CN109453123B

CN109453123B - 一种康普瑞汀类衍生物冻干粉针及其制备方法

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Publication number: CN109453123B
Application number: CN201811372794.9A
Authority: CN
Inventors: 周建平; 丁杨; 袁洲
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2038-11-19
Also published as: WO2020103175A1; CN109453123A

Abstract

本发明公开了一种康普瑞汀类衍生物冻干粉针及其制备方法。所述冻干粉针由康普瑞汀衍生物磷脂复合物、稳定剂和冻干保护剂构成，制备方法包括：康普瑞汀衍生物磷脂复合物的制备；高压均质；冷冻干燥。冻干粉针溶解于5％葡萄糖或0.9％生理盐水注射液中使用，可用于静脉注射、滴注或直接口服以治疗非小细胞肺癌、肝癌、结肠癌。本发明制备的冻干粉针药脂比高，毒副作用小，可改善康普瑞汀类衍生物的亲水性和亲脂性，具有一定缓释效果和被动靶向，能提高口服生物利用度，降低静脉给药剂量，减毒增效，复溶性良好，且该制备方法工艺过程简单，易于工业化生产。

Description

一种康普瑞汀类衍生物冻干粉针及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂及其制备技术领域，具体涉及一种康普瑞汀类衍生物冻干粉针及其制备方法。

背景技术

康普瑞汀(Combretastatin)是从非洲灌木矮柳树的树皮中分离的一种顺式二苯乙烯类天然产物，其中Combretastatin A4(以下简称为CA4)是所有结构中细胞毒性最强、结构最简单的一种化合物，其具有顺式碳碳双键连接臂连接的3，4，5－三甲氧基取代的苯环和3－羟基－4－甲氧基取代苯环的基本结构。CA4的抗肿瘤机制主要为抑制微管蛋白聚合，诱导细胞凋亡和对抗肿瘤血管作用，作用靶点与秋水仙碱类似，而活性明显优于秋水仙碱。

但是CA4水溶性和脂溶性差，且其顺式二苯乙烯结构活性更强但不稳定，因此目前主要进行3个方面的结构修饰：①修饰A环结构；②修饰B环结构；③修饰碳碳双键桥连键结构。通过结构修饰得到活性更强的CA4衍生物，起效剂量低，使用时毒副作用较小，具有巨大的临床应用前景。所述CA4衍生物，其母核结构为：

其中：A为N、O或S；R3优选自具有苯基、羟基、氨基等能与磷脂形成范德华力、氢键等作用的结构。其中根据专利CN201110422678，优选活性结构为结构1:4-(3,5-二甲氧基)-5-(4-甲氧苯基)噁唑、结构2:2-苯基-4-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-(4-吡啶基)噻唑、结构3:4-(3,5-二甲氧苯基)-5-(3-羟基-4-甲氧基苯基)咪唑。

但是CA4衍生物的水溶性仍极差，限制了它们的临床应用，因此设计和制备其水溶性衍生物前药是目前的研究热点。至今国内外文献报道的CA4衍生物的研究多局限于设计和合成其磷酸盐前药。美国OxiGene公司设计并合成了其磷酸盐前药CA4磷酸盐(combretastatin A4 phosphate,CA4P)，目前已经进入临床实验研究阶段。虽然CA4P提高了CA4的水溶性，但其在水溶液中不能稳定贮存，因此需制备为冻干粉针储存，其冻干粉针存在以下几个方面的缺陷：①CA4P冻干粉复溶后易产生降解，稳定性差；②磷酸盐形式脂溶性较差，不易进入细胞而发挥药效，起效剂量高；③体内毒副作用大，静脉内给药后即降解速释，消除快，不具有缓释效果；④局限于静脉内给药，不具备口服给药的便利和顺应性。

此外，将药物直接制成脂质体、固体分散纳米粒、聚合胶束等新型制剂的方法虽可改善药物本身，但存在载药量低，包封率不稳定等问题，其相应的冻干粉针存在相似问题，且制备工艺、辅料用量、辅料安全性及储存等方面也会存在不足。

现有专利中，未见康普瑞汀类衍生物磷脂复合物相关发明。

发明内容

本发明的一个目的是为解决康普瑞汀类衍生物冻干粉针的上述缺陷,提供一种康普瑞汀类衍生物磷脂复合物。

本发明的又一个目的是提供一种康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针及其制备方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种康普瑞汀类衍生物磷脂复合物由康普瑞汀类衍生物与磷脂构成，康普瑞汀类衍生物与磷脂的摩尔比为2:1～1:10，优选为1:3。

其中康普瑞汀类衍生物为A环含4位取代的3，5-二甲氧基苯基的咪唑、噁唑及噻唑类CombretastatinA4衍生物，优选具有苯基，羟基，氨基等能与磷脂形成范德华力、氢键等作用的结构，优选4-(3,5-二甲氧基)-5-(4-甲氧苯基)噁唑、2-苯基-4-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-(4-吡啶基)噻唑、4-(3,5-二甲氧苯基)-5-(3-羟基-4-甲氧基苯基)咪唑,进一步优选4-(3,5-二甲氧苯基)-5-(3-羟基-4-甲氧基苯基)咪唑。

其中磷脂选自天然来源的磷脂与合成来源磷脂；所述天然来源的磷脂优选大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、神经鞘磷脂、丝氨酸磷脂；所述合成来源磷脂优选氢化磷脂、PMPC、DPPC、DMPC、DPPE、DSPE、DPPSA、及其结构修饰的类似物。

本发明所述的康普瑞汀类衍生物磷脂复合物在制备康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针中的应用。

一种康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针，由所述的康普瑞汀类衍生物磷脂复合物、稳定剂和冻干保护剂构成。

其中稳定剂选自泊洛沙姆188、聚山梨醇80、聚山梨醇20或磷脂及其任意组合。

其中冻干保护剂选自甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖、山梨醇或蔗糖及其任意组合。

一种所述的康普瑞汀衍生物冻干粉针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将康普瑞汀类衍生物与磷脂溶于有机溶剂(a)中，控制反应浓度为0.5～20mg/mL，并于0～100℃温度下静置复合大于0.5h；

(2)将复合所用的有机溶剂(a)采用减压蒸发和真空干燥方法除去，得到康普瑞汀类衍生物磷脂复合物固体；

(3)将康普瑞汀类衍生物磷脂复合物分散到溶有稳定剂和冻干保护剂的注射用水中，高压均质，过膜，冷冻干燥；其中,冻干溶液各组份重量百分比为康普瑞汀类磷脂复合物0.1％～2.0％，稳定剂0～10％，冻干保护剂2～10％。

所述反应溶剂(a)优选选自芳烃、卤素衍生物、环醚、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇中的一种或多种，优选为乙醇。

其中反应浓度优选为3mg/mL，反应温度优选为25℃，复合时间优选为12h。

该法制备的康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针可复溶于5％葡萄糖或0.9％生理盐水注射液中，复溶后粒径优选为180.7±23.9nm，PDI为0.108±0.021。

本发明康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针溶解于5％葡萄糖或0.9％生理盐水注射液中使用，可用于静脉注射、滴注或直接口服以治疗非小细胞肺癌、肝癌、结肠癌。

本发明提供的康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针，具有以下优点：

1、制备工艺简单，引入有机溶剂毒性低，适于工业生产；

2、与脂质体相比，相同的摩尔数可以装载更多CA4衍生物，载药量高，降低磷脂用量；

3、磷脂分子与特定的CA4衍生物分子的缔和作用降低药物的泄漏率；

4、磷脂结构具有两亲性，与CA4衍生物相比，能明显提高CA4衍生物磷脂复合物的亲水性和亲脂性，类脂膜能提高细胞对药物的摄取；

5、CA4衍生物磷脂复合物口服给药，与CA4衍生物磷酸盐相比，可提高口服生物利用度；

6、CA4衍生物磷脂复合物静脉注射给药，与CA4衍生物磷酸盐相比，制备和储存过程中稳定性好，具有一定的缓释效果和pH响应，且纳米粒具有一定的被动靶向作用，可降低给药剂量，提高药效，克服CA4衍生物磷酸盐用药剂量高的缺陷；

7、CA4衍生物磷脂复合物能明显降低CA4衍生物口服及CA4衍生物磷酸盐静脉注射的刺激性。

附图说明

图1：康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针的体外释放测定。

图2：康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针细胞摄取测定。

图3：康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针细胞毒性测定。

图4：康普瑞汀类衍生物磷脂复合物口服生物利用度测定。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进一步详细的说明。应当理解，此处所述的具体实施例用以说明本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例1

精密称取摩尔质量比2:1康普瑞汀类衍生物(4-(3,5-二甲氧基)-5-(4-甲氧苯基)噁唑)和大豆卵磷脂于50mL圆底烧瓶中，加入5mL丙酮，控制药物浓度为20mg/mL，搅拌至完全溶解后，30℃下静置复合1h后，抽真空干燥得康普瑞汀类衍生物磷脂复合物，测定复合率为50％。

实施例2

精密称取摩尔质量比2:1康普瑞汀类衍生物(2-苯基-4-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-(4-吡啶基)噻唑)和大豆卵磷脂于50mL圆底烧瓶中，加入200mL丙酮，控制药物浓度为0.5mg/mL，搅拌至完全溶解后，35℃下静置复合2h后，抽真空干燥得康普瑞汀类衍生物磷脂复合物，测定复合率为72％

实施例3

精密称取摩尔质量比1:1康普瑞汀类衍生物(4-(3,5-二甲氧苯基)-5-(3-羟基-4-甲氧基苯基)咪唑)和蛋黄卵磷脂于50mL圆底烧瓶中，控制药物浓度为3mg/mL，加入30mL苯，搅拌至完全溶解后，40℃下静置复合2h后，抽真空干燥得康普瑞汀类衍生物磷脂复合物，测定复合率为62％。

实施例4

精密称取摩尔质量比1:2康普瑞汀类衍生物(4-(3,5-二甲氧苯基)-5-(3-羟基-4-甲氧基苯基)咪唑)和蛋黄卵磷脂于50mL圆底烧瓶中，控制药物浓度为2mg/mL，加入40mL乙醇，搅拌至完全溶解后，50℃下静置复合2h后，抽真空干燥得康普瑞汀类衍生物磷脂复合物，测定复合率为62％。

实施例5

精密称取摩尔质量比1:4康普瑞汀类衍生物(4-(3,5-二甲氧苯基)-5-(3-羟基-4-甲氧基苯基)咪唑)和脑磷脂于50mL圆底烧瓶中，加入35mL氯仿，控制药物浓度为2.5mg/mL,搅拌至完全溶解后，20℃下静置复合12h后，抽真空干燥得康普瑞汀类衍生物磷脂复合物，测定复合率为53％。

实施例6

精密称取摩尔质量比1:3康普瑞汀类衍生物(4-(3,5-二甲氧苯基)-5-(3-羟基-4-甲氧基苯基)咪唑)和蛋黄卵磷脂于50mL圆底烧瓶中，加入30mL乙醇，控制药物浓度为3mg/mL,搅拌使其完全溶解，25℃下静置复合12h后，抽真空干燥得康普瑞汀类衍生物磷脂复合物，测定复合率为97％。

实施例7

称取康普瑞汀类衍生物磷脂复合物(实施例1)100mg，Poloxamer 188 500mg(5％),葡萄糖200mg(2％)，溶解分散于10mL注射用水中，高压均质后灌装于10mL西林瓶中，冷冻干燥，冻干粉外观塌陷，测定复溶后粒径为242.1±36.9nm。

实施例8

称取康普瑞汀类衍生物磷脂复合物(实施例2)100mg，Tween-80 200mg(2％)，乳糖500mg(5％)，溶解分散于10mL注射用水中，高压均质后灌装于10mL西林瓶中，冷冻干燥，冻干粉外观较蓬松，测定复溶后粒径为221.6±45.6nm。

实施例9

称取康普瑞汀类衍生物磷脂复合物(实施例6)100mg，Poloxamer 188 300mg(3％)，甘露醇500mg(5％)，溶解分散于10mL注射用水中，高压均质后灌装于10mL西林瓶中，冷冻干燥，冻干粉外观成型，测定复溶后粒径为180.7±23.9nm。

实施例10

溶解度和表观油水分配系数的测定

采用摇瓶法(GB/T 21853-2008)测定，分别量取正辛醇预饱和的水20mL置磨口三角瓶中，各3份，分别加入过量的康普瑞汀类衍生物4-(3,5-二甲氧苯基)-5-(3-羟基-4-甲氧基苯基)咪唑和实施例6所述康普瑞汀类衍生物磷脂复合物，25℃振摇12h至溶解平衡，移至离心管中，2000×g离心20min。取上层液10mL，各置磨口三角瓶中，分别加入正辛醇10mL，于25℃振摇至溶解平衡，2000×g离心20min。分别移取水相、正辛醇相2mL置10mL量瓶中，用甲醇定容，测定康普瑞汀类衍生物和康普瑞汀类衍生物磷脂复合物在正辛醇一水系统中的溶解度。见表1。结果显示，康普瑞汀类衍生物磷脂复合物水中溶解度提高约8倍，LogP提高约1.2倍。

表1康普瑞汀类衍生物及其磷脂复合物在正辛醇一水系统中的溶解度

实施例11

体外释放测定。

分别取1mL康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针(实施例6)复溶物置于透析袋内，满足漏槽条件，两端用密封夹封口，分别放入200mL释放介质中，释放介质为含1％Tween80的pH7.4、pH6.6和pH5.5的PBS缓冲液，在37℃，100rmp搅拌下考察其释放情况。C118P组分别于5min、10min、15min、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h，分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h，取2mL释放介质，同时补充等体积新鲜的37℃释放介质，样品过0.22μm滤膜，LC-MS进样，记录峰面积，计算各时间点的累积释放度，绘制释放曲线。见图1。结果显示，康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉制剂组体外释放模型在pH 7.4和pH 6.6条件下符合药物释放一级动力学，pH 5.5条件下符合零级动力学，药物释放具有较明显的缓释效果和pH响应现象，可预见制剂在体内的药物释放具有缓释和肿瘤组织富集能力。

实施例12

细胞药效学测定

细胞摄取：设置空白、康普瑞汀类衍生物、康普瑞汀类衍生物磷酸盐、康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针(实施例9制备)四组。取对数生产期的A549细胞以5×10⁶个/孔接种于6孔板中，完全培养液37℃细胞培养箱中培养24h，使其贴壁，弃去原有培养基，用不含血清的培养液孵育15min，每孔加入1500μL(含DMSO 0.0375μL)用无血清培养基稀释成25nM药物有效浓度，设置对照组加入1500μL(含DMSO 0.0375μL)不含药物的无血清培养基，于37℃孵育，考察摄取率与摄取时间的关系。孵育不同的时间(1h、2h、3h)，观察细胞形态和密度，快速弃去培养基，加入4℃PBS终止细胞摄取，并冲洗细胞3遍。加入200μL细胞裂解液于冰浴中震荡30min破碎细胞，12000×g离心15min，吸取20μL上清液，BCA蛋白定量，取50μL上清液，加入甲醇200μL，涡旋3min，12000×g离心5min，取上清液100uL，LC-MS测定药物含量(所有组别n＝3)。。见图2。结果显示，康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针组细胞摄取量高于原料药和磷酸盐组，且具有显著性，说明康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针由于其亲脂特性更易被细胞摄取利用。

细胞毒性：取对数生产期的A549细胞，以1×10⁵个/孔接种于96孔板中，完全培养基37℃培养24h，移去培养基，每孔加入100μL无血清培养基稀释的不同浓度的对应组别(药物浓度为2.5、5、10、25、50、100nM)，于37℃孵育24h后，每孔加入20μL的5mg/mL的MTT溶液。于37℃孵育4h后，弃去培养基，加入100μL的DMSO，振摇10min以溶解甲瓒结晶，采用酶标仪与570nm处测定吸光度，计算细胞存活率。康普瑞汀类衍生物磷脂复合物细胞毒性强。见图3。结果显示，康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针IC₅₀在24h和48h各浓度下均低于原料药和磷酸盐组，且均有显著性，说明康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针的细胞毒性强于康普瑞汀类衍生物磷酸盐冻干粉针，可提高康普瑞汀类衍生物药物疗效，降低康普瑞汀类衍生物的临床给药剂量。

实施例13

口服生物利用度测定

选取大鼠18只，随机分成康普瑞汀衍生物组、普通混合物组、康普瑞汀类衍生物磷脂复合物组(实施例6制备)。禁食12h后，以50mg/kg的剂量灌胃，给药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36h眼底静脉丛采全血0.3mL，置于肝素钠试管中，10000rpm离心10min，取上层血浆检测康普瑞汀类衍生物的浓度。见图4。结果显示，康普瑞汀类衍生物磷脂复合物组与原料药组相比口服生物利用度提高约7倍，半衰期延长约5倍，口服给药，克服了康普瑞汀类衍生物磷酸盐类药物只限于静脉给药的缺陷。

Claims

1.一种康普瑞汀类衍生物磷脂复合物，其特征在于，由康普瑞汀类衍生物和磷脂构成，其中康普瑞汀类衍生物和磷脂的摩尔比为2:1～1:10；所述的康普瑞汀类衍生物选自4-(3,5-二甲氧苯基)-5-(4-甲氧苯基)噁唑、2-苯基-4-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5-(4-吡啶基)噻唑或4-(3,5-二甲氧苯基)-5-(3-羟基-4-甲氧基苯基)咪唑。

2.根据权利要求1所述的康普瑞汀类衍生物磷脂复合物，其特征在于，所述康普瑞汀类衍生物为4-(3,5-二甲氧苯基)-5-(3-羟基-4-甲氧基苯基)咪唑。

3.根据权利要求1所述的康普瑞汀类衍生物磷脂复合物，其特征在于，所述磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、神经鞘磷脂、丝氨酸磷脂。

4.权利要求1-3中任一项所述的康普瑞汀类衍生物磷脂复合物在制备康普瑞汀类衍生物磷脂复合物冻干粉针中的应用。

5.一种康普瑞汀类衍生物冻干粉针，其特征在于，由权利要求1-3中任一项所述的康普瑞汀类衍生物磷脂复合物、稳定剂和冻干保护剂构成。

6.根据权利要求5所述的康普瑞汀类衍生物冻干粉针，其特征在于，所述稳定剂选自泊洛沙姆188、聚山梨醇80、聚山梨醇20中的一种或多种。

7.根据权利要求5所述的康普瑞汀类衍生物冻干粉针，其特征在于，所述冻干保护剂选自甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖、山梨醇或蔗糖中的一种或多种。

8.一种权利要求5所述的康普瑞汀衍生物冻干粉针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将康普瑞汀类衍生物与磷脂溶于有机溶剂（a）中，控制反应浓度为0.5~20 mg/mL，并于0~100 ℃温度下静置复合大于0.5 h；

（2）将复合所用的有机溶剂（a）采用减压蒸发和真空干燥方法除去，得到康普瑞汀类衍生物磷脂复合物固体；

（3）将康普瑞汀类衍生物磷脂复合物分散到溶有稳定剂和冻干保护剂的注射用水中，高压均质，过膜，冷冻干燥即得所述的康普瑞汀衍生物冻干粉针;其中冻干溶液各组份重量百分比为康普瑞汀类磷脂复合物0.1～2.0%，稳定剂0～10%，冻干保护剂2～10%，余量为注射用水。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂（a）选自芳烃、环醚、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇中的一种或多种。