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CN106048091A - 检测登革病毒成熟miRNA的成套引物与方法 - Google Patents

检测登革病毒成熟miRNA的成套引物与方法 Download PDF

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CN106048091A
CN106048091A CN201610602108.7A CN201610602108A CN106048091A CN 106048091 A CN106048091 A CN 106048091A CN 201610602108 A CN201610602108 A CN 201610602108A CN 106048091 A CN106048091 A CN 106048091A
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stranded dna
dengue virus
mirna
sequence
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CN201610602108.7A
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李文
潘林奇
何声梅
周文雄
陈莉
陈丽
李晓杰
王茂
谈波
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Hainan International Travel Health Care Center
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Abstract

本发明公开了检测登革病毒成熟miRNA的成套引物与方法。本发明公开的检测登革病毒成熟miRNA的成套引物由序列表中序列1所示的单链DNA、序列2所示的单链DNA与序列3所示的单链DNA组成。实验证明，本发明的检测登革病毒成熟miRNA的成套引物灵敏度高，可达1×10‑4μM，特异性好，特异性可达100％，重复性好，能够从分子量比较小的RNA样本中稳定而快速、高通量的定量登革病毒成熟miRNA。

Description

检测登革病毒成熟miRNA的成套引物与方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中检测登革病毒成熟miRNA的成套引物与方法。
背景技术
miRNA在包括病毒在内的多种生物体内发挥多种重要而关键的调控作用。植物、脊椎动物和无脊椎动物通过表达相关miRNA调控入侵其体内病毒的相应基因表达而发挥靶向应答和清除病毒的作用。现在已知病毒可用其自身的miRNA来靶向调节其自身的基因表达来逃避宿主的免疫系统监视和清除，这也是病毒潜伏的重要机制。例如，人类疱疹病毒第四型(Epstein-Barr virus，EBV)编码的miR-BART5能够靶向调节宿主细胞中受P53调节的促凋亡基因PUMA的表达。上述研究结果表明，病毒入侵宿主后，病毒编码的miRNA与宿主编码的miRNA可能存在以下相互作用方式：宿主的miRNA调节自身基因表达，并且宿主的miRNA靶向调节病毒基因表达，是其抵抗和清除入侵病毒的机制；病毒的miRNA调节其自身基因的表达，并且还能调节宿主特定的基因，是病毒逃逸宿主免疫监视和免疫应答的机制。上述miRNA调控基因表达的相互作用机制可能是病毒与其宿主在漫长的进化过程中形成的。此外，病毒miRNA倾向于调控宿主特定的基因表达，以利于其自身的复制和存活，而被病毒miRNA靶向调控的这些特定的宿主基因往往是参与宿主免疫识别和应答，细胞凋亡、细胞周期或细胞分化；组织生长，组织修复(如纤维化)和血管生成等关键过程的基因。而这可能是不同种属的病毒共用的寄生于宿主细胞内并维持其自身存活和复制的机制。
目前可通过直接法或者间接法检测miRNA，直接法如荧光法、比色法、电学法。虽然这些方法能够减小样本的检测差异，但是这些方法灵敏度较低而且在同源miRNA家族中区分度也较低，因此存在一定的局限性。间接的检测方法主要包括免疫印迹、基因芯片和RT-PCR，虽然被广泛应用，但是免疫印迹和基因芯片是半定量，而且灵敏度比较低，需要大量的起始RNA。基因芯片检测miRNA具有高通量的优势和绝对定量的潜能，虽然用恒温的方法检测miRNA获得了一些成功，但是耗费人力巨大。近来研究表明，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)具有更高的灵敏度和特异度。虽然qRT-PCR在RNA定量方面具有当前最高的灵敏度和扩增效率，而基于TaqMan探针的qRT-PCR由于能高效特异的检测miRNA而被广泛应用，但是由于额外的探针水解作用，TaqMan探针法不能和快速的热循环法相适应来快速的检测miRNA。更重要的是，TaqMan探针法不能用于筛选潜在的miRNA，对新的miRNA来说，新探针的设计不仅花费巨大，而且也存在技术难题，面临很多实际困难。虽然采用荧光探针检测miRNA较为灵敏，但是实验步骤复杂，动态检测范围有限且检测同源miRNA的特异度较低。此外，目前较为认可的基于TaqMan探针的检测方法是用通用或普通的反转录引物和荧光探针扩增和检测多重miRNA。但是在这些方法中，qRT-PCR的特异度只能通过上游引物来实现，而不能够完全区分同源miRNA，因此特异度较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速检测登革病毒成熟miRNA。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测登革病毒成熟miRNA的成套引物。
本发明提供的检测登革病毒成熟miRNA的成套引物，由名称为DENV-I-RT-7的单链DNA、名称为DENV-I-F-18的单链DNA和名称为DENV-I-R-9的单链DNA组成，所述DENV-I-F-18是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述DENV-I-R-9是如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述DENV-I-RT-7是如下c1)至c4)中的任一种单链DNA：
c1)序列表中序列3所示的单链DNA；
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
c3)与c1)或c2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
上述成套引物中，a2)所述在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA为在序列1所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。b2)所述在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA为在序列2所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA为在序列1所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1、序列2或序列3所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述成套引物中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测登革病毒成熟miRNA的引物对。
本发明提供的检测登革病毒成熟miRNA的引物对，由所述DENV-I-F-18和所述DENV-I-R-9组成。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测登革病毒成熟miRNA的系统。
本发明提供的检测登革病毒成熟miRNA的系统，包括所述成套引物或所述引物对。
上述检测登革病毒成熟miRNA的系统，还可包括进行RNA逆转录和/或荧光定量PCR检测登革病毒成熟miRNA所需的试剂和仪器。具体来说，检测登革病毒成熟miRNA的系统可包括所述成套引物或所述引物对以及进行RNA逆转录和/或荧光定量PCR所需要的其它试剂和仪器。
上述系统可由所述成套引物或所述引物对与M1组成，所述M1为M1a和/或M1b，所述M1a为进行RNA逆转录所需的试剂和/或仪器，所述M1b进行荧光定量PCR所需的试剂和/或仪器。
所述成套引物和所述引物对中的各单链DNA以及进行RNA逆转录所需要的其它试剂、进行荧光定量PCR所需要的其它试剂均可独立包装。
进行RNA逆转录所需要的其它试剂可包括广州市锐博生物科技有限公司的逆转录试剂盒，如该试剂盒中的2.5×Reverse Transcription Mix。
进行荧光定量PCR所需要的其它试剂可包括广州市锐博生物科技有限公司的qPCR扩增试剂盒，如该试剂盒中的2×SYBR Green Mix。进行荧光定量PCR所需要的仪器可为荧光定量PCR仪，如罗氏Light cycler480荧光定量PCR仪。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套引物的制备方法。
本发明提供的所述成套引物的制备方法，包括将所述成套引物中各单链DNA独立包装。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述引物对的制备方法。
本发明提供的所述引物对的制备方法，包括将所述引物对中两条单链DNA独立包装。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述系统的制备方法。
本发明提供的所述系统的制备方法，包括将所述成套引物中各单链DNA独立包装。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测登革病毒成熟miRNA的方法。
本发明提供的检测登革病毒成熟miRNA的方法，包括：
1)在逆转录体系中对待测RNA样品进行逆转录，得到逆转录产物；所述逆转录体系中含有所述成套引物中序列3所示的单链DNA；
2)下述21)或22)：
21)利用所述成套引物中序列1和序列2所示的两条单链DNA对所述逆转录产物进行荧光定量PCR，根据Ct值确定所述待测样品是否为登革病毒成熟miRNA或是否含有登革病毒成熟miRNA；
22)利用权利要求1所述成套引物中序列1和序列2所示的两条单链DNA对所述逆转录产物进行PCR扩增，根据扩增产物的有无确定所述待测样品是否为登革病毒成熟miRNA或是否含有登革病毒成熟miRNA。
上述方法中，所述进行荧光定量PCR和所述PCR扩增的退火温度均可为60℃。
上述方法中，所述逆转录体系中序列3所示的单链DNA的浓度可为5μM。所述逆转录体系具体可包括：RNA、序列3所示的单链DNA、2.5×Reverse Transcription Mix和RNase-free H2O 2μL。进行逆转录的温度可为42℃，时间可为60min。
上述方法中，进行荧光定量PCR的体系中序列1和序列2所示的两条单链DNA的浓度均可为5μM。进行荧光定量PCR的体系中可包括：2×SYBR Green Mix、所述逆转录产物、序列1和序列2所示的两条单链DNA和ddH2O。
上述方法中，进行荧光定量PCR的反应条件具体可为：95℃5min；95℃10s，60℃10s，72℃10s,45个循环；95℃5s，65℃1min，97℃,continus。
上述方法中，进行荧光定量PCR可在荧光定量PCR仪上进行，如罗氏Lightcycler480荧光定量PCR仪。
在本发明的一个实施例中，将荧光定量PCR的Ct值为35作为检测待测RNA样品是否含有或是否为登革病毒成熟miRNA的判定标准：如所述待测RNA样品的Ct值<35，则所述待测RNA样品含有或候选含有登革病毒成熟miRNA，或所述待测RNA样品为或候选为登革病毒成熟miRNA；如所述待测RNA样品的Ct值≥35，则所述待测RNA样品不含有或候选不含有登革病毒成熟miRNA，或所述待测RNA样品不为或候选不为登革病毒成熟miRNA。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套引物，所述引物对，或所述系统的下述a1)或a2)的应用：
a1)在检测登革病毒成熟miRNA中的应用；
a2)在制备检测登革病毒成熟miRNA产品中的应用。
本发明的成套引物可应用于利用半巢式PCR对登革病毒成熟miRNA的检测。
实验证明，本发明的成套引物灵敏度高，可达1×10-4μM，特异性好，特异性可达100％，重复性好。本发明方法不需要对反应条件进行优化能够快速扩增，本方法之所以能够快速扩增，是因为半巢式介导的扩增片段比较短，而且SYBR Green I不需要对探针进行水解而快速收集荧光信号。本研究不需要对miRNA预扩增就可以检测较低浓度的总RNA和从血清中分离的总RNA样本。以前，220-450个碱基的miRNA大分子需要同时进行逆转录再应用于研究大样本RNA的miRNA表达的研究。因为每个miRNA需要较低浓度的RT寡核苷酸片段，在实时PCR之前还要进行预扩增，尤其是总RNA样本低于350ng时。而且使用本研究方法可以降低样本量和试剂的成本，并且能够定量miRNA。因此，本研究方法能够从分子量比较小的RNA样本中稳定而快速、高通量的定量miRNA的表达。使用本研究方法可以降低样本量和试剂的成本，并且能够定量miRNA。因此，本研究方法能够从分子量比较小的RNA样本中稳定而快速、高通量的定量登革病毒成熟miRNA。
附图说明
图1为检测登革病毒成熟miRNA的成套引物灵敏度的扩增曲线。其中，1-9分别为浓度为1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8μM的miRNA溶液。
图2为组5的标准曲线。
图3为本发明的半巢式PCR检测登革病毒的miRNA原理。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的制备
检测登革病毒成熟miRNA的成套引物，由检测登革病毒成熟miRNA的引物对与序列3所示的单链DNA(DENV-I-RT-7)组成。
检测登革病毒成熟miRNA的引物对由序列表中序列1所示的单链DNA(DENV-I-F-18)与序列2所示的单链DNA(DENV-I-R-9)组成，其中各单链DNA均独立包装，摩尔比为1:1。
检测登革病毒成熟miRNA的成套引物中的各单链均独立包装，序列如下：
DENV-I-RT-7：5’-GCTCAGACAGAAGUCACACTGAGCGGCTTAA-3’(序列3)(DENV-I-RT-7为茎环引物，具体详见图3中茎环引物)
DENV-I-F-18：5’-ACACTCCAGCTGGGTAGAAGTCAGGCCGGATT-3’(序列1)
DENV-I-R-9：5’-CTTCTGTCTGGCTTAATC-3’(序列2)
实施例2、利用检测登革病毒成熟miRNA的成套引物检测登革病毒成熟miRNA
一、检测登革病毒成熟miRNA的方法
1、血清标本中RNA的提取
采用北京天恩泽基因科技有限公司的RNA提取试剂盒进行，具体方法如下：
(1)采集登革病毒阳性感染者全血室温静置1小时；
(2)2000g离心15分钟，分离血清；
(3)吸取200μL的血清，加入800μL的Trizol(变性溶液)，涡旋震荡混匀；
(4)将样本放在冰上5分钟；
(5)每个样本加入160μL的氯仿并涡旋，得到分离相的溶液；
(6)将样本放在冰上2分钟；
(7)使用微型离心机12000g，4度离心20分钟去分离相；
(8)在一个新的管子里加入1μL的糖原，将上层水相400μL转移到新的管中，然后加入480μL的异丙醇(沉淀物)混匀；
(9)置于-20度，放置2个小时；
(10)沉淀RNA，12000g，4度离心20分钟；
(11)轻轻移出上清液，用1mL75％的乙醇冲洗沉淀物；
(12)8000g，4度离心分钟；
(13)移出上清液，用无水乙醇洗脱沉淀；
(14)12000g，4度再次离心5分钟；
(15)移出上清液，干燥RNA沉淀；
(16)用20μL的无RNA酶水溶解沉淀，得到RNA溶液。
2、RNA逆转录成miRNA的产物
采用广州市锐博生物科技有限公司的逆转录试剂盒进行，具体方法如下：
RNA逆转录成miRNA的反应体系见表1。
表1、miRNA RT反应体系
将以上体系混匀后，瞬时离心，RT反应程序为：42℃60min，70℃10min。RT反应结束后，快速置于冰上冷却，得到RT反应产物。
3、miRNA的qPCR反应体系
采用广州市锐博生物科技有限公司的qPCR扩增试剂盒进行，具体方法如下：
按照表2配置qPCR反应体系，反应程序按照罗氏Light cycler480荧光定量PCR仪自带的SYBR Green I程序进行扩增。
条件如下：95℃5min；95℃10s，60℃10s，72℃10s,45个循环；95℃5s，65℃1min，97℃,continus.上机进行检测。
表2、miRNA qPCR反应体系
试剂 体积/μL
2×SYBR Green Mix 10
步骤2的RT反应产物 2
实施例1的DENV-I-F-18(5μM) 0.8
实施例1的DENV-I-R-9(5μM) 0.8
ddH2O 6.4
合计 20
二、检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的灵敏度
为了检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的灵敏度，将由广州市锐博生物科技有限公司合成的登革病毒成熟miRNA(序列表中序列4(5’-UAGAAGUCAGGCCGGAUUAAGCC-3’))用无RNase的去离子水进行稀释，得到浓度为1μM的miRNA溶液，然后按10-1做倍比稀释，分别得到浓度为1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8μM的miRNA溶液。按照步骤一中2和3的方法，将RNA溶液分别替换为上述不同浓度的miRNA溶液，检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的灵敏度。实验重复三次，结果取平均值(表3和图1)。
表3、检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的灵敏度结果
各浓度下得到的Ct值如表3所示，扩增曲线如图1所示，取miRNA溶液浓度值的log值为横坐标，Ct值为纵坐标，分别利用下述7组数据做标准曲线：
组1：浓度为1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8的miRNA溶液及其Ct值；
组2：浓度为1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6和1×10-7的miRNA溶液及其Ct值；
组3：浓度为1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5和1×10-6的miRNA溶液及其Ct值；
组4：浓度为1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4和1×10-5的miRNA溶液及其Ct值；
组5：浓度为1、1×10-1、1×10-2、1×10-3和1×10-4的miRNA溶液及其Ct值；
组6：浓度为1、1×10-1、1×10-2和1×10-3的miRNA溶液及其Ct值；
组7：浓度为1、1×10-1和1×10-2的miRNA溶液及其Ct值。
结果发现，组5、组6和组7的miRNA溶液浓度值的log值与Ct值均呈良好的线性关系，组1-组4的miRNA溶液浓度值的log值与Ct值均不呈良好的线性关系。组5的标准曲线如图2所示，表明检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的可以检测到的登革病毒成熟miRNA的浓度为1×10-4μM，即检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的灵敏度为1×10-4μM。
三、检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的特异性
为了检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的特异性，选取五份经荧光定量PCR验证为登革I型感染者的RNA(样品编号为1-5)，按照年龄、性别分别配比挑选五份健康人群的RNA(样品编号为6-10)，按照步骤一中2的方法进行逆转录，然后按照步骤一中3的方法进行qPCR检测，实验重复五次。结果显示：五份经荧光定量PCR验证为登革I型感染者的RNA经半巢式qRT-PCR检测时的Ct值分别为32.64、33.60、31.73、31.20、和32.62，均<35，五份经荧光定量PCR验证为登革阴性的对照组(健康人群)的Ct值分别为40、40、38、40和35，Ct值均≥35，将Ct值为35作为检测待测样本是否含有登革病毒成熟miRNA的判定标准：如待测样本的Ct值<35，则该待测样本含有登革病毒成熟miRNA(即阳性)，如待测样本的Ct值≥35，则该待测样本不含有登革病毒成熟miRNA(即阴性)。结果详见表4，表明，按照该判定标准检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的特异性为100％。
表4、检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的特异性检测结果
注释：+代表阳性，－代表阴性
四、检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的重复性
选取同一登革病毒感染者的5份RNA样本和5份分别来源于5个登革病毒感染者的RNA样本，稀释至同一浓度，利用检测登革病毒成熟miRNA的成套引物按照步骤一中2和3的方法进行检测，检测结果如表5所示，同一样品内相对标准偏差(RSD)为0.05％(Ct值的均数值是23.218，标准差是0.013)，样品间的相对标准偏差(RSD)为0.15％(Ct值的均数值是21.104，标准差是0.032)，总体样品的相对标准偏差(RSD)为5％(Ct值的均数值是22.16，标准差是1.114)。重复性实验表明，在同一样品内和不同样品间，利用检测登革病毒成熟miRNA的成套引物检测登革病毒成熟miRNA的重复性较好。
表5、检测登革病毒成熟miRNA的成套引物的重复性

Claims (10)

1.检测登革病毒成熟miRNA的成套引物，由名称为DENV-I-RT-7的单链DNA、名称为DENV-I-F-18的单链DNA和名称为DENV-I-R-9的单链DNA组成，所述DENV-I-F-18是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述DENV-I-R-9是如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述DENV-I-RT-7是如下c1)至c4)中的任一种单链DNA：
c1)序列表中序列3所示的单链DNA；
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
c3)与c1)或c2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
2.检测登革病毒成熟miRNA的引物对，由权利要求1中所述DENV-I-F-18和所述DENV-I-R-9组成。
3.检测登革病毒成熟miRNA的系统，包括权利要求1所述成套引物或权利要求2所述引物对。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于：所述系统由权利要求1所述成套引物和M1组成，所述M1为M1a和/或M1b，所述M1a为进行RNA逆转录所需的试剂和/或仪器，所述M1b进行荧光定量PCR所需的试剂和/或仪器。
5.权利要求1所述成套引物的制备方法，包括将所述成套引物中各单链DNA独立包装。
6.权利要求2所述引物对的制备方法，包括将所述引物对中两条单链DNA独立包装。
7.权利要求3或4所述系统的制备方法，包括将权利要求1所述成套引物中各单链DNA独立包装。
8.检测登革病毒成熟miRNA的方法，包括：
1)在逆转录体系中对待测RNA样品进行逆转录，得到逆转录产物；所述逆转录体系中含有权利要求1所述成套引物中序列3所示的单链DNA；
2)下述21)或22)：
21)利用权利要求1所述成套引物中序列1和序列2所示的两条单链DNA对所述逆转录产物进行荧光定量PCR，根据Ct值确定所述待测样品是否为登革病毒成熟miRNA或是否含有登革病毒成熟miRNA；
22)利用权利要求1所述成套引物中序列1和序列2所示的两条单链DNA对所述逆转录产物进行PCR扩增，根据扩增产物的有无确定所述待测样品是否为登革病毒成熟miRNA或是否含有登革病毒成熟miRNA。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述进行荧光定量PCR和所述PCR扩增的退火温度均为60℃。
10.权利要求1所述成套引物，权利要求2所述引物对，或权利要求3或4所述系统的下述a1)或a2)的应用：
a1)在检测登革病毒成熟miRNA中的应用；
a2)在制备检测登革病毒成熟miRNA产品中的应用。
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