CN109266578A - 大肠埃希氏菌ACThr1032及其在发酵生产L-苏氨酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株大肠埃希氏菌ACThr1032及其在发酵生产L‑苏氨酸中的应用，属于生物技术领域。一株大肠埃希氏菌ACThr1032，其分类命名分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏编号为CGMCC No.16144，保藏日期为2018年7月23日。所述大肠埃希氏菌ACThr1032经过菌株培养、发酵培养和提取纯化发酵制备L‑苏氨酸。本发明中的大肠埃希氏菌ACThr1032，菌种稳定性大大提高，采用该菌种发酵生产L‑苏氨酸，产酸和转化率有了显著提高，在技术上取得了突破性的进展，具有显著的进步。且该菌种培养条件粗放，大大降低了能耗，具有较好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株大肠埃希氏菌ACThr1032及其在发酵生产L-苏氨酸中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
L-苏氨酸是一种必需的氨基酸，主要用于医药、食品、化妆品、饲料等多个行业，特别是饲料添加剂方面的用量增长快速，它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。近年来，苏氨酸的市场需求不断增加，市场前景看好。
目前，苏氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学合成法和微生物发酵法。生物发酵法相比蛋白质水解法和化学合成法以其绿色环保、高产高效等特点已经在工业化生产中得到广泛应用。近年来，国内外大量企业和研究机构致力于L-苏氨酸发酵生产技术的研究，L-苏氨酸的发酵水平提高。
目前菌种对原材料、培养条件和控制工艺都要求较高，在生产过程中菌种的遗传性也不稳定，使得发酵生产水平不稳定，产酸和转化率波动较大，造成原材料及能耗较大，使生产成本偏高。通过基因表达，将目的基因插入质粒，以提高更大基因拷贝数的质粒，来提高苏氨酸的产量，但是L-苏氨酸是初级代谢产物，在培养过程中，基因改造的微生物菌种，出现质粒丢失、遗传不稳定的情况较多，也是造成生产水平波动的一个原因。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株大肠埃希氏菌ACThr1032及其在发酵生产L-苏氨酸中的应用。
本发明的技术方案，一株大肠埃希氏菌ACThr1032，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.16144，保藏时间为2018年7月23日。
所述大肠埃希氏菌ACThr1032的应用，将其应用于发酵生产L-苏氨酸。
步骤如下：
(1)菌种培养：将种子培养基进行灭菌，冷却至30～40℃，pH调至6.5～7.5，将大肠埃希氏菌ACThr1032菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期；
(2)发酵培养：将发酵培养基进行灭菌，冷却至37℃，pH调至7.0；将步骤(1)制得的对数生长期菌种接入发酵培养基中进行发酵培养以制取L-苏氨酸发酵液；培养30～50h，即得到L-苏氨酸发酵液；
(3)提取纯化：将步骤(2)得到的L-苏氨酸发酵液通过膜过滤去除菌体得到过滤清液，将过滤清液进行蒸发浓缩结晶，然后降温冷却结晶，进一步离心去除母液，得到湿晶，将湿晶进行干燥，得到L-苏氨酸晶体。
进一步的，步骤(1)中所述菌种培养条件为温度30～40℃、pH值6.5～7.5，溶氧≥30％和罐压0.02～0.05MPa。
进一步的，步骤(2)中所述发酵培养条件为温度30～40℃、pH值6.5～7.5、溶氧≥30％和罐压0.02～0.10MPa。
进一步的，步骤(2)中通风量及搅拌转数根据溶氧数据交替阶梯提高，发酵过程中残糖含量控制在0.05～0.2％。
进一步的，步骤(1)所述菌种培养的培养基包含葡萄糖5～15g/L、玉米浆15～35g/L、硫酸铵0.5～4g/L、磷酸二氢钾0.5～4g/L、硫酸镁0.05～1g/L、酵母粉0.5～10g/L、微量元素1份；
进一步的，步骤(2)所述发酵培养的培养基包含葡萄糖5～40g/L、玉米浆15～40g/L、硫酸铵0.5～5g/L、磷酸0.5～4g/L、硫酸镁0.05～2g/L、氯化钾0.05～3g/L、糖蜜0.5～10g/L、微量元素1份。
进一步的，步骤(3)中提取纯化的具体设备及控制参数如下：膜过滤设备为陶瓷膜、有机膜或金属膜，孔径为8nm～100nm；蒸发浓缩结晶设备为单效或多效蒸发结晶器，蒸发温度为50～85℃，浓缩比为3～8倍；冷却结晶设备为冷结晶器，降温控制速度为2～5℃/h，最低温度为5～15℃；离心机为平板刮刀式离心机，离心后湿晶含水量≤10％。
本发明的有益效果：本发明通过将大肠杆菌E.coli THRD进行诱变育种等改造工艺，筛选得到本申请中已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.16144的大肠埃希氏菌ACThr1032。该菌株具有独特的生理和生化特性可在科研、工业等领域进行研究和应用。
本发明中的大肠埃希氏菌ACThr1032，菌种稳定性大大提高，采用该菌种发酵生产L-苏氨酸，产酸和转化率有了显著提高，在技术上取得了突破性的进展，具有显著的进步。且该菌种培养条件粗放，大大降低了能耗，具有较好的工业应用前景。
生物材料样品保藏：一株大肠埃希氏菌ACThr1032，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏日期为2018年7月23日，菌种保藏编号为CGMCC No.16144，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1大肠杆菌的诱变筛选方法
以大肠杆菌E.coli THRD为出发菌，经过原生质体紫外诱变、硫酸二乙酯(DES)化学诱变、亚硝基胍(NTG)化学诱变，再经分离纯化，获得具有底物抗性和遗传标记的苏氨酸高产菌株。
原生质体紫外诱变方法：取制备好原生质体2～3mL，加入直径5cm的平皿中，置于20w的紫外灯下，垂直照射60～90s，然后用移液枪吸取0.2mL涂布于培养皿中，避光28～35℃培养36～72h。
硫酸二乙酯(DES)化学诱变方法：用苏氨酸高产菌株斜面菌株经过一次种子培养后，离心沉降10min(3000～5000r/min)，收集菌体，用无菌水洗涤菌体2～3次，再次离心收集菌体，加入pH 7.0的磷酸盐缓冲液至原体积，用浓度为1％(v/v)的硫酸二乙酯处理30～60min，用无菌水稀释后，进行一级培养。
亚硝基胍(NTG)化学诱变方法：取苏氨酸高产菌株斜面菌株接入装有30mL1/30mol/L磷酸盐缓冲液及玻璃珠的250mL三角瓶中振摇15min，使菌体分散成单细胞，称取少量亚硝基胍溶解在少量丙酮中，再加入磷酸缓冲液，制成浓度为1.0mg/mL的亚硝基胍溶液。加入亚硝基胍溶液使终浓度为250～500μg/mL，振荡培养至培养液微浑(对数生长初期)，诱变结束后快速离心终止反应，用0.1mol/L、pH 6.0的磷酸缓冲液洗涤菌体沉淀2～3次后用0.5mL无菌生理盐水悬浮。取菌悬液涂布平板培养。
抗性突变株筛选方法：配置基本培养基，灭菌后加入适量的结构类似物，使平板中的结构类似物浓度分别为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L，再在各个不同浓度结构类似物平板上涂布适量的出发菌的菌悬液，观察生长情况，根据出发菌株耐受结构类似物的浓度确定诱变菌株筛选用结构类似物浓度。将诱变处理的菌液涂布在含有上述方法确定浓度的S-甲基半胱氨酸、天冬氨酸氧肟酸盐、α-氨基-β-羟基戊酸的筛选平板上，置36.5℃培养箱中培养3～5天，随机挑选生长菌落进行摇瓶筛选。
将得到的含有抗性标记的高产苏氨酸突变株，接入装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中36.5℃振荡培养24h后，以20％的接种量将种子液接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，36.5℃振荡培养36h，筛选出产量较高的菌株。
遗传稳定性试验：
将上述筛选获得的苏氨酸高产菌株进行单菌落分离，连续摇瓶传代10代，每一代菌株先进行种子培养，并进行遗传标记实验和发酵产酸实验，选择遗传稳定和产酸高的菌株用于进一步研究。摇瓶传代方法：把苏氨酸高产菌株从斜面转接摇瓶中，培养至对数生长期后转接至下一代摇瓶。
将最终获得的一株苏氨酸高产菌株ACThr1032再连续传种十次，使用10L发酵培养考察其L-苏氨酸的产量。结果如下：
表1菌株ACThr1032的遗传稳定性
实施例2
一株大肠埃希氏菌ACThr1032，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2018年7月23日，菌种保藏编号为CGMCC No.16144。
所述大肠埃希氏菌ACThr1032及其在发酵生产L-苏氨酸中的应用，包含以下步骤：
(1)菌种培养，将种子培养基进行灭菌，冷却至30℃左右，pH调至6.5左右，将大肠埃希氏菌ACThr1032菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期。菌种培养条件：温度30℃、pH值6.5左右、溶氧≥30％、罐压0.02MPa。
(2)发酵培养，将发酵培养基进行灭菌，冷却至37℃左右，pH调至7.0左右，将步骤(1)制得的对数生长期菌种接入发酵培养基中进行发酵培养以制取L-苏氨酸发酵液。发酵培养条件：温度30～40℃、pH值6.5～7.5、溶氧≥30％、罐压0.02～0.10MPa、通风量及搅拌转数根据溶氧数据交替阶梯提高，发酵过程中残糖含量控制在0.05～0.2％。培养至30～50h结束培养，得到L-苏氨酸发酵液。
(3)提取纯化，将步骤(2)得到的L-苏氨酸发酵液通过孔径为8nm的陶瓷膜过滤去除菌体得到过滤清液，将过滤清液使用单效蒸发结晶器进行蒸发浓缩结晶，然后使用冷却结晶器进行降温冷却结晶，使用自动刮刀离心机离心去除母液，得到湿晶，将湿晶进行干燥，得到L-苏氨酸晶体。
膜过滤设备为陶瓷膜，孔径为8nm；蒸发浓缩结晶设备为单效或多效蒸发结晶器，蒸发温度为50℃，浓缩比为3倍；冷却结晶设备为冷结晶器，降温控制速度为2℃/h，最低温度为5℃；离心机为平板刮刀式离心机，离心后湿晶含水量≤10％。
所述菌种培养的培养基包含葡萄糖5g/L、玉米浆15g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁0.05g/L、酵母粉0.5g/L、微量元素1份。
所述发酵培养的培养基包含葡萄糖5g/L、玉米浆15g/L、硫酸铵0.5g/L、磷酸0.5g/L、硫酸镁0.05g/L、氯化钾0.05g/L、糖蜜0.5g/L、微量元素1份。
通过该种方式培养，采用10L发酵罐培养，发酵培养至35h，产L-苏氨酸182g/L，转化率61.5％。经过提取纯化，得到L-苏氨酸晶体1089g。
转化率计算公式＝(发酵液体积L×发酵产酸含量g/L)/发酵总耗糖量g×100％
实施例3
一株大肠埃希氏菌ACThr1032，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2018年7月23日，菌种保藏编号为CGMCC No.16144。
所述大肠埃希氏菌ACThr1032及其在发酵生产L-苏氨酸中的应用，包含以下步骤：
(1)菌种培养，将种子培养基进行灭菌，冷却至40℃左右，pH调至7.5左右，将大肠埃希氏菌ACThr1032菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期。菌种培养条件：温度40℃、pH值7.5左右、溶氧≥30％、罐压0.05MPa。
(2)发酵培养，将发酵培养基进行灭菌，冷却至37℃左右，pH调至7.0左右，将步骤(1)制得的对数生长期菌种接入发酵培养基中进行发酵培养以制取L-苏氨酸发酵液。发酵培养条件：温度40℃、pH值7.5、溶氧≥30％、罐压0.10MPa、通风量及搅拌转数根据溶氧数据交替阶梯提高，发酵过程中残糖含量控制在0.2％。培养至50h结束培养，得到L-苏氨酸发酵液。
(3)提取纯化，将步骤(2)得到的L-苏氨酸发酵液通过孔径为50nm的金属膜过滤去除菌体得到过滤清液，将过滤清液使用三效蒸发结晶器进行蒸发浓缩结晶，然后使用冷却结晶器进行降温冷却结晶，使用自动刮刀离心机离心去除母液，得到湿晶，将湿晶进行干燥，得到L-苏氨酸晶体。
膜过滤设备为有机膜，孔径为50nm；蒸发浓缩结晶设备为单效或多效蒸发结晶器，蒸发温度为85℃，浓缩比为8倍；冷却结晶设备为冷结晶器，降温控制速度为5℃/h，最低温度为15℃；离心机为平板刮刀式离心机，离心后湿晶含水量≤10％。
所述菌种培养的培养基包含葡萄糖15g/L、玉米浆35g/L、硫酸铵4g/L、磷酸二氢钾4g/L、硫酸镁1g/L、酵母粉10g/L、微量元素1份。
所述发酵培养的培养基包含葡萄糖40g/L、玉米浆40g/L、硫酸铵5g/L、磷酸4g/L、硫酸镁2g/L、氯化钾3g/L、糖蜜10g/L、微量元素1份。
通过该种方式，采用50吨发酵罐培养，发酵培养至35h，产L-苏氨酸175g/L，转化率58.7％。经过提取纯化，得到L-苏氨酸晶体5.57吨。
转化率计算公式＝(发酵液体积L×发酵产酸含量g/L)/发酵总耗糖量g×100％
应用实施例1对比实验：
使用本发明中的大肠埃希氏菌ACThr1032和原菌株E.coli THRD，结合本发明中的相关工艺分别进行10L罐发酵培养，分别培养三批次，取三个批次平均值计算结果如表2所示。
表2
| 项目 | E.coli THRD | ACThr1032 |
| 产酸g/L | 139.1 | 182.3 |
| 转化率％ | 56.2 | 62.8 |
| 周期 | 36 | 36 |
从表2中可以看出，本发明中的菌种大肠埃希氏菌ACThr1032相比出发菌产酸率提高了31.06％，糖酸转化率提高了11.74％，具有较大提高，更利于工业化生产提高产能、降低成本。
Claims (8)
1.一株大肠埃希氏菌ACThr1032，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏编号为CGMCCNo.16144，保藏日期为2018年7月23日。
2.权利要求1所述大肠埃希氏菌ACThr1032的应用，其特征是：将其应用于发酵生产L-苏氨酸。
3.如权利要求2所述大肠埃希氏菌ACThr1032的应用，其特征是步骤如下：
（1）菌种培养：将种子培养基进行灭菌，冷却至30~40℃，pH调至6.5~7.5，将大肠埃希氏菌ACThr1032菌种接至种子培养基中进行培养，培养至对数生长期；
（2）发酵培养：将发酵培养基进行灭菌，冷却至37℃，pH调至7.0；将步骤（1）制得的对数生长期菌种接入发酵培养基中进行发酵培养以制取L-苏氨酸发酵液；培养30~50h，即得到L-苏氨酸发酵液；
（3）提取纯化：将步骤（2）得到的L-苏氨酸发酵液通过膜过滤去除菌体得到过滤清液，将过滤清液进行蒸发浓缩结晶，然后降温冷却结晶，进一步离心去除母液，得到湿晶，将湿晶进行干燥，得到L-苏氨酸晶体。
4.如权利要求3所述大肠埃希氏菌ACThr1032的应用，其特征是：步骤（1）中所述菌种培养条件为温度30~40℃、pH值6.5~7.5、溶氧≥30%和罐压0.02~0.05 MPa。
5.如权利要求3所述大肠埃希氏菌ACThr1032的应用，其特征是：步骤（2）中所述发酵培养条件为温度30~40℃、pH值6.5~7.5、溶氧≥30%和罐压0.02~0.10 MPa。
6.如权利要求5所述大肠埃希氏菌ACThr1032的应用，其特征是：步骤（2）中通风量及搅拌转数根据溶氧数据交替阶梯提高，发酵过程中残糖含量控制在0.05%~0.2%。
7.如权利要求3所述大肠埃希氏菌ACThr1032的应用，其特征是：
步骤（1）所述菌种培养的培养基包含葡萄糖5~15g/L、玉米浆15~35g/L、硫酸铵0.5~4g/L、磷酸二氢钾0.5~4g/L、硫酸镁0.05~1g/L、酵母粉0.5~10g/L、微量元素1份；
步骤（2）所述发酵培养的培养基包含葡萄糖5~40g/L、玉米浆15~40g/L、硫酸铵0.5~5g/L、磷酸0.5~4g/L、硫酸镁0.05~2g/L、氯化钾0.05~3g/L、糖蜜0.5~10g/L、微量元素1份。
8.如权利要求3所述大肠埃希氏菌ACThr1032的应用，其特征是：步骤（3）中提取纯化的具体设备及控制参数如下：膜过滤设备为陶瓷膜、有机膜或金属膜，孔径为8~100nm；蒸发浓缩结晶设备为单效或多效蒸发结晶器，蒸发温度为50~85℃，浓缩比为3~8倍；冷却结晶设备为冷结晶器，降温控制速度为2~5℃/h，最低温度为5~15℃；离心机为平板刮刀式离心机，离心后湿晶含水量≤10%。
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