CN109234449B - 一种黑麦通用2rl染色体特异共显性kasp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记及其应用，所述KASP分子标记为SWK2RL1，其KASP分子标记SWK2RL1的引物包括黑麦等位型上游引物、小麦等位型上游引物和共用下游引物；所述黑麦等位型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述小麦等位型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明基于黑麦与小麦间的差异SNP位点，首次开发了黑麦通用2RL染色体的共显性KASP标记SWK2RL1，该标记遗传稳定性好、分辨率高，为高通量检测和追踪小麦背景下不同来源的黑麦2RL染色体、加快黑麦2RL染色体上优异基因的利用和转移提供了工具，可有效应用于小麦染色体工程育种和分子标记辅助选择育种。

Description

一种黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和遗传育种领域，具体地说是一种黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记及其应用。

背景技术

小麦是世界上重要的粮食作物之一，小麦的高产、稳产对国民经济发展和国家粮食安全起着至关重要的作用。然而随着长期传统育种过程中品种间杂交次数的增加，主栽品种间遗传的高度一致性限制了小麦产量、品质和抗性的进一步提高，致使小麦遗传改良很难取得更大的突破。小麦的近缘种属蕴含着丰富的遗传变异，携带大量的高产、优质、耐生物和非生物胁迫等优良基因。因此，通过远缘杂交和染色体工程育种等手段转移和利用小麦近缘种属的优异基因，已成为小麦遗传改良的迫切需求。

黑麦(Secale cereale L.，2n = 2x = 14，RR)为小麦近缘属，是改良小麦的三级基因源，含有优异的产量、抗病和广适性等相关基因，是小麦的重要异源基因供体之一，在小麦遗传改良和育种中具有巨大的应用价值。遗传育种学家通过远缘杂交和染色体工程等手段创制了大量的小麦-黑麦双二倍体、附加系、代换系和易位系，实现了黑麦中优异抗病、抗逆和丰产基因向小麦的有效转移。

黑麦的2R染色体尤其是其长臂2RL上存在着许多可用于改良小麦抗病虫害等有关性状的优异位点，如Friebe等(1990)将Chaupon黑麦2RL染色体上的抗小麦瘿蚊基因H21通过T2BS·2RL易位的形式转移到六倍体小麦，该基因的导入不影响加工品质，可直接应用于小麦育种(Friebe et al. 1996)；McIntosh等 (1995)利用小麦-黑麦T2AS-2RS·2RL易位系，将抗小麦叶锈病的基因Lr45定位于Petkus黑麦2RL染色体上；位于Rosen黑麦2RL染色体上的抗白粉病基因 Pm7和抗叶锈病基因Lr25，被以T2RL-4BL·4BS易位的形式转移到了Transec小麦中(Friebe et al. 1996)；German white黑麦的2R染色体上也存在抗白粉病位点，An等(2006)通过远缘杂交、染色体工程的方法选育出成株期对白粉病免疫至近免疫的小偃6号-德国白黑麦2R(2D)二体异代换系WR02-145；Hysing等(2007)对一个新的T2BS·2RL易位系进行鉴定，发现其对白粉病、叶锈病、秆锈病表现苗期抗性，对条锈病表现成株期抗性；Zhuang等(2011)利用小麦-黑麦的2R二体附加系，将一个新的抗白粉病基因PmJZHM2RL定位于荆州黑麦的2RL染色体上；Rahmatov等(2016)利用T2DS·2RL易位系，将小麦抗秆锈病基因Sr59定位于2RL染色体上；Ren等(2017)将小麦品种绵阳11和A42912与百粒黑麦进行杂交，选育出3个对条锈病表现高抗的小麦-黑麦2RL小片端易位系；Li等(2018)通过与感病小麦杂交、抗病性鉴定和分子标记分析，证明了来自波兰的六倍体小黑麦Sorento的2RL染色体对叶锈病和白粉病的抗性。黑麦2RL染色体上优异基因的发掘与利用，对丰富小麦遗传变异、促进小麦遗传改良具有重要的意义。

快速、准确、简便地追踪和鉴定导入小麦背景中的黑麦遗传物质，对加速种质创新、提高选择的准确性具有极其重要的意义。基因组原位杂交 (Genomic in situhybridization，GISH) 技术和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术因其直观、准确的特点，被广泛应用于外缘遗传物质的检测。分子标记技术的发展，加速了优良种质资源的规模化筛选和外缘遗传物质的高通量检测与追踪，有效地提高了分子标记辅助选择育种的效率。SNP(Single nucleotide polymorphism单核苷酸多态性)主要是指由于单个核苷酸的变异而引起的基因组水平上的DNA序列多态性，形式包括单碱基的插入、缺失、转换和颠换等。SNP标记具有遗传稳定性高、位点丰富、分布广泛、富有代表性、适于高通量分析检测等优点。

KASP(Kompetitive allele specific PCR，竞争性等位基因特异PCR)技术是一种基于PCR过程中引物末端碱基特异性匹配来实现SNP/InDel(insertion-deletion，插入缺失位点)检测分型的方法，能够精确地进行双等位基因分型，且成本低、效率高、遗传稳定性好。KASP标记已经在小麦优异基因精细定位、图位克隆及分子育种应用中发挥了重要的作用。与小麦相比，很多小麦近缘种属缺乏高质量的全基因组序列信息，得益于多重测序手段和生物信息学技术的发展，KASP标记也能成功应用于小麦材料中外缘遗传物质的检测，为加速小麦材料中外缘染色体片段、优异基因的追踪与应用提供了强有力的支撑。Tiwari等(2014)利用染色体流式分选和二代测序技术相结合的方法开发了可用于检测小麦-卵穗山羊草渗入系中 5M^g外缘成分的KASP标记；李立会等(2017)基于四倍体冰草转录组测序数据开发了52个可用于鉴定小麦与冰草渐渗系的共显性KASP标记。目前，应用于小麦背景下外缘黑麦染色体检测的共显性KASP标记尚未见报道。因此，基于黑麦2RL染色体上与小麦基因组的特异SNP位点开发不同黑麦品种间通用的共显性染色体特异KASP分子标记，能够快速准确、低成本、高通量地实现小麦-黑麦后代材料中2RL染色体的检测，对加速黑麦优异基因向小麦的转移、应用于分子标记辅助选择育种和提高小麦育种的选择效率具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记及其应用，为高通量检测和追踪小麦背景下不同来源黑麦2RL染色体、加快黑麦2RL染色体上优异基因的转移和利用提供了有力工具，可有效应用于小麦染色体工程育种和分子标记辅助选择育种。

本发明是通过以下方法实现的：一种黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记，所述KASP分子标记为SWK2RL1，其KASP分子标记SWK2RL1的引物包括黑麦等位型上游引物、小麦等位型上游引物和共用下游引物；

所述黑麦等位型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述小麦等位型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

所述的黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记在小麦染色体工程育种和分子标记辅助选择育种中的应用。

所述的黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记在鉴定小麦-黑麦材料中是否存在黑麦2RL染色体的应用。

本发明还保护一种鉴定小麦-黑麦材料中含有黑麦2RL染色体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的DNA，作为模板；

（2）利用KASP分子标记SWK2RL1的引物对DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物；所述KASP分子标记SWK2RL1的引物包括黑麦等位型上游引物、小麦等位型上游引物和共用下游引物；所述黑麦等位型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述小麦等位型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述PCR扩增的反应体系为：20ng/μL DNA 2.4μL，2×KASP Maseter Mix 4μL，引物混合物 0.13μL，ddH₂O 1.47μL，总体系为8μL；其Primer Mix中的黑麦等位型及小麦等位型上游引物工作液浓度均为12μM；下游引物工作浓度为30 μM；

所述PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，58℃退火并延伸60秒，38个循环；

（3）采用荧光定量PCR检测仪分析PCR扩增产物基因型：37℃测量荧光信号，Bio-Rad CFX Manager 3.1读取分型结果。

本发明利用SLAF-seq(Specific Locus Amplified Fragment Sequencing)，特异位点扩增片段测序技术对帝国黑麦、德国白黑麦、荆州黑麦、百粒黑麦、固原黑麦共五种黑麦进行测序，通过序列数据比对分析获得与小麦特异的五种黑麦共有的序列，设计引物并利用843PI整套小麦-黑麦二体及端体附加系进行验证，开发获得了基于普通PCR的黑麦2RL染色体特异引物。将引物扩增序列所在的原始SLAF标签序列与中国春参考基因组(IWGSCReference Sequence v1.0)比对，发现一个黑麦2RL染色体上特异的SNP位点，根据该位点首次开发了共显性KASP标记SWK2RL1，利用该标记对不同的小麦品种、不同的黑麦品种、小麦-黑麦2R/2RL导入系进行验证，均能正确分型，准确无误。

本发明较现有技术的优点在于：

1）本发明开发的黑麦染色体特异分子标记是KASP标记，相比于传统的基于PCR的分子标记遗传稳定性好、操作简便，可以快速、高效地应用于高通量检测和追踪小麦-黑麦衍生后代中的2RL染色体，提高分子标记辅助选择育种的效率。

2）本发明开发的KASP标记基于SNP位点，分辨率高，只要含有该SNP位点的外缘片段都可以检测出来，对于染色体工程育种中小片段易位系的检测和追踪尤为重要。

3）本发明开发的KASP标记基于的SNP位点在不同来源黑麦中的保守性高，能够准确鉴定多种黑麦的2RL染色体，为高效转移和利用不同来源黑麦的2RL染色体上丰富的优良基因奠定了基础。

4）本发明开发的KASP标记是共显性分子标记，小麦-黑麦2RL导入系呈现杂合型，小麦和黑麦呈现不同的等位型，既可以追踪小麦背景中的黑麦遗传物质，也可以用于小麦和黑麦染色体变化的分析。

因此，本发明提供了一个能够准确鉴定不同来源黑麦的2RL染色体的共显性KASP标记。该标记基于黑麦与小麦间的差异SNP位点开发，遗传稳定性好、分辨率高，为高通量检测和追踪小麦背景下不同来源的黑麦2RL染色体、加快黑麦2RL染色体上优异基因的利用和转移提供了有力工具，可有效应用于小麦染色体工程育种和分子标记辅助选择育种。

附图说明

图1为利用黑麦2RL染色体特异的共显性KASP标记SWK2RL1检测材料的分型结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记SWK2RL1的获得

1、基因组DNA的提取和纯化

利用CTAB法分别提取帝国黑麦、德国白黑麦、荆州黑麦、百粒黑麦和固原黑麦共五种黑麦的基因组DNA，具体操作步骤如下：

（1）取两叶一心期的新鲜叶片于2mL离心管中，在液氮中冷冻后研磨成粉末；

（2）向离心管中加入65℃预热的CTAB提取液600μL，65℃水浴40min，每隔10min轻轻摇晃混匀；

（3）取出离心管稍微冷却几分钟，向离心管中加入与CTAB提取液等量的氯仿-异戊醇(24:1)，置于摇床15min使充分摇匀，12000rpm离心10min，取上清液移至新的1.5mL离心管中；

（4）向1.5mL离心管中加入2-3倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀至絮状DNA出现；

（5）5000rpm瞬离使DNA沉淀，轻轻倒掉无水乙醇，避免将絮状DNA倒出；

（6）用70%乙醇冲洗DNA 2次后干燥DNA；

（7）加入60μL 含有适量RNaseA 的1×TE缓冲液溶解DNA；

（8）待DNA充分溶解后，检测浓度与纯度。

2、五种黑麦共有的特异SLAF标签的获得

SLAF-seq是一种基于高通量测序技术和生物信息学原理发展而来的简化基因组深度测序技术，具有通量高、准确性高、成本低、周期短等优势，根据测序结果和生物信息学分析获得的SLAF标签可直接应用于高通量分子标记的开发。

利用SLAF-seq技术对黑麦基因组进行系统分析，最终选取小麦基因组作为参考基因组进行电子酶切预测，选择最适酶切方案，对五种黑麦的基因组DNA进行酶切，SLAF标签长度选择在464-494bp，构建SLAF-seq文库，利用高通量测序技术进行测序，对测序结果进行数据分析和质控，最终获得653,144个SLAF标签序列。将五种黑麦共有的SLAF标签与已知的小麦参考基因组序列进行比对，与小麦同源性低于50%的标签视为黑麦特异的SLAF标签。最终获得五种黑麦共有的特异SLAF标签3871个。

3、基于普通PCR的黑麦通用染色体特异分子标记的开发

根据获得的黑麦特异SLAF标签序列利用Primer3设计引物，利用843小麦、PI黑麦及其整套小麦-黑麦二体附加系和端体附加系进行验证，获得了大量的覆盖全部黑麦染色体的特异标记，借助这些分子标记能够利用普通PCR技术快速、准确地鉴定小麦遗传背景中的1R-7R全部黑麦染色体。

设计引物参考http://www.primer3plus.com/primer3web/primer3web_input.htm。

4、五种黑麦通用的2RL染色体特异共显性KASP标记的开发

将获得的黑麦2RL染色体特异标记扩增序列所在的原始SLAF标签序列与中国春参考基因组（IWGSC Reference Sequence v1.0）进行比对，发现一个与小麦相似度高于90%且仅在2RL染色体上特异的SNP位点，该位点在黑麦基因组中为C，在小麦基因组的同源染色体中均为A。根据该位点设计引物，并验证了所设计的引物扩增序列在黑麦参考基因组（NCBI:Rye_Lo7_WGS_contigs GenBank assembly）中的特异性。引物包括：

标有FAM的黑麦等位型上游核苷酸序列：

5’-gaaggtgaccaagttcatgcttcaacaccaagagaagggaac-3’，如SEQ ID NO.1所示；

标有HEX的小麦等位型上游核苷酸序列：

5’-gaaggtcggagtcaacggatttcaacaccaagagaagggaaa-3’，如SEQ ID NO.2所示；

下游序列：

5’-cagatgcatgtaggtagcgc-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

PCR扩增体系为：20ng/μL DNA 2.4μL，2×KASP Maseter Mix 4μL，Primer Mix0.13μL，ddH₂O 1.47μL，总体系为8μL；其Primer Mix中的黑麦等位型及小麦等位型上游引物工作液浓度均为12μM；下游引物工作浓度为30 μM；

PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，58℃退火并延伸60秒，38个循环。

获得的引物利用843小麦、PI黑麦及其整套小麦-黑麦二体附加系和端体附加系进行验证，该引物可以成功在小麦、黑麦、小麦-黑麦2RL导入系中实现分型，将其命名为SWK2RL1。

实施例2 黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记SWK2RL1的应用

待测材料包括：

8个小麦品种：中国春，小偃6号，Holdfast，科农199，藁城8901，冀师02-1，石新633，石新733；

7个黑麦品种：帝国黑麦、德国白黑麦、荆州黑麦、百粒黑麦、固原黑麦、威宁黑麦、KingII黑麦；

30个经过基因组原位杂交GISH/FISH鉴定并确认外缘染色体存在的小麦-黑麦材料：Holdfast-KingII小麦-黑麦整套二体附加系和双端体附加系共21个，中国春-帝国黑麦1R-7R附加系共7个，小偃6号-德国白黑麦2RL双端体附加系WR56，小偃6号-德国白黑麦2R(2D)二体异代换系WR91。

以提取上述材料的DNA为模板，利用本发明开发的KASP分子标记SWK2RL1的引物：

标有FAM的黑麦等位型上游核苷酸序列：

5’-gaaggtgaccaagttcatgcttcaacaccaagagaagggaac-3’，如SEQ ID NO.1所示；

标有HEX的小麦等位型上游核苷酸序列：

5’-gaaggtcggagtcaacggatttcaacaccaagagaagggaaa-3’，如SEQ ID NO.2所示；

下游序列：

5’-cagatgcatgtaggtagcgc-3’，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

PCR扩增体系为：20ng/μL DNA 2.4μL，2×KASP Maseter Mix 4μL，Primer Mix0.13μL，ddH₂O 1.47μL，总体系为8μL；其Primer Mix中的黑麦等位型及小麦等位型上游引物工作液浓度均为12μM；下游引物工作浓度为30 μM。PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，58℃退火并延伸60秒，38个循环。

按照如上所述的PCR扩增反应体系及优化扩增程序进行KASP分型，分型结果如图1所示。图中横轴远端样品群为不同品种的黑麦，等位型为“Allele1/Allele1”，荧光读取呈现红色；纵轴远端样品群为不同品种的小麦或不含2RL染色体的小麦-黑麦材料，等位型为“Allele2/Allele2”，荧光读取呈现蓝色；中间样品群为含有2R或2RL染色体的小麦-黑麦导入系，荧光读取呈现绿色，等位型为“Allele1/Allele2”；近原点处三个黑点代表无模板对照。该标记分型结果准确。

因此，本发明提供的黑麦2RL染色体特异共显性KASP标记SWK2RL1，在不同来源黑麦品种间保守性较高，可用于小麦背景下不同黑麦来源的2RL染色体的检测，可应用于小麦染色体工程育种和分子标记辅助选择育种。

以上所述用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以做一些修改或改进，使之对本领域技术人员是易于操作的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心

<120> 一种黑麦通用2RL染色体特异共显性的KASP分子标记及其应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> KASP分子标记SWK2RL1的黑麦等位型上游引物

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc ttcaacacca agagaaggga ac 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> KASP分子标记SWK2RL1的小麦等位型上游引物

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat ttcaacacca agagaaggga aa 42

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> KASP分子标记SWK2RL1的下游引物

<400> 3

cagatgcatg taggtagcgc 20

Claims (6)

1.一种黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记引物，其特征在于，所述KASP分子标记引物为SWK2RL1，包括黑麦等位型上游引物、小麦等位型上游引物和共用下游引物；

所述黑麦等位型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述小麦等位型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述共用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种权利要求1所述的黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记引物在小麦染色体工程育种和分子标记辅助选择育种中的应用。

3.一种权利要求1所述的黑麦通用2RL染色体特异共显性KASP分子标记引物在鉴定小麦-黑麦材料中是否存在黑麦2RL染色体的应用。

4.一种鉴定小麦-黑麦材料中含有黑麦2RL染色体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的DNA，作为模板；

（2）利用KASP分子标记引物SWK2RL1对DNA模板进行PCR扩增，得扩增产物；

所述KASP分子标记引物SWK2RL1包括黑麦等位型上游引物、小麦等位型上游引物和共用下游引物；所述黑麦等位型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述小麦等位型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述共用下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；

（3）采用荧光定量PCR检测仪分析PCR扩增产物基因型：37℃测量荧光信号，Bio-RadCFX Manager 3.1读取分型结果。

5.根据权利要求4所述的鉴定小麦-黑麦材料中含有黑麦2RL染色体的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：20ng/μL DNA 2.4μL，2×KASP Maseter Mix 4μL，PrimerMix 0.13μL，ddH₂O 1.47μL，总体系为8μL；其Primer Mix中黑麦等位型上游引物和小麦等位型上游引物的工作液浓度均为12μM；下游引物工作液浓度为30 μM。

6.根据权利要求4或5所述的鉴定小麦-黑麦材料中含有黑麦2RL染色体的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性15分钟；94℃变性20秒，64℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；94℃变性20秒，58℃退火并延伸60秒，38个循环。

Images