CN102133184A

CN102133184A - 一种淫羊藿素脂质体及其制备方法

Info

Publication number: CN102133184A
Application number: CN 201110061635
Authority: CN
Inventors: 李君�; 严以群; 殷正丰; 郑肖利; 熊俊峰; 李娟�; 晏建军; 黄亮
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2011-03-15
Filing date: 2011-03-15
Publication date: 2011-07-27

Abstract

本发明提供了一种淫羊藿素脂质体制剂及其制备方法，主要含有0.01～5％(质量比)淫羊藿素、0.05～8％(质量比)磷脂、0～8％(质量比)增塑材料、0～20％(质量比)支撑剂，余量为注射用水。将淫羊藿素，磷脂完全溶于有机溶剂后采用旋转薄膜蒸发法使有机溶剂挥发完全；加入注射用水，在常压状态下继续旋转直至薄膜完全水化；经乳化得到初乳，将所述初乳超声、匀浆后，采用注射用水定容；将pH调节为4-8，即可得到淫羊藿素脂质体注射液制剂。进一步进行真空冷冻干燥即可得到淫羊藿素脂质体粉针制剂。本发明的淫羊藿素脂质体制剂，使淫羊藿素治疗具有较好的肝脏靶向性，并且提高了药物的稳定性和生物利用度。

Description

一种淫羊藿素脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种淫羊藿素脂质体及其制备方法。

背景技术

淫羊藿素(Icaritin)，如图1所示，分子式C₂₁H₂₀O₆，分子量368，是从天然植物淫羊藿(Epmedium)中所提取的黄酮类单体化合物。近年来大量研究表明淫羊藿素具有诱导细胞增殖分化、扩张心脑血管、抗肿瘤、类雌激素、提高性机能、保护神经变性损伤以及抗骨质疏松等多方面功用。尤其在《淫羊藿素减轻急性肝损伤及其分子机制研究》(刘鹏，医药卫生科技，2009年)一文中，作者采用多种方法证实了淫羊藿素的抗自由基氧化以及抑制肝细胞凋亡作用，初步阐释了淫羊藿素防治急性肝损伤的作用机制，为其或应用于临床提供了一定的理论依据。

目前由天然植物中所提取的淫羊藿素仅存在粉剂，检索相关文献和信息后未发现该化合物脂质体剂型的报道。由于该化合物极难溶于水，大多数体内研究被限制于仅能以口服或灌胃的方式进行。虽然此法简单易行、操作方便，但仍存在着许多不可忽视的弊端，例如：进入胃肠道的药物不可避免的受到肝脏首过消除效应的干扰，大大降低治疗指数；胃肠道功能以及胃肠内容物都能大大影响药物治疗功效或表现出较差的疗效稳定性；口服给药通常吸收较慢，对于器官或组织的急性损伤疗效欠佳。相反，脂质体具有得天独厚的优势：首先它本身为磷脂双分子结构，可与水以任意比例溶解；能够使被包封的药物具有较好的稳定性；对病变组织和器官具有靶向治疗作用，并在相当程度上可降低药物毒副作用。如上特点使得脂质体在制剂领域中得到日益广泛应用，其重要性也为药剂研究的众多学者所认同。因此需要开发一种淫羊藿素脂质体新剂型来克服现有技术的缺陷。

发明内容

脂质体可选择性地聚集于单核吞噬细胞系统，大部分集中于肝、脾等部位。使得给药后，肝脏中的浓度能够大大提高，同时明显降低药物对其他脏器和组织的毒性。使得其在肝脏疾病的治疗中能够发挥较其他剂型更好的疗效，同时减少了药物的用量及毒副作用，体现出一定的药物经济学价值。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种淫羊藿素脂质体新剂型，增加其生物利用度。

本发明的另一个目的在于提供该淫羊藿素脂质体制剂的制备方法。

本发明提供的淫羊藿素脂质体制剂，主要含有0.01～5％(质量比)淫羊藿素、0.05～8％(质量比)磷脂、0～8％(质量比)增塑材料、0～20％(质量比)支撑剂，余量为注射用水。

此外，所述淫羊藿素脂质体制剂还含有pH调节剂，用于将所述淫羊藿素脂质体制剂的pH调节为4～8。

其中，所述磷脂选自但不局限于大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱中的一种或几种。

所述增塑材料为洛罗沙姆、聚氧乙烯蓖麻油缩合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油缩合物和聚山梨醇酯、胆固醇中的一种或几种。其中，聚氧乙烯蓖麻油缩合物选自聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚氧乙烯(60)蓖麻油；聚氧乙烯氢化蓖麻油缩合物选自聚氧乙烯(35)氢化蓖麻油、聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80。

所述pH调节剂为盐酸、氢氧化钠、冰醋酸、醋酸钠、磷酸、枸橼酸、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠中的一种或几种。

所述支撑剂为注射用溶剂、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、氯化钠、聚乙烯吡咯烷酮、白蛋白、右旋糖酐中的一种或几种。

本发明提供的淫羊藿素脂质体制剂的制备方法，包括以下步骤：

(a)、将淫羊藿素，磷脂完全溶于有机溶剂；

(b)、采用旋转薄膜蒸发法使所述有机溶剂挥发完全；

(c)、加入注射用水，在常压状态下继续旋转直至薄膜完全水化；

(d)、经乳化得到初乳，将所述初乳超声、匀浆后，采用注射用水定容；

(e)、将pH调节为4-8，即可得到淫羊藿素脂质体注射液制剂。

根据本发明，所述步骤(a)中还可以将增塑材料溶于所述有机溶剂中。

本发明提供的淫羊藿素脂质体制剂的制备方法，还包括步骤：

(f)、将淫羊藿素脂质体制剂进行真空冷冻干燥，得到淫羊藿素脂质体粉针剂，且在所述步骤(d)中采用注射用水定容后加入支撑剂。

其中，所述有机溶剂为氯仿、甲醇、二氯甲烷、乙醚、无水乙醇、丙酮、四氢呋喃或乙酸乙酯，可单独或混合使用。

本发明的淫羊藿素脂质体制剂具有下述优点：

1.使淫羊藿素治疗具有天然靶向性。其脂质体能选择性集中于单核吞噬细胞系统，大部分集中于肝即高度靶向肝脏，对淫羊藿素抗氧化、抑制肝细胞凋亡以及修复肝脏急性损伤等具有靶向性优势。

2.脂质体将药物包裹在脂质双分子中间，可避免光线、氧气、酸、碱等不稳定因素对淫羊藿的破坏，从而提高药物的稳定性。另外，脂质体粉针是固体制剂，可解决普通脂质体的聚集、沉降、融合、渗漏等的不稳定性问题。

附图说明

图1为淫羊藿素的结构式。

图2为采用SD大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型检测的实验流程图。

图3为血清ALT含量检测结果。

图4为肝组织中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量检测结果。

图5为肝细胞凋亡指数(apoptosis index，AI)检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明方法的范围并不局限于下述的实例。

实施例1：淫羊藿素脂质体注射液的制备

步骤1：称取淫羊藿素1g，大豆卵磷脂20g及胆固醇2.5g置圆底烧瓶内；

步骤2：加入适量8ml乙醇和4ml氯仿组成的混合液至上述混合物中使完全溶解成澄明溶液，以旋转薄膜蒸发法在65℃条件下减压干燥约4小时将有机溶剂挥发完全；

步骤3：加800ml注射用水，在常压状态下继续旋转直至薄膜完全水化；

步骤4：用剪切乳化器乳化5分钟(转速2000转/分)，得初乳，将初乳用微射流高压均质机均化(压力9000psi)三次，注射用水定容至1000ml；

步骤5：以磷酸二氢钾缓冲液调节pH为5.0，分装于安瓿(或西林瓶)内，消毒，即得淫羊藿素注射用脂质体。

实施例2：淫羊藿素脂质体注射液的制备

步骤1：称取淫羊藿素1g，蛋黄卵磷脂30g，胆固醇30g及5g聚山梨醇酯80置圆底烧瓶内；

步骤2：加入30ml氯仿至上述混合物中使完全溶解成澄明溶液，以旋转薄膜蒸发法在70℃条件下减压干燥约2小时将有机溶剂挥发完全；

步骤3：加600ml注射用水，在常压状态下继续旋转直至薄膜完全水化；

步骤4：用剪切乳化器乳化3分钟(转速3000转/分)，得初乳，将初乳用微射流高压均质机均化(压力8000psi)三次，注射用水定容至1000ml；

步骤5：以磷酸二氢钠缓冲液调节pH为6.0，分装于安瓿(或西林瓶)内，消毒，即得淫羊藿素注射用脂质体。

实施例3：淫羊藿素脂质体注射液的制备

步骤1：称取淫羊藿素4g，大豆卵磷脂10g置圆底烧瓶内；

步骤2：加入15ml氯仿至上述混合物中使完全溶解成澄明溶液，以旋转薄膜蒸发法在75℃条件下减压干燥约3小时将有机溶剂挥发完全；

步骤3：加200ml注射用水，在常压状态下继续旋转直至薄膜完全水化；

步骤4：用剪切乳化器乳化4分钟(转速1000转/分)，得初乳，将初乳用超声波仪超声10分钟，注射用水定容至1000ml；

步骤5：以冰醋酸调节pH为4.5，分装于安瓿(或西林瓶)内，消毒，即得淫羊藿素注射用脂质体。

实施例4：淫羊藿素脂质体注射液的制备

步骤1：称取淫羊藿素5g，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱20g，胆固醇15g置圆底烧瓶内；

步骤2：加入30ml乙醇至上述混合物中使完全溶解成澄明溶液，以旋转薄膜蒸发法在85℃条件下减压干燥约4小时将有机溶剂挥发完全；

步骤3：加500ml注射用水，在常压状态下继续旋转直至薄膜完全水化；

步骤4：用剪切乳化器乳化6分钟(转速1000转/分)，得初乳，将初乳用微射流高压均质机均化(压力4000psi)三次，注射用水定容至1000ml；

步骤5：以磷酸氢二钾调节pH为6.5，分装于安瓿(或西林瓶)内，消毒，即得淫羊藿素注射用脂质体。

实施例5：淫羊藿素脂质体注射液的制备

步骤1：称取淫羊藿素5g，蛋黄卵磷脂5g，聚氧乙烯(35)蓖麻油5g，泊罗沙姆(F68)10g置圆底烧瓶内；

步骤2：加入适量10ml氯仿和30ml四氢呋喃氯仿组成的混合液至上述混合物中使完全溶解成澄明溶液，以旋转旋转薄膜蒸发法在70℃条件下减压干燥约4小时将有机溶剂挥发完全；

步骤3：加400ml注射用水，在常压状态下继续旋转直至薄膜完全水化；

步骤4：用剪切乳化器乳化7分钟(转速1000转/分)，得初乳，将初乳用超声波仪超声10分钟，注射用水定容至1000ml；

步骤5：以磷酸氢二钠调节pH为6.5，分装于安瓿(或西林瓶)内，消毒，即得淫羊藿素注射用脂质体。

实施例6：淫羊藿素脂质体注射液的制备

步骤1：称取淫羊藿素8g，大豆卵磷脂10g置圆底烧瓶内；

步骤2：加入适量15ml乙醇和15ml丙酮氯仿组成的混合液至上述混合物中使完全溶解成澄明溶液，以旋转薄膜蒸发法在85℃条件下减压干燥约5小时将有机溶剂挥发完全；

步骤4：用剪切乳化器乳化7分钟(转速4000转/分)，得初乳，将初乳用超声波仪超声15分钟，注射用水定容至1000ml；

步骤5：以磷酸氢二钾调节pH为5.5，分装于安瓿(或西林瓶)内，消毒，即得淫羊藿素注射用脂质体。

实施例7：淫羊藿素脂质体注射液的制备

步骤1：称取淫羊藿素0.2g，二硬脂酰磷脂酰胆碱0.1g，胆固醇0.1g，置圆底烧瓶内；

步骤2：加入10ml甲醇至上述混合物中使完全溶解成澄明溶液，以旋转薄膜蒸发法在75℃条件下减压干燥约3小时将有机溶剂挥发完全；

步骤3：加150ml注射用水，在常压状态下继续旋转直至薄膜完全水化；

步骤4：用剪切乳化器乳化7分钟(转速3000转/分)，得初乳，将初乳用微射流高压均质机均化(压力4000psi)三次，注射用水定容至1000ml；

步骤5：以磷酸氢二钾调节pH为7.0，分装于安瓿(或西林瓶)内，消毒，即得淫羊藿素注射用脂质体。

实施例8：淫羊藿素脂质体注射液的制备

步骤1：称取淫羊藿素15g，二棕榈酰磷脂酰胆碱90g，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱50g，聚氧乙烯(60)蓖麻油5g，及胆固醇50g置圆底烧瓶内；

步骤2：加入适量100ml乙酸乙酯至上述混合物中使完全溶解成澄明溶液，以旋转薄膜蒸发法在65℃条件下减压干燥约6小时将有机溶剂挥发完全；

步骤4：用剪切乳化器乳化4分钟(转速2000转/分)，得初乳，将初乳用超声波仪超声25分钟，注射用水定容至1000ml；

步骤5：以氢氧化钠调节pH为8.0，分装于安瓿(或西林瓶)内，消毒，即得淫羊藿素注射用脂质体。

实施例9：淫羊藿素脂质体粉针剂的制备

步骤1：称取淫羊藿素8g，蛋黄磷脂14g及胆固醇7g置圆底烧瓶内；

步骤2：加入20ml二氯甲烷至上述混合物中使完全溶解成澄明溶液，以旋转薄膜蒸发法在65℃条件下减压干燥约4小时将有机溶剂挥发完全；

步骤4：用剪切乳化器乳化7分钟(转速3000转/分)，得初乳，将初乳用微射流高压均质机均化(压力4000psi)三次，注射用水定容至1000ml，加入200克甘露醇溶解；

步骤5：以磷酸氢二钾调节pH为7.0，分装于15ml西林瓶(3ml/瓶)内；

步骤6：以真空冷冻干燥法在-40℃条件下预冻12小时，升温至-20℃，在-20℃环境中保持6小时，在15小时内升温至25℃，解压，即得淫羊藿素注射用脂质体粉针剂。

实施例10：淫羊藿素脂质体粉针剂的制备

步骤1：称取淫羊藿素2g，大豆磷脂20g及胆固醇20g置圆底烧瓶内；

步骤2：加入50ml氯仿至上述混合物中使完全溶解成澄明溶液，以旋转薄膜蒸发法在65℃条件下减压干燥约4小时将有机溶剂挥发完全；

步骤3：加700ml注射用水，在常压状态下继续旋转直至薄膜完全水化；

步骤4：用剪切乳化器乳化2分钟(转速3000转/分)，得初乳，将初乳用微射流高压均质机均化(压力6000psi)三次，注射用水定容至1000ml，加入300克海藻糖溶解；

步骤5：以磷酸氢二钠调节pH为7.0，分装于10ml西林瓶(2ml/瓶)内；

步骤6：以真空冷冻干燥法在-45℃条件下预冻18小时，升温至-30℃，在-30℃环境中保持10小时，在15小时内升温至30℃，解压，即得淫羊藿素注射用脂质体粉针剂。

实施例11：淫羊藿素脂质体注射液的制备

步骤1：称取淫羊藿素3g，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱28g，胆固醇30g及泊罗沙姆(F₆₈)40g置圆底烧瓶内；

步骤2：加入适量30ml乙醇和30ml乙酸乙酯氯仿组成的混合液至上述混合物中使完全溶解成澄明溶液，以旋转旋转薄膜蒸发法在70℃条件下减压干燥约4小时将有机溶剂挥发完全；

步骤4：用剪切乳化器乳化2分钟(转速1000转/分)，得初乳，将初乳用用JM-LB60胶体磨乳化(转数2900转/分钟)进行匀浆2次，注射用水定容至1000ml；

步骤5：以磷酸氢二钾调节pH为4.5，分装于安瓿(或西林瓶)内，消毒，即得淫羊藿素注射用脂质体。

实施例12：动物试验

如图2所示，本实施例先建立SD大鼠肝脏缺血再灌注(I/R)损伤模型，将32只体重250-280克雄性大鼠随机分成4组：静脉注射组(iV+I/R)、口服灌胃组(ig+I/R)、单纯损伤组(I/R)和假手术组(SHAM)。其中，前两组于肝门阻断前分别以静脉注射法、口服灌胃法给予含有0.1(w/v％)的淫羊藿素的淫羊藿素脂质体(1.5ml/kg)进行预处理；单纯损伤组不予任何预处理直接阻断血流；假手术组不予任何预处理以及手术操作，各组经肝门阻断60分钟、于血流恢复后2h和6h采集血液和肝脏组织标本，进行血清ALT含量、肝组织中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量以及肝细胞凋亡指数(apoptosis index，AI)检测，结果如图3～5所示。且在以上试验中，SD大鼠肝脏缺血再灌注(I/R)损伤模型的建立及肝门阻断均采用本领域常规方法。

如图3所示，肝门阻断后的第2、第6小时，静脉注射组(iv+I/R)的大鼠外周血中ALT水平较口服灌胃组(ig+I/R)以及单纯损伤组(I/R)有明显降低。如图4所示，肝门阻断后的第2、第6小时，静脉注射组(iv+I/R)的大鼠肝组织中MDA含量较口服灌胃组(ig+I/R)以及单纯损伤组(I/R)有显著下降。如图5所示，肝门阻断后的第2、第6小时，静脉注射组(iv+I/R)的大鼠肝细胞凋亡率较口服灌胃组(ig+I/R)以及单纯损伤组(I/R)有明显降低。

实施例13-17动物实验

实施例13-17采用与实施例12相同的实验方法，不同之处仅在于所用的淫羊藿素脂质体含有的淫羊藿素的量不同，具体的，淫羊藿素的含量分别为0.01(w/v％)，0.5(w/v％)，1(w/v％)，3(w/v％)，5(w/v％)。结果表明，静脉注射组(iv+I/R)的大鼠外周血中ALT水平较口服灌胃组(ig+I/R)以及单纯损伤组(I/R)有明显降低；静脉注射组(iv+I/R)的大鼠肝组织中MDA含量较口服灌胃组(ig+I/R)以及单纯损伤组(I/R)有显著下降；静脉注射组(iv+I/R)的大鼠肝细胞凋亡率较口服灌胃组(ig+I/R)以及单纯损伤组(I/R)有明显降低。

实施例18在小鼠体内的药物动力学及组织分布

1.取昆明种小鼠24只，随机分为2组，分别尾静脉注射淫羊藿素脂质体。于给药后经眼眶静脉取血约0.5mL，置肝素化离心管中，离心后分离血浆，并于零下20℃下保存。处死动物后取出肝、脾、肾、肺，用冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，称总质量后于零下20℃下保存。

2.组织样品处理

精密称取约0.1g各组织样品，提取，漩涡混匀，取有机层在40℃水浴中氮气流吹干，将残留物离心，取上清液测定，结果如表1所示。

表1组织分布结果

结果表明淫羊藿素脂质体进入体内后，在肝脏的聚集量较脾脏、肾、肺明显增多，显示出淫羊藿素脂质体具有尚佳的肝脏靶向性。

本发明的淫羊藿素脂质体，能够在淫羊藿素较低浓度(0.01-5w/v％)时，即可发挥其抗自由基氧化、减轻肝脏损伤以及抑制肝细胞凋亡，对于缺血再灌注损伤的肝脏具有显著的保护作用。众所周知，传统的口服给药方式不可避免的受到肝脏首过消除效应的干扰，同时胃肠道功能以及胃肠内容物都能大大影响药效以及稳定性；而且通过该途径给药通常吸收较慢，对于器官或组织的急性损伤疗效欠佳。本发明成功的解决了上述不足，本发明的淫羊藿素脂质体具有肝脏靶向性和尚佳的稳定性，对淫羊藿素抗氧化、抑制肝细胞凋亡以及修复肝脏急性损伤等具有靶向性优势，在较低浓度、较短时间使得药效得以充分显现，体现了其无可比拟的优势与价值，为其今后能在临床上得以应用具有深远意义。且脂质体将药物包裹在脂质双分子中间，可避免光线、氧气、酸、碱等不稳定因素对淫羊藿的破坏，从而提高药物的稳定性。另外，脂质体粉针是固体制剂，可解决普通脂质体的聚集、沉降、融合、渗漏等的不稳定性问题。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种淫羊藿素脂质体制剂，主要由淫羊藿素、磷脂、增塑材料、支撑剂、以及注射用水组成，其中各组分的重量百分比如下：淫羊藿素0.01～5％(质量比)，磷脂0.05～8％(质量比)，增塑材料0～8％(质量比)，支撑剂0～20％(质量比)，余量为注射用水。

2.如权利要求1所述的淫羊藿素脂质体制剂，其特征在于，所述淫羊藿素脂质体制剂还含有pH调节剂，所述pH调节剂用于将所述淫羊藿素脂质体制剂的pH调节为4～8。

3.如权利要求1所述的淫羊藿素脂质体制剂，其特征在于，所述磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱中的一种或几种。

4.如权利要求1所述的淫羊藿素脂质体制剂，其特征在于，所述增塑材料为洛罗沙姆、聚氧乙烯蓖麻油缩合物、聚氧乙烯氢化蓖麻油缩合物和聚山梨醇酯、胆固醇中的一种或几种，其中，聚氧乙烯蓖麻油缩合物选自聚氧乙烯(35)蓖麻油、聚氧乙烯(60)蓖麻油；聚氧乙烯氢化蓖麻油缩合物选自聚氧乙烯(35)氢化蓖麻油、聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80。

5.如权利要求1所述的淫羊藿素脂质体制剂，其特征在于，所述支撑剂为注射用溶剂、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、氯化钠、聚乙烯吡咯烷酮、白蛋白、右旋糖酐中的一种或几种。

6.如权利要求1所述的淫羊藿素脂质体制剂，其特征在于，所述pH调节剂为盐酸、氢氧化钠、冰醋酸、醋酸钠、磷酸、枸橼酸、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠中的一种或几种。

7.一种淫羊藿素脂质体制剂的制备方法，其特征在于，包括：

(a)、制备混合溶液，所述混合溶液中含有淫羊藿素，磷脂，及有机溶剂；

(b)、采用旋转薄膜蒸发法使所述混合溶液中的所述有机溶剂挥发完全；

(e)、将pH调节为4-8，即可得到所述淫羊藿素脂质体制剂。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)的所述混合溶液还包含增塑材料。

9.如权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤：

(f)、将淫羊藿素脂质体制剂进行真空冷冻干燥；且在所述步骤d中在所述定容后加入支撑剂。

10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自氯仿、甲醇、二氯甲烷、乙醚、无水乙醇、丙酮、四氢呋喃、乙酸乙酯中的一种或几种。