YNB)和/或氨基酸。痕量金属可以是二价阳离子，包括但不限于Mn2+和/或Mg2+。在一些实施方案中，Mn2+可以是MnCl2二水合物形式，且范围为约0.01g/L至100g/L。在一些实施方案中，Mg2+可以是MgSO4七水合物形式，且范围为约0.01g/L至100g/L。例如，培养液可以包含i)约0.02-0.03g/L MnCl2二水合物和约0.5-3.8g/L MgSO4七水合物，ii)约0.03-0.06g/L MnCl2二水合物和约0.5-3.8g/L MgSO4七水合物，和/或iii)约0.03-0.17g/L MnCl2二水合物和约0.5-7.3g/L MgSO4七水合物。此外，培养液可以包含重组宿主产生的一种或多种甜菊醇糖苷，如本文所述。
在一些实施方案中，包含如下基因的重组宿主可在体内生产甜菊醇：编码能够由法呢基二磷酸(FPP)和异戊烯二磷酸(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的多肽(例如，香叶基香叶基焦磷酸合成酶(GGPPS))的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合成酶(CDPS))的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽(例如，贝壳杉烯合成酶(KS))的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽(例如，贝壳杉烯氧化酶(KO))的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，细胞色素P450还原酶(CPR)或P450氧化还原酶(POR)；例如但不限于能够在NADPH转化为NADP+期间将电子从NADPH转移到细胞色素P450复合物的多肽，其用作萜类化合物生物合成的辅因子)的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，甜菊醇合成酶(KAH))的基因；和/或编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸和能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合成酶(CDPS)-内根-贝壳杉烯合成酶(KS)多肽)的基因。参见，例如图1。技术人员将理解，这些基因中的一个或多个相对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(并且在一些实施方案中，所有)基因是引入重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，包含如下基因的重组宿主可以在体内生产甜菊醇糖苷：编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，UGT76G1多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽(例如，UGT91D2或EUGT11多肽)的基因。技术人员将理解，这些基因中的一个或多个相对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(并且在一些实施方案中，所有)基因是引入重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，甜菊醇糖苷、甜菊醇前体的糖苷和/或甜菊醇糖苷前体是在体内通过表达一种或多种在重组宿主中参与甜菊醇糖苷生物合成途径的酶而产生。例如，包含如下基因的重组宿主可以在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体：编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够从内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够从内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇、和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够从GGPP合成内根-柯巴基二磷酸和从内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽的基因。参见，例如图1和图2。技术人员将理解，这些基因中的一个或多个相对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(并且在一些实施方案中，所有)基因是引入重组宿主中的重组基因。
在某些方面，能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽包括具有SEQ ID NO：20(其可由SEQID NO：19中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：22(由SEQ ID NO：21中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：24(由SEQ ID NO：23中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：26(由SEQ IDNO：25中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：28(由SEQ ID NO：27中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：30(由SEQ ID NO：29中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：32(由SEQ ID NO：31中所列核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：116(由SEQ ID NO：115中所列核苷酸序列编码)中所列氨基酸序列的多肽。
在某些方面，能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽包括具有SEQ ID NO：34(其可由SEQ ID NO：33中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：36(由SEQ ID NO：35中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：38(由SEQ ID NO：37中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：40(由SEQ ID NO：39中所列核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：42(由SEQ ID NO：41中所列核苷酸序列编码)中所列氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽缺少叶绿体转运肽。
在某些方面，能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽包括具有SEQID NO：44(其可由SEQ ID NO：43中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：46(由SEQ ID NO：45中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：48(由SEQ ID NO：47中所列核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：50(由SEQ ID NO：49中所列核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：52(由SEQ ID NO：51中所列核苷酸序列编码)中所列氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸以及由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因。在某些方面，双功能多肽包括具有SEQ ID NO：54(其可由SEQ ID NO：53中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：56(由SEQ ID NO：55中所列核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：58(由SEQ ID NO：57中所列核苷酸序列编码)中所列氨基酸序列的多肽。
在某些方面，能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽包括具有SEQ ID NO：60(其可由SEQ ID NO：59中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：62(由SEQ ID NO：61中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：117(由SEQID NO：63或SEQ ID NO：64中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：66(由SEQ ID NO：65中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：68(由SEQ ID NO：67中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：70(由SEQ ID NO：69中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：72(由SEQ ID NO：71中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：74(由SEQ ID NO：73中所列核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：76(由SEQ ID NO：75中所列核苷酸序列编码)中所列氨基酸序列的多肽。
在某些方面，能够还原细胞色素P450复合物的多肽包含具有SEQ ID NO：78(其可由SEQ ID NO：77中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：80(由SEQ ID NO：79中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：82(由SEQ ID NO：81中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：84(由SEQID NO：83中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：86(由SEQ ID NO：85中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：88(由SEQ ID NO：87中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：90(由SEQ IDNO：89中所列核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：92(由SEQ ID NO：91中所列核苷酸序列编码)中所列氨基酸序列的多肽。
在某些方面，能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽具有SEQ ID NO：94(其可由SEQ ID NO：93中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：97(由SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：100(由SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：99中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106(由SEQ ID NO：105中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：108(由SEQ ID NO：107中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：110(由SEQ ID NO：109中所列核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：112(由SEQ ID NO：111中所列核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：114(由SEQ ID NO：113中所列核苷酸序列编码)中所列氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的核酸，编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的核酸、编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的核酸，编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽的核酸。在某些这样的实施方案中，该重组宿主还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；和/或编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸和由内根-柯巴基二磷酸合成的内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因，这样的多肽是例如UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase多肽、UDPG1多肽、UN1671多肽、UGT74F1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽。在某些这样的实施方案中，重组宿主还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸和由内根-柯巴基二磷酸合成的内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽的基因。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因，这样的多肽是例如UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73C7多肽、UGT73E1多肽和/或UGT76E12多肽。在某些这样的实施方案中，重组宿主还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸和由内根-柯巴基二磷酸合成的内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽的基因。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽(即，糖基-糖基化位置的示例)的基因，这样的多肽是例如UGT73C6多肽、CaUGT3多肽、UN32491多肽和/或UN1671多肽。在某些这样的实施方案中，重组宿主还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸和由内根-柯巴基二磷酸合成的内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽的基因。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽的基因，这样的多肽是例如UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、UGT76E12多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase、UDPG1多肽、UGT74F1多肽、UGT75D1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽。在某些这样的实施方案中，重组宿主还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸和由内根-柯巴基二磷酸合成的内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽的基因。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽)(SEQ ID NO：7)的核酸，编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，UGT76G1多肽)(SEQ ID NO：9)的核酸，编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽)(SEQ ID NO：4)的核酸，编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽(例如，EUGT11多肽)(SEQ ID NO：16)的核酸。在某些方面，能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽(例如，UGT91D2多肽)可以是UGT91D2e多肽(SEQ ID NO：11)或UGT91D2e-b多肽(SEQ ID NO：13)。
在某些方面，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽是由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中所列核苷酸序列编码，能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽是由SEQ IDNO：8中所列核苷酸序列编码，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽是由SEQ ID NO：3中所列核苷酸序列编码，能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽是由SEQ ID NO：10、12、14或15中所列核苷酸序列编码。技术人员将理解，这些基因的表达可能是产生特定甜菊醇糖苷所必要的，但这些基因中的一个或多个相对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(并且在一些实施方案中，所有)基因是引入重组宿主中的重组基因。
在一个特定实施方案中，产甜菊醇的重组微生物包含编码如下多肽的外源核酸：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽，能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽，和能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽。
在另一个特定实施方案中，产甜菊醇的重组微生物包含编码如下多肽的外源核酸：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽；和能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽。
在一些实施方案中，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化催化内根-贝壳杉烯酸(KA)进行19-O糖基化而变成内根-贝壳杉烯酸+1Glc(#58)的多肽包括UGT73C1(SEQ ID NO：127)、UGT73C3(SEQ ID NO：133)、UGT73C5(SEQ ID NO：135)、UGT73C6(SEQ ID NO：137)、UGT73E1(SEQ ID NO：141)、UGT74G1(SEQ ID NO：4)、UGT75B1(SEQ IDNO：145)、UGT75L6(SEQ ID NO：147)、UGT76E12(SEQ ID NO：153)、OleI(SEQ ID NO：177)、UGT5(SEQ ID NO：181)、SA Gtase(SEQ ID NO：183)、UDPG1(SEQ ID NO：185)、UGT74F1(SEQID NO：203)、UGT75D1(SEQ ID NO：205)、UGT84B2(SEQ ID NO：207)、CaUGT2(SEQ ID NO：209)和UGT74F2样UGT多肽(SEQ ID NO：211)。参见实施例3。
在一些实施方案中，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化催化甜菊醇进行13-O糖基化，变为13-SMG的多肽包括UGT73C1(SEQ ID NO：127)、UGT73C3(SEQ IDNO：133)、UGT73C5(SEQ ID NO：135)、UGT73C6(SEQ ID NO：137)、UGT73C7(SEQ ID NO：139)、UGT73E1(SEQ ID NO：141)、UGT76E12(SEQ ID NO：153)和UGT85C2(SEQ ID NO：7)。参见实施例3。
在一些实施方案中，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化催化甜菊醇进行19-O糖基化而变为19-SMG的多肽包括UGT73C1(SEQ ID NO：127)、UGT73C3(SEQ IDNO：133)、UGT73C5(SEQ ID NO：135)、UGT73C6(SEQ ID NO：137)、UGT73E1(SEQ ID NO：141)、UGT74D1(SEQ ID NO：143)、UGT74G1(SEQ ID NO：4)、UGT75B1(SEQ ID NO：145)、UGT75L6(SEQ ID NO：147)、OleI(SEQ ID NO：177)、UGT5(SEQ ID NO：181)、SA Gtase(SEQ ID NO：183)和UDPG1(SEQ ID NO：185)。参见实施例3。
在一些实施方案中，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化催化13-SMG进行19-O糖基化而变为甜茶苷的多肽包括UGT73C1(SEQ ID NO：127)、UGT73C6(SEQ IDNO：137)、UGT74G1(SEQ ID NO：4)、UGT85C2(SEQ ID NO：7)、SA Gtase(SEQ ID NO：183)、UDPG1(SEQ ID NO：185)、UN1671(SEQ ID NO：201)、UGT74F1(SEQ ID NO：203)、UGT75D1(SEQID NO：205)、UGT84B2(SEQ ID NO：207)、CaUGT2(SEQ ID NO：209)和UGT74F2样UGT多肽(SEQID NO：211)。参见实施例3。
在一些实施方案中，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化催化13-SMG(即，糖基-糖基化位置的示例)糖基化，变为甜菊醇-1，2-二糖苷的多肽包括UGT91D2e-b(SEQ ID NO：13)、EUGT11(SEQ ID NO：16)和UN32491(SEQ ID NO：199)。
在一些实施方案中，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化催化甜茶苷的糖基位置糖基化，变为1，2-甜菊苷的多肽包括UGT73C6(SEQ ID NO：137)、UGT91D2e-b(SEQ ID NO：13)、CaUGT3(SEQ ID NO：169)和EUGT11(SEQ ID NO：16)。参见实施例3。
在一些实施方案中，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化催化甜茶苷的糖基位置糖基化而变为甜菊醇+3Glc(#55)的多肽包括EUGT11(SEQ ID NO：16)。
在一些实施方案中，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化催化RebB进行19-O糖基化而变为RebA的多肽包括UGT74G1(SEQ ID NO：4)。参见实施例3。
在一些实施方案中，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化催化RebA的糖基位置糖基化而变为RebD的多肽包括EUGT11(SEQ ID NO：16)。
在一些实施方案中，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化催化RebA的糖基位置糖基化而变为甜菊醇+5G1c(#24)的多肽包括EUGT11(SEQ ID NO：16)和UN1671(SEQ ID NO：201)。参见实施例3。
在一些方面，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化对甜菊醇、甜菊醇糖苷及其前体具有19-O糖基化活性的多肽包括UGT73C1(SEQ ID NO：127)、UGT73C3(SEQID NO：133)、UGT73C5(SEQ ID NO：135)、UGT73C6(SEQ ID NO：137)、UGT73E1(SEQ ID NO：141)、UGT74G1(SEQ ID NO：4)、UGT85C2(SEQ ID NO：7)、UGT75B1(SEQ ID NO：145)、UGT75L6(SEQ ID NO：147)、UGT76E12(SEQ ID NO：153)、OleI(SEQ ID NO：177)、UGT5(SEQ ID NO：181)、SA Gtase(SEQ ID NO：183)、UDPG1(SEQ ID NO：185)、UN1671(SEQ ID NO：201)、UGT74F1(SEQ ID NO：203)、UGT75D1(SEQ ID NO：205)、UGT84B2(SEQ ID NO：207)和UGT74F2样UGT(SEQ ID NO：211)。参见实施例3。19-O糖基化反应的非限制性实例包括内根-贝壳杉烯酸转化为内根-贝壳杉烯酸+1Glc(#58)，13-SMG转化为甜茶苷，和/或甜菊醇转化为19-SMG(参见，例如图1)。
在一些方面，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化对甜菊醇和甜菊醇糖苷具有13-O糖基化活性的多肽包括UGT73C1(SEQ ID NO：127)、UGT73C3(SEQ ID NO：133)、UGT73C5(SEQ ID NO：135)、UGT73C6(SEQ ID NO：137)、UGT73C7(SEQ ID NO：139)、UGT73E1(SEQ ID NO：141)、UGT76E12(SEQ ID NO：153)和UGT85C2(SEQ ID NO：7)。参见实施例3。13-O糖基化反应的非限制性实例包括甜菊醇转化为13-SMG(参见，例如图1)。
在一些方面，能够在体外，在重组宿主中，或通过全细胞生物转化对甜菊醇糖苷的葡萄糖残基具有糖基化活性(包括但不限于催化13-SMG转化为甜菊醇-1，2-二糖苷，催化甜荼苷转化为1，2-甜菊苷，和/或催化RebA转化为甜菊醇+5Glc(#24)(参见，例如图1))的多肽包括UGT73C6(SEQ ID NO：137)、UGT91D2e-b(SEQ ID NO：13)、CaUGT3(SEQ ID NO：169)、EUGT11(SEQ ID NO：16)、UN32491(SEQ ID NO：199)和UN1671(SEQ ID NO：201)。参见实施例3。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码UGT85C2多肽(SEQ ID NO：7)的核酸、编码UGT76G1多肽(SEQ ID NO：9)的核酸、编码UGT74G1多肽(SEQ ID NO：4)的核酸、编码UGT91D2多肽的核酸和/或编码EUGT11多肽(SEQ ID NO：16)的核酸。在某些方面，UGT91D2多肽可以是UGT91D2e多肽(SEQ ID NO：11)、UGT91D2e-b多肽(SEQ ID NO：13)。在一些实施方案中，重组宿主包含编码UGT73C1多肽(SEQ ID NO：127)的核酸、编码UGT73C3多肽(SEQ ID NO：133)的核酸、编码UGT73C5多肽(SEQ ID NO：135)的核酸、编码UGT73C6多肽(SEQ ID NO：137)的核酸、编码UGT73C7多肽(SEQ ID NO：139)的核酸、编码UGT73E1多肽(SEQ ID NO：141)的核酸、编码UGT74D1多肽(SEQ ID NO：143)的核酸、编码UGT75B1多肽(SEQ ID NO：145)的核酸、编码UGT75L6多肽(SEQ ID NO：147)的核酸、编码UGT76E12多肽(SEQ ID NO：153)的核酸、编码CaUGT3多肽(SEQ ID NO：169)的核酸、编码OleI多肽(SEQ ID NO：177)的核酸、编码UGT5(SEQ ID NO：181)的核酸、编码SA Gtase多肽(SEQ ID NO：183)的核酸、编码UDPG1多肽(SEQID NO：185)的核酸、编码UN32491多肽(SEQ ID NO：199)的核酸、编码UN1671多肽(SEQ IDNO：201)的核酸、编码UGT74F1多肽(SEQ ID NO：203)的核酸、编码UGT75D1多肽(SEQ ID NO：205)的核酸、编码UGT84B2多肽(SEQ ID NO：207)的核酸、编码CaUGT2多肽(SEQ ID NO：209)的核酸或编码UGT74F2样UGT多肽(SEQ ID NO：211)的核酸。
在某些方面，UGT85C2多肽是由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6中所列核苷酸序列编码，UGT76G1多肽是由SEQ ID NO：8中所列核苷酸序列编码，UGT74G1多肽是由SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：213中所列核苷酸序列编码，UGT91D2e多肽是由SEQ ID NO：10中所列核苷酸序列编码，UGT91D2e-b多肽是由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：212中所列核苷酸序列编码，EUGT11多肽是由SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15中所列核苷酸序列编码，UGT73C1多肽是由SEQ ID NO：126中所列核苷酸序列编码，UGT73C3多肽是由SEQ ID NO：132中所列核苷酸序列编码，UGT73C5多肽是由SEQ ID NO：134中所列核苷酸序列编码，UGT73C6多肽是由SEQ IDNO：136中所列核苷酸序列编码，UGT73C7多肽是由SEQ ID NO：138中所列核苷酸序列编码，UGT73E1多肽是由SEQ ID NO：140中所列核苷酸序列编码，UGT74D1多肽是由SEQ ID NO：142中所列核苷酸序列编码，UGT75B1多肽是由SEQ ID NO：144中所列核苷酸序列编码，UGT75L6多肽是由SEQ ID NO：146中所列核苷酸序列编码，UGT76E12多肽是由SEQ ID NO：152中所列核苷酸序列编码，CaUGT3多肽是由SEQ ID NO：168中所列核苷酸序列编码，OleI多肽是由SEQ ID NO：176中所列核苷酸序列编码，UGT5多肽是由SEQ ID NO：180中所列核苷酸序列编码，SA Gtase多肽是由SEQ ID NO：182中所列核苷酸序列编码，UDPG1多肽是由SEQ ID NO：184中所列核苷酸序列编码，UN32491多肽是由SEQ ID NO：198中所列核苷酸序列编码，UN1671多肽是由SEQ ID NO：200中所列核苷酸序列编码，UGT74F1多肽是由SEQ ID NO：202中所列核苷酸序列编码，UGT75D1多肽是由SEQ ID NO：204中所列核苷酸序列编码，UGT84B2多肽是由SEQ ID NO：206中所列核苷酸序列编码，CaUGT2多肽是由SEQ ID NO：208中所列核苷酸序列编码，且UGT74F2样UGT多肽是由SEQ ID NO：210中所列核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，甜菊醇糖苷、甜菊醇前体的糖苷和/或甜菊醇糖苷前体是通过甜菊醇糖苷前体与一种或多种参与体外甜菊醇糖苷途径的酶接触来产生。例如，使甜菊醇与一种或多种编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽、和能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽或者能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因接触可以导致体外产生甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷前体是通过上流甜菊醇糖苷前体与一种或多种参与体外甜菊醇糖苷途径接触产生。例如，使内根-贝壳杉烯酸与能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽接触可以在体外产生甜菊醇。
在一些实施方案中，一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物是在体外产生。在一些实施方案中，该方法包括将与SEQ ID NO：7中所列氨基酸序列的具有至少55％同一性的UGT85C2多肽；与SEQ ID NO：9中所列氨基酸序列的具有至少50％同一性的UGT76G1多肽；与SEQ ID NO：4中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的UGT74G1多肽；包含与SEQ ID NO：11中所列氨基酸序列具有90％或更大同一性的UGT91D2e多肽或与SEQ IDNO：13中所列氨基酸序列具有90％或更大同一性的UGT91D2e-b多肽的UGT91D2功能同源多肽；与SEQ ID NO：16中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的EUGT11多肽；UGT73C1多肽包含与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽；UGT73C3多肽包含与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽；UGT73C5多肽包含与SEQ IDNO：135中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽；UGT73C6多肽包含与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽；UGT73E1多肽包含与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；UGT75B1多肽包含与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；UGT75L6多肽包含与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；UGT76E12多肽包含与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；OleI多肽包含与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；UGT5多肽包含与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽；SA Gtase多肽包含与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；UDPG1多肽包含与SEQ ID NO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；UN1671多肽包含与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％同一性的多肽；UGT74F1多肽包含与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；UGT75D1多肽包含与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；UGT84B2多肽包含与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性的多肽；UGT74F2样UGT多肽包含与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；UGT73C7多肽包含与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽；CaUGT3多肽包含与SEQ ID NO：169中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；和/或UN32491多肽包含与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；以及植物衍生的或合成的甜菊醇糖苷前体或植物衍生的或合成的甜菊醇添加至反应混合物；其中所述多肽中的至少一种是重组多肽；并由此产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
在一些实施方案中，甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体是通过全细胞生物转化生产。为发生全细胞生物转化，表达一种或多种参与甜菊醇糖苷途径的酶的宿主细胞将甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体吸入细胞并修饰；体内修饰后，甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体留在细胞中，和/或分泌到细胞培养基中。例如，表达编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽的基因的宿主细胞可将甜菊醇和糖基化甜菊醇吸入细胞；体内糖基化后，甜菊醇糖苷可被分泌到培养基中。在某些这样的实施方案中，宿主细胞还可表达编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；和/或编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸和由内根-柯巴基二磷酸合成的内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因。
在一些实施方案中，如本文公开的产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的方法包括在重组宿主细胞的细胞培养基中利用如下进行植物衍生的或合成的甜菊醇糖苷前体或植物衍生的或合成的甜菊醇前体的全细胞生物转化：(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽；(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽；(c)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化(即，对甜菊醇糖苷的糖基-位置糖基化活性的示例)的多肽；和/或(d)能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽；其中至少一个多肽是在重组宿主细胞中表达的重组多肽，并由此产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
在如本文公开的用于通过在本文所述重组宿主细胞的细胞培养基中，植物衍生的或合成的甜菊醇糖苷前体或植物衍生的或合成的甜菊醇前体的全细胞生物转化生产一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的方法的一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽包括UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase多肽、UDPG1多肽、UN1671多肽、UGT74F1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽包括UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73C7多肽、UGT73E1多肽和/或UGT76E12多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化(即，对甜菊醇糖苷的糖基-位置糖基化活性的示例)的多肽包括UGT73C6多肽、CaUGT3多肽、UN32491多肽和/或UN1671多肽；和/或能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽包括UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、UGT76E12多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase、UDPG1多肽、UGT74F1多肽、UGT75D1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽。
在如本文公开的用于通过在本文所述重组宿主细胞的细胞培养基中，植物衍生的或合成的甜菊醇糖苷前体或植物衍生的或合成的甜菊醇前体的全细胞生物转化生产一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的方法的一些实施方案中，UGT73C1多肽包含与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C3多肽包含与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C5多肽包含与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C6多肽包含与SEQ IDNO：137中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73E1多肽包含与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT75B1多肽包含与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75L6多肽包含与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，UGT76E12多肽包含与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，OleI多肽包含与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT5多肽包含与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽，SA Gtase多肽包含与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UDPG1多肽包含与SEQ ID NO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UN1671多肽包含与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％同一性的多肽，UGT74F1多肽包含与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75D1多肽包含与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT84B2多肽包含与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性的多肽，UGT74F2样UGT多肽包含与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT73C7多肽包含与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，CaUGT3多肽包含与SEQ ID NO：169中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，或UN32491多肽包含与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽。
在一些实施方案中，多肽，例如UGT多肽可以通过使之与锚定基序融合展示在本文公开的重组宿主细胞表面。
在一些实施方案中，使细胞透化吸收底物，以修饰或分泌修饰的产物。在一些实施方案中，可添加透化剂来帮助原料进入宿主，并帮助产物出来。在一些实施方案中，用诸如甲苯的溶剂或诸如Triton-X或Tween的洗涤剂使细胞透化。在一些实施方案中，用表面活性剂使细胞透化，例如阳离子表面活性剂，诸如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。在一些实施方案中，用周期性机械冲击使细胞透化，诸如电穿孔或轻微渗压震扰。例如，可以将培养的微生物的粗制裂解物离心，得到上清液。然后可将所得上清液施加至色谱柱，例如C18柱，并用水清洗，移除亲水化合物，然后用诸如甲醇的溶剂洗脱刚兴趣的化合物。然后通过制备型HPLC进一步纯化这种(这些)化合物。又参见WO 2009/140394。
在一些实施方案中，甜菊醇，一种或多种甜菊醇糖苷前体和/或一种或多种甜菊醇糖苷是通过共同培养两种或更多种宿主产生。在一些实施方案中，一种或多种宿主(每种表达一种或多种参与甜菊醇糖苷途径的酶)产生甜菊醇、一种或多种甜菊醇糖苷前体和/或一种或多种甜菊醇糖苷。例如，表达如下基因的宿主生产一种或多种甜菊醇糖苷：编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；和/或编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸和由内根-柯巴基二磷酸合成的内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因的宿主以及表达编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽的基因。
在一些实施方案中，包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽(例如，UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase多肽、UDPG1多肽、UN1671多肽、UGT74F1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽)的基因的重组宿主还包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：7中所列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：9中所列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：4中所列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16中所列的多肽)的基因。在某些这样的实施方案中，重组宿主细胞还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽(例如，具有SEQ ID NO：20中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，具有SEQ ID NO：40中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽(例如，具有SEQ ID NO：52中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽(例如，具有SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：117中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，具有SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：92中所列氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，具有SEQ ID NO：94中所列氨基酸序列的多肽)的基因。
在一些实施方案中，包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽(例如UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73C7多肽、UGT73E1多肽和/或UGT76E12多肽)的基因的重组宿主还包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：7中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：9中所列的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽(例如，具有SEQ IDNO：4中所列的氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16中所列的氨基酸序列的多肽)的基因。在某些这样的实施方案中，重组宿主细胞还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽(例如，具有SEQ ID NO：20中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，具有SEQ ID NO：40中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽(例如，具有SEQ ID NO：52中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽(例如，具有SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：117中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，具有SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：92中所列氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，具有SEQ ID NO：94中所列氨基酸序列的多肽)的基因。
在一些实施方案中，包含编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽(即，糖基-糖基化位置的示例)(例如，UGT73C6多肽、CaUGT3多肽、UN32491多肽和/或UN1671多肽)的基因的重组宿主还包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：7中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：9中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：4中所列氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16中所列氨基酸序列的多肽)的基因。在某些这样的实施方案中，重组宿主细胞还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽(例如，具有SEQ ID NO：20中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，具有SEQ ID NO：40中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽(例如，具有SEQ ID NO：52中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽(例如，具有SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：117中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，具有SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：92中所列氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，具有SEQID NO：94中所列氨基酸序列的多肽)的基因。
在一些实施方案中，包含编码能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽(例如(UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、UGT76E12多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase、UDPG1多肽、UGT74F1多肽、UGT75D1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽)的基因的重组宿主还包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽(例如，具有SEQ IDNO：7中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：9中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：4中所列氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16中所列氨基酸序列的多肽)的基因。在某些这样的实施方案中，重组宿主细胞还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽(例如，具有SEQ ID NO：20中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，具有SEQ ID NO：40中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽(例如，具有SEQ ID NO：52中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽(例如，具有SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：117中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，具有SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：92中所列氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，具有SEQ ID NO：94中所列氨基酸序列的多肽)的基因。
在一些实施方案中，包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽，如SA Gtase(例如，具有SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列的多肽)的基因的重组宿主还包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：7中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：9中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：4中所列氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16中所列氨基酸序列的多肽)的基因。在某些这样的实施方案中，重组宿主细胞还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽(例如，具有SEQ ID NO：20中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，具有SEQ ID NO：40中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽(例如，具有SEQID NO：52中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸、内根-贝壳杉烯醇和/或内根-贝壳杉烯醛的多肽(例如，具有SEQ ID NO：60或SEQ IDNO：117中所列氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，具有SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：92中所列氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，具有SEQ ID NO：94中所列氨基酸序列的多肽)的基因。
在某些方面，在包含编码GGPPS多肽(例如，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20)的重组基因、编码截短CDPS多肽(例如，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)的重组基因、编码KS多肽(例如，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52)的重组基因、编码KO多肽(例如，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：60)的重组基因、编码ATR2多肽(例如，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92)的重组基因、编码EUGT11多肽(例如，SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16)的重组基因、编码KAH多肽(例如，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94)的重组基因、编码CPR8多肽(例如，SEQ ID NO：85，SEQID NO：86)的重组基因、编码UGT85C2多肽(例如，SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：7)或SEQ ID NO：7的UGT85C2变体(或功能同源物)的重组基因、编码UGT74G1多肽(例如，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4)或SEQ ID NO：4的UGT74G1变体(或功能同源物)的重组基因、编码UGT76G1多肽(例如，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9)或SEQ ID NO：9的UGT76G1变体(或功能同源物)的重组基因、和编码UGT91D2e多肽(例如，SEQ ID NO：10，SEQID NO：11)和/或SEQ ID NO：11的UGT91D2e变体(或功能同源物)(诸如UGT91D2e-b(SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：13)多肽)的重组基因的一个或多个拷贝的酿酒酵母中表达SA Gtase(SEQ ID NO：182，SEQ ID NO：183)导致内根-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、13-SMG、RebA、RebB、甜菊醇+4Glc(#36)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或内根-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)增加。参见实施例4。
在一些实施方案中，在体内/在体外或通过全细胞生物转化产生的甜菊醇糖苷和/或甜菊醇前体的糖苷或其自组合物包含较少污染物或少于来自尤其是甜叶菊植物的甜叶菊提取物的任何特定污染物。污染物可以包括导致异味的植物衍生的化合物。潜在的污染物包括颜料、脂类、蛋白质、酚类、糖类、斯巴醇和其他倍半萜烯、半日花烷二萜、单萜、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、α-香树素、β-香树素、羽扇豆醇、β-香树素乙酸酯、五环三萜、矢车菊黄素(centauredin)、槲皮素、表-α-杜松醇、石竹烯(carophyllene)和衍生物、β-蒎烯、β-谷甾醇和赤霉素。
如本文所用，术语“可检测量”、“可检测浓度”、“可测量量”和“可测量浓度”是指以AUC、μM/OD600、mg/L、μM或mM衡量的甜菊醇糖苷水平。可以通过本领域技术人员通常可获得的技术检测和/或分析甜菊醇糖苷生产情况(即，总量、上清液和/或胞内甜菊醇糖苷水平)，例如但不限于液相色谱-质谱(LC-MS)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、紫外-可见光谱法/分光光度测定(UV-Vis)、质谱法(MS)和NMR。
如本文所用，术语“不可检测浓度”是指太低而无法通过诸如TLC、HPLC、UV-Vis、MS或NMR的技术测量和/或分析的化合物水平。在一些实施方案中，“不可检测浓度”的化合物不存在于甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物中。
如本文所用，术语“或”和“和/或”用于描述组合或彼此排斥的多个组件。例如，“x、y和/或z”可以指只有“x”、只有“y”、只有“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。在一些实施方案中，“和/或”用于指重组细胞包含的外源核酸，其中重组细胞包含一种或多种选自一组群的外源核酸。在一些实施方案中，“和/或”用于指生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。在一些实施方案中，“和/或”用于指生产甜菊醇糖苷，其中生产了一种或多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，“和/或”用于指生产甜菊醇糖苷，其中通过以下一个或多个步骤生产了一种或多种甜菊醇糖苷：培养重组微生物，在重组微生物中合成一种或多种甜菊醇糖苷，和/或分离一种或多种甜菊醇糖苷。
功能同源物
上述多肽的功能同源物也适合用在重组宿主中生产甜菊醇糖苷。功能同源物是与参考多肽具有序列相似性且带有该参考多肽的一种或多种生化或生理功能的多肽。功能同源物和参考多肽可以是天然的多肽，序列相似性可以归因于趋同或趋异进化事件。因此，功能同源物有时在文献中称为同源物、直系同源物或旁系同源物。天然功能同源物的变体(诸如由野生型编码序列的突变体编码的多肽)它们本身可以是功能同源物。功能同源物也可以通过多肽的编码序列的定点诱变或通过组合不同天然多肽的编码序列的结构域(“结构域交换”)产生。用于修饰编码本文所述功能多肽的基因的技术是已知的，且尤其包括定向进化技术、定点诱变技术和随机诱变技术，且可用于增加多肽的特异性活性，改变底物特异性，改变表达水平，改变亚细胞定位，或以期望方式修饰多肽-多肽相互作用。这种修饰的多肽被视为功能同源物。有时术语“功能同源”适用于编码功能同源性多肽的核酸。
功能同源物可通过分析核苷酸和多肽序列比对来鉴定。例如，对核苷酸或多肽序列的数据库进行查询可以鉴定甜菊醇糖苷生物合成多肽的同源物。序列分析可涉及使用UGT氨基酸序列作为参考序列以BLAST、倒数BLAST或PSI-BLAST分析非冗余数据库。在某些情况下，氨基酸序列是从核苷酸序列推导出的。数据库中具有大于40％序列同一性的那些多肽是进一步评估作为甜菊醇糖苷生物合成多肽的适合性的候选者。氨基酸序列相似性允许保守氨基酸取代，如用一个疏水残基取代另一个或用一个极性残基取代另一个。如果需要，可以人工检查这些候选者，以缩减要进一步评估候选者的数量。可以通过选择似乎具有存在于甜菊醇糖苷生物合成多肽中的结构域的候选者来进行人工检查，例如，保守的功能结构域。在一些实施方案中，基于表达水平而不是通过使用BLAST分析从转录组数据鉴定核酸和多肽。
保守区域可通过定位甜菊醇糖苷生物合成多肽的一级氨基酸序列内的区域来识别，该区域是重复序列，形成一些二级结构(例如，螺旋和β折叠)，建立带正电或带负电的结构域，或代表蛋白质基序或结构域。参见，例如描述各种蛋白质基序和结构域的共有序列的Pfam网站，万维网网址sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janelia.org/。Pfam数据库中包括的信息描述在Sonnhammer等人，Nucl.Acids Res.，26：320-322(1998)；Sonnhammer等人，Proteins，28：405-420(1997)；和Bateman等人，Nucl.Acids Res.，27：260-262(1999)中。保守区也可以通过比对来自密切相关物种的相同或相关多肽的序列来确定。密切相关的物种优选地来自相同科。在一些实施方案中，比对两种不同物种的序列足以鉴定此类同源物。
通常，具有至少约40％氨基酸序列同一性的多肽可用于鉴定保守区域。相关多肽的保守区域具有至少45％氨基酸序列同一性(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守区域具有至少92％、94％、96％、98％或99％氨基酸序列同一性。
例如，适用于在重组宿主中产生甜菊醇的多肽包括UGT的功能同源。
修饰例如UGT的底物特异性的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于定点/合理诱变方法、随机定向进化方法和组合，其中随机诱变/饱和技术是靠近酶的活性位点进行的。例如，参见Osmani等人，2009，Phytochemistry 70：325-347。
候选序列的长度通常是参考序列长度的80％至200％，例如参考序列长度的82％、85％、87％、89％、90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。功能同源多肽的长度通常为参考序列长度的95％至105％，例如参考序列长度的90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％或120％，或其间任何范围。候选核酸或多肽相对于参考核酸或多肽的％同一性可以如下确定。利用计算机程序Clustal Omega(1.2.1版，默认参数)将参考序列(例如，本文所述核酸序列或氨基酸序列)与一个或多个候选序列比对，这允许对核酸或多肽序列跨其整个长度来比对(全局比对)。Chenna等人，2003，Nucleic Acids Res.31(13)：3497-500。
ClustalW计算参考序列与一个或多个候选序列之间的最佳匹配，并将它们进行比对，以便可确定身份、相似性和差异。可将一个或多个残基的缺口插入参考序列、候选序列或二者，以最大化序列比对。为了核酸序列的快速逐对比对，使用以下默认参数：字长：2；窗口大小：4；评分方法：年龄％；顶部对角线数量：4；和空位罚分：5.为了核酸序列的多重比对，使用以下参数：空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；和权重转换：是。为了蛋白质序列的快速逐对比对，使用以下参数：字长：1；窗口大小：5；评分方法：年龄％；顶部对角线数量：5；空位罚分：3.为了蛋白质序列的多重比对，使用以下参数：权重矩阵：blosum；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水空位：开启；亲水残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；残基特异性空位罚分：开启。ClustalW输出是反映序列间关系的序列对比。例如，可以在万维网的贝勒医学院(Baylor College of Medicine)搜索启动栏站点(searchlauncher.bcm.tmc.edu/mul ti-align/multi-align.html)和万维网欧洲生物信息研究所站点(ebi.ac.uk/clustalw)运行ClustalW。
为确定候选核酸或氨基酸序列与参考序列的同一性％，利用Clustal Omega比对序列，比对中相同匹配的数量除以参考序列的长度，并用结果乘以100。注意，同一性％值可以四舍五入至十分位。例如，将78.11、78.12、78.13和78.14四舍五入为78.1，而将78.15、78.16、78.17、78.18和78.19四舍五入为78.2。
应当理解，功能性UGT蛋白可以包括不参与酶进行的酶活性的其他氨基酸。在一些实施方案中，UGT蛋白是融合蛋白。术语“嵌合体”、“融合多肽”、“融合蛋白”、“融合酶”、“融合构建体”、“嵌合蛋白”、“嵌合多肽”、“嵌合构建体”和“嵌合酶”在本文可互换使用，是指通过连接两个或多个编码不同蛋白质的基因而工程化的蛋白质。在一些实施方案中，编码UGT多肽的核酸序列可以包括标记序列，其编码设计用来便于后续操纵(例如，便于纯化或检测)、分泌或定位所编码的多肽的“标记”。可将标记序列插入编码多肽的核酸序列，使得编码的标记位于多肽的羧基或氨基末端。编码标记的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、人流感血凝素(HA)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、多组氨酸标记(HIS标记)和FlagTM标记(Kodak，New Haven，CT)。标记的其他实例包括叶绿体转运肽、线粒体转运肽、淀粉样蛋白肽、信号肽或分泌标记。
在一些实施方案中，融合蛋白是通过结构域交换改变的蛋白。如本文所用，术语“结构域交换”用于描述用第二蛋白质的结构域取代第一蛋白质的结构域的过程。在一些实施方案中，第一蛋白质的结构域和第二蛋白质的结构域在功能上相同或功能上相似。在一些实施方案中，第二蛋白质结构域的结构和/或序列不同于第一蛋白质结构域的结构和/或序列。在一些实施方案中，UGT多肽通过结构域交换改变。
在一些实施方案中，融合蛋白是通过循环排列改变，其在于随后将在别处打开的蛋白质的末端的共价结合。因此，序列的次序被改变，但不会引起蛋白质的氨基酸的变化。在一些实施方案中，可以通过包括但不限于设计一个连接原始蛋白的末端的间隔区产生目标循环排列。一旦确定了间隔区，有几种通过普遍接受的分子生物学技术产生排列的可能性，例如但不限于通过PCR产生多联体并随后扩增多联体内的特定排列或通过扩增蛋白质的离散片段来交换，以不同的顺序加入它们。产生排列的步骤之后可以接着通过结合片段末端并随机切割来创建环状基因，从而由独特构建体形成排列集合。
甜菊醇和甜菊醇糖苷生物合成核酸
编码本文所述多肽的重组基因包含该多肽的编码序列，其可操作地敏感连接至一个或多个适合表达该多肽的调节区。因为许多微生物能够从多顺反子mRNA表达多种基因产物，所以如果需要，可以在那些微生物的单一调节区的控制下表达多种多肽。当调节区和编码序列被定位使得调节区有效调节序列的转录或翻译时，认为编码序列和调节区被可操作地连接。通常，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点位于单顺反子基因调节区下游的一个和约五十个核苷酸之间。
在许多情况下，在除重组宿主之外的物种中鉴定了本文所述多肽的编码序列，即是异源核酸。因此，如果重组宿主是微生物，则编码序列可以来自其他原核或真核微生物，来自植物或来自动物。然而，在某些情况下，编码序列是源自宿主并且正被重新引入该生物体的序列。
本源(native)序列通常可以通过与外源核酸连接的非天然序列(例如，重组核酸构建体中天然序列侧翼的非本源调节序列)的存在与天然存在的序列区分开。另外，稳定转化的外源核酸通常整合在除了发现本源序列的位置之外的位置。“调节区”是指具有影响转录或翻译产物的转录或翻译起始和速率，以及稳定性和/或移动性的核苷酸序列的核酸。调节区包括但不限于启动子序列、增强子序列、反应元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5′和3′非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、内含子及其组合。调节区通常包含至少一个核心(基础)启动子。调节区还可以包含至少一种控制元件，例如增强子序列、上游元件或上游激活区(UAR)。通过定位调节区与编码序列，调节区可操作地连接至编码序列，使得调节区有效调节该序列的转录或翻译。例如，为了可操作地连接编码序列和启动子序列，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点通常位于启动子下游的一个和约五十个核苷酸之间。然而，调节区可位于翻译起始位点上游约5,000个核苷酸处，或转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。
要包括的调节区的选择取决于几个因素，包括但不限于某些培养阶段期间的效率、选择性、可诱导性、期望的表达水平和优先表达。对于本领域技术人员而言，通过适当地相对于编码序列选择和定位调节区来调节编码序列的表达是常规事项。应当理解，可以存在超过一个的调节区，例如，内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导型元件。
一种或多种基因可以以“模块”组合在重组核酸构建体中，所述“模块”可用于甜菊醇和/或甜菊醇糖苷生产的离散方面。将多个基因组合在模块中，特别是多顺反子模块，有助于在各种物种中使用该模块。例如，甜菊醇生物合成基因簇或UGT基因簇可以组合在多顺反子模块中，使得在插入合适的调节区后，可以将模块引入多种物种中。作为另一个例子，可以组合UGT基因簇，使得每个UGT编码序列可操作地连接到单独的调节区，以形成UGT模块。这种模块可用于需要或期望单顺反子表达的那些物种。除了可用于甜菊醇或甜菊醇糖苷生产基因外，重组构建体通常还含有复制起点和一种或多种选择性标记，用于在适当的物种中维持构建体。
应当理解，由于遗传密码的简并性，许多核酸可以编码特定的多肽；即，对于许多氨基酸，存在超过一个作为氨基酸的密码子的核苷酸三联体。因此，可以利用宿主(例如，微生物)的适当密码子偏性表修饰给定多肽的编码序列中的密码子，使得在该特定宿主中表达最佳。作为分离的核酸，这些修饰的序列可以作为纯化的分子存在，并且可以掺入载体或病毒中，用于构建重组核酸构建体的模块。
在某些情况下，希望抑制内源多肽的一种或多种功能，以便将代谢中间体转向甜菊醇或甜菊醇糖苷生物合成。例如，可能需要下调酵母菌株中甾醇的合成，以例如通过下调角鲨烯环氧酶进一步增加甜菊醇或甜菊醇糖苷的产生。作为另一个实例，可能需要抑制某些内源基因产物的降解功能，例如，如本文所讨论的除去次级代谢物或磷酸酶的葡萄糖部分的糖水解酶。在这样的情况下，过表达多肽或基因产物的核酸可以包含在转化到菌株中的重组构建体中。可选地，可利用诱变产生希望增加或增强功能的基因中的突变体。
本公开的一个方面是编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽或其催化活性部分的分离核酸分子。该核酸是cDNA。在一些实施方案中，所编码的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽或其催化活性部分包含UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase多肽、UDPG1多肽、UN1671多肽、UGT74F1多肽、UGT84B2多肽或UGT74F2样UGT多肽。在一些实施方案中，所编码的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽或其催化活性部分包含具有SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：133、SEQ IDNO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：203、SEQ IDNO：207或SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列的多肽。
本公开的另一方面是编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分的分离核酸分子。在一些实施方案中，所编码的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分包含UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73C7多肽、UGT73E1多肽或UGT76E12多肽。在一些实施方案中，所编码的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分包含具有SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ IDNO：139、SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列的多肽。
本公开的另一方面是编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽或其催化活性部分的分离核酸分子。该核酸是cDNA。在一些实施方案中，所编码的能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽或其催化活性部分包含UGT73C6多肽、CaUGT3多肽、UN32491多肽或UN1671多肽。在一些实施方案中，所编码的能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽或其催化活性部分包含SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：169、SEQ IDNO：199或SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列的多肽。
本公开的另一方面是编码能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分的分离核酸分子。该核酸是cDNA。在一些实施方案中，所编码的能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分包含UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、UGT76E12多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase、UDPG1多肽、UGT74F1多肽、UGT75D1多肽、UGT84B2多肽或UGT74F2样UGT多肽。在一些实施方案中，所编码的能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分包含具有SEQ IDNO：127、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：183、SEQ IDNO：185、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：207或SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列的多肽。
宿主微生物
重组宿主可用于表达生产甜菊醇糖苷的多肽，包括哺乳动物、昆虫、植物和藻类细胞。许多原核生物和真核生物也适用于构建本文所述的重组微生物，例如，革兰氏阴性细菌、酵母和真菌。首先分析选择用作甜菊醇糖苷生产菌株的物种和菌株，以确定哪些生产基因对该菌株是内源的，哪些基因不存在。菌株中不存在内源对应物的基因有利地组装在一种或多种重组构建体中，然后将其转化到该菌株中以提供缺失的一个或多个功能。
通常，重组微生物在发酵罐中在一个或多个温度下生长一段时间，其中该温度和时间段有利于甜菊醇糖苷的产生。本发明所提供的构建和遗传工程化微生物可以利用常规发酵工艺培养，尤其包括恒化器法、分批、分批补料培养、半连续发酵(诸如抽取和补充)、连续灌注发酵和连续灌注细胞培养。根据该方法中使用的特定微生物，也可以存在和表达其他重组基因，如异戊烯基生物合成基因和萜烯合酶和环化酶基因。底物和中间体，如异戊烯二磷酸、二甲基烯丙基二磷酸、GGPP、内根-贝壳杉烯和内根-贝壳杉烯酸的水平可以通过从培养基提取样品，以根据公开的方法来分析。
本方法中使用的碳源包括可被重组宿主细胞代谢以促进甜菊醇糖苷生长和/或产生的任何分子。合适的碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如，如在糖蜜中发现的)、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其他含葡萄糖的聚合物。在使用酵母作为宿主的实施方案中，例如，碳源如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖是合适的。可在整个培养期间将碳源提供给宿主生物体，或可选地，生物体可在另一种能源(例如，蛋白质)的存在下生长，然后只在分批补料期间提供碳源。
在重组微生物在培养物中生长一段时间后，其中温度和时间段有利于甜菊醇糖苷的产生，然后可以使用本领域中已知的各种技术从培养物中回收甜菊醇和/或一种或多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，可添加透化剂来帮助原料进入宿主，并帮助产物出来。例如，可以将培养的微生物的粗制裂解物离心，得到上清液。然后可将所得上清液施加至色谱柱，例如C-18柱，并用水清洗，移除亲水化合物，然后用诸如甲醇的溶剂洗脱刚兴趣的化合物。然后通过制备型HPLC进一步纯化这种(这些)化合物。又参见WO 2009/140394。
应当理解，本文讨论的各种基因和模块可以存在于两种或更多种重组宿主中而不是单一宿主中。当使用多种重组宿主时，它们可以在混合培养物中生长以积累甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。
可选地，两个或更多个宿主各自可以在单独的培养基中生长，并且第一培养基的产物(例如甜菊醇)可以被引入第二培养基中以转化为后续中间体，或者终产物，例如RebA。然后回收由第二个或最终宿主产生的产物。还应理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的系统培养重组宿主。
以下更详细地描述了示例性原核和真核物种。然而，应该理解，其他物种可能是合适的。例如，合适的物种可以在以下属中，诸如伞草属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假丝酵母属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假囊酵母属(Eremothecium)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、镰刀菌属/赤霉菌属(Fusarium/Gibberella)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、普法夫酵母属(Phaffia)、平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)、藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)或亚罗酵母属(Yarrowia)。来自这些属的示例性物种包括虎皮香菇(Lentinus tigrinus)、硫色绚孔菌(Laetiporus sulphureus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、杰丁塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera jadinii)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、黏红酵母(Rhodoturula glutinis)、粘质红酵母(Rhodoturulamucilaginosa)、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)、红发夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)、水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi)/藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、白假丝酵母(Candida albicans)和解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)。
在一些实施方案中，微生物可以是原核生物，诸如埃希氏杆菌属细菌细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞；乳杆菌属细菌细胞；乳球菌属细菌细胞；棒状杆菌属细菌细胞；醋酸杆菌属细菌细胞；醋杆菌属细菌细胞；不动杆菌属细菌细胞；或假单胞菌属细菌细胞。
在一些实施方案中，微生物可以是子囊菌，诸如藤仓赤霉、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillus niger)、解脂耶罗威亚酵母、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)或酿酒酵母。
在一些实施方案中，微生物可以是藻类细胞，诸如三孢布拉氏霉(Blakesleatrispora)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻属物种(Chlorella sp.)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、马尾藻属(Sargassum)、海带(Laminaria japonica)、栅藻物种(Scenedesmus almeriensis species)。
在一些实施方案中，微生物可以是蓝藻细胞，诸如三孢布拉氏霉、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻属物种、裙带菜、马尾藻属、海带、栅藻。
酵母属物种
酵母属是合成生物学中广泛使用的底盘生物，且可用作重组微生物平台。例如，存在酿酒酵母可用的突变体、质粒、详细代谢计算机模型和其他信息的文库，允许合理设计各种模块来提高产物收率。已知用于制造重组微生物的方法。
曲霉属物种
曲霉属物种如米曲菌(A.oryzae)、黑曲菌(A.niger)和酱油曲菌(A.sojae)是食品生产中广泛使用的微生物，且也可用作重组微生物平台。核苷酸序列可用于构巢曲菌(A.nidulans)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲菌、棒曲霉(A.clavatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲菌和(A.terreus)的基因组，允许合理设计和修改内源途径，以增加通量和增加产物收率。已经为曲霉属开发了代谢模型，以及转录学研究和蛋白质组学研究。培养黑曲菌用于许多食品成分诸如柠檬酸和葡糖酸的工业生产，且因此诸如黑曲菌的物种通常适合生产甜菊醇糖苷。
大肠杆菌(E.coli)
大肠杆菌，合成生物学中另一广泛使用的平台微生物，也可以用作重组微生物平台。类似于酵母属，有供大肠杆菌可用的突变体、质粒、详细代谢计算机模型和其他信息的文库，允许合理设计各种模块来提高产物收率。上文针对酵母属所述的那些类似的方法可用于制造重组大肠杆菌微生物。
伞草属、赤霉菌属和平革菌属物种
可使用伞草属、赤霉菌属和平革菌属物种，因为已知它们在培养物中生产大量类异戊二烯。因此，用于产生大量甜菊醇糖苷的萜烯前体已经由内源基因产生。因此，可将包含甜菊醇糖苷生物合成多肽的重组基因的模块引入来自这些属的物种中，而不必引入甲羟戊酸或MEP途径基因。
解腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans)(食腺嘌呤节孢酵母(Blasrobotrvs adeninivorans))
解腺嘌呤阿氏酵母是具有不寻常生化特性的二性态酵母(它像烘焙酵母一样在至高42℃下作为出芽酵母生长，在此阈值之上，它以丝状形式生长)。它可以在各种底物上生长，并可以吸收硝酸盐。已将其成功应用到生产可以产生天然塑料的菌株，或开发环境样品中雌激素的生物传感器。
解脂耶罗威亚酵母
解脂耶罗威亚酵母是二性态酵母(参见解腺嘌呤阿氏酵母)且属于半子囊菌科。已知解脂耶罗威亚酵母的整个基因组。亚罗酵母属物种是需氧物种，且被认为是非致病的。亚罗酵母属有效利用疏水性底物(例如烷烃、脂肪酸、油)，且可在糖上生长。它具有很高的工业应用潜力，并且是一种含油的微生物。解脂耶罗威亚酵母可以积聚脂含量至其细胞干重的约40％，且是用于脂积聚和再活化的模型微生物。参见例如Nicaud，2012，Yeast 29(10)：409-18；Beopoulos等人，2009，Biochimie 91(6)：692-6；Bankar等人，2009，ApplMicrobiol Biotechnol.84(5)：847-65。
红酵母属物种
红酵母属是单细胞有色酵母。已显示，含油红酵母，胶粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)从粗甘油产生脂质和类胡萝卜素(Saenge等人，2011，Process Biochemistry 46(1)：210-8)。已显示，圆红酵母(Rhodotorula toruloides)菌株是增加生物量和脂质产量的有效补料-分批发酵系统(Li等人，2007，Enzyme and Microbial Technology 41：312-7)。
圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)
圆红冬孢酵母菌是含油酵母，且可用于工程化脂质生产途径(参见例如Zhu等人，2013，Nature Commun.3：1112；Ageitos等人，2011，Applied Microbiology andBiotechnology 90(4)：1219-27)。
博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)
博伊丁假丝酵母是甲基营养型酵母(可以在甲醇上生长)。与其他甲基营养型物种如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和毕赤酵母一样，它提供生产异源蛋白的优秀平台。已经报道了数克分泌外来蛋白的收率。一种计算方法，IPRO最近预测了实验上将博伊丁假丝酵母木糖还原酶的辅因子特异性由NADPH转换为NADH的突变。参见例如，Mattanovich等人，2012，Methods Mol Biol.824：329-58；Khoury等人，2009，Protein Sci.18(10)：2125-38。
多形汉逊酵母(Pichia angusta)
多形汉逊酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁假丝酵母)。它还可以生长在众多其他底物上；它具有耐热性，且可吸收硝酸盐(另参见乳酸克鲁维酵母)。已将其用于生产乙型肝炎疫苗、胰岛素和用于治疗丙型肝炎的干扰素α-2a，此外还用于一系列技术酶。参见例如，Xu等人，2014，Virol Sin.29(6)：403-9。
乳酸克鲁维酵母
乳酸克鲁维酵母是常用于生产开菲尔的酵母。它可以在几种糖上生长，最重要的是在牛奶和乳清中存在的乳糖上生长。尤其是，已将它成功用于生产凝乳酶(一种通常存在于小牛胃中的酶)来生产奶酪。以40,000L规模在发酵罐中进行生产。参见例如，van Ooyen等人，2006，FEMS Yeast Res.6(3)：381-92。
毕赤酵母
毕赤酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁假丝酵母和多形汉逊酵母)。它为生产外源蛋白提供有效平台。平台元素可作为试剂盒提供，且在学术界，它在全球范围内用于生产蛋白质。菌株已被工程化，可以产生复杂的人类N-聚糖(酵母聚糖与人类中发现的相似，但不相同)。参见例如，Piirainen等人，2014，N Biotechnol.31(6)：532-7。
藓属物种
小立碗藓属藓(Physcomitrella mosses)，当在悬浮培养物中生长时具有与酵母或其他真菌培养物相似的特性。该属可用于产生植物次级代谢物，其在其他类型的细胞中难以产生。
应当理解，本文公开的重组宿主细胞可以包含植物细胞，包括在植物中生长的植物细胞；哺乳动物细胞；昆虫细胞；真菌细胞，包括酵母细胞，其中酵母细胞是来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶罗威亚酵母、光滑假丝酵母、棉阿舒囊霉、杰丁塞伯林德纳氏酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母、解腺嘌呤阿氏酵母、红发夫酵母或白假丝酵母物种的细胞，或者是酵母菌或是酿酒酵母细胞、藻类细胞或细菌细胞(包括埃希氏杆菌属细胞、乳杆菌属细胞、乳球菌属细胞、棒状杆菌属细胞、醋酸杆菌属细胞、不动杆菌属细胞或假单胞菌属细胞)。
甜菊醇糖苷组合物
甜菊醇糖苷在不同事物系统中不一定具有相同性能。因此，希望具有引导合成所选甜菊醇糖苷组合物的能力。本文所述的重组宿主可以产生选择性富集甜菊醇糖苷(例如，RebD或RebM)且具有一贯口感特征的组合物。如本文所用，术语“富集的”用于描述与来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物(提取物)相比，特定甜菊醇糖苷比例增加的甜菊醇糖苷组合物。因此，本文所述重组宿主可以促进生产如下组合物，该组合物经定制以满足给定食物产品所需的甜味特征且每种甜菊醇糖苷的比例在不同批次之间是一致。在一些实施方案中，本文描述的宿主不产生或产生量减少的甜叶菊提取物中找到的非期望植物副产物。因此，本文所述重组宿主所产生的甜菊醇糖苷组合物不同于衍生自甜菊叶植物的组合物。
单种甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的积聚量可以是约1至约7,000mg/L，例如约1至约10mg/L、约3至约10mg/L、约5至约20mg/L、约10至约50mg/L、约10至约100mg/L、约25至约500mg/L、约100至约1,500mg/L或约200至约1,000mg/L、至少约1,000mg/L、至少约1,200mg/L、至少约1,400mg/L、至少约1,600mg/L、至少约1,800mg/L、至少约2,800mg/L或至少约7,000mg/L。在某些方面，单种甜菊醇糖苷的量可超过7,000mg/L。甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的组合的积聚量可以是约1mg/L至约7,000mg/L，例如约200至约1,500、至少约2,000mg/L、至少约3,000mg/L、至少约4,000mg/L、至少约5,000mg/L、至少约6,000mg/L或至少约7,000mg/L。在某些方面，甜菊醇糖苷的组合的量可以超过7,000mg/L。通常，培养时间越长将得到更多的产物。因此，重组微生物可以培养1天至7天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天或约5天。
应当理解，本文讨论的各种基因和模块可以存在于两种或更多种重组微生物中而不是单一微生物中。当使用多种重组微生物时，它们可以在混合培养物中生长以产生甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。例如，第一微生物可包含一种或多种用于产生甜菊醇糖苷前体的生物合成基因，而第二种微生物包含甜菊醇糖苷生物合成基因。然后回收由第二个或最终微生物产生的产物。还应理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的系统培养重组微生物。
可选地，两个或更多个微生物各自可以在单独的培养基中生长，并且第一培养基的产物(例如甜菊醇)可以被引入第二培养基中以转化为后续中间体，或者终产物，诸如RebA。然后回收由第二个或最终微生物产生的产物。还应理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的系统培养重组微生物。
本文公开的方法所获得的甜菊醇糖苷和组合物可用于制造食物产品、饮食补充剂和甜味剂组合物。参见例如WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328。
例如，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷(诸如RebM或RebD)可以包含在食物产品中，诸如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、酸奶、烘焙食品、口香糖、硬糖和软糖以及调味汁。基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷也可以包含在非食物产品中，诸如药学产品、医用产品、饮食补充剂和营养补充剂。对于农业工业和伴侣动物工业，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷也可以包含在动物饲料产品中。可选地，甜菊醇和/或甜菊醇糖苷的混合物可以这样制备，分别培养重组微生物，每种微生物产生特定甜菊醇或甜菊醇糖苷，从每种微生物回收基本上纯净形式的甜菊醇或甜菊醇糖苷，然后合并这些化合物，得到包含期望比例的每种化合物的混合物。与当前的甜叶菊产品相比，本文所述重组微生物允许获得更精确一致的混合物。
在另一替代方案中，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷可与其他甜味剂一起掺入食物产品，例如糖精、右旋糖、蔗糖、果糖、赤藓糖醇、阿斯巴甜、三氯蔗糖、莫纳甜或乙酰磺胺酸钾。甜菊醇或甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的重量比可以根据需要变化，以在最终食物产品中获得令人满意的味道。参见例如U.S.2007/0128311。在一些实施方案中，甜菊醇或甜菊醇糖苷可具有香料(例如，柑橘)作为调味剂。
可将由本文所述重组微生物产生的组合物掺入食物产品。例如，重组微生物所产生的甜菊醇糖苷组合物可以约20mg甜菊醇糖苷/kg食物产品至约1800mg甜菊醇糖苷/kg食物产品(按干重)的量掺入食物产品，这取决于甜菊醇糖苷和食物产品的类型。例如，由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可掺入甜点、冷点心(例如，冰淇淋)、乳制品(例如，酸奶)或饮料(例如，碳酸饮料)，使得食物产品具有最多500mg甜菊醇糖苷/kg食品，按干重。由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可掺入烘焙食品(例如，饼干)，使得食物产品具有最多300mg甜菊醇糖苷/kg食品，按干重。由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可掺入调味汁(例如，巧克力糖浆)或植物产品(例如，腌菜)中，使得食物产品具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食品，按干重。由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可掺入面包，使得食物产品具有按干重计最多160mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷组合物可掺入硬糖或软糖，使得食物产品具有按干重计最多1600mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷组合物可掺入加工的水果产品(例如，果汁、水果馅、果酱和果冻)，使得食物产品具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食品，按干重。在一些实施方案中，本文产生的甜菊醇糖苷组合物是药物组合物的组分。参见例如，Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA，2007，由Harriet Wallin制备，Food Agric.Org.；EFSA Panel on Food Additives and NutrientSources added to Food(ANS)，“Scientific Opinion on the safety of steviolglycosides for the proposed uses as a food additive，”2010，EFSA Journal 8(4)：1537；U.S.Food and Drug Administration GRAS Notice 323；U.S Food and DrugAdministration GRAS Notice Notice 329；WO 2011/037959；WO 2010/146463；WO 2011/046423；和WO 2011/056834。
例如，这种甜菊醇糖苷组合物可具有90-99重量％RebA和可检测量的甜叶菊植物-衍生的污染物，且可以按25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg(按干重)掺入食物产品。
这种甜菊醇糖苷组合物可以是具有超过3重量％RebB的富RebB组合物，且可掺入食物产品，使得RebB在该产品中的量是25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg(按干重计)。通常，富RebB组合物具有不可检测量的甜叶菊植物-衍生的污染物。
这种甜菊醇糖苷组合物可以是具有超过3重量％RebD的富RebD组合物，且可掺入食物产品，使得RebD在该产品中的量是25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg(按干重计)。通常，富RebD组合物具有不可检测量的甜叶菊植物-衍生的污染物。
这种甜菊醇糖苷组合物可以是具有超过3重量％RebE的富RebE组合物，且可掺入食物产品，使得RebE在该产品中的量是25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg(按干重计)。通常，富RebE组合物具有不可检测量的甜叶菊植物-衍生的污染物。
这种甜菊醇糖苷组合物可以是具有超过3重量％RebM的富RebM组合物，且可掺入食物产品，使得RebM在该产品中的量是25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg(按干重计)。通常，富RebM组合物具有不可检测量的甜叶菊植物-衍生的污染物。
在一些实施方案中，将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷掺入餐桌用甜味剂或“杯装(cup-for-cup)”产品。通常，用一种或多种增量剂(例如，本领域中技术人员已知的麦芽糖糊精)将这类产品稀释至适当甜味水平。富含RebA、RebB、RebD、RebE或RebM的甜菊醇糖苷组合物可以包装在小袋中，例如10,000至30,000mg甜菊醇糖苷/kg产品(按干重计)，供桌面用。在一些实施方案中，在体外、体内或通过全细胞生物转化产生甜菊醇糖苷。
以下实施例中将进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
下面的实施例说明本发明的具体实施方案及其各种用途。列出它们只是出于解释目的，且不应视为限制本发明。
实施例1：LC-MS分析程序
在Waters ACQUITY(Waters Corporation)上用电喷雾电离(ESI)以负模式进行LC-MS分析，Waters ACQUITYBEH C18柱(2.1x 50mm，1.7μm粒子，孔径)连接至Waters ACQUITY TQD三重四极杆质谱仪。
方法A的化合物分离是通过两个流动相梯度实现：A(含0.1％甲酸的水)和B(含0.1％甲酸的MeCN)在0.3至2.0min之间从20％增加至50％B，在2.01min增加至100％B，保持100％B 0.6min，并重新平衡0.6min。
方法B的化合物分离是通过两个流动相梯度实现：A(含0.1％甲酸的水)和B(含0.1％甲酸的MeCN)，在2.5min内从60％增加至100％B，保持100％B 0.1min，并重新平衡0.3min。
流速是0.6mL/min，且柱温度为55℃。利用SIM(单离子监测)监测甜菊醇糖苷，并通过与真实标准物比较来量化。检测到的甜菊醇糖苷的m/z迹线和保留时间值参见表1。
表1：甜菊醇和甜菊醇糖苷的LC-MS分析数据。
实施例2：粗制裂解物制备
将构建用于表达UGT多肽的大肠杆菌菌株的菌落放入有1mL含氨苄青霉素的NZCYM细菌培养液的无菌96深孔板中。将板密封，并允许在37℃生长过夜，以200rpm振荡。次日(即，第2天)，将50μL每种培养物转移到新的有1mL含氨苄青霉素和多肽表达诱导剂的NZCYM细菌培养液的无菌96深孔板中。将板密封，并在20℃下培养样品，以200rpm振荡约20h。在第3天，在4℃下以4000rpm使板离心10min。在倾析上清液后，向每个孔添加50μL含Tris-HCl、MgCl2、CaCl2和蛋白酶抑制剂的缓冲液，并通过在4℃下以200rpm振荡5min使细胞重新悬浮。然后将每个孔的内容物(即，细胞浆液)转移到PCR板并密封，然后在-80℃下冷冻过夜。冷冻细胞浆液在室温下解冻至多30min。如果解冻的混合物因为细胞裂解而不粘稠，使样品再次冷冻和解冻。当样品差不多解冻时，向每个孔添加25μL含DNase和MgCl2的结合缓冲液。在室温下培养PCR板5min，以500rpm振荡，直到样品不那么粘稠。最后，以4000rpm对样品离心5min，此后，使用上清液测量UGT活性，如实施例3中所述。
实施例3：UGT活性分析
通过制备根据表2的反应混合物，在体外筛选根据实施例2制备的UGT多肽样品对底物的活性，所述底物包括RebA、RebB、甜荼苷、甜菊醇、内根-贝壳杉烯酸和13-SMG。
表2：UGT活性分析的反应混合物。
在30℃下培养反应混合物过夜。通过添加30μL 100％DMSO使反应停止。根据实施例1，用90μL 50％DMSO进一步稀释所得混合物以进行LC-MS分析。形成两种产物，并在表3至表7(根据底物整理)中所示每种产物的曲线下面积(AUC)值。
表3：UGT对内根-贝壳杉烯酸的活性。
表4：UGT对甜菊醇的活性。
表5：UGT对13-SMG的活性。
表6：UGT对甜茶苷的活性。
表7：UGT对RebA的活性。
如表3至表7中所示，观察到UGT多肽对几种底物的19-O-糖基化、13-O-糖基化和糖基糖基化活性，导致形成内根-贝壳杉烯酸和甜菊醇的糖苷。
表8：UGT对13-SMG和内根-贝壳杉烯酸的活性。
如表8中所示，与UGT74G1(SEQ ID NO：4)相比，UDPG1(SEQ ID NO：185)和UGT75D1(SEQ ID NO：205)在体外从13-SMG产生的甜荼苷相对比从内根-贝壳杉烯酸产生的内根-贝壳杉烯酸+1Glc(#58)更多。
实施例4：菌株工程化和发酵
在产甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株中使用p416-GPD载体表达SA Gtase(SEQ ID NO：182，SEQ ID NO：183)，该菌株包含以下重组基因的一个或多个拷贝：编码GGPPS多肽(SEQID NO：19，SEQ ID NO：20)的重组基因、编码截短CDPS多肽(SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)的重组基因、编码KS多肽(SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52)的重组基因、编码KO多肽(SEQ IDNO：59，SEQ ID NO：60)的重组基因、编码ATR2多肽(SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：92)的重组基因、编码EUGT11多肽(SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16)的重组基因、编码KAH多肽(SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：94)的重组基因、编码CPR8多肽(SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：86)的重组基因、编码UGT85C2多肽(SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：149，SEQ IDNO：7)或SEQ ID NO：7的UGT85C2变体(或功能同源物)的重组基因、编码UGT74G1多肽(SEQID NO：3，SEQ ID NO：4)或SEQ ID NO：4的UGT74G1变体(或功能同源物)的重组基因、编码UGT76G1多肽(SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9)或SEQ ID NO：9的UGT76G1变体(或功能同源物)的重组基因、和编码UGT91D2e多肽(SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11)和SEQ ID NO：11的UGT91D2e变体(或功能同源物)(诸如UGT91D2e-b(SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13))的重组基因。
在30℃下在1mL合成完全(SC)尿嘧啶缺陷培养基中培养菌株五天，以400rpm振荡。将50μL每种培养物转移至50μL DMSO中，在80℃下培养10min，并以3220g离心5min。然后将15μL所得上清液转移至105μL 50％DMSO进行LC-MS分析，这是根据实施例1进行。对应于RebD和RebM的LC-MS衍生峰的归一化曲线下面积(AUC)值分别为约0.25μM/OD600和1.15μM/OD600。内根-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)和内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)的积聚水平分别为约200AUC/OD600、15AUC/OD600和1000AUC/OD600。13-SMG、RebA和Reb B的积聚水平分别为约4.8μM/OD600、2.5μM/OD600和0.25μM/OD600。甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或2)的积聚水平分别为约200AUC/OD600、15AUC/OD600、75AUC/OD600和750AUC/OD600。
虽然已经详细并通过参考具体实施方案描述了本发明，但应该了解，可能在不脱离随附权利要求书中所限定的本发明的范围的情况下进行修改和变化。更具体地，尽管本发明的一些方面在本文中被认定为特别有利，但是预期本发明不必限于本发明的这些特定方面。
表9.本文公开的序列。
SEQ ID NO：3
人工序列
SEQ ID NO：4
甜叶菊
SEQ ID NO：5
甜叶菊
SEQ ID NO：6
人工序列
SEQ ID NO：7
甜叶菊
SEQ ID NO：8
人工序列
SEQ ID NO：9
甜叶菊
SEQ ID NO：10
人工序列
SEQ ID NO：11
甜叶菊
SEQ ID NO：12
人工序列
SEQ ID NO：13
人工序列
SEQ ID NO：14
水稻(Oryza sativa)
SEQ ID NO：15
人工序列
SEQ ID NO：16
水稻
SEQ ID NO：17
人工序列
SEQ ID NO：18
人工序列
SEQ ID NO：19
甜叶菊
SEQ ID NO：20
甜叶菊
SEQ ID NO：21
人工序列
SEQ ID NO：22
藤仓赤霉
SEQ ID NO：23
人工序列
SEQ ID NO：24
小家鼠(Mus musculus)
SEQ ID NO：25
人工序列
SEQ ID NO：26
假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)
SEQ ID NO：27
人工序列
SEQ ID NO：28
棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)
SEQ ID NO：29
人工序列
SEQ ID NO：30
嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)
SEQ ID NO：31
人工序列
SEQ ID NO：32
聚球藻属物种(Synechococcus sp.)
SEQ ID NO：33
人工序列
SEQ ID NO：34
甜叶菊
SEQ ID NO：35
人工序列
SEQ ID NO：36
棒状链霉菌
SEQ ID NO：37
人工序列
SEQ ID NO：38
慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)
SEQ ID NO：39
人工序列
SEQ ID NO：40
玉米(Zea mays)
SEQ ID NO：41
人工序列
SEQ ID NO：42
拟南芥(Arabidopsis thaliana)
SEQ ID NO：43
人工序列
SEQ ID NO：44
甜叶菊
SEQ ID NO：45
人工序列
SEQ ID NO：46
甜叶菊
SEQ ID NO：47
人工序列
SEQ ID NO：48
玉米
SEQ ID NO：49
人工序列
SEQ ID NO：50
毛果杨(Populus trichocarpa)
SEQ ID NO：51
人工序列
SEQ ID NO：52
拟南芥
SEQ ID NO：53
人工序列
SEQ ID NO：54
桃拟茎点霉(Phomopsis amygdali)
SEQ ID NO：55
人工序列
SEQ ID NO：56
小立碗藓
SEQ ID NO：57
人工序列
SEQ ID NO：58
藤仓赤霉
SEQ ID NO：59
人工序列
SEQ ID NO：60
甜叶菊
SEQ ID NO：61
人工序列
SEQ ID NO：62
莴苣(Lactuca sativa)
SEQ ID NO：63
掌叶悬钩子(Rubus suavissimus)
SEQ ID NO：64
人工序列
SEQ ID NO：65
人工序列
SEQ ID NO：66
板栗(Castanea mollissima)
SEQ ID NO：67
人工序列
SEQ ID NO：68
盐芥(Thellungiella halophila)
SEQ ID NO：69
人工序列
SEQ ID NO：70
酿酒葡萄(Vitis vinifera)
SEQ ID NO：71
人工序列
SEQ ID NO：72
藤仓赤霉
SEQ ID NO：73
人工序列
SEQ ID NO：74
云芝(Trametes versicolor)
SEQ ID NO：75
人工序列
SEQ ID NO：76
拟南芥
SEQ ID NO：77
人工序列
SEQ ID NO：78
甜叶菊
SEQ ID NO：79
罗汉果(Siraitia grosvenorii)
SEQ ID NO：80
罗汉果
SEQ ID NO：81
人工序列
SEQ ID NO：82
藤仓赤霉
SEQ ID NO：83
甜叶菊
SEQ ID NO：84
甜叶菊
SEQ ID NO：85
人工序列
SEQ ID NO：86
甜叶菊
SEQ ID NO：87
人工序列
SEQ ID NO：88
掌叶悬钩子
SEQ ID NO：89
人工序列
SEQ ID NO：90
拟南芥
SEQ ID NO：91
人工序列
SEQ ID NO：92
拟南芥
SEQ ID NO：93
人工序列
SEQ ID NO：94
甜叶菊
SEQ ID NO：95
掌叶悬钩子
SEQ ID NO：96
人工序列
SEQ ID NO：97
掌叶悬钩子
SEQ ID NO：98
甜樱桃(Prunus avium)
SEQ ID NO：99
人工序列
SEQ ID NO：100
甜樱桃
SEQ ID NO：101
梅
SEQ ID NO：102
梅
SEQ ID NO：103
梅
SEQ ID NO：104
碧桃(Prunus persica)
SEQ ID NO：105
人工序列
SEQ ID NO：106
甜叶菊
SEQ ID NO：107
人工序列
SEQ ID NO：108
甜叶菊
SEQ ID NO：109
人工序列
SEQ ID NO：110
拟南芥
SEQ ID NO：111
人工序列
SEQ ID NO：112
酿酒葡萄
SEQ ID NO：113
人工序列
SEQ ID NO：114
蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)
SEQ ID NO：115
人工序列
SEQ ID NO：116
拟南芥
SEQ ID NO：117
掌叶悬钩子
SEQ ID NO：126
拟南芥
SEQ ID NO：127
拟南芥
SEQ ID NO：132
拟南芥
SEQ ID NO：133
拟南芥
SEQ ID NO：134
拟南芥
SEQ ID NO：135
拟南芥
SEQ ID NO：136
拟南芥
SEQ ID NO：137
拟南芥
SEQ ID NO：138
拟南芥
SEQ ID NO：139
拟南芥
SEQ ID NO：140
甜叶菊
SEQ ID NO：141
甜叶菊
SEQ ID NO：142
拟南芥
SEQ ID NO：143
拟南芥
SEQ ID NO：144
拟南芥
SEQ ID NO：145
拟南芥
SEQ ID NO：146
栀子花(Gardenia jasminoides)
SEQ ID NO：147
栀子花
SEQ ID NO：152
拟南芥
SEQ ID NO：153
拟南芥
SEQ ID NO：168
长春花(Catharanthus roseus)
SEQ ID NO：169
长春花
SEQ ID NO：172
拟南芥
SEQ ID NO：173
拟南芥
SEQ ID NO：176
抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)
SEQ ID NO：177
抗生链霉菌
SEQ ID NO：180
水稻
SEQ ID NO：181
水稻
SEQ ID NO：182
红花烟草(Nicotiana tabacum)
SEQ ID NO：183
红花烟草
SEQ ID NO：184
罗汉果
SEQ ID NO：185
罗汉果
SEQ ID NO：198
番红花(Crocus sativus)
SEQ ID NO：199
番红花
SEQ ID NO：200
番红花
SEQ ID NO：201
番红花
SEQ ID NO：202
拟南芥
SEQ ID NO：203
拟南芥
SEQ ID NO：204
拟南芥
SEQ ID NO：205
拟南芥
SEQ ID NO：206
拟南芥
SEQ ID NO：207
拟南芥
SEQ ID NO：208
长春花
SEQ ID NO：209
长春花
SEQ ID NO：210
番茄(Solanum lycopersicum)
SEQ ID NO：211
番茄
SEQ ID NO：212
人工序列
SEQ ID NO：213
甜叶菊

Claims (39)

1.一种能够生产一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的重组宿主细胞，其包含：
(a)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；
(b)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；
(c)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽的基因；和/或
(d)编码能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽的基因；
其中所述基因中至少一个是重组基因。
2.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中：
(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase多肽、UDPG1多肽、UN1671多肽、UGT74F1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽；
(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73C7多肽、UGT73E1多肽和/或UGT76E12多肽；
(c)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽是UGT73C6多肽、CaUGT3多肽、UN32491多肽和/或UN1671多肽；和/或
(d)能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT74D1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、UGT76E12多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase、UDPG1多肽、UGT74F1多肽、UGT75D1多肽、UGT84B2多肽、CaUGT2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽。
3.如权利要求2所述的重组宿主细胞，其中：
所述UGT73C1多肽包含与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，所述UGT73C3多肽包含与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，所述UGT73C5多肽包含与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，所述UGT73C6多肽包含与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，所述UGT73E1多肽包含与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，所述UGT74D1多肽包含与SEQ ID NO：143中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，所述UGT75B1多肽包含与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，所述UGT75L6多肽包含与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，所述UGT76E12多肽包含与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，所述OleI多肽包含与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，所述UGT5多肽包含与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽，所述SA Gtase多肽包含与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，所述UDPG1多肽包含与SEQ ID NO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，所述UN1671多肽包含与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％同一性的多肽，所述UGT74F1多肽包含与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，所述UGT75D1多肽包含与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，所述UGT84B2多肽包含与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性的多肽，所述UGT74F2样UGT多肽包含与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，所述UGT73C7多肽包含与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，所述CaUGT3多肽包含与SEQ ID NO：169中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，所述UN32491多肽包含与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽和/或所述CaUGT2多肽包含与SEQ ID NO：209中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞还包含：
(a)编码能够由法呢基二磷酸(FPP)和异戊烯二磷酸(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的多肽的基因；
(b)编码能够由GGPP合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；
(c)编码能够由内根-柯巴基二磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽的基因；
(d)编码能够由内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸的多肽的基因；
(e)编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；
(f)编码能够由内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；
(g)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；
(h)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；
(i)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；和/或
(k)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽的基因；
其中所述基因中至少一个是重组基因。
5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其中：
(a)能够合成GGPP的多肽包含与SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：116中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(b)能够合成内根-柯巴基二磷酸的多肽包含与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：120中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(c)能够合成内根-贝壳杉烯的多肽包含与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(d)能够合成内根-贝壳杉烯酸的多肽包含与SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：117、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74或SEQID NO：76中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(e)能够还原细胞色素P450复合物的多肽包含与SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ IDNO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(f)能够合成甜菊醇的多肽包含与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100、SEQID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114中所列氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(g)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：7中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(h)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’进行β1，3糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：9中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；
(i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：4中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；和/或
(k)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β1，2糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：11中所列氨基酸序列具有80％或更大同一性的多肽；与SEQ ID NO：13中所列氨基酸序列具有80％或更大同一性的多肽；或与SEQID NO：16中所列氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽。
6.如权利要求1-5中任一项所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少一个或多个重组基因的相应宿主而言，所述一个或多个重组基因的表达增加了所述细胞积聚的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的量。
7.如权利要求6所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少一个或多个重组基因的相应宿主而言，所述一个或多个重组基因的表达使所述细胞积聚的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的量增加至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约100％。
8.如权利要求6或7所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少一个或多个重组基因的相应宿主而言，所述一个或多个重组基因的表达增加了所述细胞积聚的内根-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、瑞鲍迪苷A(RebA)、瑞鲍迪苷B(RebB)、甜菊醇+4Glc(#36)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或内根-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)的量。
9.如权利要求1-8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体是以下各项，或其组合物包含以下各项：甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、瑞鲍迪苷A(RebA)、瑞鲍迪苷B(RebB)、瑞鲍迪苷C(RebC)、瑞鲍迪苷D(RebD)、瑞鲍迪苷E(RebE)、瑞鲍迪苷F(RebF)、瑞鲍迪苷M(RebM)、瑞鲍迪苷Q(RebQ)、瑞鲍迪苷I(RebI)、杜克苷A、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯醇、二糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊醇糖苷、四糖基化甜菊醇糖苷、五糖基化甜菊醇糖苷、六糖基化甜菊醇糖苷、七糖基化甜菊醇糖苷或其异构体。
10.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其中所述单糖基化内根-贝壳杉烯酸包含表1的KA1.58和/或所述五糖基化甜菊醇包含表1的化合物5.24。
11.如权利要求1-10所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。
12.一种在细胞培养物中生产一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的方法，所述方法包括在表达所述基因的条件下，在所述细胞培养物中培养如权利要求1-11中任一项所述的重组宿主细胞，且其中由所述重组宿主细胞生产所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述基因进行组成型表达和/或所述基因进行诱导型表达。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中相对于缺少一个或多个重组基因的相应宿主而言，所述重组宿主细胞积聚的内根-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、内根-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、13-SMG、RebA、RebB、甜菊醇+4Glc(#36)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或内根-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)的量增加至少约5％。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述细胞培养物分离由此生产的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述分离步骤包括：
(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得包含所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)提供一种或多种吸附树脂，包括在填充柱中提供所述吸附树脂；和
(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一种或多种吸附树脂接触，以获得至少一部分所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物，从而分离所生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物；
或
(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得包含所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)提供一种或多种离子交换或离子交换或反相色谱柱；和
(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一种或多种离子交换或离子交换或反相色谱柱接触，以获得至少一部分所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物，从而分离所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物；
或
(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得包含所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)结晶出或提取所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物，从而分离所生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
17.如权利要求12-14中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述细胞培养物回收所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物，其中所述细胞培养物相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或甜菊醇前体的糖苷或其组合物，且相对于植物衍生的甜叶菊提取物具有水平降低的甜叶菊植物衍生的组分。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述回收的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物以不同于从甜叶菊植物回收的甜菊醇糖苷组合物的相对量存在，且相对于植物衍生的甜叶菊提取物具有水平降低的甜叶菊植物衍生的组分。
19.一种用于生产一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的方法，其包括在利用以下基因的重组宿主细胞的细胞培养基中进行植物衍生的或合成的甜菊醇、甜菊醇前体和/或甜菊醇糖苷的全细胞生物转化：
(a)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽的基因；
(b)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽的基因；
(c)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽的基因；和/或
(d)编码能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽的基因；
其中所述多肽中的至少一种是在所述重组宿主细胞中表达的重组多肽；并由此生产所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中：
(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase多肽、UDPG1多肽、UN1671多肽、UGT74F1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽；
(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73C7多肽、UGT73E1多肽和/或UGT76E12多肽；
(c)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽是UGT73C6多肽、CaUGT3多肽、UN32491多肽和/或UN1671多肽；和/或
(d)能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽是UGT73C1多肽、UGT73C3多肽、UGT73C5多肽、UGT73C6多肽、UGT73E1多肽、UGT75B1多肽、UGT75L6多肽、UGT76E12多肽、OleI多肽、UGT5多肽、SA Gtase、UDPG1多肽、UGT74F1多肽、UGT75D1多肽、UGT84B2多肽和/或UGT74F2样UGT多肽。
21.如权利要求20所述的方法，其中：
所述UGT73C1多肽包含与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，所述UGT73C3多肽包含与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，所述UGT73C5多肽包含与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，所述UGT73C6多肽包含与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，所述UGT73E1多肽包含与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT74D1多肽包含与SEQ ID NO：143中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，所述UGT75B1多肽包含与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，所述UGT75L6多肽包含与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，所述UGT76E12多肽包含与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，所述OleI多肽包含与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，所述UGT5多肽包含与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽，所述SA Gtase多肽包含与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，所述UDPG1多肽包含与SEQ ID NO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，所述UN1671多肽包含与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％同一性的多肽，所述UGT74F1多肽包含与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，所述UGT75D1多肽包含与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，所述UGT84B2多肽包含与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性的多肽，所述UGT74F2样UGT多肽包含与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，所述UGT73C7多肽包含与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，所述CaUGT3多肽包含与SEQ ID NO：169中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，所述UN32491多肽包含与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，或所述CaUGT2多肽包含与SEQ ID NO：209中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽。
22.如权利要求12-21中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。
23.一种用于生产一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物的体外方法，所述方法包括将：
(a)与SEQ ID NO：7中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的UGT85C2多肽；
(b)与SEQ ID NO：9中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的UGT76G1多肽；
(c)与SEQ ID NO：4中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的UGT74G1多肽；
(d)UGT91D2功能同源多肽，其包含与SEQ ID NO：11中所列氨基酸序列具有90％或更大同一性的UGT91D2e多肽或与SEQ ID NO：13中所列氨基酸序列具有90％或更大同一性的UGT91D2e-b多肽；
(e)与SEQ ID NO：16中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的EUGT11多肽；和/或
(f)UGT73C1多肽包含与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C3多肽包含与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C5多肽包含与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C6多肽包含与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73E1多肽包含与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT74D1多肽包含与SEQ ID NO：143中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT75B1多肽包含与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75L6多肽包含与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，UGT76E12多肽包含与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，OleI多肽包含与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT5多肽包含与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽，SA Gtase多肽包含与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UDPG1多肽包含与SEQ IDNO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UN1671多肽包含与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％同一性的多肽，UGT74F1多肽包含与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75D1多肽包含与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT84B2多肽包含与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性的多肽，UGT74F2样UGT多肽包含与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT73C7多肽包含与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，CaUGT3多肽包含与SEQ ID NO：169中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UN32491多肽包含与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，或CaUGT2多肽包含与SEQ ID NO：209中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；
以及植物衍生的或合成的甜菊醇糖苷前体或植物衍生的或合成的甜菊醇前体添加至反应混合物；
其中所述多肽中的至少一种是重组多肽；和
由此生产所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述反应混合物包含：
(a)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(b)反应缓冲液和/或盐。
25.如权利要求12-24中任一项所述的方法，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体是以下各项，或其组合物包含以下各项：13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebM、RebQ、RebI、杜克苷A、单糖基化内根-贝壳杉烯酸、二糖基化内根-贝壳杉烯酸、三糖基化内根-贝壳杉烯酸、单糖基化内根-贝壳杉烯醇、二糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化内根-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊醇糖苷、四糖基化甜菊醇糖苷、五糖基化甜菊醇糖苷、六糖基化甜菊醇糖苷、七糖基化甜菊醇糖苷或其异构体。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述单糖基化内根-贝壳杉烯酸包含表1的KA1.58和/或所述五糖基化甜菊醇包含表1的化合物5.24。
27.一种包含如权利要求1-11中任一项所述的重组宿主细胞的细胞培养物，所述细胞培养物还包含：
(a)由所述重组宿主细胞生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物，
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和
(c)包含痕量金属、维生素、盐、酵母氮源(YNB)和/或氨基酸的补充营养物；
其中所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物是以至少1mg/升所述细胞培养物的浓度存在；
其中相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物，所述细胞培养物富含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或甜菊醇前体的糖苷或其组合物，且相对于植物衍生的甜叶菊提取物具有水平降低的甜叶菊植物衍生的组分。
28.一种来自生长在所述细胞培养物中的如权利要求1-11中任一项所述的重组宿主细胞的细胞裂解物，其包含：
(a)由所述重组宿主细胞生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物；
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(c)包含痕量金属、维生素、盐、酵母氮源、YNB和/或氨基酸的补充营养物；
其中由所述重组宿主细胞生产的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物是以至少1mg/升所述细胞培养物的浓度存在。
29.一种反应混合物，其包含：
(a)与SEQ ID NO：7中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的UGT85C2多肽；
(b)与SEQ ID NO：9中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的UGT76G1多肽；
(c)与SEQ ID NO：4中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的UGT74G1多肽；
(d)UGT91D2功能同源多肽，其包含与SEQ ID NO：11中所列氨基酸序列具有90％或更大同一性的UGT91D2e多肽或与SEQ ID NO：13中所列氨基酸序列具有90％或更大同一性的UGT91D2e-b多肽：
(e)与SEQ ID NO：16中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的EUGT11多肽；和/或
(f)UGT73C1多肽包含与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C3多肽包含与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C5多肽包含与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73C6多肽包含与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，UGT73E1多肽包含与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，UGT75B1多肽包含与SEQ ID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75L6多肽包含与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，UGT76E12多肽包含与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，OleI多肽包含与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT5多肽包含与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽，SA Gtase多肽包含与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UDPG1多肽包含与SEQ IDNO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UN1671多肽包含与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％同一性的多肽，UGT74F1多肽包含与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT75D1多肽包含与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽，UGT84B2多肽包含与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性的多肽，UGT74F2样UGT多肽包含与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽，UGT73C7多肽包含与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽，CaUGT3多肽包含与SEQ ID NO：169中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽，或UN32491多肽包含与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；
且还包含：
(g)一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体或其组合物；
(h)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(i)反应缓冲液和/或盐。
30.一种由如权利要求1-11中任一项所述的重组宿主细胞生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体的组合物；
其中由所述重组宿主细胞生产的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体以不同于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物的相对量存在，且相对于植物衍生的甜叶菊提取物具有水平降低的甜叶菊植物衍生的组分。
31.一种由如权利要求12-26中任一项所述的方法生产的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体的组合物；
其中由所述重组宿主细胞生产的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体以不同于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物的相对量存在，且相对于植物衍生的甜叶菊提取物具有水平降低的甜叶菊植物衍生的组分。
32.一种甜味剂组合物，其包含如权利要求30或31所述的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化甜菊醇前体。
33.一种食物产品，其包含如权利要求32所述的甜味剂组合物。
34.一种饮料或饮料浓缩物，其包含如权利要求32所述的甜味剂组合物。
35.一种编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽或其催化活性部分的分离核酸分子，其中所述编码的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基位置糖基化的多肽或其催化活性部分与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ IDNO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性，与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％序列同一性，与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性，与SEQ ID NO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％序列同一性，与SEQ ID NO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性，或与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性。
36.一种编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分的分离核酸分子，其中所述编码的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：139中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ IDNO：141中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，或与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性。
37.一种编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽或其催化活性部分的分离核酸分子，其中所述编码的能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’进行β-1，2-糖基化和/或C3’进行β-1，3-糖基化的多肽或其催化活性部分与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ IDNO：169中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：199中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，或与SEQ ID NO：201中所列氨基酸序列具有至少45％序列同一性。
38.一种编码能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分的分离核酸分子，其中所述编码的能够使甜菊醇前体在其C-19羧基或C-19羟基位置糖基化的多肽或其催化活性部分与SEQ ID NO：127中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：133中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：135中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：137中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：141中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQID NO：145中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：147中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：153中所列氨基酸序列具有至少60％序列同一性，与SEQ ID NO：177中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性，与SEQ ID NO：181中所列氨基酸序列具有至少65％序列同一性，与SEQ ID NO：183中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性，与SEQ ID NO：185中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ IDNO：203中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：205中所列氨基酸序列具有至少50％序列同一性，与SEQ ID NO：207中所列氨基酸序列具有至少40％序列同一性，或与SEQ ID NO：211中所列氨基酸序列具有至少55％序列同一性。
39.如权利要求35-38中任一项所述的分离核酸，其中所述核酸是cDNA。
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