CN106148510B - 水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记及其应用，命名为Pi5InDel，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所提供的稻瘟病抗性基因Pi5基因特异性分子标记特异性高；在实际应用中低成本、高通量；能广泛应用于遗传背景不同的群体中以筛选含有稻瘟病抗性基因Pi的水稻种质。利用该分子标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地涉及稻瘟病技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记及其应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，每年因稻瘟病造成的经济损失达数十亿美元(郑钊等，2009)。我国水稻主产区几乎都受到稻瘟病的危害，年发病面积到330-570万公顷，损失稻谷数亿公斤。从粮食安全和水稻遗传育种的角度来看，培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的方法之一。但由于稻瘟病生理小种致病性变异快，单一抗性品种的抗性会逐渐丧失(殷得所等，2011)；而传统的抗病育种策略存在工作量大，周期长等特点。因此，迫切需要改变传统抗病育种的策略。基于分子标记辅助选择(Marker-associatedselection，MAS)技术的抗病分子育种具有对目标性状的选择不受基因表达和环境条件影响、可在植株生长的任何阶段进行、能在分离世代快速准确地鉴定植株基因型、还可以有效克服目标基因与不利基因的连锁累赘等优点，已被用在水稻稻瘟病的抗性育种领域。然而与目的基因紧密连锁的分子标记在应用过程中有可能受到遗传背景的限制，在不同的群体中需对亲本的多态性进行检测；另外，与目的基因有一定距离的分子标记仍然存在着因染色体发生交换而失去了目的基因的可能性，这使得在目的基因鉴定过程中会出现错选或漏选的情况(Hayashi et al.，2006；Ingvardsen et al.，2008)。然而，基于基因内部序列所开发的基因特异性分子标记可以使上述问题得到有效解决，从而提高抗性基因的利用效率，有助于稻瘟病抗性育种的开展。
Pi5是定位于第9染色体上的广谱抗稻瘟病基因(Jeon等，1994)，测序发现Pi5-1和Pi5-2分别有5和6个外显子。Pi5介导的稻瘟病抗性需要同时具有这两个基因，抗性基因Pi5所表现出的稻瘟病广谱抗性使其在稻瘟病抗性育种工作中具有极大的应用价值。但是，Pi5在我国水稻种质资源和品种中的分布情况尚不明了，制约了该抗性基因在育种中的广泛应用。为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因Pi5应用到水稻抗性育种工作中，有必要在抗性基因Pi5的基因内部开发出Ρi5特异的InDel分子标记，这种基因特异性分子标记能对目标基因筛选的准确率理论值达100％。
发明内容
解决的技术问题：为了能更快、更有效地将稻瘟病抗性基因Pi5应用到抗性育种中，本发明提供一种稻瘟病抗性基因Pi5基因特异性分子标记Pi5InDel及其应用。该分子标记Pi5InDel基于基因序列插入缺失的差异(Insertion-deletion，InDel)研究得到，其能提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中的利用效率。
技术方案：水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记，命名为Pi5InDel，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述携带有稻瘟病抗性基因Pi5的稻瘟病抗性品种为水稻抗病品种IRBL5-M。
上述分子标记在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因中的应用。
上述应用包含如下步骤:(1)扩增:利用引物Fl和Rl对待检测的水稻品种的基因组进行PCR；(2)检测:分子量大小为93bp的的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pi5；若没有检测到分子量大小为93bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种没有携带有稻瘟病抗性基因Pi5。
用于扩增所述分子标记的引物对，核酸序列如下所示：
SEQ ID NO.2：Fl:5’-GTTTCGAGATAGTGCTAA-3’；
SEQ ID NO.3：Rl:5’-GAATGACAGTAATAGAAA-3’。
一种鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的试剂盒，含有核酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pi5InDel，以及如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的引物对。
本发明的原理:插入/缺失(insertion-deletion，InDel)标记基于PCR扩增技术，因其稳定性好、多态性高、分型系统简单，开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及医学诊断等领域。本发明通过多序列比对的方法寻找Pi5基因序列内部出现的InDel，据此位点的上下游设计引物对F1/R1，用其进行常规PCR扩增，携带有Pi5水稻品种的扩增产物分子量大小为93bp，在本发明所要求的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，携带Pi5水稻品种的酶切产物分子量为93bp，而不携带Pi5的水稻品种的酶切产物分子量以95bp或无带呈现。
有益效果：(1)本发明提供的分子标记特异性高：Pi5所在的基因组区域存在着功能与非功能基因非特性片段，利用已有的标记鉴定会有很多假阳性的结果出现。本发明提供的分子标记是经过不断地进行序列多态性搜查，并通过实验验证得到的，能明显地将Pi5与存在于该基因组区域内与Pi5高度同源的旁系同源基因区分开来。
(2)本发明提供的分子标记在实际应用中低成本、高通量：目前，InDel标记检测方式简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，在电泳技术平台上即可进行。本发明提供的InDel分子标记的扩增产物带型清晰简单，其稳定性和产物分离效果较好；由于扩增产物较短，对DNA质量要求较低，且对样品量要求较少，甚至能扩增高度降解的DNA，特别适用于生产实践中。
(3)本发明是第一个针对Pi5基因内部序列所开发的Pi5基因特异性InDel标记。本发明能用电泳检测的方法成功地将Pi5与定位在该位点上的其它非Pi5基因区分开。到目前为止，还没有有关这类标记的报道。本发明所提供的Pi5特异性分子标记Pi5InDel是一个共显性标记，在实际应用过程中其可靠性和准确性优于显性标记。本发明可应用于种质资源分析、Pi5转基因鉴定，基因聚合(尤其是序列高度同源的等位基因的聚合)，以及基于MAS技术的水稻抗性育种工作中。该标记存在于Pi5基因内部，因此对Pi5的筛选能力理论值可达100％，这样的筛选能力优于已报道的与Pi5连锁的分子标记。
(4)本发明提供的分子标记能广泛应用于遗传背景不同的群体中。现有的与Pi5连锁的分子标记大部分都是针对同一个群体2个不同亲本的序列多态性所开发的，这些标记在其它群体中的适用性有限。本发明适用于任何遗传背景下的种质资源分析、转基因育种、基因聚合以及基于MAS技术的抗性育种，无需重复进行亲本多态性的筛选，大大提高了育种效率。
因此，本发明所提供的稻瘟病抗性基因Pi5基因特异性分子标记具有重要的应用价值，利用此标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。
附图说明
图1是JJ813标记在12份代表性品种中的扩增情况，其中:泳道M为DNA ladder，泳道2～12的DNA模板依次为抗性品种IRBL5-M(Pi5)、中花16、粤野占、花节糯、天丰B、明恢63、日本晴、9311、桂朝2号、连粳7号、II-32A、广占63s。
图2是Pi5基因特异性分子标记Pi5SNP与JJ813的对比验证图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1:稻瘟病抗性基因Pi5基因特异性分子标记及其引物设计与检测
(1)Pi5插入/缺失(insertion-deletion，InDel)位点的分析:
从公共数据库中下载得到已经公开发表的Pi5基因组序列(Genebank收录号分别为：EU869185，EU869186)，针对Pi5位点进行设计引物，筛查Pi5特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的插入/缺失(InDel)差异位点。具有基因特异性InDel的水稻稻瘟病抗性基因Pi5与其它含有非Pi5功能基因的品种多序列比对结果如下，其中，缺失的两个碱基部分即为鉴定到的Pi5基因插入/缺失(InDel)差异位点。
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(2)设计引物：
根据InDel标记的设计原理，在所述InDel位点处的上下游设计引物，引物对碱基序列如下所示：
F1：5’-GTTTCGAGATAGTGCTAA-3’；
R1：5’-GAATGACAGTAATAGAAA-3’。
(3)PCR扩增，获得含有Pi5基因特异性InDel的片段
利用上述引物对F1和R1，以上述的12个水稻品种的总DNA(使用CTAB法提取植物基因组DNA得到)为模板，进行常规PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，连接到Pmd18-T Vector上，挑PCR法确认含有插入目的片段的进行测序(赛默飞世尔科技有限公司)。
PCR扩增反应体系如下：
2x Reaction Mix：12.5μL
引物F1(10μM)：1μL
引物R1(10μM)：1μL
Golden DNA polymerase：0.4μL
DNA模板(20-50ng/μL)：1μL
ddH2O：补足至25μL。
PCR温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。
PCR反应结束后，取适量酶切样品在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，20分钟，试剂盒纯化。
(4)PCR产物连接、测序
1)在微量离心管中配制下列DNA溶液全量为5μL。
18-T Vector*1 1μL
纯化PCR产物4μL
2)加入5μL等量的Solution I。
3)16℃反应30分钟。
4)全量10μL加入至100μL JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5)42℃加热45秒钟后再在冰中放置1分钟。
6)加入890μL SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。
7)在含有Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。
8)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。
实施例2:抗性基因Pi5基因特异性分子标记在鉴别Pi5基因的应用。
根据多态性的PCR产物条带，可以把含有目标基因Pi5区分开来。图1是利用已开发的标记JJ801对12个代表性品种的扩增情况，根据该标记鉴定的依据，IRBL5-M(Pi5)、中花16、粤野占、花节糯、明恢63、桂朝2号和连粳7号都是阳性带型。图2的结果显示，Pi5基因特异性分子标记既能区分不包含该位点的等位基因，又能区分包含该位点的等位基因。也就是说，凡是携带有Pi5的水稻品种，电泳检测条带以93bp呈现，而在该位点上的其它等位基因以95bp呈现，不包含该位点的以无带呈现。可见试验结果较之前的标记准确性得到提高，说明抗性基因Pi5基因特异性分子标记在鉴别Pi5基因方面得到应用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 淮阴师范学院
江苏省农业科学院
<120> 水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记及其应用
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 93
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Claims (5)
1.水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记，其特征在于命名为Pi5InDel，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因Pi5功能特异性分子标记，其特征在于携带有稻瘟病抗性基因Pi5的稻瘟病抗性品种为水稻抗病品种IRBL5-M。
3.权利要求1所述的分子标记在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因Pi5中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包含如下步骤: (1)扩增:利用如SEQ IDNO.2所示的引物Fl和SEQ ID NO.3所示的Rl对待检测的水稻品种的基因组进行PCR；(2)检测: 分子量大小为93bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pi5 ;若没有检测到分子量大小为93bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种没有携带有稻瘟病抗性基因Pi5。
5.一种鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的试剂盒，其特征在于核酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pi5InDel，以及如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对。
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| Polymorphism analysis of genomic regions associated with broad-spectrum effective blast resistance genes for marker development in rice;G.tacconi等;《Molecular breeding》;20101231;第26卷(第4期);摘要和第604页左栏最后1段至右栏第1段，表3，图2 * |
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