CN109251891B

CN109251891B - 一种cd40联合pd-l1及细胞因子扩增pbmc的方法

Info

Publication number: CN109251891B
Application number: CN201811107312.7A
Authority: CN
Inventors: 古彦铮; 张学光; 黄子逸; 刘翠平
Original assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2038-09-21
Also published as: CN109251891A

Abstract

本发明公开了一种CD40联合PD‑L1及细胞因子扩增PBMC的方法，步骤如下：1）取正常人外周血，与PBS混合稀释后进行Ficoll密度梯度离心；2）离心结束后，得到4层液体；用移液管吸取中间云雾层细胞，用10倍体积的PBS洗涤离心，得到PBMC；3）将PBMC细胞用RMPI1640完全培养基配成细胞悬液，转入6孔板和24孔板里，然后于各组细胞培养液中加入相应细胞因子液：将孔板放到CO₂培养箱内培养；4）视细胞状态每隔2~3天补加一次细胞因子液。本发明从CD40信号联合PD‑L1及细胞因子IL‑15和IL‑7组合扩增PBMC制备新型过继免疫治疗细胞为切入点，提供一种新的过继免疫细胞的体外诱导方案。此外，本发明所提供的方法实验设备要求低、操作简单省时、过继免疫细胞的收集率高、纯度高。

Description

一种CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重要疾病之一。目前，手术、放疗、化疗仍是主要的处理方法。但复发率和死亡率还是很高。过继细胞免疫治疗（ACT）正成为当今继放化疗后治疗恶性肿瘤的一种新的治疗手段，主要通过致敏淋巴细胞（具有特异免疫力的）输给肿瘤病人，使其获得抗肿瘤免疫力。

过继免疫疗法的效应细胞具有异质性，如细胞毒性T细胞（CTL）、自然杀伤细胞（NK）、巨噬细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activatedkillercells, LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lympbocytes，TIL)等都在肿瘤细胞杀伤中起作用。

外周血单个核细胞（PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞（monocyte）、树突状细胞和其它少量细胞（造血干细胞等）。

新型过继免疫细胞细胞治疗技术是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(CD3McAb，IL-2, IFN-γ,IL-1α等)共同培养一段时间后获得的一群以 CD3⁺CD56⁺、CD3⁺CD8⁺细胞为主的异质细胞群，增殖速度快、杀瘤活性、高杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞敏感，对G0期细胞也有杀伤作用、杀瘤活性不受环抱素A(CsA)和FKSO6等免疫抑制剂的影响、对正常骨髓造血前体细胞毒性小、能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞经Fas-FasL分子途径介导的凋亡。

常规以CD3McAb联合细胞因子IL-2, IFN-γ,IL-1α诱导的新型过继免疫细胞细胞治疗仍然存在着很多亟待解决的问题：由于用IL-2维持后期T细胞的增殖，而IL-2诱导的淋巴细胞中负性共刺激分子PD-1/PD-L1比例相当高。并且大剂量IL-2的应用会诱导一定数量的调节性T细胞（Treg），这可能是影响新型过继免疫细胞疗效的关键因素。

发明内容

本申请的主要目的在于提供一种新的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法。需要说明的是，本发明所提供的方法是一种过继免疫细胞的体外诱导方法，并非是针对活体的研究，也并非是以疾病治疗为直接目的的。

负性共刺激分子在T细胞的表达在T细胞介导的肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。PD-1是55KD的跨膜蛋白，由胞外的IgV样基序、跨膜区、胞内的ITIM（immun oreceptortyrosine-based inhibitory motif）和ITSM（immunoreceptor tyrosine-based switchmotif）基序组成。它表达于T细胞、B细胞和胸腺细胞等，并在细胞活化后上调表达。PD-1与其配体PD-L1结合后，可导致T细胞凋亡和衰竭、T细胞耐受、改变细胞因子的分泌、增殖减弱和效应T细胞的细胞毒性降低，不能产生有效的抗肿瘤免疫应答，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。

封闭PD-L1/PD-1信号传导通路可部分恢复肿瘤特异性T淋巴细胞的功能。因此通过阻断PD-1/PD-L1信号转导通路，增强肿瘤源的T细胞反应，可达到杀伤肿瘤细胞的作用，正成为逆转肿瘤免疫逃逸的一个重要手段。

因此，本发明的主要研究内容是：1. CD40信号联合PD-L1及细胞因子IL-15和IL-7诱导的过继免疫细胞和常规新型过继免疫细胞细胞生物学特性的比较性研究。通过两组细胞因子的组合扩增正常人的PBMC，研究两组诱导细胞的活力，细胞活化增殖，淋巴细胞亚群表达差异，负性共刺激分子PD-1、Tim-3等在淋巴细胞的表达差异，调节性T细胞、记忆性T细胞内IFN-γ的表达。2. CD40信号联合IFN-α、IL-7诱导的过继免疫细胞和常规新型过继免疫细胞细胞体外抗肿瘤效应的比较性研究。用丝裂霉素处理几株不同的肿瘤细胞株，将两组过继免疫细胞按照效靶比梯度置于96孔板中培养，3天后加入CCK-8进行检测。

具体的，本发明所述的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，包括如下步骤：

1）取正常人外周血，与PBS混合稀释后进行Ficoll密度梯度离心；

2）离心结束后，得到4层液体；用移液管吸取中间云雾层细胞，然后用10倍体积的PBS洗涤离心，最后得到PBMC；（所述4层液体分别为血小板、单个核细胞、粒细胞、红细胞，所述的的中间云雾层是指单个核细胞层。）

3）将PBMC细胞用RMPI1640完全培养基配成细胞悬液，然后转入6孔板和24孔板里，然后于各组细胞培养液中加入相应细胞因子液：然后将孔板放到CO₂培养箱内培养；

4）视细胞状态每隔2~3天补加一次细胞因子液。

上述步骤中，细胞培养液中加入相应细胞因子液，其过程为：CD3激发组，起始时，即第0天，加入IFN-γ（1000U/ml），24h后再加入IL-2（1000U/ml）、IL-1α（100U/ml）和抗CD3mAb（100ng/ml）。

CD40激发组，起始时，即第0天，加入5C11（2μg/ml），PD-L1(1μg/ml)，抗CD3mAb（30ng/ml）、IL-2 （300U/ml）、IL-7（5ng/ml）、IL-15（5ng/ml）。

进一步的，补加细胞因子液时，CD3激发组，仅补加IL-2（1000U/ml）。

补加细胞因子液时，CD40激发组，补加IL-2（200U/ml）、IL-7（2ng/ml）、IL-15（2ng/ml）。

具体的，所述的Ficoll密度梯度离心为：先将提前置于室温条件的Ficoll加入华氏管中，然后按照Ficoll：稀释血液=1：2的比例，沿管壁缓慢加入稀释血液，然后于控温离心机中离心。加入稀释血液时，华氏管倾斜45°，避免Ficoll与稀释血液的界面发生强烈震荡。

具体的，所述的CO₂培养箱内培养条件为：CO₂浓度为5%、温度为37℃、饱和湿度95%。

具体的，所述的离心条件为1800rpm/min，30min，20~24℃。

具体的，所述的RMPI1640完全培养基含10%小牛血清。

具体的，所述的6孔板为：5.0×10⁶/孔；所述的24孔板为：2.0×10⁵/孔。

有益效果：本发明从CD40信号联合PD-L1及细胞因子IL-15和IL-7组合扩增PBMC制备新型过继免疫治疗细胞为切入点，与常规方法培养的新型过继免疫细胞细胞为对照，提供一种新的优化的过继免疫细胞的体外诱导方案。

本发明所提供的方法实验设备要求低、操作简单省时、过继免疫细胞的收集率高、纯度高。

附图说明

图1 本发明过继免疫细胞培养方式与传统方式的培养的过继免疫细胞的细胞数量增殖情况示意图；

图2 本发明过继免疫细胞培养方式与传统方式的培养的过继免疫细胞的细胞亚群分析图；

图3 本发明过继免疫细胞培养方式与传统方式的培养的过继免疫细胞CD40激发组中CD8⁺Tcm细胞的比例示意图；

图4本发明过继免疫细胞培养方式与传统方式的培养的过继免疫细胞CD40激发组NK-T细胞的比例示意图；

图5本发明过继免疫细胞培养方式与传统方式的培养的过继免疫细胞CD40激发组Treg细胞的比例示意图；

图6 本发明过继免疫细胞培养方式与传统方式的培养的过继免疫细胞CD40激发组IFN-γ细胞的比例示意图；

图7 本发明过继免疫细胞培养方式与传统方式的培养的过继免疫细胞CD40联合PD-L1杀伤肿瘤细胞HTC116的杀伤能力示意图；

图8 本发明过继免疫细胞培养方式与传统方式的培养的过继免疫细胞CD40联合PD-L1杀伤肿瘤细胞HTC116的细胞因子分泌情况示意图；

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，

本发明中具体实施例的实验结果均采用graphpad 5.0 统计软件，计量资料以x

s表示，计数资料以比率（P）表示，X²检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。本发明具体实施例中所使用的主要试剂有：人鼠嵌合抗体CD40(5C11), 人鼠嵌合抗体PD-L1(2H11),抗人 CD3 单克隆抗体（OKT-3）、IL-2为市售抗人CD3 单克隆抗体（OKT-3）、IL-2为市售；CD4- FITC、CD8-PE、CD8-PE-CY5，CD3-PE-CY7，CD3-PE-CY5，CD19-FITC，CD28-PE，PD-1-PE-CY5.5， CD4-PE-CY5，CD25-PE-CY5，CD14-FITC，CD4-PE-Cy7，CD3-PE，CD8-PE，CD19-PE和PD-L1-PE， PD-1-PE，Tim-3-PE荧光抗体均为市售；PBS、cck-8、CFSE、1640培养基、胎牛血清、淋巴细胞分离液（ficoll，比重1.077g/ml）、OKT-3、CFSE、CD3⁺磁珠分选试剂、Cytometric Bead Array (CBA)试剂盒均为市售产品，此外下述具体实施例中所采用的未特别提及的试剂、操作工具和仪器等均为本领域常规试剂、操作工具和仪器，不再赘述。

实施例1：过继免疫治疗细胞的体外扩增培养

PBMC的分离，提取和扩增

取正常人外周血，与PBS按照1:2的比例稀释后进行Ficoll密度梯度离心。先将提前置于室温条件的Ficoll加入华氏管中，然后按照Ficoll：稀释血液=1：2的比例，沿管壁缓慢加入稀释血液（华氏管倾斜45°，切忌Ficoll与稀释血液的界面发生强烈震荡），然后于控温离心机中离心（1800rpm/min，30min，20~24℃）。离心结束后，得到如下图所示的4层液体，我们所需要的PBMC来自中间云雾层。用移液管仔细吸取云雾层细胞，然后用10倍体积的PBS洗涤离心，最后得到PBMC。

将PBMC细胞用RMPI1640完全培养基（含10%小牛血清）配成细胞悬液，然后转入6孔板（5.0×10⁶/孔）和24孔板(2.0×10⁵/孔)里，然后于各组细胞培养液中加入相应细胞因子：CD3激发组起始时（即第0天）加入IFN-γ（1000U/ml），24h后再加入IL-2（1000U/ml）、IL-1α（100U/ml）和抗CD3mAb（100ng/ml）；CD40激发组起始时（即第0天）加入5C11（2μg/ml），PD-L1(1μg/ml)，抗CD3mAb（30ng/ml）、IL-2 （300U/ml）、IL-7（2ng/ml）、IL-15（2ng/ml）、然后将孔板放到37℃ 、5%CO₂、饱和湿度95%的CO₂培养箱内培养。之后，视细胞状态每隔2-3天即每3天补一次细胞因子液，其中CD3激发组仅补加IL-2（1000U/ml），而CD40激发组则补IL-2（200U/ml）、IL-7（5ng/ml）、IL-15（5ng/ml）、。每天观察，并拍照记录如图1

在过继免疫治疗细胞体外培养的过程中，我们使用倒置显微镜观察孔板中的细胞生长状态，并在第6，9，12天，使用细胞成像仪对CD3激发组和CD40激发组的细胞拍照记录生长形态。

台盼蓝法测定过继免疫治疗细胞的体外增殖

盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

制备计数用的细胞悬液：用移液枪吸取10µl细胞悬液到一支离心管中，加入10µ l台盼蓝染液（0.4％），死细胞则会被染成蓝色，以此来区别活细胞和死细胞。

4分钟后将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹打均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。

计算原细胞悬液的细胞数：按照下面公式计算细胞密度。

（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×稀释倍数×10⁴。

标记PBMC检测体外增殖实验

用CFSE检测人外周血T细胞体外扩增：取适量分离好的人外周血单个核细胞（PBMC)于适量CFSE的工作液中，轻轻混匀，然后于37℃水浴10 min，离心后去上清，加入5ml10%小牛血清的1640溶液，再离心后去上清，重复此操作1次，再加入合适的培养基制成细胞悬液，铺板（24孔板，每孔1×10⁶），同上加入相应的细胞因子于37℃、5%CO₂、饱和湿度95%的CO₂ 培养箱内培养，并每天观察细胞形态，并拍照记录。

在培养第10天收集用CFSE荧光标记过的过继免疫治疗细胞，检测其CD4⁺T ,CD8⁺T增殖情况。由图1可见，CD40激发组的CD3⁺T扩增数高于CD3激发组；CD40 激发组的CD8⁺T比例为78.9%，CD3激发组的CD8⁺T比例为54.4%，由此可见，CD3激发组的CD8⁺T扩增数明显低于CD40激发组（见图1）。

实施例2：流式细胞术检测过继免疫治疗细胞的免疫表型

细胞的膜表面分子的流式检测

将细胞悬液转移到离心管中，1500 rpm/min离心3 min，弃上清液。

加入PBS（含1%小牛血清），1500 rpm/min离心3 min，去除上清液，再重复本步操作一次。

设定对照组：阴性对照管（只加未染色细胞），单标补偿管。

加入PBS（含1%小牛血清），制成终浓度为1×10⁶cells/ml的细胞悬液。

取100 μl第4步中的细胞悬液，加入到新的tube中。

向细胞悬液中加入荧光抗体，室温下避光培养30 min。

洗涤离心，加入500 μl 鞘液，上机检测。

在培养的第14天收集培养的过继免疫治疗细胞,检测其两组 CD3⁺CD4⁺ T和 CD3⁺CD8⁺ T 细胞群体的变化情况。结果显示,CD3激发组的 CD3⁺CD4⁺ T细胞比例为25%，CD40激发组的 CD3⁺CD4⁺ T细胞为13.7%；CD3激发组的 CD3⁺CD8⁺ T细胞比例为66.4% ,而 CD40激发组的CD3⁺CD8⁺T细胞比例为79.1%；CD3激发组的CD4⁺ T细胞比例高于CD8⁺T细胞，而CD40激发组的CD8⁺ T细胞比例高于CD4⁺ T细胞。同时经比较，CD40激发组T淋巴细胞负性共刺激分子PD-1，PD-L1，Tim-3的表达显著下调。（见图2）

在培养的第 14天收集过继免疫治疗细胞,检测其CCR7和CD62L 的T_CM和CD3⁺CD56⁺细胞群体的变化状况。结果显示,CD3激发组的T_CM（如图2）和CD3⁺CD56⁺NK-T（如图4）细胞比例低于CD40激发组的细胞比例。

1.2.2.2 Treg细胞的流式检测

在每个流式上样管中加入100μl准备好的细胞悬液，细胞数约为1×10⁶个。

按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原（CD4、CD25）。

用预冷的PBS洗涤细胞。

旋涡震荡重悬细胞后加入100μl的固定/破膜工作液（Fixation/ Permeabilization），并再次旋涡混匀。

避光4℃孵育90分钟。

加入1ml Permeabilization Buffer工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

重复第6步操作洗涤细胞。

直接加入稀释好的荧光标记Foxp3抗体（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释）100μl，避光4℃孵育30分钟。

重复上一步洗涤细胞后用500μl鞘液重悬细胞，并上机检测分析。

CD40激发组的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺细胞明显低于CD3激发组。CD40激发组的Foxp3⁺细胞比例为2.67%，而CD3激发组的Foxp3⁺细胞比例为10.0%。即CD40激发组的Treg 细胞比例显著低于CD3激发组的Treg 细胞比例（见图3）。

实施例3：体外杀伤功能检测

T淋巴细胞表达IFN-γ情况的流式检测

在每个流式上样管中加入100μl准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个。

按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原（CD3、CD4、CD8），荧光抗体用量是2μ l/test。

用预冷的PBS洗涤细胞。

旋涡震荡重悬细胞后加入200μl的固定/破膜工作液（Fixation/ Permeabilization），并再次混匀。

避光4℃孵育12分钟。

加入500μl Permeabilization Buffer工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

重复第6步操作洗涤细胞。

直接加入稀释好的荧光标记IFN-γ抗体（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释）100μl，避光4℃孵育20分钟。

加入500 μl Permeabilization Buffer工作液离心洗涤细胞并弃去上清液并重复洗涤细胞一次。

用500μl鞘液重悬细胞，并上机检测分析。

CD40激发组的CD8⁺IFN-γ⁺细胞明显低于CD3激发组。CD40激发组的CD8⁺IFN-γ⁺细胞比例为17.2%，而CD3激发组的CD8⁺IFN-γ⁺细胞比例为13.8%。即CD40激发组的CD8⁺IFN-γ⁺细胞比例显著高于CD3激发组的Treg 细胞比例（见图6）。

杀伤实验的比较：

细胞培养到第10天，把肿瘤细胞HCT116种进6孔板里，使其完全贴壁，随后用丝裂霉素（每毫升培养基用100 μl）处理2小时，接着用PBS洗两遍，用适当浓度的胰酶对肿瘤细胞消化，计数，种进96孔板，每孔1×10⁴个细胞（100 μl培养基）；两个小时后待其完全贴壁后开始种体外培养的过继免疫治疗细胞，分别按照1:20，1:40，1:60，1:80的比例，放进37℃、5%CO₂、饱和湿度95%的CO₂培养箱内培养，三天后每孔加20 μl cck-8检测。（如图 7）

从杀伤结果可以证明：CD40激发组的过继免疫治疗细胞对肿瘤细胞的杀伤效果强于CD3激发组的杀伤效果相差不大。

体外细胞因子分泌实验的比较

本实验使用BD公司CBA试剂盒，实验步骤如实验说明书实验结果显示：较单CD3激发组，CD40联合PD-L1分泌更多的杀伤肿瘤细胞因子。（如图8）

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2）离心结束后，得到4层液体；用移液管吸取中间云雾层细胞，然后用10倍体积的PBS洗涤离心，最后得到PBMC；

4）视细胞状态每隔2~3天补加一次细胞因子液；

其中，所述细胞培养液中加入相应细胞因子液，其过程为：

CD40激发组，起始时，即第0天，加入浓度为2μg/ml的5C11，浓度为1μg/ml的PD-L1，浓度为30ng/ml的抗CD3mAb，浓度为300U/ml的IL-2，浓度为5ng/ml的IL-7，浓度为5ng/ml的IL-15;

其中，补加细胞因子液时，CD40激发组，补加浓度为200U/ml的IL-2、浓度为2ng/ml的IL-7、浓度为2ng/ml的IL-15。

2.根据权利要求1所述的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，所述的Ficoll密度梯度离心为：先将提前置于室温条件的Ficoll加入华氏管中，然后按照Ficoll：稀释血液=1：2的比例，沿管壁缓慢加入稀释血液，然后于控温离心机中离心。

3.根据权利要求1所述的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，所述的CO₂培养箱内培养条件为：CO₂浓度为5%、温度为37℃、饱和湿度95%。

4.根据权利要求1所述的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，所述的离心，条件为1800rpm/min，30min，20~24℃。

5.根据权利要求1所述的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，所述的RMPI1640完全培养基含10%小牛血清。

6.根据权利要求1所述的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，所述的6孔板为：5.0×10⁶/孔；所述的24孔板为：2.0×10⁵/孔。