CN109385468A - 检测链特异性效率的成套试剂与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测链特异性效率的成套试剂与方法。本发明公开的检测链特异性效率的成套试剂由SEQ ID NO:1‑6所示的RNA组成，检测链特异性效率的方法，包括：向待建库的RNA中添加本发明的成套试剂，后进行链特异性转录组文库构建，然后进行高通量测序，将测序数据与成套试剂的序列进行比对，计算成套试剂的正义比对读段数目占成套试剂的总读段数目的比例，该比例即为链特异性系数，根据链特异性系数确定链特异性效率。本发明的检测链特异性效率的方法与成套试剂可以用于指示mRNA或非编码RNA等链特异性转录组测序数据的可信程度，确保分析结果的可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，检测链特异性效率的成套试剂与方法。
背景技术
随着NGS(新一代测序技术)的蓬勃发展，转录组测序技术已成为研究基因表达的主要手段。转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带，是基因功能及结构研究的基础和出发点。通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在特定状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。
但常规转录组在测序序列中不能提供链方向的特征信息，无法真实的反映转录情况。因此，链特异性转录组测序技术(ssRNA-Seq)应运而生。通过在构建测序文库时，将mRNA链的方向信息保留，测序后的数据分析可确定转录本是来自正义还是反义DNA链。与普通转录组测序相比，它更能准确地统计转录本的数量和确定基因的结构，同时可以发现更多的反义转录本，目前被广泛地应用于研究基因结构和基因表达调控等领域范围。
目前有多种方法可以实现链特异性建库，其中包括：RNA接头连接法、末端模板转换法、dUTP法等。据文献报道，评估链特异性转录组建库数据的常用方法为：明确实验样本的物种信息，并在互联网数据库中检索其参考基因集，假定其所有基因都不存在反义表达现象，然后统计测序数据中来自反义链的读段比例，并以此比例来评估链特异性转录组数据的质量。
现有的评估方案在应用中存在多种局限。首先，随着转录组研究范围的扩大，有大量实验样本其参考基因序列是不完整或可信度较低的，导致现有的评估方案无法进行。其次，假定其所有基因都不存在反义表达现象，是一种非常武断的假设，不同物种、不同生理状态下的样本，必然存在不同程度的反义表达事件；而发现真实存在的反义表达事件，这也是链特异性转录组测序的实验目标。再次，链特异性转录组建库过程中所使用的反转录酶可能会有较强的DDDP(DNA-Dependent DNA Polymerase activities)活性及模版扩增步骤使用到PCR酶的差异等因素，都有可能会造成链特异性效率的下降，例如，深圳华大基因股份有限公司展开链特异性转录组测序研究，但RNA样品鉴定到的定量结果与QPCR验证实验一致性较低，Pearson coefficient仅为0.542(附图1)。最后，现有的评估方案需要在生物信息学流程中做额外一次反义比对的操作，需耗费较多的计算资源和时间。
高效率的链特异性处理，是确保转录本定量和基因结构优化结果准确的前提，但目前并不存在一种成熟的检测方案，用于计算测序数据中链特异性处理的效率。这严重制约着链特异性转录组测序技术的应用和发展。
发明内容
本发明首先提供了检测链特异性效率的成套试剂。
本发明所提供的成套试剂，为名称分别为SCS1、SCS2、SCS3、SCS4、SCS5和SCS6的RNA中的至少一种；
所述SCS1为如下a1)至a4)中的任一种RNA：
a1)序列表中SEQ ID NO:1所示的RNA；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
a3)与a1)或a2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的RNA杂交的RNA；
所述SCS2为如下b1)至b4)中的任一种RNA：
b1)序列表中SEQ ID NO:2所示的RNA；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
b3)与b1)或b2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的RNA杂交的RNA；
所述SCS3为如下c1)至c4)中的任一种RNA：
c1)序列表中SEQ ID NO:3所示的RNA；
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
c3)与c1)或c2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的RNA杂交的RNA；
所述SCS4为如下d1)至d4)中的任一种RNA：
d1)序列表中SEQ ID NO:4所示的RNA；
d2)在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
d3)与d1)或d2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的RNA杂交的RNA；
所述SCS5为如下e1)至e4)中的任一种RNA：
e1)序列表中SEQ ID NO:5所示的RNA；
e2)在e1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
e3)与e1)或e2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的RNA杂交的RNA；
所述SCS6为如下f1)至f4)中的任一种RNA：
f1)序列表中SEQ ID NO:6所示的RNA；
f2)在f1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
f3)与f1)或f2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
f4)在严格条件下与f1)或f2)限定的RNA杂交的RNA。
所述RNA可为单链RNA或双链RNA。
其中所述添加一个或几个核苷酸均可为添加一至十个核苷酸。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID NO:1-6任一所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
本发明还提供了链特异性效率的检测方法，所述方法包括：
1)向待建库的RNA中添加外源RNA，所述外源RNA与生物体内的RNA序列均不一致，得到混合RNA；
2)对所述混合RNA进行链特异性转录组文库构建，得到链特异性转录组文库；
3)对所述链特异性转录组文库进行高通量测序，得到测序数据；
4)将所述测序数据与所述外源RNA的序列进行比对，计算所述外源RNA的正义比对读段数目占所述外源RNA的总读段数目的比例，该比例即为链特异性系数，根据所述链特异性系数确定链特异性效率；
所述外源RNA的正义比对读段为与所述外源RNA中任一RNA或其任一片段序列相同的读段。
上述方法中，所述外源RNA可为所述成套试剂。
上述方法中，所述链特异性系数越高链特异性效率越高，所述链特异性系数越低链特异性效率越低。
步骤2)中对所述混合RNA进行链特异性转录组文库构建可采用现有技术中的方法进行，具体可依次包括：将所述混合RNA片段化、反转录得到cDNA一链、插入dUTP合成cDNA二链、对cDNA末端修复并连接接头、通过PCR方法扩增cDNA得到链特异性转录组文库。
上述方法中，所述待建库的RNA与所述外源RNA的质量比可为(0.5-2)×104：1。
所述待建库的RNA与所述外源RNA的质量比具体可为1×104:1。
上述方法中，步骤1)还可包括在加入所述外源RNA前将所述待建库的RNA片段化。
上述方法中，步骤1)还可包括11)和12)：
11)富集所述待建库的RNA中的mRNA，得到mRNA库；
12)向所述mRNA库中添加所述外源RNA，得到混合RNA。
上述方法中，所述mRNA库中mRNA与所述外源RNA的质量比可小于等于1％。
上述方法中，步骤12)还可包括在加入所述外源RNA前将所述mRNA库mRNA片段化。
本发明还提供了链特异性转录组文库构建方法，所述方法包括：
1)向待建库的RNA中添加所述外源RNA，得到混合RNA；
2)对所述混合RNA进行链特异性转录组文库构建，得到链特异性转录组文库。
本发明还提供了链特异性转录组测序方法，所述方法包括：将待测序转录组按照所述链特异性转录组文库构建方法构建链特异性转录组文库，将得到的链特异性转录组文库进行测序完成所述转录组的测序。
本发明还提供了所述成套试剂的下述任一应用：
X1、在制备链特异性效率产品中的应用；
X2、在链特异性效率中的应用；
X3、在制备链特异性转录组文库构建产品中的应用；
X4、在链特异性转录组文库构建中的应用。
本发明利用链特异性效率来评价链特异性转录组文库构建效率(即链特异性处理的效率)，即正义链的读段比例，来评估链特异性转录组数据的质量，通过设计检测链特异性效率的成套试剂并建立了检测链特异性效率的方法。本发明的检测链特异性效率的方法得到的链特异性系数可以直接反映实验流程中链特异性效率的真实情况。QPCR的验证结果显示，链特异性效率与链特异性系数的变化趋势具有一致性，表明，链特异性系数可以直接反应链特异性效率，链特异性系数越高链特异性效率越高，链特异性系数越低链特异性效率越低。本发明的检测链特异性效率的方法是一种有效的检测方法，可以用于指示mRNA或非编码RNA等链特异性转录组测序数据的可信程度，确保分析结果的可靠性。
附图说明
图1为RNA样品定量结果与QPCR验证实验一致性比较。
图2为检测链特异性效率的流程图。
图3利用FLAG信息实现区分正反义比对结果的方法的流程图。
图4为不同批次的正义比对和反义比对的读段数目。
图5为QPCR结果与第一个批次的链特异性转录组文库的基因定量结果的相关性分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、链特异性效率的检测方法
本实施例提供了利用检测链特异性效率的成套试剂检测链特异性效率的方法，检测链特异性效率的成套试剂由名称分别为SCS1、SCS2、SCS3、SCS4、SCS5和SCS6组成；
SCS1为序列表中SEQ ID NO:1所示的单链RNA；
SCS2为序列表中SEQ ID NO:2所示的单链RNA；
SCS3为序列表中SEQ ID NO:3所示的单链RNA；
SCS4为序列表中SEQ ID NO:4所示的单链RNA；
SCS5为序列表中SEQ ID NO:5所示的单链RNA；
SCS6为序列表中SEQ ID NO:6所示的单链RNA。
该成套试剂中，SCS1、SCS2、SCS3、SCS4、SCS5和SCS6的摩尔比可为1:1:1:1:1:1。
1、链特异性效率的检测
检测链特异性效率的具体方法如下，流程图如附图2所示：
(1)测定RNA样品总RNA质量，按照mRNA占总RNA 1％估算mRNA质量；
(2)富集mRNA并片段化，然后向片段化的mRNA中加入量为mRNA估算量1％的外源序列SCS，即上述检测链特异性效率的成套试剂，得到混合RNA；
(3)将混合RNA分为三份，利用现有技术中的相同的试剂和方法进行三次链特异性转录组文库构建，得到三个批次的链特异性转录组文库，所用反转录酶均为SuperScriptTMII Reverse Transcriptase(Thermo Fisher Scientific)；采用高通量测序技术IlluminaHiSeq4000测序平台，基于边合成边测序技术读取碱基信息，获得待测RNA样品的三个批次的原始测序数据；
链特异性转录组文库的构建过程包括：富集mRNA并片段化、反转录得到cDNA一链、插入dUTP合成cDNA二链、对cDNA末端修复并连接接头、通过PCR方法扩增cDNA得到文库、将文库上机HiSeq4000测序。
(4)测序数据过滤后与外源序列SCS(外源转录本)进行序列比对，获得SAM文件；
(5)通过计算和分类FLAG(FLAG是SAM/BAM格式的序列文件中用于表示与参考序列比对后结果的标记文字)信息，区分正义比对和反义比对，见附图3；正义比对读段为与外源序列SCS中任一RNA或其任一片段序列相同的读段；反义比对读段为与外源序列SCS中任一RNA或其任一片段序列互补的读段；
(6)分别统计各批次中的正义比对和反义比对的读段数目，见附图4，并计算正义比对的读段数目在总读段数目中的比值，即链特异性系数(SC，SpecificityCoefficient)，得到3个批次所对应的数据链特异性系数SC，分别为99.98％、96.74％、99.75％；由于链特异性系数为成套试剂的正义比对的读段数目在总读段数目中的比值，可以直接反应混合RNA中正义比对的读段数目与总读段数目的关系，因此可用来直接确定链特异性效率，链特异性系数越高链特异性效率越高，链特异性系数越低链特异性效率越低；
(7)通过比较3个批次的实验结果，发现第二批次链特异性系数存在较明显的异常，第一批次的链特异性系数最高，表明，第一批次的链特异性效率在三个批次中最高。
2、链特异性效率的QPCR验证
对步骤1中的三个批次的RNA样品进行QPCR验证，具体采用转录组测序方法学研究了标准样品UHRR(Agilent Technologies)，对样品内约1000个基因进行了QPCR实验并共享了其表达量结果，其结果可在Gene Expression Omnibus网站检索GSE5350下载。
将结果分别与步骤一的三个批次的链特异性转录组文库的基因定量结果进行相关性分析，结果显示，QPCR结果与第一、二和三个批次的链特异性转录组文库的基因定量结果的Pearson coefficient分别为0.809(附图5)、0.611和0.814。说明，第一、三和二个批次的链特异性效率逐渐降低，与链特异性系数的变化趋势具有一致性，进一步表明，链特异性系数可以直接反应链特异性效率，链特异性系数越高链特异性效率越高，链特异性系数越低链特异性效率越低。
<110> 深圳华大基因股份有限公司
<120> 检测链特异性效率的成套试剂与方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 113
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gauccguuag cuaucguucg cgagaaaguu aguagacaca caggacccag gcgugcaagu 60
caauuucagc ugacuacacc gauucugguu aaaagagccu auggccaccc uua 113
<210> 2
<211> 125
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
auccugcaga ugcauccagu acuaguaugg cccggggcca uucgcgauuc caugagacuc 60
caaggguucu gcacaacuua ugcaccucua uuagaucauu guguucuacg cacaacauga 120
gaaga 125
<210> 3
<211> 141
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gggggauccg uauacguuuc uaauuuguag uuaacgguug agcuucggca cagggcucaa 60
auugcaucau uaaaugucuc cgauguggcu auaugucaug gauaaaggca gcccccuaua 120
ucuuuuuuug uggcagaaaa a 141
<210> 4
<211> 158
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gggggauccg uuagcuaucg uucgcgagaa aguuaguaga ucuggcaaac uuauagagga 60
auuaugagca ugucuugccc uucauggugg auauucacag cugaaaguag gacacaacga 120
ggaaaccuga agucuagcuc ggaguuaaca auuuacca 158
<210> 5
<211> 174
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
aguauggcgg gggauccuua ucugucaaaa ccgcuaaugu ccguucuaag accgucugga 60
gaacacuugc ccaucagugc uuuugaaccu uuuuuucaca ggucccuucc gauuguagga 120
guaauacuac ccagcuuaua acccucaaac guagggcaga uggcggccgc gaua 174
<210> 6
<211> 196
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
aguauggccc gggggauuga uauauuguga ggagcauugc gaacccuaga gcuguccggu 60
caaauaaccc ccucacaaua aguguaaugu caugggauaa ucaaaagacu aagggagggc 120
uuuuauagaa ggcgugaggu caugcuaucc cccucugaag acgcggccgc gauauccugc 180
agaugcaucc aguaca 196
Claims (10)
1.成套试剂，为名称分别为SCS1、SCS2、SCS3、SCS4、SCS5和SCS6的RNA中的至少一种；
所述SCS1为如下a1)至a4)中的任一种RNA：
a1)序列表中SEQ ID NO:1所示的RNA；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
a3)与a1)或a2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的RNA杂交的RNA；
所述SCS2为如下b1)至b4)中的任一种RNA：
b1)序列表中SEQ ID NO:2所示的RNA；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
b3)与b1)或b2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的RNA杂交的RNA；
所述SCS3为如下c1)至c4)中的任一种RNA：
c1)序列表中SEQ ID NO:3所示的RNA；
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
c3)与c1)或c2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的RNA杂交的RNA；
所述SCS4为如下d1)至d4)中的任一种RNA：
d1)序列表中SEQ ID NO:4所示的RNA；
d2)在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
d3)与d1)或d2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的RNA杂交的RNA；
所述SCS5为如下e1)至e4)中的任一种RNA：
e1)序列表中SEQ ID NO:5所示的RNA；
e2)在e1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
e3)与e1)或e2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的RNA杂交的RNA；
所述SCS6为如下f1)至f4)中的任一种RNA：
f1)序列表中SEQ ID NO:6所示的RNA；
f2)在f1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的RNA；
f3)与f1)或f2)限定的RNA具有85％以上的同一性的RNA；
f4)在严格条件下与f1)或f2)限定的RNA杂交的RNA。
2.链特异性效率的检测方法，包括：
1)向待建库的RNA中添加外源RNA，所述外源RNA与生物体内的RNA序列均不一致，得到混合RNA；
2)对所述混合RNA进行链特异性转录组文库构建，得到链特异性转录组文库；
3)对所述链特异性转录组文库进行高通量测序，得到测序数据；
4)将所述测序数据与所述外源RNA的序列进行比对，计算所述外源RNA的正义比对读段数目占所述外源RNA的总读段数目的比例，该比例即为链特异性系数，根据所述链特异性系数确定链特异性效率；
所述外源RNA的正义比对读段为与所述外源RNA中任一RNA或其任一片段序列相同的读段。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述外源RNA为权利要求1所述的成套试剂。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述待建库的RNA与所述外源RNA的质量比为(0.5-2)×104：1。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤1)还包括在加入所述外源RNA前将所述待建库的RNA片段化。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1)还包括11)和12)：
11)富集所述待建库的RNA中的mRNA，得到mRNA库；
12)向所述mRNA库中添加所述外源RNA，得到混合RNA。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述mRNA库中mRNA与所述外源RNA的质量比小于等于1％；
和/或，步骤12)还包括在加入所述外源RNA前将所述mRNA库中mRNA片段化。
8.链特异性转录组文库构建方法，包括：
1)向待建库的RNA中添加权利要求2或3中所述外源RNA，得到混合RNA；
2)对所述混合RNA进行链特异性转录组文库构建，得到链特异性转录组文库。
9.链特异性转录组测序方法，包括：将待测序转录组按照权利要求8所述的方法构建链特异性转录组文库，将得到的链特异性转录组文库进行测序完成所述转录组的测序。
10.权利要求1所述成套试剂的下述任一应用：
X1、在制备链特异性效率产品中的应用；
X2、在链特异性效率中的应用；
X3、在制备链特异性转录组文库构建产品中的应用；
X4、在链特异性转录组文库构建中的应用。
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